JPH0923785A - 繊毛虫類の大量培養法 - Google Patents
繊毛虫類の大量培養法Info
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- JPH0923785A JPH0923785A JP8176130A JP17613096A JPH0923785A JP H0923785 A JPH0923785 A JP H0923785A JP 8176130 A JP8176130 A JP 8176130A JP 17613096 A JP17613096 A JP 17613096A JP H0923785 A JPH0923785 A JP H0923785A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/08—Flask, bottle or test tube
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
- C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/10—Protozoa; Culture media therefor
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 繊毛虫類は有用な生体物質の有望な供給源と
みられていたが、その大量培養が課題となっていた。 【解決手段】 動物細胞培養用に開発されていた所謂ス
ピナーフラスコを繊毛虫類の培養に適用することによっ
て、大量培養に成功した。
みられていたが、その大量培養が課題となっていた。 【解決手段】 動物細胞培養用に開発されていた所謂ス
ピナーフラスコを繊毛虫類の培養に適用することによっ
て、大量培養に成功した。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は撹拌フラスコ中での繊毛
虫類の培養法に関する。
虫類の培養法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】繊毛
虫類は、有用な生体物質例えば酵素（I. Munro, 1985,
Process Biochem., 20, 139）、不飽和脂肪酸（Y. Goss
elin 等, 1989, Biotechnol. Lett., 11,423）および
「単細胞タンパク質」（A. Ayerbe, 1980, Enzyme Micr
ob. Technol., 2, 54）の有望な供給源である。
虫類は、有用な生体物質例えば酵素（I. Munro, 1985,
Process Biochem., 20, 139）、不飽和脂肪酸（Y. Goss
elin 等, 1989, Biotechnol. Lett., 11,423）および
「単細胞タンパク質」（A. Ayerbe, 1980, Enzyme Micr
ob. Technol., 2, 54）の有望な供給源である。
【０００３】繊毛虫類が、その可能性にもかかわらず、
今日まで生産性微生物として産業上利用されていなかっ
た理由は、これらの微生物の常々の、乏しい培養可能性
によるものである。繊毛虫類の醗酵における中心的な問
題は、適切な、費用−効果のある培地が欠如しているこ
と、およびせん断力に対して常々高い感受性を示すこと
である（Y. Gosselin 等, 1989, Biotechnol. Lett., 1
1, 423; M. Midler および R.K. Finn, 1966, Biotechn
ol. Bioeng., 8, 71）。例えばテトラヒメナ（Tetrahym
ena）やパラメシウム（Paramesium）のような一部の繊
毛虫類は培養タンク中で培養することに成功しているが
（T. Kiy および A. Tiedtke, 1992, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 38, 141; U. Schounefeld 等, J. Proto
zool., 33, 222）、大部分の繊毛虫類については、現在
までのところ大量培養法が存在していない。しかして、
上述した属の繊毛虫類も通常の培養タンクでは損傷なく
培養することができない。このことは、とりわけ、テト
ラヒメナ細胞の損傷程度を撹拌式培養タンクでのせん断
力の尺度として使用していることから理解される（M. M
idler および R.K. Finn, 1966, Biotechnol. Bioeng.,
8, 71）。大多数の繊毛虫類は、これまで極めて低い細
胞密度で非常に小さい規模でしか増殖されていなかっ
た。かくして、コルポディド・ボトム・繊毛虫類（colp
odid bottom ciliates）の通例の培養法は、「溢流ペト
リ皿」（flooded petri dish）法であり、この方法では
２、３mlの培養液をペトリ皿で培養している（W. Foiss
ner, 1993, Protozoenfauna：〔原生動物相〕, 4巻，4
／1：Colpodia （有繊毛類），Gustav Fischer Ver
l.）。
今日まで生産性微生物として産業上利用されていなかっ
た理由は、これらの微生物の常々の、乏しい培養可能性
によるものである。繊毛虫類の醗酵における中心的な問
題は、適切な、費用−効果のある培地が欠如しているこ
と、およびせん断力に対して常々高い感受性を示すこと
である（Y. Gosselin 等, 1989, Biotechnol. Lett., 1
1, 423; M. Midler および R.K. Finn, 1966, Biotechn
ol. Bioeng., 8, 71）。例えばテトラヒメナ（Tetrahym
ena）やパラメシウム（Paramesium）のような一部の繊
毛虫類は培養タンク中で培養することに成功しているが
（T. Kiy および A. Tiedtke, 1992, Appl. Microbiol.
