CN102002517B - 制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。本发明所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵方法包括以下步骤：将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到发酵液，即得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。本方法可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。

Description

制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法

技术领域

本发明涉及制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法。

背景技术

重组白细胞介素-1受体拮抗剂(简称IL-1ra)是一种存在于人体的蛋白质类细胞因子受体拮抗剂，通过结合白细胞介素-1(IL-1)受体，特异性地封闭IL-1的活性。

自Arend等1990年克隆出人IL-1ra的cDNA以来，各国学者都在对IL-1ra进行更为全面、深入的研究。同时，众多制药厂商也都在致力于IL-1ra的开发，2003年美国FDA批准Amgen公司生产的重组人IL-1ra(商品名Kineret)用于治疗类风湿性关节炎。我国SFDA 2008年批准西藏华西药业生产的重组人IL-1ra用于治疗眼部非感染性炎症，虽然也有厂家申请IL-1ra用于治疗类风湿性关节炎，但是至今未有产品正式上市销售。

目前制备重组人白细胞介素-1受体拮抗剂的方法有真核表达和原核表达两种。真核表达产量低，成本高，但蛋白活性好。原核表达(大肠杆菌)表达分包涵体表达和可溶性表达。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基。

本发明所提供的发酵培养基，由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B₁、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；

以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：

胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B10.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。

本发明的另一个目的是提供制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法。

本发明所提供的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；

所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。

所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：

(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；

所述种子培养基A由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：

胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L；

(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；

所述种子培养基B由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：

胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。

所述发酵培养的温度为37℃；

所述接种量为9％-10％，具体为9％和10％；

所述发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30％-50％，具体为30％、40％和50％；

所述发酵体系的pH值为7.0-7.2，具体为7.0、7.1和7.2；

所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。

所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤：在所述发酵体系的OD600达到7.0-9.0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；

所述补加的补料培养基与所述发酵培养基的体积比为1∶3；

所述补料培养基由以下成分组成：

酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B₁和水；

以上成分在所述补料培养基中浓度分别为：

酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L、维生素B₁0.1g/L。

所述发酵培养中，包括如下诱导培养步骤：在发酵体系的OD₆₀₀值达到35-45时，向发酵体系中加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基-β-D硫代半乳糖苷在发酵体系中的浓度为0.1mmol/L-0.2mmol/L，诱导培养的时间为3h-4h；

所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

本发明的制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基及其发酵方法，适合重组大肠杆菌的生长和目标蛋白的表达。本工艺可重复性好；菌体生长快，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，可满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好。

附图说明

图1为PET-30a-IL-1Ra表达质粒构建示意图。

图2为IL-1ra PCR鉴定图。

图3为pET-hIL-1ra表达质粒酶切图谱

图4为IL-1ra大肠杆菌表达结果。

图5为IL-1ra工程菌划种LB琼脂平板的结果。

图6为电镜检查IL-1ra工程菌的形态。

图7为20100623批发酵SDS-PAGE电泳。

图8为20100205批发酵菌体生长曲线图。

图9为质谱分析测定IL-1ra工程菌发酵液样品的C末端序列结果。

图10为EDMAN降解蛋白质N-末端氨基酸的序列分析方法测定IL-1ra工程菌发酵液样品的N-末端氨基酸的序列。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、构建IL-1ra工程菌

大肠杆菌表达载体PET-30a购自Novagen公司，产品目录号：69909-3；

大肠杆菌JM109菌株购自Promega公司；

大肠杆菌菌株BL21(DE3)购自MERCK公司；

PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库，购自美国Clontech Laboratories.Inc。

一、获得IL-1ra基因

1、IL-1ra cDNA的PCR扩增

以PHA刺激的人外周血T细胞cDNA文库为模板，加入合成的IL-1ra引物和dNTP，上游引物为：5′-GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3′，下游引物为：5′-GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3′，上游引物引入NdeI酶切位点，从编码成熟人IL-1ra的第一个氨基酸开始，下游引物导入大肠杆菌高效终止密码TAA和SalI酶切位点。95℃5’变性后加入pfu DNA聚合酶2.5U，95℃1’，50℃1’30”，72℃1’30”一轮，经35轮反应，最后一轮72℃15’，得到的PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果如图2所示。利用美国Promega公司的Magic PCR纯化试剂盒纯化IL-1raPCR产物。

