JP4225783B2

JP4225783B2 - 培養培地に適切な前駆体分子を加えることによる、繊毛虫培養物からのγ−リノレン酸の製造方法

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Publication number: JP4225783B2
Application number: JP2002565119A
Authority: JP
Inventors: プッテン、アントンファン; タンヤケーニヒ、; ディルクファブリティウス、; トーマスキユ、; アレクサンダーレスケ、; ヨアーンプロテ、
Original assignee: ニュートリノヴァ・ニュートリッション・スペシャルティーズ・アンド・フード・イングリーディエンツ・ゲーエムベーハー
Priority date: 2001-02-12
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2009-02-18
Anticipated expiration: 2022-02-08
Also published as: US20060205047A1; US20040180414A1; EP1402045A2; US7476522B2; ATE473285T1; DE10106660A1; WO2002064807A2; JP2004519231A; US7081356B2; EP1402045B1; DE50214524D1; WO2002064807A3

Description

本発明は、繊毛虫類で、発酵させることによってω−６脂肪酸（ＰＵＦＡ、多価不飽和脂肪酸）、特にγ−リノレン酸（ＧＬＡ）を製造する方法に関する。この脂質／脂肪酸は、ヒト／動物の栄養、さらに製薬の分野で利用できる。

脂質／脂肪酸を得る繊毛虫類は、テトラヒメナ種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｓｐ．）であることが好ましく、テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）であることが特に好ましい。

図１は、真核生物に関係のある酵素を考慮に入れたＰＵＦＡ生合成の一般図（ＧｉｌｌおよびＶａｌｉｖｅｔｙのＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、第１５巻：４０１〜４０９ページに従って変更したもの）を示す。ステアリン酸（１８：０）のオレイン酸（１８：１Δ９）への変換は、Δ９不飽和化酵素（デサチュラーゼ）に触媒される。オレイン酸は、Δｌ２不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によってリノール酸（１８：２ Δ９，１２、略語ＬＡ）に変換され、これが次に、Δ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によってγ−リノレン酸（１８：３、Δ６，９，１２、略語：ＧＬＡ）に変換され、あるいはΔ１５不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によってα−リノレン酸（１８：３ Δ９，１２，１５、略語：ＡＬＡ）に変換される。脂肪酸の伸長は、伸長酵素（エロンガーゼ）によって触媒され、これによってたとえばγ−リノレン酸からは、ジホモ−γ−リノレン酸（２０：３、Δ８，１１，１５、略語：ＤＧＬＡ）が生成され、これが次に、Δ５不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によってアラキドン酸（２０：４ Δ５，８，１１，１５、略語：ＡＲＡ）、すなわち、生理学的に活性なエイコサノイド、たとえばプロスタグランジン類、プロスタサイクリン類、トロンボキサン類、ロイコトリエン類の直接の前駆体分子に変換される。ＧＬＡ（以下ではΔ６不飽和化脂肪酸と称する）から誘導されるＰＵＦＡの生成では、Δ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によるＬＡのＧＬＡへの変換が律速ステップであることがわかっている（ＨｕａｎｇＹＳおよびＭｉｌｌｓＤＥの「γ−ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ：Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｎｄｍｅｄｉｃｉｎｅ」、ＡＯＣＳＰｒｅｓｓ、米イリノイ州シャンペーン、１９９６年）。

脊椎動物は、脂肪酸の９位より後に二重結合を導入することができないので、ＬＡやＡＬＡなどの不飽和脂肪酸は、脊椎動物には合成できず、主として食物の植物供給源に由来する必須栄養素である。哺乳類は、Δ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によって、ＬＡを、ＡＲＡ前駆体であり、かつ大部分のプロスタグランジン類の本質的な前駆体分子でもあるＧＬＡに変換することができる。ステアリドン酸（１８：４ Δ６，９，１２，１５）、すなわちＥＰＡの前駆体分子のＡＬＡからの生成も、同じくΔ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）によって触媒される。したがってΔ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）は、エイコサノイド生合成の第１の必須ステップである。

哺乳類のΔ６不飽和化酵素（デサチュラーゼ）の活性は、たとえばアルコール摂取、ストレス、食物摂取不足、および加齢プロセスなどの要因によって弱まることが判明している（ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｓ、１９９６年；Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０年）のＲｅｖ．Ｃｏｎｔｅｍｐｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．第１巻：１〜４５ページ；Ｂｏｌｔｏｎ−ＳｍｉｔｈＣ等（１９９７年）のＥｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．第５１巻：６１９〜６２４ページ；ＬｅｖｅｎｔｈａｌＬＪ等（１９９３年）のＡｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．第１１９巻：８６７〜８７３ページ）。これがＧＬＡの供給不足をもたらし、次いで結局は、ＡＲＡなどのＧＬＡ由来の分子、およびそれから生成する生理学的に重要なエイコサノイドが不足することになる（ＢｒｅｎｎｅｒＲＲ（１９７６年）のＡｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．第８３巻：８５〜１０１ページ；ＮａｋａｈａｒａＴ等（１９９３年）のＪ．Ｊｐｎ．ＯｉｌＣｈｅｍ．Ｓｏｃ．第４２巻：２４２〜２５３ページ；Ｃｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８年）の「Ｒｅａｐｐｒａｉｓａｌｏｆｔｈｅｅｓｓｅｎｔｉａｌｆａｔｔｙａｃｉｄｓ」、出典：「Ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｆｏｏｄａｎｄｔｈｅｉｒｈｅａｌｔｈｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、第２版（ＣｈｏｗＣＫ編）、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、ニューヨーク州ニューヨーク）。ＧＬＡの供給によって、Δ６不飽和化脂肪酸の内在レベルの低下を補償するだけでなく、このような脂肪酸の所要量の増加を賄うことができる（Ｈｏｒｒｏｂｉｎ（１９９０年））。したがって、食事によってＧＬＡを摂取することは、ＧＬＡ由来分子が生合成されるために有利である（Ｆａｎ．ＹＹおよびＣｈａｐｋｉｎ，ＲＳ（１９９８年）のＪ．Ｎｕｔｒ．第１２８巻：１４１１〜１４１４ページ）。

