JP2000224997A - 原生動物Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ属からのγ―リノレン酸の獲得 - Google Patents

原生動物Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ属からのγ―リノレン酸の獲得

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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】α−リノレン酸（全シス６，９，１２−オクタ
デカトリエン酸；１８：３ｎ−６；（ＧＬＡ））の製造
方法及び使用方法の提供。 【解決手段】Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ（ナガマメガタミズケ
ムシ）からのγ−リノレン酸（ＧＬＡ）の製造方法及び
その食品、化粧品及び医薬品における使用に関する。Ｃ
ｏｌｐｉｄｉｕｍは、最適培地においてＧＬＡが高い絶
対収量になるまで発酵により培養することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ（ナガマメ
ガタミズケムシ）属の原生動物から高級不飽和脂肪酸、
好ましくは生理学的に重要なγ−リノレン酸（全シス
６，９，１２−オクタデカトリエン酸；１８：３ ｎ−
６；以下、「ＧＬＡ」）を製造する方法、及びその使用
に関する。
【０００２】脂肪酸、特に栄養生理学に関して重要（必
須）である脂肪酸、好ましくは多価不飽和脂肪酸の獲得
及び単離に対する産業界の関心は高い。特に、ＧＬＡを
安く産生し得る新規な生物源（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓｏｕｒｃｅｓ）を開発及び選択することは特別な関心
に値する。ＧＬＡは、資源によるが、主に植物油から得
られている。
【０００３】特に、高級不飽和脂肪酸（いわゆる「ＰＵ
ＦＡ」：多価不飽和脂肪酸（ｐｏｌｙ−ｕｎｓａｔｕｒ
ａｔｅｄ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ））は、それが
（１．）食品添加物（ベビーフード等多数の食品、ＷＯ
９１／１１９１８を参照のこと）として、（２．）多く
の適応症における医薬活性化合物として、及び（３．）
化粧品の構成成分として明確な効果を有するので、経済
的に重要である。
【０００４】ヒト及び動物の代謝において、デルタ−６
−デサチュラーゼ（ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）は、リノー
ル酸（１８：２ ｎ−６）からγ−リノレン酸を合成す
るための必須酵素である。他のすべてのω−６ ＰＵＦ
Ａ及び数種のエイコサノイドホルモン（ｅｉｃｏｓａｎ
ｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ）がＧＬＡから誘導される。
例えば、加齢、栄養不良又はアルコール中毒症によって
デルタ−６−デサチュラーゼの活性が過度に低下する
と、ＧＬＡ及びその二次産物の供給不足が起こり、その
結果多くの障害が引き起こされ得る。
【０００５】故にＧＬＡは、ヒト及び動物の炎症及び免
疫疾患（Ｗｕ，Ｄ．，Ｍｅｙｄａｎｉ，Ｓ．Ｎ．，１９
９６；「γ−リノレン酸、代謝及び栄養と医学における
その役割（ＨｕａｎｇとＭｉｌｌｓ編）」、１９９６
ＡＯＣＳ，１０６〜１１７）、心臓血管系障害（Ｄｅｆ
ｅｒｎｅ，Ｊ．Ｌ．＆ Ｌｅｅｄｓ，１９９２；Ｊ．Ｈ
ｕｍ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ，６，１１３〜１１
９）、特に高血圧、糖尿病（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，Ｄ．
Ｆ．，１９８８；Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３
１，１６３〜１９４）及びある種の癌（Ｄａｓ，Ｕ．
Ｎ，１９９６；「γ−リノレン酸、代謝及び栄養と医学
におけるその役割（ＨｕａｎｇとＭｉｌｌｓ編）」、１
９９６ＡＯＣＳ，１０６〜１１７）の治療に使用されて
いる。ＧＬＡの使用はまた、慢性、退行性の疾患、特に
慢性関節リウマチの予防及び治療に対しても知られてい
る。
【０００６】哺乳動物は、ＧＬＡをジホモ−ＧＬＡ（２
０：３ ｎ−６；ＤＧＬＡ）へ転換してＤＧＬＡを母乳