2、IL-1ra表达质粒的构建

将大肠杆菌表达载体PET-30a用NdeI和SalI酶切，将步骤1的PCR产物用NdeI和SalI酶切，与上面处理好的PET-30a连接，所用连接酶为T4DNA连接酶，构建成IL-1ra表达质粒PET-30a-IL-1Ra(图1)。

3、质粒酶切鉴定

将表达质粒PET-30a-IL-1Ra转入大肠杆菌JM109菌株，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提纯PET-30a-IL-1Ra表达质粒，经酚抽提，乙醇沉淀后，经内切酶KpnI、SalI消化，1％琼脂糖电泳鉴定，其酶谱与预期结果一致(图3：泳道1为λDNA+Hind III分子量标准；泳道2为PET-30a-IL-1Ra/Kpn I；泳道3为PET-30a-IL-1Ra/SalI；泳道4未切的pET-hIL-1ra。

4、目的基因的序列分析

PET-30a-IL-1Ra质粒高保真Taq酶PCR(上游引物为：5′-GGCATATGCGACCCTCTGGGA-3′，下游引物为：5′-GGAGGACGAGTAAGTCGACAA-3′)，产物片段连入pGEM-T质粒(购自Promega公司)的克隆位点，构建成pGEM-T-IL-1Ra质粒，利用Pharmacia Biotech公司的自动DNA测序仪进行DNA的自动测序。

目的基因的DNA序列分析结果如下：

pGEM-T-IL-1Ra质粒的插入片段的序列为序列表中序列1，经序列分析证明与公布的序列完全一致，无突变点出现。序列表中序列1为完整的成熟区IL-1ra cDNA序列。成熟区IL-1ra cDNA编码152个氨基酸，包括N端附加的甲硫氨酸共为153个氨基酸(序列表中序列2)。

二、构建表达载体

1、人重组IL-1ra在大肠杆菌的表达

表达载体PET-30a-IL-1Ra转化宿主菌BL21(DE3)细胞，构建IL-1ra工程菌。同时用转空载体对照质粒PET-30a转化宿主菌BL21(DE3)细胞，构建转空载体对照菌。挑取单个菌落，接种IL-1ra工程菌和转空载体对照菌于LB培养基中(含100μg/ml Kana)在37℃培养振荡过夜，再以2％浓度接种于LB培养液中，到OD₆₀₀为0.4左右，添加0.2mMIPTG开始诱导，继续培养4小时。将诱导表达的细菌离心，收集菌体，直接加入含SDS的裂解液进行SDS-PAGE分析及等电点分析。

诱导表达后的细菌裂解物通过SDS-PAGE分析，发现pET-30a-hIL-1ra克隆出现明显的表达带，分子量20KD，与文献报道分子量一致，而转空载体对照菌未出现分子量为20KD的表达带(见图4，图4为IL-1ra大肠杆菌表达结果，其中，泳道1为蛋白质分子量标准；泳道2为转空载体对照菌；泳道3为诱导后全菌；泳道4为菌体超声上清。)。经薄层扫描结果，表达量占菌体总蛋白的30％以上。

三、鉴定IL-1ra工程菌

(一)种子库鉴定

(1)菌种检定：划种LB琼脂平板

IL-1ra工程菌呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。菌落圆形、小、隆起、透明或半透明、整齐、发亮(图5)。