Biotechnol., 38, 141; U. Schounefeld 等, J. Proto
zool., 33, 222）、大部分の繊毛虫類については、現在
までのところ大量培養法が存在していない。しかして、
上述した属の繊毛虫類も通常の培養タンクでは損傷なく
培養することができない。このことは、とりわけ、テト
ラヒメナ細胞の損傷程度を撹拌式培養タンクでのせん断
力の尺度として使用していることから理解される（M. M
idler および R.K. Finn, 1966, Biotechnol. Bioeng.,
8, 71）。大多数の繊毛虫類は、これまで極めて低い細
胞密度で非常に小さい規模でしか増殖されていなかっ
た。かくして、コルポディド・ボトム・繊毛虫類（colp
odid bottom ciliates）の通例の培養法は、「溢流ペト
リ皿」（flooded petri dish）法であり、この方法では
２、３mlの培養液をペトリ皿で培養している（W. Foiss
ner, 1993, Protozoenfauna：〔原生動物相〕, 4巻，4
／1：Colpodia （有繊毛類），Gustav Fischer Ver
l.）。
【０００４】大量培養での繊毛虫類の培養法は望ましい
ものである。このようなシステムは、有用な生体物質の
供給源としてこれらの微生物の評価もしくは使用のため
の必須要件とみなされるべきである。通常の培養タンク
で生じるせん断力に対して多くの繊毛虫類は耐えること
ができない。比較的低いせん断力を生じるものの、培養
物の適切な混合をも保証するシステムは、所謂スピナー
フラスコ（spinner flask）である（図１）。図１
（ａ）は R. Ian Freshney による Culture of Animal
Cells (1983) (Alan R. Liss社）に記載されたものであ
り、図１（ｂ）はミクロキャリアー培養のための通常の
スピナーフラスコで T. Lidl & J. Bauer による Cell
and Tissue Culture(1987）（Gustav-Fischer社）に記
載されたものであり、図１（ｃ）はミクロキャリアー培
養のための新規に開発された培養フラスコで円形底部ト
ラフに球状マグネットを配することにより、通常のスピ
ナー容器よりも一層高い細胞収率が可能となる。このシ
ステムの典型的な例は、培養容器の下方に位置するマグ
ネチック・スタラーで駆動される磁気コアを備えたかき
まぜ機である。このかきまぜ機は、穏やかな、低せん断
応力の混合をもたらす。
ものである。このようなシステムは、有用な生体物質の
供給源としてこれらの微生物の評価もしくは使用のため
の必須要件とみなされるべきである。通常の培養タンク
で生じるせん断力に対して多くの繊毛虫類は耐えること
ができない。比較的低いせん断力を生じるものの、培養
物の適切な混合をも保証するシステムは、所謂スピナー
フラスコ（spinner flask）である（図１）。図１
（ａ）は R. Ian Freshney による Culture of Animal
Cells (1983) (Alan R. Liss社）に記載されたものであ
り、図１（ｂ）はミクロキャリアー培養のための通常の
スピナーフラスコで T. Lidl & J. Bauer による Cell
and Tissue Culture(1987）（Gustav-Fischer社）に記
載されたものであり、図１（ｃ）はミクロキャリアー培
養のための新規に開発された培養フラスコで円形底部ト
ラフに球状マグネットを配することにより、通常のスピ
ナー容器よりも一層高い細胞収率が可能となる。このシ
ステムの典型的な例は、培養容器の下方に位置するマグ
ネチック・スタラーで駆動される磁気コアを備えたかき
まぜ機である。このかきまぜ機は、穏やかな、低せん断
応力の混合をもたらす。
【０００５】この培養法はすでに何年も前に動物細胞の
培養（例えば、ハイブリドーマ細胞）の培養のために開
発されていたが（T. Lidl および J. Bauer, 1987, Zel
l-und Gewebekultur〔細胞および組織培養〕、Gustav-F
ischer Verl.）、この培養法を自由生活繊毛虫類に転用
することは行われていなかった。僅かに関連があるだけ
の真核生物例えばミドリムシ藻類（Euglenophyceae）の
ミドリムシ（Euglena）、緑藻類（Chlorophyceae）グル
ープのコナミドリムシ（Chlamydomonas）（Vogels等, 1
978, J. Phycol., 14, 403）およびアメーバ類（Amoebi
da）グループのエントアメーバ・ヒストリティカ（Enta
moeba histolytica）（Said-Fernandez等, 1992, Arch.