ＧＬＡが人体に種々な有益な効果を及ぼすという発見は、この間、非常に多数の科学的研究によって補強されている。一例として、ＧＬＡが、たとえばアトピー性湿疹、リウマチ様関節炎、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性ニューロパシー、片頭痛、精神分裂病、および癌に有益な作用を及ぼすことが、臨床研究によって実証されている。このような研究では、統計的に有意な改善だけでなく、臨床像における臨床的に有意な改善が目標とされた。

このような有益な特性のために、ＧＬＡは、製薬、化粧品、動物飼料、および食品業界においてその使用範囲が広い。

ヒトおよび動物からの多くのＰＵＦＡは、直接に食物に由来するか、または食物を介して供給された必須脂肪酸が、不飽和化因子および伸長因子による変換を経たものである。

ＧＬＡを生成するのは、いくつかの市販の脂肪種子だけである。ＧＬＡは、マツヨイグサ（Ｏｅｎｏｔｈｅｒａｂｉｅｎｎｉｓ、総脂肪酸含有量の約１０％がＧＬＡ）、ルリヂサ（Ｂｏｒａｇｏｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ、約２３％）、およびクロスグリ（Ｒｉｂｅｓｎｉｇｒｕｍ、約１８％）など、種々の植物の種子中にしか生成しない。その他には、たとえば真菌類のケカビ属およびクサレケカビ属（最高で約２５％）、藍藻類のスピルリナ（約１２〜１８％）他といった種々の微生物も、ＧＬＡ供給源として知られている。記載されている特にＧＬＡに富む供給源は、繊毛虫類、たとえばテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）（最高で４７％、Ｈｉｌｌ，ＤＬ（１９７２年）の「ＴｈｅｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙｏｆＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ」、第３章、４６〜７３ページ、Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ロンドン；Ｅｒｗｉｎ，ＪおよびＢｌｏｃｈ，Ｋ（１９６３年）のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２３８巻：１６１８〜１６２４ページ）である。

種々の真菌類、たとえばクサレケカビ属およびケカビ属からの発酵によるＧＬＡの製造は、文献（Ｎａｋａｊｉｍａ等のＥｓｓｅｎｔ．ＦａｔｔｙＡｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ，ＩｎｖｉｔｅｄＰａｐ．Ｉｎｔ．Ｃｏｎｇｒ．、第３巻、１９９２年、５７〜６４ページ；Ｎａｋａｈａｒａ等のＩｎｄｕｓｔｒｉａｌａｐｐｌ．ｏｆｓｉｎｇｌｅｃｅｌｌｏｉｌｓ、ＡＯＣＳＰｒｅｓｓ、（１９９２年）、６１〜９７ページ）にすでに記載されている。糸状に成長する真菌類の場合では、通常、培地の粘度が高いために、莫大な費用をかけない限り、ＧＬＡ産生に不可欠な十分な酸素供給を工業的規模で実行することはできず、この問題は、依然として克服が待たれている（Ｈｉｒｕｔａ等のｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、（１９９７年）、第８３巻、７９〜８６ページ；ＣｈｍｉｅｌのＢｉｏｐｒｏｚｅβｔｅｃｈｎｉｋ２、（１９９１年）、２８７〜３０２ページ；Ｃｒｕｅｇｅｒおよびｃｒｕｅｇｅｒの「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ−ＬｅｈｒｂｕｃｈｄｅｒａｎｇｅｗａｎｄｔｅｎＭｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ（応用微生物学のバイオテクノロジー教本）」、（１９８９年）、２２４〜２６６ページ）。

したがって、このような天然供給源からのＧＬＡの工業生産は、これまでその工業的規模での使用を妨げてきた重大な不利点および問題点を抱えている。このような生物体から生成される油は、質だけでなく量がさまざまになり、さらに油の組成が非常に不均一であり、ＧＬＡを濃縮するために複雑かつ費用のかかる精製ステップが必要である。その上、ＧＬＡ含有植物の栽培は、あまり経済的でない（ＨａｎｓｅｎＣＥ等（１９９１年）のＪ．Ｓｃｉ．ＦｏｏｄＡｇｒｉｃ．第５４巻：３０９〜３１２ページ）。ＧＬＡ含有油の製造については、いくつかのＧＬＡ産生微生物における空間／時間の収率が、高等植物の場合よりも著しく良好であることがわかっている。