(2)涂片革兰氏染色

在光学显微镜下观察为典型的革兰氏阴性杆菌。

(3)电镜检查

IL-1ra工程菌呈典型的大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染(图6)。

(4)生化反应

IL-1ra工程菌生化反应检测结果如表1所示。

表1IL-1ra工程菌生化反应检测结果

DP3(三氯新)	-	OFG(葡萄糖氧化)	+	GC(阳性生物抑制)	+
						ACE(乙酰氨)	+	ESC(七叶树苷)	-	PLI(植物尿蓝母)	-
URE(尿素)	+	CIT(枸椽酸盐)	+	MAL(丙二酸盐)	+
						TDA(苯丙氨酸)	-	PXB(多粘菌素B)	-	LAC(乳糖)	+
MLT(麦芽糖)	-	MAN(甘露醇)	+	XYL(木糖)	+
						RAF(棉子糖)	-	SOR(山梨糖)	+	SUC(蔗糖)	-
INO(肌醇)	-	ADO(侧金盏花醇)	-	COU(香豆酸)	+
						H2S(硫化氢)	-	ONP(β-半乳糖苷酶)	+	RHA(鼠李糖)	+
ARA(阿拉伯糖)	+	GLU(葡萄糖发酵)	+	ARG(精氨酸)	-
						LYS(赖氨酸)	-	ORN(鸟氨酸)	-	OXI(氧化酶)	-

(二)工程菌传代稳定性

1.酶切鉴定

根据IL-1ra基因和载体质粒pET-30a酶切图谱，IL-1ra基因序列中有KpnI、PvuII的单酶切位点。从工程菌原代开始每传五代提一次质粒，并用KpnI和PvuII分别酶切质粒，一直到第50代，其酶谱与预期结果一致。

2.抗性鉴定

将LB平板分成左右两个区，从工程菌原代开始，每传五代，划一次LB平板，一直到第50代，结果表明工程菌的Kana抗性很稳定。

3.工程菌传代表达稳定性

(1)实验材料：试管Φ10、100；甘油(分析纯)；甘油冻存菌(-20℃、-70℃)；1L中含有LB培养基：Tyrptone         10g；

              Yeast extract    5g；

              NaCl             10g；

             卡那霉素          0.5g；

             氢氧化钠          调PH7.2

(2)使用设备：空气恒温摇床G24(NBS)；超净工作台JS-90(北京)；恒温培养箱HHX-50(湖北)；灭菌锅(日本)；扫描仪Alpha Image 1220(美国)

(3)实验方法：

A.配置LB培养基：称取Tyrptone 5g、Yeaster extract 2.5g、NaCl 5g，放到1L烧杯中加纯水溶解，用1N NaOH调pH为7.2，定容到500ml，分装到两只500ml三解瓶中，121℃、30分钟灭菌。待冷却到50℃，加卡那霉素使终浓度为100μg/ml，超净台中分装试管2ml/只，4℃保存备用。

B.培养：取甘油保存(-20℃)菌种一支，向LB试管加入0.1ml菌种，37℃培养箱培养过夜。将培养好的菌种各取0.1ml分别加入三只新的LB试管中，一支放到37℃培养箱中培养，作为下代菌种，其余两支入到摇床中37℃、250转/分培养4小时，然后取出其中一支作为诱导前对照，将另一支试管进行诱导4小时。以上步骤重复50代。

C.制样：SDS-PAGE：各取摇床中培养好的两支试管中1ml菌液，离心，去上清，加入0.2ml纯水，振荡使菌体混悬，加入0.1ml buffer水煮5分钟。制成样品。上样20μl进行SDS-PAGE电泳，常规脱色后，进行表达量分析。各代菌种蛋白表达量扫描结果见表2。

表2各代菌种蛋白表达量扫描结果

由表2可见，各代菌种蛋白表达量相对稳定。

实施例2、重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵工艺

一、摇瓶发酵

1、种子培养

将IL-1ra工程菌单克隆接种于装有50mlLB培养基(LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L)的250ml三角瓶，37℃，200rpm，振荡培养12-15h，得到种子。

2、发酵瓶培养

在步骤1的基础上，按1％接种量将种子接入2×YT培养基(2×YT培养基的组成为：胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L)发酵培养瓶，37℃，200rpm，振荡培养2-2.5h，OD₆₀₀达1.0左右开始加异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养。