Med. Res., 23, 57）はすでにスピナーフラスコで培養
されている。
培養（例えば、ハイブリドーマ細胞）の培養のために開
発されていたが（T. Lidl および J. Bauer, 1987, Zel
l-und Gewebekultur〔細胞および組織培養〕、Gustav-F
ischer Verl.）、この培養法を自由生活繊毛虫類に転用
することは行われていなかった。僅かに関連があるだけ
の真核生物例えばミドリムシ藻類（Euglenophyceae）の
ミドリムシ（Euglena）、緑藻類（Chlorophyceae）グル
ープのコナミドリムシ（Chlamydomonas）（Vogels等, 1
978, J. Phycol., 14, 403）およびアメーバ類（Amoebi
da）グループのエントアメーバ・ヒストリティカ（Enta
moeba histolytica）（Said-Fernandez等, 1992, Arch.
Med. Res., 23, 57）はすでにスピナーフラスコで培養
されている。
【０００６】
【課題解決のための手段】意外にも、このタイプの細胞
培養が繊毛虫類に適用し得ることが明らかとなった。そ
れで、本発明は培地の撹拌を伴う繊毛虫類の培養法に関
するものであり、本発明の方法は、培養容器として、磁
気コアを備えた撹拌機を有する培養フラスコを使用する
ことを特徴とし、而して該撹拌機は撹拌機がフラスコ底
部に触れないように培養フラスコの上部中に懸垂されて
おり、この撹拌機は磁場によって駆動されることを特徴
とするもので、好適にはスピナーフラスコを使用するも
のである。
培養が繊毛虫類に適用し得ることが明らかとなった。そ
れで、本発明は培地の撹拌を伴う繊毛虫類の培養法に関
するものであり、本発明の方法は、培養容器として、磁
気コアを備えた撹拌機を有する培養フラスコを使用する
ことを特徴とし、而して該撹拌機は撹拌機がフラスコ底
部に触れないように培養フラスコの上部中に懸垂されて
おり、この撹拌機は磁場によって駆動されることを特徴
とするもので、好適にはスピナーフラスコを使用するも
のである。
【０００７】現在までのところ試験して成功したすべて
の種の繊毛虫類はこのようなスピナーフラスコで培養す
ることが可能である。殊に、コロポディア（Colopodi
a）〔例えば、コルポダ（Colpoda）、プラティオフリア
（Platyophrya）〕、ホロトリキア（Holotrichia）〔例
えば、テトラヒメナ（Tetrahymena）、パラメシウム（P
aramecium）、コルピジウム（Colpidium）〕、ペリスト
リキア（Peristrichia）〔例えば、フォルティセラ（Vo
rticella）〕、およびスピロトリキア（Spirotrichia）
〔例えば、ブレファリスマ（Blepharisma）、ステント
ル（Stentor）、ユープロテス（Euplotes）、スチロニ
キア（Stylonichia）〕の代表的な繊毛虫類がスピナー
フラスコ中で非常によく培養することができる〔K. Hau
smannによる分類法、Protozoologie〔原生動物学〕、Ge
org Thieme Verl.〕。この場合の増殖温度は１３〜３５
℃、好ましくは２０〜３０℃である。
の種の繊毛虫類はこのようなスピナーフラスコで培養す
ることが可能である。殊に、コロポディア（Colopodi
a）〔例えば、コルポダ（Colpoda）、プラティオフリア
（Platyophrya）〕、ホロトリキア（Holotrichia）〔例
えば、テトラヒメナ（Tetrahymena）、パラメシウム（P
aramecium）、コルピジウム（Colpidium）〕、ペリスト
リキア（Peristrichia）〔例えば、フォルティセラ（Vo
rticella）〕、およびスピロトリキア（Spirotrichia）
〔例えば、ブレファリスマ（Blepharisma）、ステント
ル（Stentor）、ユープロテス（Euplotes）、スチロニ
キア（Stylonichia）〕の代表的な繊毛虫類がスピナー
フラスコ中で非常によく培養することができる〔K. Hau
smannによる分類法、Protozoologie〔原生動物学〕、Ge
org Thieme Verl.〕。この場合の増殖温度は１３〜３５
℃、好ましくは２０〜３０℃である。
【０００８】繊毛虫類は、アゼナス培地（axenous medi
a）（無菌培地）（例えば、PPYS培地またはスキムミル
ク培地中でのテトラヒメナ）、モノゼナス培地（monoxe
nousmedia）〔例えば、飼料細菌として大腸菌もしくは
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluo
rescens）を存在させたブレハリスマ（Blepharisma）〕
またはポリゼナス（polyxenous）培地中で生育させるこ
とができる。培養は、バッチ培養、フェド・バッチ培養