に濃縮する。ヒトの母乳では、ＧＬＡ含量は０．３５〜
１．０％の範囲である（Ｇｉｂｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，Ｋｎ
ｅｅｂｏｎｅ，１９８１；Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔ
ｒ．，３４，２５２〜２５７）。故にＧＬＡは食品産
業、特に幼児栄養において使用されている。
【０００７】ネーティブなＧＬＡ資源の供給は、以下の
ような高等植物及び多くの微生物において特に起こる
（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｕａｎｇ，Ｙ．−
Ｓ．，１９９６；「γ−リノレン酸、代謝及び栄養と医
学におけるその役割（ＨｕａｎｇとＭｉｌｌｓ編）」、
１９９６ ＡＯＣＳ，１０６〜１１７）：アカバナ（Ｏｎａｇｒａｃｅａｅ） 科：マツヨイグサ
（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａ ｂｉｅｎｎｉｓ）の種子は、油
を２４％まで含有する（Ｗｈｉｐｋｅｙ，Ａ．，Ｓｉｍ
ｏｎ，Ｊ．Ｅ．Ｊａｎｉｃｋ，Ｊ．，１９８８；Ｊ．Ａ
ｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６５，９７９〜９８
４）；これは７〜１４％のＧＬＡを含有する（Ｗｏｌ
ｆ，Ｒ．Ｂ．，Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｒ．，Ｅｎｇｌａｎ
ｄ，Ｒ．Ｅ．，１９８３，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．６０，１８５８〜１８６０）。マツヨイグ
サの油は、臨床及び医薬応用に最も頻繁に使用されるＧ
ＬＡ源である（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ，Ｄ．Ｆ．，１９９
２；Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．３１，１６３〜１
９４）。ムラサキ（Ｂｏｒａｇｉｎａｃｅａｅ） 科：Ｂｏｒａｇ
ｏ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（ルリヂサ）及びＳｙｍｐ
ｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ（ヒレハリソウ）の
種子油は、２０〜２７％の割合のＧＬＡを含有する（Ｋ
ｌｅｉｍｅｎ，Ｒ．，Ｅａｒｌｅ，Ｆ．Ｒ．，Ｗｏｌｆ
ｆ，Ｉ．Ａ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｑ．１９６４；Ｊ．Ａｍ．
Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．４１，２０９〜１１）。し
かしながら、ルリヂサ油（ｂｏｒａｇｅ ｏｉｌ）は、
より多量の長鎖モノ不飽和脂肪酸を有し、有毒な不飽和
ピロリジジンアルカロイドを含有する。ユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａｃｅａｅ） 科：クロス
グリ（Ｒｉｂｅｓ ｎｉｇｒｕｍ）の種子は、ＧＬＡを
１９％まで含有する（Ｔｒａｉｔｌｅｒ，Ｈ．，Ｗｉｌ
ｌｅ，Ｈ．Ｊ．，Ｓｔｕｄｅｒ，Ａ．，１９８８；Ｊ．
Ａｍ．Ｏｉｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．６５，７５５〜７６
０）。
【０００８】微生物の発酵に由来するＧＬＡ含有油は以
下のようなものが知られている：次の各属の真菌 − モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）（Ｍ．
ｒａｍａｎｎｉａｎａ，抽出油のＧＬＡ含量は約２５
％）（Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｄｏｓｔａｌｅｋ，Ｍ．，
１９８８；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌ．：２８，２４０〜６）。 − ムコール（Ｍｕｃｏｒ）（Ｍ．ｒｏｕｘｉｉ及び
Ｍ．ａｌｐｉｎａ，抽出油のＧＬＡ含量は約１７％）
（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｎｓｓｏｎ，
Ｌ．，１９９１；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉ
ｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２６〜８；Ｓｈｉｍｉｔｚ
ｕ，Ｓ．，Ｓｈｉｎｍｅｎ，Ｙ．，Ｋａｗａｓｈｉｍ
ａ，Ｈ．，Ａｋｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｙａｍａｄａ，
Ｈ．，１９８８；Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ＩＳ
Ｆ−ＪＯＣＳ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ １９８
８，１０００〜６）。 − 藻菌類（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）（Ｐ．ｂｌａ
ｋｅｓｌｅｅａｎｕｓ，抽出油のＧＬＡ含量は約１６
％）（Ｓｈａｗ，Ｒ．，１９６５；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９８，２３０〜７）。 − リゾ−プス・アリズス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ａｒｒ
ｈｉｚｕｓ）（Ｋｒｉｓｔｏｆｉｋｏｖａ，Ｌ．，Ｒｏ
ｓｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｖｌｎｏｖａ，Ａ．，Ｓａｊｂ
ｉｄｏｒ，Ｊ．，Ｃｅｒｔｉｋ，Ｍ．，１９９１；Ｆｏ
ｌｉａ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，４５１〜５）。
次の属の「藻類」 − スピルリナ（Ｓ．ｐｌａｔｅｎｓｉｓ，抽出油のＧ
ＬＡ含量は１２〜２６％）（Ｍａｈａｊａｎ Ｇ．，Ｋ
ａｍａｔ，Ｍ．，１９９５；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４３，４６６〜９；Ｎ
ｉｃｈｏｌｓ，Ｂ．Ｗ．，Ｗｏｏｄ，Ｂ．Ｊ．Ｂ．，１
９６８；Ｌｉｐｉｄｓ，３，４６〜５０）、及び次の属
の原生動物 − テトラヒメナ・ロストラータ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅ
ｎａ ｒｏｓｔｒａｔａ）：抽出油のＧＬＡ含量は約２
１％（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｙ．，Ｌｏｇｎａｙ，Ｇ．，
Ｔｈｏｎａｒｔ，Ｐ．，１９８９；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．，１１（６），４２３〜６による）、テ
トラヒメナ・サーモフィラ（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ
ｔｈｅｒｍｏｐｈ ｉｌａ）：抽出油のＧＬＡ含量は約３３％（Ｋｉｙ，
Ｔ．，１９９３；学位論文による）。
【０００９】他の上記生物体に比較すると、原生動物
は、高級不飽和脂肪酸の獲得源としてあまり記載されて
いないし、ＧＬＡの工業上の獲得源としてほとんど全く
開発されていない。
【００１０】他の既知の生物源に比較したその利点は以
下にある： （１．）それぞれ特徴的な脂肪酸スペクトルを有し、油
の顕著な主要成分となるものもあるという多様性； （２．）バイオリアクター発酵での培養可能性； （３．）発酵の間正確に制御され得る、つまり環境上の
諸影響から独立した培養； （４．）発酵後の規定された処理プロセス； （５．）世代時間が植物及び真菌より著しく短ければ、
より高い空間−時間収量（ｓｐａｃｅ−ｔｉｍｅ ｙｉ
ｅｌｄｓ）が得られる。
【００１１】細菌、シアノバクテリア、藻類、真菌及び
植物又は動物起源の多細胞組織由来の細胞培養の発酵に
ついては先行技術に記載されているが、例えば発酵にお
けるその濃縮、処理及び精製は原生動物へ転用すること
はできない。
【００１２】原生動物の発酵条件（Ｋｉｙ，Ｐｒｏｔｉ
ｓｔ，１４９，１９９８）は、ごく最近開発された。従
って、テトラヒメナ種の発酵が記載されているが、それ
は原生動物内の他の関連種へ転用することはできない。
さらに、欠点は、多くの不飽和脂肪酸を有する広い脂肪
酸スペクトルであり、当該脂肪酸を分離することが技術
的に複雑であること（図１参照）、及びＧＬＡの獲得を
特定しないことである。Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ ｃａｕ
ｄａｔｕｍ （ゾウリムシ）及びＣｏｌｐｏｄａ ｓｔ