3、IPTG诱导浓度摸索

采用摇瓶，在发酵液OD₆₀₀达到1.0时分别加入IPTG，终浓度分别为0.0001mmol/L、0.001mmol/L、0.1mmol/L、0.1mmol/L和1.0mmol/L，诱导4h下瓶分析发酵液。

表3IPTG使用浓度与蛋白表达率

通过表3中目标蛋白表达情况来看，当培养基中TPTG在浓度为0.01mmol/以下时仍能起到诱导效果，但诱导能力明显下降。因此，在摇瓶实验中IPTG浓度不应该低于0.01mmol/L。

4、IPTG诱导时机摸索

采用摇瓶，在发酵生长阶段的2.5h、3h、3.5h和4h分别诱导，诱导4h下瓶分析发酵液。

表4IPTG诱导时机实验发酵数据

实验结果显示，随着诱导时OD600的增加，目标蛋白的表达率逐渐下降，杂蛋白量上升；菌体产量随着诱导时OD600的增加，先上升后下降。因此得出，从后期纯化角度看，在较低OD600(约1.0左右)时诱导时目标蛋白表达率高，有利于纯化；从菌体产量角度看，在较高OD600时诱导有助于提高菌体产量。

5、培养基优化

(1)碳源实验

以2×YT为发酵基础培养基，分别在基础料和在发酵诱导时补加不同浓度的葡萄糖和甘油，看其对菌体产量和目标蛋白表达率的影响。

表5基础料补加实验结果

表6诱导时补料实验结果

表5数据显示，基础料补加0.1-0.2％的葡萄糖可提高菌体产量，以0.1％葡萄糖效果最好，但补加葡萄糖使目的蛋白表达率下降；基础料补加甘油可以提高目标蛋白表达率，但菌体产量低，分析原因，葡萄糖为速效碳源，易被菌体利用，有利于提高菌体产量，但由于葡萄糖代谢产酸不利目标蛋白合成；甘油为缓慢利用碳源，代谢产酸量少，有利目标蛋白表达，但不利于菌体产量提高。

表6数据结果显示，在加IPTG诱导时补加葡萄糖和甘油均能提高菌体产量，补加0.2％的葡萄糖对提高菌体产量最有利，但蛋白表达率下降；补加甘油在提高菌体产量方面不如葡萄糖，补加2％甘油使目标蛋白表达率略有上升。由此得出，发酵中期补料应以甘油为主要碳源，适量配以葡萄糖。

(2)氮源实验

在发酵过程中补加酵母粉，蛋白胨，氯化铵不同氮源。采用正交实验法，做3因素3水平实验。

表7补加酵母粉、蛋白胨、氯化铵不同氮源的正交实验结果

经极差分析可知，3因素按重要性顺序为：酵母粉＞胰蛋白胨＞氯化铵，最佳配比为A₃B₃C₃由此得出，补料氮源应该以酵母粉为主，适当配以胰蛋白胨和氯化铵。

(3)发酵培养基对照实验

采用5种不同发酵培养基进行发酵，进一步摸索最佳发酵培养基。5种培养基分别为①2×YT②超级肉汤(胰蛋白胨32g/L，酵母粉20g/L，氯化钠5g/L)，③LB+M9(胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠0.5g/L，葡萄糖2g/L，十二水磷酸氢二钠15g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化钙0.011g/L，硫酸镁0.24g/L)④2×YT+M9⑤超级肉汤+M9培养基配后调PH至7.30。