微生物での発酵によるＧＬＡの製造は、この理由で、これまでどうしても十分な程度に実現されていなかった、他のＧＬＡ供給源に代わる大いに有望な選択支を提供する。

多くの微生物の脂肪酸スペクトルは、高等生物ほど不均一でなく、これによって精製が有利になる。その上、発酵による製造は、天候、飼料供給などの外的な要因に左右されない。さらに、このようにして調製したＰＵＦＡは、たとえば環境汚染による汚染物質をほとんど含まない。別の有利点は、たとえば、植物供給源から得たＧＬＡとは対照的に、発酵法によって生成したＧＬＡの利用性が信頼できることである。

ＰＵＦＡまたはＧＬＡを工業的に提供することへの関心は大きいので、従来技術には、発酵によってこのような脂肪酸の製造を最適化するおびただしい方法が存在する。これらの例は、ＲａｔｌｅｄｇｅＣ（１９９３年）のＴｒｅｎｄｓＢｉｏｃｈｅｍ．第１１巻：２７８〜２８４ページ；ＲａｔｌｅｄｇｅＣ（１９８９年）のＢｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．第１７巻：１１３９〜１１４１ページ；ＧｏｓｓｅｌｉｎＹ等（１９８９年）のＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．第１１巻：４２３〜４２６ページ、さらにまた国際特許出願ＷＯ８６／０３５１８に出ている。しかし、ＧＬＡの微生物発酵による工業的規模での製造については、ＰＵＦＡ産生微生物による発酵が複雑かつ高価であり、したがって現在達成できるＧＬＡ含有量では不経済であるので、ＧＬＡ含有量を増大させることが必要である（ｓｕｐｒａＲａｔｌｅｄｇｅ１９９３年）。さらに、総脂質に対するＧＬＡ含有量が少ないために、精製が必要であるが、この精製を定量的に行うことができないので、高純度ＧＬＡを発酵によって意味のある収量で製造することは、実際的な側面から、現在では不可能である。

そのＧＬＡ含有量が本来すでに比較的高いために、発酵によるＧＬＡの製造には、特にテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）が適するといえる。テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）は、発酵槽中で培養でき、高い細胞密度を実現することができる（Ｋｉｙ，Ｔ．およびＴｉｅｄｔｋｅ（１９９２年）のＡｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３７巻、５７６〜５７９ページ；Ｋｉｙ，Ｔ．およびＴｉｅｄｔｋｅ，Ａ．（１９９２年）のＡｐｐｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第３８巻、１４１〜１４６ページ）。

（ＧＬＡを含む）ＰＵＦＡは、大部分がテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の細胞膜のリン脂質（ＰＬ）に結合して存在している。細胞は、中性脂質（貯蔵脂質）の３．５〜４倍のリン脂質を含有している（Ｌｅｅｓ等のＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９６年）第５巻（５）、１４７５〜１４８１ページ；Ｊｏｎａｈ等の（１９７１年）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔｂｉｏｐｈｙｓｉｃａａｃｔａ、第２３１巻、８０〜９２ページ）。しかし、細胞膜の面積は限られており、培養中では細胞数を増加させることによってしか増やすことができない。これによって、ＰＵＦＡ含有量の増加に必然的に制限がかかる。培養中には、細胞含有量を自由裁量で増すことができないからである。

対照的に、細胞あたりの中性脂質（貯蔵脂質）量は、増加させ、脂質液滴の形で蓄積させることができる。これは、的を絞ったアセタート供給について記載されている（Ｏｋｕｙａｍａ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９７７年）、第２５３巻（１０）、３５８８〜３５９４ページ；Ｂｏｒｏｗｉｔｚ等のＢｉｏｃｈｉｍ．ｅｔｂｉｏｐｈｙｓ．ａｃｔａ、（１９７６年）、第４２４巻、１１４〜１２４ページ）。

しかし、中性脂質（ＮＬ）中のＧＬＡの割合は、非常に低い（ＮＬ中で６．７％（ｗ／ｗ）、総脂質中で２５．６％（ｗ／ｗ）（Ｊｏｎａｈ等のＢｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔｂｉｏｐｈｙｓｉｃａａｃｔａ、（１９７１年）、第２３１巻、８０〜９２ページ）、あるいはＮＬ中２．１％（ｗ／ｗ）、リン脂質（ＰＬ）中２９．５％（ｗ／ｗ）、かつ総脂質中１９％（ｗ／ｗ）（Ｅｒｗｉｎ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、（１９６３年）、第２３８巻（５）、１６１８〜１６２４ページ））。アセタートを供給しても、脂肪酸組成は変化しない（Ｈｏｌｚ等（１９７３年）のＢｉｏｌＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ、９９〜１２２ページ）。

テトラヒメナピリフォーミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）については、アセタートを供給した場合の細胞数の増加が報告されている（グルコースを含まない基本培地に０．１％アセタートを加えた場合、１ｍｌあたり細胞１．２×ｌ０⁵個から１．６×１０⁵個）。グルコースを含む基本培地では、増加が有意でない（１ｍｌあたりアセタートなしで細胞１．８５×１０⁵個、アセタートを加えて細胞１．９×１０⁵個）（Ｍａｖｒｉｄｅｓ（１９７３年）のＣａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、３２３〜３３１ページ、培地組成：Ｄｅｗｅｙ等（１９５０年）のＡｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、第２９巻、２８１ページ）。しかし、これらの刊行物で報告された細胞数は、本発明に従って使用できる培地を用いて達成できる細胞数をずっと下回っている（本発明で使用した培地の１×１０⁶〜３×１０⁷個に対して最大２×１０⁵個）。