ｅｉｎｉ（Ｄｅｍｂｉｔｓｋｉｉ，Ｖ．Ｍ．，Ｚｈａｒ
ｉｋｏｖａ，Ｎ．Ｉ．Ｉｎｓｔ．Ｚｏｏｌ．Ｔｏｌｙａ
ｔｔｉ，ＵＳＳＲ．Ｋｈｉｍ．Ｐｒｉｒ．Ｓｏｅｄｉ
ｎ．（１９９８）２，２９４〜５）のような他の原生動
物では、ごく微量のＧＬＡしか検出できなかった。
【００１３】所望される工業生産の場合、選択される生
物源の不純物は、得られるＧＬＡ含有バイオマスの品質
に悪影響を及ぼす。このことは上記の予防及び医学的作
用に対する不利な効果をもたらし得るし、それ故複雑な
増菌（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）及び精製を必要とする。
さらに、獲得されるべきＧＬＡが食品及び薬剤として利
用され得るならば、病原性でない、特にヒトの病原体で
はない生物源がそのために必要とされる。
【００１４】さらに、工業利用を可能にする精製ととも
に、経済的で廉価な生産を確立することが必要である。
【００１５】故に本発明の目的は、原生動物からＧＬＡ
を可能な限り純粋で豊富な形態で製造するための方法で
ある。
【００１６】この目的は、驚くべきことに、Ｃｏｌｐｉ
ｄｉｕｍ（ナガマメガタニズケムシ）属の原生動物、特
に好ましくはＣｏｌｐｉｄｉｕｍ ｃａｍｐｙｌｕｍ種
の原生動物を特定して選択することによって達成され
る。Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍは、脂肪酸スペクトルにおいて
高いＧＬＡ含量を有する（図３参照）。ＧＬＡ分画は、
ＧＬＡに性質が似ている（ＡＬＡのような）他の脂肪酸
形態の混入がなく、その結果、ＧＬＡの精製は直に促進
され、ＧＬＡは純粋な形態でこのバイオマスから安く入
手される。この不飽和脂肪酸の工業生産がクロマトグラ
フィー処理の助けを借りて実施されているとすれば、こ
のことは特に注目される。
【００１７】本発明の意味では原生動物は以下のように
体系化される（ＣａｖａｌｉｅｒＳｍｉｔｈ，Ｔ．（１
９９５），Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅｓ ｄｉｐｌｏｋａｒ
ｙｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｒｃｈｅｚｏａｎ ｏ
ｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓｅｘ；ａｒｃｈ．Ｐｒｏｔｉｓｔ
ｅｎｋ．，１４５（３−４）１８９〜２０７）：「原生
動物界」は以下の科を有する： １．パーコロゾア（Ｐｅｒｃｏｌｏｚｏａ） ２．パラバサリア（Ｐａｒａｂａｓａｌｉａ） ３．ユーグレノゾア（Ｅｕｇｌｅｎｏｚｏａ） ４．動菌類（Ｍｙｃｅｔｏｚｏａ） ５．エンタメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ） ６．オパロゾア（Ｏｐａｌｏｚｏａ） ７．ジノゾア（Ｄｉｎｏｚｏａ） ８．アピコンプレキサ（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ） ９．シリオホーラ（Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ） １０．ハプロスポリジア（Ｈａｐｌｏｓｐｏｒｉｄｉ
ａ） １１．パラミクシア（Ｐａｒａｍｙｘｉａ） １２．リゾポーダ（Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ） １３．レチクローサ（Ｒｅｔｉｃｕｌｏｓａ） １４．太陽虫類（Ｈｅｌｉｏｚｏａ） １５．ラジオゾア（Ｒａｄｉｏｚｏａ） １６．アメボゾア（Ａｍｏｅｂｏｚｏａ） １７．コアノゾア（Ｃｈｏａｎｏｚｏａ） 原生動物の中では、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ属、特にＣｏｌ
ｐｉｄｉｕｍ ｃａｍｐｙｌｕｍがシリオホーラ（「繊
毛虫類（ｃｉｌｉａｔｅｓ）」ともいう）由来の発明に
よれば、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍがヒトの病原体ではないた
めに好ましい。故に本発明はＧＬＡを獲得及び単離する
ための生物源としてのＣｏｌｐｉｄｉｕｍ属の使用に関
する。
【００１８】特に、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ属は、原生動物
の割には有利にも、５０μｍという大きな細胞径を有し
（テトラヒメナは約２５μｍ）、製造用のバイオマス生
産、特に培養及び発酵において特により高い空間−時間