表8不同发酵培养基发酵实验结果

表8实验结果显示，超级肉汤+M9培养基在菌体产量和蛋白表达双方面均比其他培养基高，优势较为明显。

(4)无机盐及维生素实验

在超级肉汤+M9培养基基础上，调整硫酸镁和氯化铵用量，同时引入维生素B₁，采用正交实验法，做3因素3水平实验。

表9硫酸镁、氯化铵用量和维生素B₁正交实验结果

经极差分析可知，3因素按重要性顺序为：硫酸镁＞维生素B₁＞氯化铵，最佳配比为A₃B₁C₃，硫酸镁对菌体产量提高影响最大，维生素B₁次之，氯化铵影响最小。

二、发酵罐实验

1、发酵培养基确定

以步骤一摇瓶发酵培养基优化的结果为依据，发酵罐基础料培养基以超级肉汤+M9培养基为基础，结合步骤一中无机盐及维生素实验的结果，发酵罐基础料培养基由以下成分组成：胰蛋白胨(购自OXOID，LOT：772424)32g/L，酵母粉(购自OXOID，LOT：1090788-02)20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B10.033g/L和丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L，其余为水(硫酸镁、氯化钙和维生素B₁各自灭菌后加入；灭菌：维生素B₁过滤除菌，其他同发酵罐一起118℃，30min高压蒸汽；灭菌前培养基调PH至7.20)。

发酵罐补料培养基以步骤一中碳源实验、氮源实验和无机盐及维生素实验的实验数据为依据，补料应当以浓缩液形式补加，将各组分扩大适当倍数。发酵罐补料培养基由以下成分组成：酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L和维生素B₁0.1g/L，其余为水(配后自然PH，118℃灭菌30min)。

2、发酵培养

(1)种子培养

一级种子培养：将IL-1ra工程菌单克隆接入装有8ml种子培养基A(即LB培养基)试管，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；

所述种子培养基A由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：

胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L；

(2)二级种子培养：按1％将一级种子液接种量接入装有150ml种子培养基B(即2×YT培养基)的1L三角瓶，共计2瓶，在PH值7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子。

所述种子培养基B由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：

胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。

(2)发酵培养

以优化后的发酵罐基础料培养基和发酵罐补料培养基进行发酵实验。分别做三个批次发酵实验，三个批次发酵实验的条件分别为：

发酵批次20100205：将培养好的二级种子液接入装有3L基础料(即初始发酵培养基)发酵罐，接种量为9％(体积百分比，接种量＝种子液体积/(种子液体积+基础料体积)×100％)，37℃下进行发酵培养，发酵过程中保持发酵体系的溶氧为30％(通过如下方式保持溶氧：调节搅拌速度和向发酵体系中通入氧气与空气混合气，通气速率为1.0L/min/L初始发酵培养基)当发酵体系的OD₆₀₀值达到7.0时(一般为发酵2.5-3h时)，开始流加补料(发酵过程中流加补料的量为：发酵0h-发酵1h：以50ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵1h-发酵2h：以100ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵2h-发酵3h：以150ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵3h-放罐前15分钟：以175ml-200ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料)，发酵过程共计补料1L，即补加的补料培养基与初始发酵培养基的体积比为1∶3。当搅拌转速达到本次发酵预设最高转速(500rpm)后溶氧降至30％以下时，开始通氧气与空气混合气，以保持发酵体系的溶氧量在30％以上。当菌体生长至对数生长中后期即OD₆₀₀达到35时，向发酵体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在发酵体系中的浓度为0.1mmol/L，诱导培养的时间为3h；发酵过程中通过2M氢氧化钠调节发酵体系的PH为7.0。

通过以上发酵方法得到发酵液，发酵液为容器内的所有物质，发酵体系也为发酵容器内的所有物质。

发酵批次20100623：将培养好的种子液接入装有3L基础料发酵罐，接种量为10％，37℃下进行发酵培养，发酵过程中保持发酵体系的溶氧为40％(通过如下方式保持溶氧：调节搅拌速度和向发酵体系中通入无菌空气，通气速率为1.0L/min/L初始发酵培养基)，当发酵体系的OD600值达到8.0时(一般为发酵2.5-3h)，开始流加补料(发酵过程中流加补料的量为：发酵0h-发酵1h：以50ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵1h-发酵2h：以100ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵2h-发酵3h：以150ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵3h-放罐前15分钟：以175m1-200ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料)，发酵过程共计补料1L。当搅拌转速达到本次发酵预设最高转速(500rpm)后溶氧降至40％以下时，开始通氧气与空气混合气，以保持发酵体系的溶氧量在40％以上。当菌体生长至对数生长中后期即OD600值达到40时，向发酵体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在发酵体系中的浓度为0.2mmol/L，诱导培养的时间为3h；发酵过程中通过2M氢氧化钠调节PH为7.1。

