JP2001517429A

JP2001517429A - 繊毛虫（原生動物）の連続大量培養を用いた生物由来の貴重物質を生産する発酵法

Info

Publication number: JP2001517429A
Application number: JP2000512927A
Authority: JP
Inventors: キー，トーマス
Original assignee: アヴェンティス・リサーチ・ウント・テクノロジーズ・ゲーエムベーハー・ウント・コー・カーゲー
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 2001-10-09
Also published as: PT1012246E; ATE327318T1; EP1012246B1; DE59813558D1; WO1999015634A1; US6716617B1; DE19741489A1; EP1012246A1; ES2267196T3; DK1012246T3

Abstract

(57)【要約】繊毛虫（原生動物）の連続大量培養を用いた本発明による発酵法において、繊毛虫細胞は複合無菌培地（生きた餌又は餌生物がない）で培養され、所望の生物由来の貴重物質を含有するバイオマスが連続（永続）細胞抽出によって得られる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、所望の生物由来の貴重物質を含有するバイオマスが連続（永続）細
胞抽出により得られる、繊毛虫（原生動物）の連続大量培養を用いた生物由来の
貴重物質（ｖａｌｕａｂｌｅｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）を産生する発酵法に関す
る。

【０００２】今日まで、繊毛虫（原生動物の綱）の生物工学的な利用においては初期の試み
しかなされていないが、これら生物の数多くの代謝物は、リソソーム酵素のよう
に経済的に興味深いものである。今までのところ、生物由来の貴重物質を繊毛虫
から得るための生物工学的な方法はごくわずか［主として繊毛虫のテトラヒメナ
（ＫｉｙとＴｉｅｄｔｋｅ，１９９１，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，１４；Ｋｉｙら、１９９６，ＥｎｚｙｍｅＭｉｃｒ
ｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，１８，２６８；ＫｉｙとＴｉｅｄｔｋｅ，１９９２，
Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３８，１４１）］し
か記載されておらず、しかもこれらは排出された細胞生成物、即ち繊毛虫の細胞
によって培養基へ放出される細胞生成物を得る方法に限られている。この種の方
法では、繊毛虫を発酵槽で培養し、排出された生物由来の貴重物質を含有する培
養基がほぼ規則的な間隔で周期的に除去され、新鮮な培地に交換される。培地交
換の間、繊毛虫は、細胞材料がほとんど失われずに細胞培養物がほぼ永続的に存
在するように、例えば膜の使用、細胞の固定化等によるある種の方法を使用して
、発酵槽の中に保持される。しかし、細胞に付着している生物由来の貴重物質を
得るためには、細胞全体、いわゆるバイオマスを採取することが必要である。こ
の目的のためには、一般には（即ち貴重物質の生産者としての細菌又は真菌を用
いた発酵法として一般に知られている）いわゆるバッチ発酵が実施されるが、こ
こでは発酵槽に播種し、最大のバイオマス又は生成物濃度に達するまで細胞を培
養し、次いでバイオマスが採取される。このような方法はすでにＰａｒａｍｅｃ
ｉｕｍ（ゾウリムシ）、Ｃｏｌｐｏｄａ（コルポーダ）及びＴｅｔｒａｈｙｍｅ
ｎａ（テトラヒメナ）のような様々な繊毛虫について記載されている（Ｐｒｏｐ
ｅｒとＧａｒｖｅｒ，１９６６，Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，８，２
８７；Ｓｃｈｏｅｎｅｆｅｌｄら、１９８６，Ｊ．Ｐｒｏｔｏｚｏｏｌ．，３３，２２２；ＫｉｙとＴｉｅｄｔｋｅ，１９９２，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３７，５７６）。

【０００３】しかしながら、バッチ発酵法には、時折発酵槽を洗浄して再播種すること、及
び特に重要な増殖期の間は、細胞培養を集中モニタリングして面倒をみなければ
ならないことという根本的な欠点がある。

【０００４】貴重物質の生産者としての細菌又は酵母を用いた発酵技術としては、バッチ発
酵法だけでなく、「連続発酵法」も知られている。この方法では、ある細胞密度に達するまで細胞が発酵槽で培養され、次いで連続細胞抽出によって発酵槽から
採取されるが、この間新鮮な培養基が同時に同量追加される。単位時間あたりに
抽出される細胞の量（細胞抽出量）は、発酵槽に残っている細胞が、連続的な細
胞分裂によって、採取による細胞密度の低下を容易に補填し得るほどのものであ
る。ある範囲の細胞抽出率又は希釈率「Ｄ」では、培養物、従って所望される生
成物が連続的に採取されても、発酵槽の細胞密度は一定に保たれる。

【０００５】原則として、この連続発酵法はバッチ発酵法より経済的に断然優れているが、
その実現には、培養又は飼育される生物が比較的迅速かつ一様に成長及び増殖す
ること、及び連続発酵法で遭遇する撹拌・剪断力に対してそれらが非感受性であ
ることが求められる。