（fed-batch fermentation）（基質の規則的な供給）ま
たは循環培地交換を伴う培養で実施することができる。
a）（無菌培地）（例えば、PPYS培地またはスキムミル
ク培地中でのテトラヒメナ）、モノゼナス培地（monoxe
nousmedia）〔例えば、飼料細菌として大腸菌もしくは
シュードモナス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluo
rescens）を存在させたブレハリスマ（Blepharisma）〕
またはポリゼナス（polyxenous）培地中で生育させるこ
とができる。培養は、バッチ培養、フェド・バッチ培養
（fed-batch fermentation）（基質の規則的な供給）ま
たは循環培地交換を伴う培養で実施することができる。
【０００９】スピナーフラスコ（図１）に加えて、培地
の気泡のない通気をするための膜通気スタラーを包含し
ている超スピナーフラスコ（superspinner flasks）
（図２）（出典：Fraune et. al., (cyclobatch cell c
ulture in Superspinner) 1955, Bio Tec, 2, 16）が繊
毛虫類の培養に適している。超スピナーフラスコは現在
までのところハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗
体を生産するのに使用されているだけである。撹拌方式
は、混合手段として、または回転方向の変化を伴う往復
混合手段として設計することができる。かきまぜ機速度
は１〜７０rpm、好ましくは１０〜４０rpmの範囲にある
(ここで、rpmは回毎分(revolutions per minute）であ
る）。
の気泡のない通気をするための膜通気スタラーを包含し
ている超スピナーフラスコ（superspinner flasks）
（図２）（出典：Fraune et. al., (cyclobatch cell c
ulture in Superspinner) 1955, Bio Tec, 2, 16）が繊
毛虫類の培養に適している。超スピナーフラスコは現在
までのところハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗
体を生産するのに使用されているだけである。撹拌方式
は、混合手段として、または回転方向の変化を伴う往復
混合手段として設計することができる。かきまぜ機速度
は１〜７０rpm、好ましくは１０〜４０rpmの範囲にある
(ここで、rpmは回毎分(revolutions per minute）であ
る）。
【００１０】
【実施例】(いずれの種もAmerican Culture Collectio
n, 米国, Maryland, Rockville あるいは Culture Coll
ection of Algae and Protozoa, 英国, Cumbria, Amble
sideより入手可能である。） 実施例１ ブレファリスマ・アメリカナム（Blepharisma american
um）を標準培地〔ボルヴィック（Volvic）水９部、レタ
ス培地１部、オートクレーブ処理した小麦穀粒２、３
粒〕１リットル中２リットル容量のTECNOMARAR 細胞ス
ピナー容器で２５℃で培養した。撹拌機速度は３０rpm
であった。１４日後、細胞は３６００細胞／mlの密度に
達した（図３）。細菌懸濁液（１０ml／５００ml：Amer
ican TypeCulture Collectionからの菌株１２６５８）
を繰り返して給飼（１回／週）することにより、５０,
０００細胞／mlの細胞密度が得られた。
n, 米国, Maryland, Rockville あるいは Culture Coll
ection of Algae and Protozoa, 英国, Cumbria, Amble
sideより入手可能である。） 実施例１ ブレファリスマ・アメリカナム（Blepharisma american
um）を標準培地〔ボルヴィック（Volvic）水９部、レタ
ス培地１部、オートクレーブ処理した小麦穀粒２、３
粒〕１リットル中２リットル容量のTECNOMARAR 細胞ス
ピナー容器で２５℃で培養した。撹拌機速度は３０rpm
であった。１４日後、細胞は３６００細胞／mlの密度に
達した（図３）。細菌懸濁液（１０ml／５００ml：Amer
ican TypeCulture Collectionからの菌株１２６５８）
を繰り返して給飼（１回／週）することにより、５０,
０００細胞／mlの細胞密度が得られた。
【００１１】実施例２ コルポダ・ククルス（Colpoda cucullus）を標準培地
〔ボルヴィック水９部、レタス培地１部、オートクレー
ブ処理した小麦穀粒２、３粒〕５００ml中１リットル容
量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器で２５℃で培養し