したがって、本発明の目的は、ＧＬＡの収量を著しく増加させることのできる手段によって、ＰＵＦＡ、好ましくはＧＬＡを工業的規模で製造する方法を提供することである。この方法は、技術的に簡単であり、取扱いも容易であり、信頼でき、かつ費用のかからないものである。

本発明の別の目的は、より純粋な形のＧＬＡを得るために中性脂質中のＧＬＡ含有量を増加させることである。

これらの目的に加え、明確に記載していないが、本明細書で最初から論じた文脈から問題なく派生し、または推論される他の目的は、特許請求項１の特徴をすべて備えた方法によって実現される。本発明の方法の好都合な変更は、請求項１を引用している従属請求項の形で保護範囲に含まれる。

これは、それ自体が知られている条件下、発酵槽中で繊毛虫を培養し、培地にＧＬＡ前駆体分子を加えることによって、ＧＬＡ収量の増加が予想し得なかった方式で実現できることによるものである。

ＧＬＡ前駆体分子に加えて、アセタートも培地に加えることが特に好ましい。

本発明の好ましい実施形態では、繊毛虫は、テトラヒメナ種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｓｐ．）である。

本発明の別の好ましい実施形態では、繊毛虫は、テトラヒメナロストラタ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｒｏｓｔｒａｔａ）（たとえばＡＴＣＣ３０７７０）である。

本発明のもう１つの別の好ましい実施形態では、繊毛虫は、テトラヒメナピリフォーミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ３００３９、３０００５、３０２０２）である。

本発明のもう１つの別の好ましい実施形態では、繊毛虫は、テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩ（たとえばＡＴＣＣ３０３８４）である。

アセタートは、培養開始の２０〜３９時間後に初めて加えることが好ましく、２５〜３５時間後に初めて加えることが特に好ましい。

本発明の別の好ましい実施形態では、アセタートを２段階で加える。

したがって、本発明の特に好ましい実施形態は、培養開始の２０〜３９時間後に最初の供給パルス（ｆｅｅｄｐｕｌｓｅ）を加え、培養開始の４０〜７０時間後に次の供給パルスを加える場合、２５〜３５時間後に最初の供給適用量を加え、５０〜６０時間後に次の供給適用量を加えることが特に好ましい。

本発明の別の特に好ましい実施形態は、アセタートを、培養開始の２０時間後、特に好ましくは培養開始の２５時間後に加え始め、少なくとも１時間毎０．０５ｇ／ｌの速度で、培養期間中ずっと連続的に加えるものである。

ＧＬＡ前駆体分子は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、および／もしくはリノール酸（Ｃ１８：２）、または対応する前駆体分子のトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、エステル、もしくは塩であることが好ましい。

本発明の好ましい実施形態では、培養物に、ヒマワリ種子油など、天然油の形のＧＬＡ前駆体分子を加える。

本発明の別の好ましい実施形態では、培養物にアザミ油の形のＧＬＡ前駆体分子を加える。

本発明のもう１つの別の好ましい実施形態では、培養物にオリーブ油の形のＧＬＡ前駆体分子を加える。

アセタートは、酢酸の形で、または酢酸塩、たとえば酢酸ナトリウムとして加えることが好ましい。

本発明をもたらした上述の発明者等の研究では、驚くべきことに、接種前、また培養中にアセタートを加えると、成長が弱くなることが判明した（実施例３）。このバイオマスの脂肪酸スペクトルまたはＧＬＡ含有量に著しい変化はないので、全体的に見て、ＧＬＡの収量に減損が生じる。

そこで、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）に脂肪酸前駆体のみ、前駆体分子のトリアシルグリセリドのみ、アセタートのみ、または前駆体分子のトリアシルグリセリドとアセタートの組合せのいずれかを供給するさまざまな供給物実験を実施すると、驚くべきことに、テトラヒメナ種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｓｐ．）に前記前駆体分子とアセタートを合わせて供給すると、中性脂質含有量だけでなく、中性脂質中のＧＬＡ含有量が特に望ましく増加し、これによって、バイオマスＤＭのＧＬＡ含有量が２５０％まで、すなわち２．０％（ｗ／ｗ）から５．０％（ｗ／ｗ）に増大することが判明した。特に驚くべきことに、培養開始の約２０〜４０時間に、時間をずらしてアセタートを加えると、ＧＬＡの収量が特に高くなる。比較としては、脂肪酸前駆体およびアセタートを加えない標準の培養を行った。

したがって、本発明によれば、繊毛虫類は、そのＰＵＦＡ含有量、好ましくはＧＬＡ含有量が高くなる条件下で培養する。

本発明の目的では、ＰＵＦＡ含有量またはＧＬＡ含有量が高いとは、対応する脂肪酸が、細胞および／または培養ブロス中に、遊離脂肪酸の形で、リン脂質として、中性脂質として、またはそれ以外に通常の生物学的条件下で脂肪酸が発生し得る他の形で存在する意味とする。