【０００６】しかしながら、繊毛虫については、しばしば非常にゆっくりとしか成長及び増
殖しないこと、様々な成長期を経ること、及び撹拌・剪断力に対して非常に敏感
に反応するということが一般に知られている（ＣｕｒｄｓとＣｏｃｋｂｕｒｎ，
１９７１，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ
６６，９５−１０９；ＭｉｄｄｌｅｒとＦｉｎｎ，１９６６，Ｂｉｏｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ８，７１−８４）。繊
毛虫の連続大量培養の試みについての記載はあるが、それには細菌を含有する培
養基が必ず使用されていて、１０日以上の培養にもかかわらず、最大の細胞密度
で数万個／ｍｌの細胞しか得られていない（ＣｕｒｄｓとＣｏｃｋｂｕｒｎ，同
上）。工業スケールでの使用には、そのような細胞密度は全く不十分である。さ
らに、ＣｕｒｄｓとＣｏｃｋｂｕｒｎにより記載された培養が工業使用に完全に
適さないのは、餌生物、即ち細菌を含有する培地の使用を指示するからである。
細菌含有の培養基では、細菌もまた当然ながら永続的に増殖し、その程度は存在
している繊毛虫の量次第である。繊毛虫集団と細菌集団との共存的な平衡はきわ
めて不安定であり、些細な介入物でも両集団に実質的な変化を引き起こす可能性
がある。

【０００７】さらに、ＣｕｒｄｓとＣｏｃｋｂｕｒｎの実験は２５年以上も前に実施され、
繊毛虫が工業スケールの連続発酵法に適さないという通説を明らかに裏付けてき
た。

【０００８】上記の欠点を回避し、特に工業使用に非常に適している、細胞抽出を用いた繊
毛虫の連続発酵法を提供することが本発明の目的である。

【０００９】この目的は、繊毛虫の細胞を無菌複合培地で培養するという最初に述べたタイ
プの方法によって達成される。

【００１０】本発明の目的にとって、複合培地とは、微生物を培養して得られる天然の生成
物又は抽出物が水性溶液に溶けた栄養培地である。

【００１１】本発明の目的にとって、無菌培地とは、飼料及び餌生物（いわゆる食用生物）
を含まない栄養培地である。

【００１２】本発明による方法は、複合無菌培地を使用する細胞抽出を用いた連続発酵法が
、純粋な繊毛虫培養物を使用して、成功裡にかつ経済的に十分見返りのあるやり
方で実行し得るという驚くべき発見に基づいている。テトラヒメナの場合、培養
開始後３日目にして、１００万個の細胞／ｍｌというオーダーの連続細胞密度が
問題なく実現され得る。従って、既知の発酵槽を使用して、無菌培地において（
即ち生きた飼料又は餌生物のない状態で）通常遭遇する剪断力の存在下では、数
十万〜百万個の細胞／ｍｌという細胞密度の連続大量培養に繊毛虫は適さないと
いう以下の理由による当業者の偏見は、克服される：・それらは、あまりにゆっくりと、しかも必ずしも十分に一様ではなく増殖し、・撹拌・剪断力に対してほとんど抵抗性を示さず、そのような力によってごく容
易にかつすぐに損傷及び／又は破壊され、・これまでに実行されてきた培養の試みでは、餌生物の含有培地、従って実質的
に天然の養分を使用したにもかかわらず、相対的にごく低い最大細胞密度にしか
到達していない。

【００１３】本発明による方法を使用すれば、細胞に付着した生物由来の貴重物質の工業生
産用に繊毛虫を利用すること、従って、特にタウロリピド（ｔａｕｒｏｌｉｐｉ
ｄｓ）及びテトラヒマノール（ｔｅｔｒａｈｙｍａｎｏｌ）のような繊毛虫由来
としてのみ知られている貴重物質又は、例えばγ−リノレン酸、ドコサヘキサエ
ン酸、エイコサペンタエン酸、オクタテトラエン酸及びアラキドン酸のような、
繊毛虫によってごく特異的に産生される物質を、経済的に重要なスケールで獲得
することが初めて可能になる。

【００１４】繊毛虫は純粋な培養物として、即ち他の生物がない状態に保たれるので、重要
な妨害要因が初めから回避され、技術上の経費でさえ最少に制限される：例えば
餌生物を再増殖させるためにの発酵槽は全く余計である。

【００１５】抽出されたバイオマスから得られる生成物は、ペプチド及びタンパク質、特に
酵素（例えばβ−ヘキソサミニダーゼ、Ｌ−アスパラギナーゼ、ジイソプロピル
フルオロホスファターゼ、グルコシダーゼ、フコシダーゼ、ホスファターゼ、ヌ
クレアーゼ又はカテペプシン．Ｌ）、脂肪酸及び脂質（例えば、γ−リノレン酸
、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、オクタテトラエン酸、アラキド
ン酸、ホスホノリピド、タウロリピド又はテトラヒマノール）、多糖類、核酸、
二次代謝物、ポリマー等を包含する。バイオマスそのものも生成物であり得る。