収量のために利用され得る。さらに、発酵の最適条件
は、好ましくは１９〜２８℃、特に好ましくは２２〜２
５℃に存する（テトラヒメナでは約３０℃（Ｋｉｙ，Ｔ
ｉｅｄｔｋｅ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ，３７（１９９２））。
【００１９】Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍは、ＧＬＡ生産生物と
して確認されているテトラヒメナ属から系統発生的に著
しく離れている（図２）。
【００２０】原生動物Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ ｃａｍｐｙ
ｌｕｍの最初の培養はＲｏｇｅｒｓｏｎとＢｅｒｇｅｒ
によって実施され（Ｒｏｇｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｂｅｒｇ
ｅｒ，Ｊ．，１９８１；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ．，１２４，５３〜９；Ｒｏｇｅｒｓｏｎ，Ａ．，Ｂ
ｅｒｇｅｒ，Ｊ．，１９８３；Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐ
ｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２９，４１〜５０）、細
菌含有（単一純粋培養）培地において最大細胞密度３ｘ
１０3細胞／ｍｌ及び８〜１４時間の世代時間を生じて
いる。
【００２１】本発明の意味では、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍの
バイオマスからの新規なＧＬＡ生産及び単離又はＧＬＡ
製造は、直接的に実施され得るか又はバイオマス、特に
脂質分画から得られる油を介して得られ、これによりＧ
ＬＡを純粋な形態（以下の本発明によるＧＬＡ）で獲得
することが可能になる。ＧＬＡは、直接的に、又は酸触
媒作用若しくはエステル分解を伴う加水分解の手段によ
って（特に、糖脂質又はリン脂質のような）脂質から得
られる。
【００２２】故に本発明はまたバイオマス及び／又は油
そのものを含有する脂質に関する。バイオマスは、一方
ではＣｏｌｐｉｄｉｕｍ属の原生動物そのものの前駆体
を意味するものとして、及び本発明により発酵されて培
養される（実施例参照）、処置されたＣｏｌｐｉｄｉｕ
ｍ属の原生動物を意味するものとして解釈される。バイ
オマスも油、特に脂質分画、及びそれから精製されるＧ
ＬＡも、食品、医薬品又は化粧品の原材料及び添加物又
は補助剤として純粋な形態で使用することができる。
【００２３】故に本発明はまた、上記バイオマス及び／
又は油からの本発明によるＧＬＡを純粋な形態で、及び
適切ならば、製剤学的に許容される添加物及び／又は補
助剤とともに含む医薬品に関する。
【００２４】さらに本発明は、本発明によるＧＬＡを製
剤学的に許容される添加物及び／又は補助剤とともに製
剤化することを含む、ヒト及び動物の心臓血管系障害、
糖尿病、癌及び関節炎を治療するための医薬品の生産方
法に関する。さらに本発明は、本発明によるＧＬＡを、
好ましくは幼児栄養のためにごく純粋な形態で含む、動
物及びヒトの栄養における食品添加物に関する。
【００２５】本発明はまた本発明によるＧＬＡを含む化
粧品基剤及び／又は添加物に関する。
【００２６】超臨界流体反応（ＳＦＲ）法は、ごく純粋
な形態をした油及び／又はＧＬＡを獲得するための好ま
しい方法として特に適している。特定の実施形態では、
ＧＬＡの製造は、本明細書で明白に引用されるドイツ特
許出願１９８３２７８４．６に記載されている通りのＳ
ＦＲ／ＳＦＥ（超臨界流体抽出）複合技術の手段により
実施される。しかしながら、原則としては、当業者に知
られている他のクロマトグラフィー法もまた排除されな
い。
【００２７】本発明はさらに、ビタミン（例、酵母抽出
物）及び炭水化物源（実施例参照）及び更なる補助剤及
び添加物に加えて、１〜５％までの、特に好ましくは
０．５〜２．５％及びごく特別に好ましくは２％の脱脂
粉乳を含有する、複合（即ち、成分が欠落していない）
かつ無菌の（即ち、栄養性の微生物を含まない）培地に
おいて、本発明によるＧＬＡを生産及び単離するため
に、Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍを発酵培養することに関する。
【００２８】以下の実施例は、本発明をより詳しく説明
することに役立つが、本発明はこの実施例に記載される