培養物または培養ブロスからγ−リノレン酸含有脂質またはγ−リノレン酸を単離できる方法は、当業者によく知られている。

繊毛虫からγ−リノレン酸含有脂質を単離するためのここでの一方法は、以下の段階、すなわち、
（ｉ）発酵ブロスを０〜１０℃に冷却し、次いで冷却した培養ブロスを遠心分離または濾過にかける段階、
（ｉｉ）得られたバイオマスを乾燥させる段階、
（ｉｉｉ）得られた脂質を、
（ａ）（ｉｉ）から得たバイオマスＤＭ（ＢＤＭ）を、全脂質を抽出できる極性溶媒、好ましくはエタノールでの抽出にかけ、
（ｂ）その代わりに、非極性溶媒、好ましくはｎ−ヘキサンでＢＤＭから中性脂質を抽出し、および／または
（ｃ）（ａ）から得た全脂質を非極性溶媒で処理して、中性脂質と極性脂質、たとえばリン脂質を分離することによって抽出する段階
を踏めばよい。

繊毛虫から遊離のγ−リノレン酸またはそのエステルを単離する別の方法は、以下の段階、すなわち、
（ｉ）上述の方法の段階（ｉｉ）または（ｉｉｉ）で得た生産物をけん化またはエステル化して、遊離脂肪酸またはエステルを生成させる段階、
（ｉｉ）沈殿（たとえば尿素沈殿）法および／またはクロマトグラフィ法によって、ＧＬＡを濃縮する段階
を踏めばよい。

発酵ブロスから直接に遊離γ−リノレン酸を単離する別の方法は、以下の段階、すなわち、
（ｉ）発酵ブロスを０〜１０℃に冷却し、次いで遠心分離または濾過にかける（その後希釈して濾過性を確認する）段階、
（ｉｉ）内在するテトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）リパーゼによって、または他のリパーゼを加えることによって、遊離した脂質を加水分解する段階、
（ｉｉｉ）沈殿（たとえば尿素沈殿）法および／またはクロマトグラフィ法によってＧＬＡを濃縮する段階
を含めばよい。

さらに、当業者にはわかりきったことであるが、たとえば、上で示したように得た脂質、脂肪酸、または脂肪エステルから、構造脂質（たとえば、トリグリセリド、リン脂質）が合成される。

非常に多くの類似の精製法が当業者に利用でき、本発明の範囲から離れなければ、こうした方法の１または複数のこれらの段階に変更を加えてよいことは言うまでもない。完全に異なる精製プランでさえ、ここには何も変化をもたらさないはずである。従来技術から多くの異なる精製プランを引き出すことができ、かつそのようなタイプの精製が選択されても、当業者の通常の知識に対応しているからである。

以下で述べる図面は、本発明の理解の向上に寄与するものである。

当業者にはわかることであるが、上で述べた詳細を考慮すれば、非常に多くの他のテトラヒメナ種、たとえばテトラヒメナシルバナ（Ｔ．ｓｉｌｖａｎａ）（たとえばＡＴＣＣ５００８４）、テトラヒメナマラクセンシス（Ｔ．ｍａｌａｃｃｅｎｓｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ５００６５）、テトラヒメナアジアティカ（Ｔ．ａｓｉａｔｉｃａ）（たとえばＡＴＣＣ５００６８）、テトラヒメナボレアリス（Ｔ．ｂｏｒｅａｌｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ３０２０３）、テトラヒメナカナデンシス（Ｔ．ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ５００９８）、テトラヒメナオーストレイリス（Ｔ．ａｕｓｔｒａｌｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ３０３４９）、テトラヒメナボラックス（Ｔ．ｖｏｒａｘ）（たとえばＡＴＣＣ３０４２１）、テトラヒメナファーガソニ（Ｔ．ｆｕｒｇａｓｏｎｉ）（たとえばＡＴＣＣ９３５７）、テトラヒメナセトーサ（Ｔ．ｓｅｔｏｓａ）（たとえばＡＴＣＣ３０７８２）、およびテトラヒメナトロピカリス（Ｔ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）（たとえばＡＴＣＣ３０２７５）を用いる本発明の手順を使用しても、同様に良好なＧＬＡの収量が得られる。

以下で述べる実施例によって、本発明をより詳細に述べる。しかし、実施例は、限定的であるとみなされるものではない。別段の記載がない限り、個々の実験にはテトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩ（たとえばＡＴＣＣ３０３８４）を使用した。

[参考例１]
標準培養物
１００ｍｌ容コニカルフラスコに２０ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地（表１を参照されたい）を装入し、またはバッフルを備えた５００ｍｌ容コニカルフラスコに１００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を装入し、セルロース／綿製の栓で閉め、１２１℃で２０分間滅菌した。

相応する場合は、滅菌前に、培地に添加物を入れた。

予備培養物
予備培養物については、２０ｍｌの培地を含む１００ｍｌ容フラスコに、細胞密度が１ｍｌあたり細胞約５×１０⁴〜１×１０⁵個のＭＭ−Ｖａｒ培地（表１を参照されたい）を接種し、２５℃、６０ｒｐｍで２日間かけて培養した。細胞数を、１ｍｌあたり細胞１×１０⁶個と３×１０⁶個の間の値に到達させた。

振とうフラスコ中の主培養物
１００ｍｌの培地を含む５００ｍｌ容コニカルフラスコ中で振とうフラスコ実験を行った。実験用フラスコに１ｍｌあたり約５×１０⁴〜１×１０⁵個の細胞密度を接種し、２５℃、１００ｒｐｍで２日間かけて培養した。

１ｌまたは５ｌ規模での発酵
１ｌ容発酵槽（７００ｍｌの稼動体積）、５ｌ容発酵槽（３ｌの稼動体積）、および１３ｌ容発酵槽（１０ｌの稼動体積）中で発酵を行った。発酵槽に、ｐＨ電極、ｐＯ₂電極、通気環、円板型攪拌器を備えた攪拌軸、酸／アルカリ用供給ライン、フィード供給用供給ライン、接種用フィッティング、およびサンプリングを標準装備した。