た。オートクレーブ処理した細菌懸濁液（American Typ
e Culture Collectionからの菌株１２６５８）１０mlを
追加して給飼した。撹拌機速度は３０rpmであった。接
種密度は１００細胞／mlであった。１０,０００細胞／m
lの細胞密度が２８０時間後に測定された。
〔ボルヴィック水９部、レタス培地１部、オートクレー
ブ処理した小麦穀粒２、３粒〕５００ml中１リットル容
量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器で２５℃で培養し
た。オートクレーブ処理した細菌懸濁液（American Typ
e Culture Collectionからの菌株１２６５８）１０mlを
追加して給飼した。撹拌機速度は３０rpmであった。接
種密度は１００細胞／mlであった。１０,０００細胞／m
lの細胞密度が２８０時間後に測定された。
【００１２】実施例３ コルポダ・ステイニイ（Colpoda steinii）をＳ／Ｗ培
地（CCPA カタログ, 1988年, Titus Wilson & Son Lt
d., Kendal）５００ml中１リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。撹拌機速度は３
０rpmであった。接種密度は５０,０００細胞／mlであっ
た。１０7細胞／mlの細胞密度が４８時間後に測定され
た。
地（CCPA カタログ, 1988年, Titus Wilson & Son Lt
d., Kendal）５００ml中１リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。撹拌機速度は３
０rpmであった。接種密度は５０,０００細胞／mlであっ
た。１０7細胞／mlの細胞密度が４８時間後に測定され
た。
【００１３】実施例４ プラチオフリア・マクロストマ（Platyophrya macrosto
ma）を、オートクレーブ処理した１０％濃度の酵母懸濁
液１０mlを加えた培地（ボルヴィック水９部、レタス培
地１部）７００ml中で、２リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。撹拌機速度は３
０rpmであった。１５０時間後に、細胞は７０,０００細
胞／mlの濃度に達した。接種密度は１０4細胞／mlであ
った。
ma）を、オートクレーブ処理した１０％濃度の酵母懸濁
液１０mlを加えた培地（ボルヴィック水９部、レタス培
地１部）７００ml中で、２リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。撹拌機速度は３
０rpmであった。１５０時間後に、細胞は７０,０００細
胞／mlの濃度に達した。接種密度は１０4細胞／mlであ
った。
【００１４】実施例５ テトラヒメナ・テルモフィラ（Tetrahymena thermophil
a）をスキムミルク培地〔２％のスキムミルク粉末、０.
５％の酵母エキス、０.１％のグルコース、０.００３％
のセクェストレン（Sequestrene)〕５００ml中で１リッ
トル容量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器中２５℃で培
養した。回転方向の変化を伴う往復混合手段（３０rp
m）によって、混合を行った。２４時間後に、細胞は２
×１０6細胞／mlの細胞密度を達成した(図４）。接種密
度は３×１０4細胞／mlであった。
a）をスキムミルク培地〔２％のスキムミルク粉末、０.
５％の酵母エキス、０.１％のグルコース、０.００３％
のセクェストレン（Sequestrene)〕５００ml中で１リッ
トル容量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器中２５℃で培
養した。回転方向の変化を伴う往復混合手段（３０rp
m）によって、混合を行った。２４時間後に、細胞は２
×１０6細胞／mlの細胞密度を達成した(図４）。接種密
度は３×１０4細胞／mlであった。
【００１５】実施例６ テトラヒメナ・セトサ（Tetrahymena setosa）をスキム
ミルク培地〔２％のファルマメディア（Pharmamedi
a）、０.５％の酵母エキス、０.１％のグルコース、０.
００３％のセクェストレン〕５００ml中で１リットル容
量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器中２５℃で培養し
た。回転方向の変化を伴う往復混合手段（３０rpm）に
よって、混合を行った。２４時間後に、細胞は３×１０
6細胞／mlの細胞密度に到達した。接種密度は３×１０4
細胞／mlであった。
ミルク培地〔２％のファルマメディア（Pharmamedi
a）、０.５％の酵母エキス、０.１％のグルコース、０.