生成物及び実施形態によって制限されない。 実施例： ａ．）培養： 脱脂乳培地： ２％（ｗ／ｖ） 脱脂粉乳（Ｏｘｏｉｄ，Ｕｎｉｐａｔ
ｈ，Ｗｅｓｅｌ） ０．５％（ｗ／ｖ） 酵母抽出物（ディフコ、デトロイ
ト、アメリカ） １％（ｗ／ｖ） グルコース（別にオートクレーブ処
理） ０．１％（ｖ／ｖ） 鉄微量溶液／水（再蒸留）。 鉄微量溶液： ３４ｍＭ クエン酸三ナトリウム ９０ｍＭ ＦｅＣｌ3／水（再蒸留）。 長期培養： オートクレーブ処理した再蒸留水１２ｍｌ及びヒヨコマ
メ（ｃｈｉｃｋ−ｐｅａ）を含む試験管において、２５
℃、暗所で培養し、この培養液の２００μｌを３ヶ月ご
とに新しい管へ移す。 前培養： １００ｍｌエーレンマイヤー・フラスコにおいてＭＭ１
０ｍｌを２５℃、暗所で振盪（６０ｒｐｍ、Ｉｎｆｏｒ
ｓ振盪斜面、Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ）する；３．５日後
（後期対数増殖期）、この培養液２００μｌで新たに接
種することが可能になる。 振盪培養：５００ｍｌエーレンマイヤー・フラスコにお
いてＭＭ１００ｍｌを２５℃、暗所で振盪（１００ｒｐ
ｍ、Ｉｎｆｏｒｓ ＨＴ，Ｉｎｆｏｒｓ，Ｂｏｔｔｍｉ
ｎｇｅｎ）する；３．５日後、後期対数増殖期に達す
る。 ｂ．）発酵：Ｂｉｏｓｔａｔ Ｑ バイオリアクターシ
ステム（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒ
ｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）を使用するＣ
ｏｌｐｉｄｉｕｍの発酵を以下の条件で実施する： ・ｐＨ：７．０で一定 ・温度：２２〜３１℃で一定 ・ｐ（Ｏ2）＞２０％空気飽和 ・磁気スターラーの回転速度：０．３３リットルの用量
につき１００ｒｐｍ、又はｐ（Ｏ2）に依存して、０．
６６リットルの用量につき最大２８０ｒｐｍ（ディスク
撹拌機又はプロペラスターラー）。
【００２９】発酵槽のインサイチュー（ｉｎ ｓｉｔ
ｕ）滅菌化、及びグルコース溶液を追加した後で、後期
対数増殖期の振盪培養物由来の初期細胞密度１ｘ１０5
細胞／ｍｌを用いて接種を実施する。
【００３０】発酵の間に泡沫を形成する場合、最大０．
０３％までのシリコーン油が加えられる。 ｃ．）分析方法：進行中の発酵物から定期的にアリコー
トを分取し、トルエン／エタノールで抽出し、抽出物を
ジクロロメタン／メタノールに溶かす。このサンプルを
トリメチルスルホニウムヒドロキシド（ＴＭＳＨ）（Ｔ
ＭＳＨ５０〜１００μｌ／油２ｍｇ）でエステル交換反
応させる。好ましくは、凍結乾燥生物物質（ＤＢＭ）の
直接的に的なエステル交換反応が実施される。
【００３１】得られる脂肪酸メチルエステルは、ＨＰ６
８９０ガスクロマトグラフ・シリーズ、水素炎イオン化
検出器（ＨＰ ＦＩＤ）及び化学結合したＰＥＧ−２ニ
トロフタル酸エステルを含有する極性毛細管カラム（Ｐ
ｅｒｍａｂｏｎｄ ＦＦＡＰ、長さ２５ｍｍ、直径２５
０μｍ、フィルム厚０．１μｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎ
ａｇｅｌ ＧｍｂＨ デューレン、ドイツ）の付いたＨ
Ｐ Ｇ１５１２Ａ自動液体試料採取器を使用するガスク
ロマトグラフィーによって分析される。脂肪酸の同定及
び定量は、既知の脂肪酸メチルエステルに関して得られ
ている保持時間の比較、特にＨＰ・ケム（Ｃｈｅｍ）ス
テーション（ヒューレット−パッカード社、ウィルミン
トン、アメリカ）によるコンピュータ支援の比較によっ
て実施される。
【００３２】工業的に実施されている植物油からのＧＬ
Ａの獲得に比較して、繊毛虫類を使用するＧＬＡ生産
は、短い世代時間及びより高いＧＬＡの絶対含量のため
に有意に高い空間−時間収量を基本的に有する。
【００３３】Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ ｃａｍｐｙｌｕｍか
ら得られるＧＬＡ３００ｍｇ／培養液１リットルという
収量を、微生物からＧＬＡを生産する確立した方法と比
較すると、ＧＬＡ生産生物としてのこの高い潜在可能性
が確かめられる。微小藻類Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐｌａ
ｔｅｎｓｉｓの振盪培養からは、培養液１リットルにつ
きＧＬＡ３８ｍｇを得るのがやっとであるとかつて報告
され（ＭａｈａｊａｎＧ．，Ｋａｍａｔ，Ｍ．，１９９