発酵槽に稼動体積の培地を装入し、滅菌器中、１２３℃で３０分間滅菌した。

表２に発酵条件を明記する。

発酵物に振とう培養物からの主培養物（上を参照）を接種した。

バイオマスの定量
バイオマス乾燥物を定量するために、５ｍｌの細胞培養物を４℃、３４００ｇで１０分間遠心分離し、上清をデカントし、細胞ペレットを−８０℃で凍らせた。凍結したバイオマスを凍結乾燥させ、バイオマス乾燥物の重量を決定した。

細胞数の決定
ＣＡＳＹ１ＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ＋ＡｎａｌｙｓｅｒＳｙｓｔｅｍ、ＴＴＣ型、ＳｃｈａｒｆｅＳｙｓｔｅｍを使用して、細胞密度を決定した。測定については、細胞を弱いＣＡＳＹ電解質溶液中に希釈し（１：５００）、直径１５０μｍの毛細管を通して輸送した。粒径が１５〜５０μｍの範囲の細胞をカウントした。

バイオマス乾燥物中の中性脂質含有量の決定
ｎ−ヘキサンを用いてバイオマス乾燥物から非極性脂質成分（中性脂質）を抽出した。１バッチについて、約５００ｍｇのバイオマス乾燥物を、５ｍｌのｎ−ヘキサン中、６０℃で１時間攪拌し、次いで２７００ｇで２分間遠心分離し、懸濁した物体を濾別することによって上清を精製した。濾過については、詰める高さを約１ｃｍとして脱脂綿を詰めたパスツールピペットを使用した。最初の抽出の細胞残渣を５ｍｌの溶媒でもう一度抽出し、バイオマスを遠心分離によって除き、上清を濾過した。２回の抽出の精製された有機相を合わせ、回転蒸発装置で溶媒を完全に蒸発させ、抽出された脂質の量を秤量によって決定した。

抽出した脂質の質的かつ量的分析
ＩａｔｒｏｓｃａｎＴＭｎｅｗＭＫ−５Ａｎａｌｙｓｅｒを使用して、抽出した脂質を質的かつ量的に分析した。クロマトグラフィ材料には、表面材料として耐熱性シリカゲルが使用されている分離棒（クロマロッド）を使用した。分離棒をデシケーター中に保管し、それぞれの分離操作の前にか焼して、妨害物質を除去した。ＦＩＤの測定条件は、走査速度：３０秒／スキャン、Ｏ₂流量：２ｌ／分、およびＨ₂流量：１６０ｍｌ／分となるように選択した。

分析しようとする脂質を、濃度約１０ｇ／ｌのクロロホルム／メタノール（２：１）中に溶解させ、その１μｌを分離棒にのせた。分離は、移動層中で３０分間かけて行ったが、その移動層の組成を表３に明記する。

実行後、棒を８０℃で５分間乾燥させ、Ｉａｔｒｏｓｃａｎで分析した。各脂質を割当て、確実な標準物質と比較することによって数量化した。標準溶液は、メタノール／クロロホルム（２：１）に溶解させた、４．６５ｇ／ｌのトリパルミチン酸、５．１７ｇ／ｌのジパルミチン酸、および５．６４ｇ／ｌのパルミチン酸の混合物とした。検量線を作成するために、０．５〜２．０μ１の量の標準溶液を分離棒にのせ、溶媒中で展開し、ＴＬＣ−ＦＩＤによって分析した（表４）。

ガスクロマトグラフィ（ＧＣ）によるＧＬＡ含有量の決定
水素炎イオン化検出器（ヒューレットパッカード社、米ウィルミントン）を装備したガスクロマトグラフィ装置（ＨＰＧＣ６８９０）によって、脂肪酸スペクトルを決定した。

使用したカラムは、ＦＦＡＰ（遊離脂肪酸層）Ｐｅｒｍｂｏｎｄ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆ＮａｇｅｌＧｍｂＨ、Ｄｕｒｅｎ）であった。脂肪酸メチルエステル標準物質の滞留時間と比較することによって、脂肪酸を同定した。標準物質の既知の濃度に基づき、試料中の脂肪酸濃度が決定できた。

３０〜７０ｍｇの凍結乾燥バイオマス乾燥物（バイオマスの定量を参照されたい）を秤量し、２０％強度のＨＣｌメタノール溶液１ｍｌおよび標準メタノール溶液（１ｍｇ／ｍｌ）１ｍｌと混合した。脂肪酸を遊離させ、エステル交換を行って脂肪酸メチルエステルにするために、フタをした試験管に入った試料を、水浴中、６０℃で２時間攪拌し、室温に冷却した。次に、試料を中和するために、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液１ｍｌを加え、試料を慎重に混合した。ｎ−ヘキサンを加えて、脂肪酸メチルエステルを抽出した。次いで、バッチを激しく混合し、４３００ｒｐｍで２分間遠心分離することによって、相を分離した。上方の有機相の約２／３を取り去り、１μｌの試料をＧＣカラム上に注入し、分析した（表５も参照されたい）。

[参考例２]
アザミ油（リノレン酸供給源）がＧＬＡ生成に及ぼす影響
１ｍｌ／ｌのアザミ油を、滅菌する前に、１００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む２本の５００ｍｌ容フラスコそれぞれに加えた。１００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む２本の５００ｍｌ容フラスコを基準として使用した。アザミ油は、表６に報告された組成を有していた。脂肪酸は、トリグリセリドの形であった。