通过以上发酵方法得到发酵液，发酵液为容器内的所有物质，发酵体系也为发酵容器内的所有物质。

发酵批次20100714：将培养好的种子液接入装有3L基础料发酵罐，接种量为10％，37℃下进行发酵培养，发酵过程中保持发酵体系的溶氧为50％(通过如下方式保持溶氧：调节搅拌速度和向发酵体系中通入无菌空气，通气速率为1.0L/min/L初始发酵培养基)，当发酵体系的OD600值达到9.0(一般为发酵2.5-3h时)，开始流加补料(发酵过程中流加补料的量为：发酵0h-发酵1h：以50ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵1h-发酵2h：以100ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵2h-发酵3h：以150ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料，发酵3h-放罐前15分钟：以175m1-200ml/h/3L初始发酵培养基的速度补料)，发酵过程共计补料1L。当搅拌转速达到本次发酵预设最高转速(500rpm)后溶氧降50％以下时，开始通氧气与空气混合气以保持发酵体系的溶氧量为50％以上。当菌体生长至对数生长中后期即OD600值达到45时，向发酵体系中加入IPTG进行诱导培养，使IPTG在发酵体系中的浓度为0.2mmol/L，诱导培养的时间为4h；发酵过程中通过2M氢氧化钠调节PH为7.2。

通过以上发酵方法得到发酵液，发酵液为容器内的所有物质，发酵体系也为发酵容器内的所有物质。

3、发酵结果

(1)目的蛋白的产率

通过多次发酵实验，优化后的培养基和发酵培养条件适合菌体生长和蛋白表达，实现高密度发酵目的。发酵水平稳定，每升发酵液收获湿菌保持在120g以上，目的蛋白表达率30％以上，且可溶性良好，表10为三个批次的发酵实验结果。

表10部分发酵批次情况

放罐即发酵结束。

湿菌重是按照如下方法得到的：取发酵结束后的发酵液，称量体积，经4℃，8000rpm冷冻离心10min，收集菌体称重，即得到湿菌重。

产率为每升发酵液经离心后得到的湿菌重量(发酵液指发酵容器内的所有物质)。

蛋白表达率是指目的蛋白占菌体总蛋白量的百分率。

(2)SDS-PAGE电泳检测

取40μL发酵液，加5×LoadingBuffer 10μL，沸水浴10min，10000rpm离心5min，取10μL上样，跑12％分离胶的SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色2h，经脱色液脱色，Bandscan5.0(凝胶图像分析软件)分析蛋白表达情况，结果如图7所示。图7为20100623批发酵SDS-PAGE电泳结果，由图中可见，诱导1小时、2小时、3小时以及放罐上清中均出现分子量20KD的表达带，而诱导前和超声沉淀中均未检测到该表达带。

优化后培养基和发酵工艺，适合重组大肠杆菌的生长和目标蛋白的表达。本工艺具有可重复性好；菌体生长快(图8)，可大幅缩短发酵周期；菌体产量高，满足高密度发酵需要和目标蛋白表达率高，且可溶性良好等优点。发酵培养基中，酵母粉有助于提高菌体产量，甘油有助于目的蛋白表达。发酵过程中溶氧控制，诱导时OD₆₀₀值，流加补料控制对于提高菌体产量至关重要。

三、分离提取重组白细胞介素-1受体拮抗剂并鉴定

1、分离提取重组白细胞介素-1受体拮抗剂

取发酵结束后的发酵液，称量体积，经4℃，8000rpm冷冻离心10min，收集菌体称重。将菌体悬于20mmol/LTris-HCl缓冲液中，超声破碎，离心，收集上清。

2、蛋白鉴定：

(1)质谱分析测定C末端序列

取分离提取后的IL-1ra工程菌发酵液样品溶液，用溴化氰裂解，裂解后的样品进行Q-TOF2串联质谱测序。检测条件：正离子检测方式；毛细管电压3000V，cone电压50V，Collision电压10V；MCP检测器电压2150V。检测环境：环境温度20.5℃；环境相对湿度37％。检测仪器名称及型号：Q-TOF2 ESI-MS/MS(Micromass)，仪器允许误差为0.1Da。