５；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌ．，４３，４６６〜９）、真菌Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕ
ｘｉｉ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，Ａ．Ｍ．，Ｈａｎｓｓｏ
ｎ，Ｌ．，１９９１；Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３６，２６〜８）及びＲｈｉ
ｚｏｐｕｓ ａｒｒｈｉｚｕｓ（リゾープス アリズ
ス）（Ｋｒｉｓｔｏｆｉｋｏｖａ，Ｌ．，Ｒｏｓｅｎｂ
ｅｒｇ，Ｍ．，Ｖｌｎｏｖａ，Ａ．，Ｓａｊｂｉｄｏ
ｒ，Ｊ．，Ｃｅｒｔｉｋ，Ｍ．，１９９１；Ｆｏｌｉａ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６，４５１〜５）は、培養
液１リットルあたりそれぞれＧＬＡ３３０ｍｇ及び４０
０ｍｇまでの収量を達成した。繊毛虫Ｔｅｔｒａｈｙｍ
ｅｎａ ｒｏｓｔｒａｔａ（テトラヒメナ ロストラー
タ）（Ｇｏｓｓｅｌｉｎ，Ｙ．，Ｌｏｇｎａｙ，Ｇ．，
Ｔｈｏｎａｒｔ，Ｐ．，１９８９；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌ．Ｌｅｔｔ．，１１（６），４２３〜６）は培養液１
リットルにつきＧＬＡ５００ｍｇの最大収量をもたら
し、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ
（テトラヒメナ サーモフィラ）（Ｋｉｙ，Ｔ．，１９
９３；ミュンスター大学の学位論文）の脱脂乳培地での
大量培養（ｍａｓｓ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ）では培養液
１リットルにつきＧＬＡ１．１ｇを達成した。しかしな
がら、後者の微生物由来の脂質組成はＣｏｌｐｉｄｉｕ
ｍ由来の脂質組成より複雑なので、その結果、テトラヒ
メナからＧＬＡを製造して獲得することは複雑なのであ
る。図面の説明 図１は、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉ
ｌａ（テトラヒメナサーモフィラ）の脂肪酸スペクト
ル、つまり「分析方法」の節に記載した方法によって得
られたテトラヒメナ・サーモフィラの脂肪酸スペクトル
のガスクロマトグラフを示す図である。ＧＬＡは１８．
２分後に溶出する。これは全脂肪酸含量の１６．３％
（ｗ／ｗ）の比率を有する。
【００３４】図２は、Ｃｏｙｎｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｙａｏ，
Ｍ．−Ｃ．，１９９６；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４４：１
４７７９〜８７による様々な繊毛虫種の系統発生図を示
す図である。
【００３５】図３は、Ｃ．ｃａｍｐｙｌｕｍの２２℃〜
３１℃での発酵を示す図である。それぞれの接種量は５
ｘ１０4細胞／ｍｌ。最短世代時間は、最大細胞密度
１．４ｘ１０6ｍｌ-1、２５℃（２０．８時間）で得ら
れる。一方、２２℃では、４５．４時間の世代時間で
１．５ｘ１０6ｍｌ-1の細胞密度が得られる。
【００３６】図４は、２５℃、８５時間発酵後のガスク
ロマトグラムを示す図である（図３に対応する）。ＧＬ
Ａ含量は全脂質の１９％であるが、これは乾燥バイオマ
ス（ＤＢＭ）１ｇあたりＧＬＡ５ｍｇ、又は培地１リッ
トルあたりＧＬＡ５０ｍｇである。
【００３７】図５ａ及び５ｂは、２２℃及び２５℃での
発酵経過でＧＬＡ産生が進展する様子を示す図である。
ＧＬＡ絶対量が最大になるのは、細胞密度１．４ｘ１０
6ｍｌ-1の前期安定増殖期である。最適増殖条件（２５
℃）下で発酵すると、Ｃ．ｃａｍｐｙｌｕｍ培養物の相
対脂肪酸組成は、高比率の飽和脂肪酸から高いＧＬＡ含
量へ移行する。遅延期にはＧＬＡ１５％が存在する。最
大相対ＧＬＡ量として、２２℃又は２５℃での発酵でも
約１６０時間後の対数期に１９％のＧＬＡが得られる。
しかし、この場合は、２５℃より増殖が緩やかなために
約５０時間遅れている。さらに増殖すると、相対ＧＬＡ
含量は再び低下する。
【００３８】最高の定量的なＧＬＡ収量が得られるの
は、培養温度２５℃、発酵１８５時間後の安定期であ
り、ＤＢＭ１ｇにつきＧＬＡ１３ｍｇ、つまり培養液１
リットルにつきＧＬＡ２９０ｍｇである。このことは、
温度２２℃、発酵２２０時間後ではＤＢＭ１ｇにつき最
大でもＧＬＡ７ｍｇ、培養液１リットルにつきＧＬＡ１