結果は、図２〜４に示す。これを加えたことによって、バイオマスが約８．３ｇ／ｌから約９．５ｇ／ｌに増加した（図２）。バイオマス内容物中のＧＬＡ含有量は、若干しか増加しなかったが（図３）、バイオマス濃度が高いことによって、ＧＬＡの体積濃度が２８％（１８０ｍｇ／ｌから２３０ｍｇ／ｌ）増大した。アザミ油を加えることによって、全脂肪酸中のＧＬＡの比率は、３３％から２２％に低下した（図５）。

[参考例３]
オリーブ油（オレイン酸供給源）がＧＬＡ生成に及ぼす影響
１ｍｌ／ｌのオリーブ油を、滅菌する前に、１００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む２本の５００ｍｌ容フラスコそれぞれに加えた。１００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む２本の５００ｍｌ容フラスコを基準とした。オリーブ油の組成は、表６（上）に示したものであった。脂肪酸は、トリグリセリドの形であった。結果は、図２〜４に示す。これを加えることによって、バイオマスが約８．３ｇ／ｌから約９．１ｇ／ｌに増加した（図２）。バイオマス中のＧＬＡ含有量は、有意に増加し（２．１％から３％）（図３）、バイオマス濃度も高くなり、ＧＬＡの体積濃度は、５３％（１８０ｍｇ／ｌから２７５ｍｇ／ｌに）増大した。オリーブ油を加えることによって、全脂肪酸中のＧＬＡの比率は、３３％から２４％に低下した（図５）。

［参考例４］
アセタートがＧＬＡ生成に及ぼす影響（基本培地中のアセタート）
７００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む１ｌ容発酵槽において発酵を行った。１つの発酵物を基準とし、他の２つには、滅菌前に、その培地に０．５および１．０ｇ／ｌの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）を加えた。

酢酸ナトリウムは、培養の際、テトラヒメナサーモフィラ（ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩの細胞成長に有害な影響を及ぼした（図６および７）。この実験の細胞密度だけでなく、そのバイオマス乾燥物（ＢＤＭ）も、基準発酵物の結果を下回っていた。次いで、使用した酢酸ナトリウム量と細胞成長抑制作用の直接の相関関係としてはバイオマス乾燥物のＧＬＡ含有量は、ＮａＡｃを加えても変わらなかった（図８）。

また中性脂質の合成も、酢酸ナトリウムの添加によって若干変化しただけであった（表７を参照されたい）。

４６時間の培養時間の後でも、標準の発酵物との有意な差は観察できなかった。増加が認められたのは、７０時間後になってからであり、ＭＭ−Ｖａｒ基本培地にＮａＡｃを加えることによって、ＮＬ含有量が１１％から１７％（ｗ／ｗ）に増加した。中性脂質中のＧＬＡ含有量は、標準発酵物と若干の差があるだけであった。

驚くべきことに、ＮａＡｃを加えることによって、ＧＬＡ産物の生成体積は低下した（図９）。

［参考例５］
アセタートがＧＬＡ生成に及ぼす影響（２４時間後に培養物に加えたアセタート）
７００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む１ｌ容発酵槽において発酵を行った。１つの発酵物を基準とし、他の発酵物には、発酵２９時間後に滅菌した（１２１℃で２０分間）１０％強度溶液の形で、０．２、０．５、および１．０ｇ／ｌの酢酸ナトリウム（ＮａＡｃ）を加えた。２９時間後に０．２および０．５ｇ／ｌのＮａＡｃを供給した発酵物では、発酵５４時間後に再度同じ量を加えた。

酢酸ナトリウムは、培養中では、テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩの細胞成長に有害な影響を及ぼした（図１０および１１）。実験の細胞密度だけでなく、そのＢＤＭも、基準培養物の結果を下回っていた。使用した酢酸ナトリウム量と細胞成長抑制活性は、直接に相関していた。培養の際にＮａＡｃを加えた場合、認められることのある直接の反応は、成長の低下、または細胞密度の減少である。バイオマス乾燥物のＧＬＡ含有量は、ＮａＡｃを加えても変化しなかった（図１２）。

また、中性脂質の合成も、酢酸ナトリウムの添加によって若干変化しただけであった（表８を参照されたい）。

アセタート培地を４６時間培養した後、標準発酵物との差は観察されなかった。７０時間後でさえ、有意な増加は認められなかった。ＧＬＡ産物の生成体積は、アセタートを加えることによって縮小した（図１３）。

［実施例１］
酢酸ナトリウムとアザミ油を加える
７００ｍｌのＭＭ−Ｖａｒ培地を含む１ｌ容発酵槽において発酵を行った。１つの発酵物を基準とし、１つには滅菌前に０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび１ｍｌ／ｌのアザミ油を、１つには０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび１ｍｌ／ｌのアザミ油を、対数期の終わりに向けて（２８時間後まで）加えた。

図１４および図１５は、細胞数およびバイオマス乾燥物の経過を示す。培地にＮａＡｃおよびアザミ油を加えると、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）の成長が低下したことがわかるであろう。発酵開始時期に基質を加えた場合、基準発酵物と比べて、対数成長期が遅れたことが観察され、得られたＢＤＭは、ほぼ同じであった。２８時間後に加えると、その供給の結果としてＢＤＭが減少した。