Q-TOF2串联质谱序列分析结果见图9，该样品的C端氨基酸的序列为：Val Thr LysPhe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu。此序列与IL-1ra cDNA编码的氨基酸(序列表中序列2)C端序列一致。

(2)N-末端氨基酸的序列分析

将菌体破碎后的上清液转膜后，用EDMAN降解蛋白质N-末端氨基酸的序列分析方法测定N-末端氨基酸的序列。检测仪器名称及型号为美国Applied Biosystems公司PROCISE491。检测环境为：室内温度25℃，相对湿度46.0％RH。检测图谱见图10，得到该样品的N-末端15个氨基酸的序列为：Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser LysMet Gln Ala Phe Arg。此序列与IL-1ra cDNA编码的氨基酸(序列表中序列2)N-末端序列一致。

由以上样品中蛋白C末端序列和N-末端氨基酸的序列的分析结果可知，分离提取获得的蛋白即为重组白细胞介素-1受体拮抗剂。

Claims (7)

1.一种用于制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的发酵培养基，由以下成分组成：胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、葡萄糖、十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁、维生素B₁、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚和水；

以上成分在所述发酵培养基中浓度分别为：

胰蛋白胨32g/L、酵母粉20g/L、氯化钠0.5g/L、葡萄糖2g/L、十二水磷酸氢二钠15g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化钙0.011g/L、硫酸镁0.96g/L、维生素B₁ 0.033g/L、丙三醇聚氧丙烯聚氧乙烯醚0.2ml/L。

2.制备重组白细胞介素-1受体拮抗剂的方法，包括以下步骤：将重组菌接种于权利要求1所述发酵培养基，发酵培养，得到重组白细胞介素-1受体拮抗剂；

所述重组菌为向大肠杆菌中导入序列表中序列1所示基因，得到的重组大肠杆菌，所述序列表中序列1所示基因通过如下重组表达载体导入大肠杆菌：将序列中序列1所示基因插入PET-30a载体的多克隆位点得到的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述方法中，在所述发酵培养前，包括如下种子培养的步骤：

(1)一级种子培养：将重组菌接种于种子培养基A，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养12小时得到一级种子液；

所述种子培养基A由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基A中浓度分别为：

胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L和氯化钠10g/L；

(2)二级种子培养：将步骤(1)得到的一级种子液按1％接种量接入种子培养基B，在PH值为7.2、37℃和200rpm的条件下培养7-8小时得到二级种子液；

所述种子培养基B由以下成分组成：

胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠和水；

以上成分在所述种子培养基B中浓度分别为：

胰蛋白胨16g/L、酵母粉10g/L和氯化钠5g/L。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

发酵培养的温度为37℃；

发酵培养中，接种量为9％-10％；

发酵培养中，使发酵体系的溶氧量保持在30％-50％；

发酵培养中，发酵体系的pH值为7.0-7.2；

所述发酵体系为发酵容器内的所有物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养过程中，包括如下补料的步骤：在所述发酵体系的OD₆₀₀值达到7.0-9.0时，开始向发酵体系中补加补料培养基；

所述补加的补料培养基与权利要求1所述发酵培养基的体积比为1∶3；

所述补料培养基由以下成分组成：

酵母粉、胰蛋白胨、甘油、葡萄糖、氯化铵、硫酸镁、维生素B₁和水；

以上成分在所述补料培养基中浓度分别为：

酵母粉200g/L、胰蛋白胨20g/L、甘油200ml/L、葡萄糖10g/L、氯化铵10g/L、硫酸镁5g/L和维生素B₁0.1g/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养中，包括如下诱导培养步骤：在发酵体系的OD₆₀₀值达到35-45时，向发酵体系中加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷进行诱导培养，使异丙基-β-D硫代半乳糖苷在发酵体系中的浓度为0.1mmol/L-0.2mmol/L，诱导培养的时间为3h-4h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述大肠杆菌为大肠杆菌菌株BL21(DE3)。

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