７０ｍｇであることと対照的である。
【００３９】Ｃ．ｃａｍｐｙｌｕｍの最高相対ＧＬＡ含
量は対数増殖期に達成されるが、最高絶対ＧＬＡ含量が
達成されるのは、増殖期から安定期へ移行してからであ
る。このことは、安定期で最大細胞密度に達成すること
に加えて、全脂肪含量が増加することによって説明され
る（Ｅｒｗｉｎ，Ｊ．，Ｂｌｏｃｈ，Ｋ．，１９６３；
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３８（５），１６１８〜
２４；Ｈｏｌｚ，Ｇ．Ｇ．，Ｃｏｎｎｅｒ，Ｒ．，１９
７３；Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎ
ａ；Ｓｔｒｏｕｄｓｂｕｒｇ，ＰＡ）。
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｔｈｅｒｍｏｐｈ
ｉｌａ（テトラヒメナ サーモフィラ）の脂肪酸スペク
トル、つまり「分析方法」の節に記載した方法によって
得られたテトラヒメナ・サーモフィラの脂肪酸スペクト
ルのガスクロマトグラフを示す図である。
【図２】 Ｃｏｙｎｅ，Ｒ．Ｓ．，Ｙａｏ，Ｍ．−
Ｃ．，１９９６；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１４４：１４７７
９〜８７による様々な繊毛虫種の系統発生図を示す図で
ある。
【図３】 Ｃ．ｃａｍｐｙｌｕｍの２２℃〜３１℃での
発酵を示す図である。
【図４】 ２５℃、８５時間発酵後のガスクロマトグラ
ムを示す図である（図３に対応する）。
【図５】 図５ａおよび５ｂは、それぞれ２２℃及び２
５℃での発酵経過でＧＬＡ産生が進展する様子を示す図
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/202 Ａ６１Ｋ 31/202 Ａ６１Ｐ 3/10 Ａ６１Ｐ 3/10 9/02 9/02 19/02 19/02 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/10 Ｃ１２Ｎ 1/10 //(Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:90）

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 γ−リノレン酸の獲得及び単離のための
    生物源としてのＣｏｌｐｉｄｉｕｍ属の使用。
  2. 【請求項２】 Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ属を培養及び発酵す
    る、請求項１に記載のγ−リノレン酸の製造方法。
  3. 【請求項３】 発酵及び培養を１９〜２８℃で実施す
    る、請求項２に記載の製造方法。
  4. 【請求項４】 バイオマス及び／又は油及び／又は脂質
    からγ−リノレン酸を単離する、請求項１〜３のいずれ
    か１項に記載のγ−リノレン酸の製造方法。
  5. 【請求項５】 Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍ由来のγ−リノレン
    酸を含むバイオマス及び／又は油。
  6. 【請求項６】 好ましくは脱脂粉乳２％、ビタミン及び
    炭素源及び更なる補助剤及び添加物を含む、請求項２及
    び３に記載の培養及び発酵用の複合無菌培地。
  7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のγ
    −リノレン酸、及び適切ならば、製剤学的に許容される
    添加物及び／又は補助剤を含む医薬品。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれか１項に記載のγ
    −リノレン酸を製剤学的に許容される添加物及び／又は
    補助剤とともに製剤化することを含む、ヒト及び／又は
    動物の心臓血管系障害、糖尿病、癌及び関節炎を治療す
    るための医薬品の生産方法。
  9. 【請求項９】 請求項１〜５のいずれか１項記載のγ−
    リノレン酸の、動物又はヒトの栄養における食品添加物
    としての使用。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれか１項記載のγ
    −リノレン酸の、化粧品基剤及び化粧品添加物としての
    使用。
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