図１６では、発酵の経過におけるバイオマスあたりのＧＬＡ含有量がプロットしてある。アザミ油および酢酸ナトリウムでの培養によって、ＧＬＡ含有量が５．２％（ｗ／ｗ）まで著しく増加した。標準培養物は、２〜３％（ｗ／ｗ）という著しく低い値を示した。ＢＤＭが減少したにもかかわらず、ＧＬＡ含有量が増加したことは、３４２ｍｇ／ｌ（７１時間、図１７）というＧＬＡ濃度の高さに表われており、ＧＬＡの純度は、３０面積％であった（図１８）。

［参考例６］
オリーブ油とアセタートの供給の組合せ
オリーブ油を使用しても同様に良好な結果が得られた。

真核生物でのＰＵＦＡの生合成を示す一般図である。ＭＭ−Ｖａｒ（標準培地）、ＭＭ−Ｖａｒ＋アザミ油、およびＭＭ−Ｖａｒ＋オリーブ油（２本ずつの平行試験）を使用して得られたバイオマス乾燥物をｇ／ｌで示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ（標準培地）、ＭＭ−Ｖａｒ＋アザミ油、およびＭＭ−Ｖａｒ＋オリーブ油（２本ずつの平行試験）を使用して得られた、バイオマス乾燥物に対するＧＬＡの重量百分率を％で示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ（標準培地）、ＭＭ−Ｖａｒ＋アザミ油、およびＭＭ−Ｖａｒ＋オリーブ油（２本ずつの平行試験）を使用して得られたＧＬＡ収量をｍｇ／ｌで示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ（標準培地）、ＭＭ−Ｖａｒ＋アザミ油、およびＭＭ−Ｖａｒ＋オリーブ油（２本ずつの平行試験）を使用して得られたＧＬＡの収量をｇ／ｌの面積［％］で示すグラフである。面積［％］は、総脂質含有量のＧＬＡ比率を示す。ＭＭ−Ｖａｒ基本培地にＮａＡｃを加えた場合の細胞数の経過を示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ基本培地にＮａＡｃを加えた場合のバイオマスＤＭの経過を示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ基本培地にＮａＡｃを加えた場合のバイオマスＤＭのＧＬＡ含有量を示すグラフである。ＭＭ−Ｖａｒ基本培地にＮａＡｃを加えた場合の培養物のＧＬＡ濃度を示すグラフである。培養中にＮａＡｃを供給した場合の細胞数の経過を示すグラフであり（ｔ＝２５ｈ、５４ｈ）、矢印はそれを加えた時点を示す。培養中にＮａＡｃを供給した場合のバイオマスＤＭの経過を示すグラフであり（ｔ＝２５ｈ、５４ｈ）、矢印はそれを加えた時点を示す。培養中にＮａＡｃを供給した場合のＧＬＡ含有量を示す図である（ｔ＝２５ｈ、５４ｈ）。培養中にＮａＡｃを供給した場合の培養物のＧＬＡ濃度を示すグラフである（ｔ＝２５ｈ、５４ｈ）。０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび０．１％のアザミ油がＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａＢ１８６８ＶＩＩの細胞数に及ぼす影響を示すグラフである。０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび０．１％のアザミ油がＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａＢ１８６８ＶＩＩのバイオマスＤＭに及ぼす影響を示すグラフである。０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび０．１％のアザミ油で成長させたティー．サーモフィラ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩのＧＬＡ含有量の経過を示すグラフである。ティー．サーモフィラ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩの培養中、０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび０．１％のアザミ油がＧＬＡの収量に及ぼす影響を示すグラフである。０．５ｇ／ｌのＮａＡｃおよび０．１％のアザミ油で成長させたティー．サーモフィラ（Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）Ｂ１８６８ＶＩＩのバイオマスＤＭにおけるＧＬＡ面積の経過を示すグラフである。

Claims

γ−リノレン酸を発酵によって製造する方法であって、
γ−リノレン酸前駆体分子を加えた培地でテトラヒメナ種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｓｐ．）を培養し、培養開始の２０〜３９時間後に最初の添加を行い培養開始の４０〜７０時間後に次の添加を行って２段階でアセタートを加え、培養を終えた後、テトラヒメナ種（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｓｐ．）からγ−リノレン酸を単離し、
前記γ−リノレン酸前駆体分子が、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、若しくはリノール酸（Ｃ１８：２）、又は、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、及びリノール酸（Ｃ１８：２）のうち何れか一つの脂肪酸のトリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、リン脂質、エステル、若しくは塩であることを特徴とするγ−リノレン酸の製造方法。
テトラヒメナサーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
テトラヒメナピリフォーミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
テトラヒメナロストラタ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａｒｏｓｔｒａｔａ）を使用することを特徴とする請求項１に記載の方法。
培養開始の２５〜３５時間後に最初のアセタートを加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
培養開始の２５〜３５時間後に最初の添加を行い、培養開始の５０〜６０時間後に次の添加を行って、２段階でアセタートを加えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
酢酸の形、または酢酸塩としてのアセタートを培養物に加えることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
培地に、最終濃度を０．１ｍｌ／ｌ〜１０ｍｌ／ｌとして植物油を加えることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
濃度が０．１ｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの酢酸ナトリウムとしてのアセタートを加えることを特徴とする請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
前記γ−リノレン酸前駆体分子がアザミ油であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。