００３％のセクェストレン〕５００ml中で１リットル容
量のTECNOMARAR 細胞スピナー容器中２５℃で培養し
た。回転方向の変化を伴う往復混合手段（３０rpm）に
よって、混合を行った。２４時間後に、細胞は３×１０
6細胞／mlの細胞密度に到達した。接種密度は３×１０4
細胞／mlであった。
【００１６】実施例７ コルピジウム・カムピラム（Colpidium campylum）をス
キムミルク培地（２％のスキムミルク粉末、０.５％の
酵母エキス、０.１％のグルコース、０.００３％のセク
ェストレン）５００ml中で１リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。回転方向の変
化を伴う往復混合手段（３０rpm）によって、混合を行
った。７２時間後に、細胞は１.２×１０6細胞／mlの細
胞密度に到達した。接種密度は２.２×１０4細胞／mlで
あった。
キムミルク培地（２％のスキムミルク粉末、０.５％の
酵母エキス、０.１％のグルコース、０.００３％のセク
ェストレン）５００ml中で１リットル容量のTECNOMARAR
細胞スピナー容器中２５℃で培養した。回転方向の変
化を伴う往復混合手段（３０rpm）によって、混合を行
った。７２時間後に、細胞は１.２×１０6細胞／mlの細
胞密度に到達した。接種密度は２.２×１０4細胞／mlで
あった。
【図１】（ａ）〜（ｃ）は、繊毛虫類の培養に適したス
ピナーフラスコの例を示す略図である。
ピナーフラスコの例を示す略図である。
【図２】繊毛虫類の培養に適した超スピナーフラスコの
一例を示す略図である。
一例を示す略図である。
【図３】スピナーフラスコでのブレファリスマ・アメリ
カナムの増殖を示すグラフである。
カナムの増殖を示すグラフである。
【図４】スピナーフラスコでのテトラヒメナ・テルモフ
ィラの増殖を示すグラフである。
ィラの増殖を示すグラフである。
１ 培養フラスコ ２ 膜モジュールを有するスタラー ３ 管状オリーブを有するステンレス鋼ヘッド ４ ステンレス鋼ヘッドに対するねじぶた ５ サンプル取出用立上り管 ６ フィルターおよびバイパス用Ｔ−ピースを有する
ガス供給用接続管 ７ ビン洗浄用管状接続管 ８ ヘッド空間換気用無菌フィルターを有する接続管 ９ 培養フラスコのあき側口 １０ フラスコ−ヘッド間のシール
ガス供給用接続管 ７ ビン洗浄用管状接続管 ８ ヘッド空間換気用無菌フィルターを有する接続管 ９ 培養フラスコのあき側口 １０ フラスコ−ヘッド間のシール
Claims (12)
- 【請求項１】 培地を撹拌しながら繊毛虫類を培養する
方法において、培養容器として、磁気コアを備えたかき
まぜ機を有する培養フラスコを使用し、而してこのかき
まぜ機はかきまぜ機がフラスコ底部に触れないように培
養フラスコの上部中に懸垂されており、このかきまぜ機
は磁場によって駆動されることを特徴とする上記培養方
法。 - 【請求項２】 前記かきまぜ機が膜通気かきまぜ機とし
て設計されている請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 培養がフェド・バッチ培養で実施される
請求項１および２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４】 培養が循環培地交換で実施される請求項
１および２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 撹拌速度が１〜７０rpmである請求項１
〜４のいずれかに記載の方法。 - 【請求項６】 撹拌速度が１０〜４０rpmである請求項
５記載の方法。 - 【請求項７】 撹拌方式が往復混合法として設計されて
いる請求項１〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 撹拌方式が、回転方向の変化を伴う往復
混合法として設計されている請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 繊毛虫類がコルポディア（Colpodia）グ
ループに属する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 繊毛虫類がホロトリキア（Holotrichi
a）グループに属する請求項１〜８のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１１】 繊毛虫類がペリトリキア（Peritrichi
a）グループに属する請求項１〜８のいずれかに記載の
方法。 - 【請求項１２】 繊毛虫類がスピロトリキア（Spirotri
chia）グループに属する請求項１〜８のいずれかに記載
の方法。
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