【００１６】本発明の方法により培養し得る繊毛虫の群は、無菌栄養培地又は餌生物の死滅
バイオマスを栄養分として含む栄養培地において従来の静置及び／又は振盪培養
又はバッチ発酵において原則的に培養し得る生物分類上のすべての繊毛虫亜群を
包含する。これらは、特に、繊毛虫亜群であるＨｏｌｏｔｒｉｃｈａ（全毛類）
、Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈａ（緑毛類）、Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈａ（旋毛類）及びＳ
ｕｃｔｏｒｉａ（吸管虫類）であり、非常に特定すれば、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎ
ａ（テトラヒメナ）、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ（ゾウリムシ）、Ｃｏｌｐｏｄａ（
コルポーダ）、Ｇｌａｕｃｏｍａ（グラウコマ）、Ｐａｒａｕｒｏｎｅｍａ（パ
ラウロネマ）、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉｅｌｌａ（エンゲルマニエラ）、Ｓｔｙｌ
ｏｎｉｃｈｉａ（スチロニチア）、Ｅｕｐｌｏｔｅｓ（ユープロテス）及びＣｏ
ｌｐｉｄｉｕｍ（コルピデイウム）の目（Ｋ．Ｈａｕｓｍａｎｎ：Ｐｒｏｔｏｚ
ｏｏｌｏｇｉｅ，ＴｈｉｅｍｅＶｅｒｌａｇ，１９８５による分類）である。
さらに、本発明は野生株に限定されず、突然変異体及び組換え体の株を包含する
。

【００１７】本発明による方法の好ましい態様では、発酵は撹拌又は泡沫カラム、又はエア
リフト発酵槽において実行される。

【００１８】発酵の間、ｐＨは、好ましくはｐＨ４〜ｐＨ９の範囲の値に調節され得る。繊
毛虫の種によって、発酵温度は１５〜４０℃である。

【００１９】炭素源として、好ましくは以下に挙げる物質の少なくとも１つが使用される：
グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、デンプン、
フコース、グルコサミン、ラクトース、糖蜜、デキストラン、脂肪酸（例えば、
オレイン酸）、大豆油、ひまわり油、グリセロール、グルタミン酸、マンニトー
ル、脱脂粉乳又は酢酸塩。

【００２０】炭素源の濃度は、培養基に対して０．２〜２０重量％の範囲とすべきである。窒素源として、好ましくは以下に挙げる物質の少なくとも１つが使用される：
ペプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、肉抽出物、脱脂粉乳、カサミノ酸（ｃａｓ
ａｍｉｎｏａｃｉｄ）、コーンスティープリカー、グルタミン酸ナトリウム及
び尿素のような有機窒素源、酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム又は硝酸アンモニウムのような無機窒素源。窒素源の濃度は、培養基に対
して０．１〜１０重量％の範囲とすべきである。

【００２１】本発明による方法の変形では、少なくとも１つのリン酸源、例えばリン酸カリ
ウム又はリン酸二水素カリウムが培養基へ追加される。それとは別に又はさらに
加えて、問題にしている繊毛虫の成長及び増殖速度をさらに最適化するために、
硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、マグネシウム、鉄、銅、カルシウム、ビタ
ミン、微量元素及び増殖因子を追加することも可能である。

【００２２】連続的に採取されるバイオマスは、好ましくは、遠心分離、限外濾過（ｔａｎ
ｇｅｎｔｉａｌｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、マイクロ濾過、沈降法、浮上法又は
分離装置を使用して培養基から分離される。しかしながら、他の方法も実行可能
である。

【００２３】本発明による方法の好ましい態様では、細胞抽出率又は希釈率Ｄ（＝１日あた
りの交換量／発酵槽の稼動量）は、繊毛虫株の増殖速度に依存して、０．１〜１
２（＝１／１０〜１２／１）の範囲である。以下に、実施例を使用して本発明を
より詳細に示す。実施例１：テトラヒメナ・ピリフォーミス（ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）の連続発酵テトラヒメナ・ピリフォーミスを次の条件下で、ＢｉｏｓｔａｔＭＤタイプ
（ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈ．Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）の２リットル発酵槽で培
養した。培地：以下のものを水に加える。 − ０．５重量％のプロテオースペプトン（ＰｒｏｔｅｏｓｅＰｅｐｔｏｎｅ） − ０．１重量％の酵母抽出物 − ３重量％の液状デンプン糖（ｌｉｑｕｉｄｓｔａｒｃｈｓｕｇａｒ） − １ｍｌ／ｌの微量の鉄（ｉｒｏｎｔｒａｃｅ）発酵条件： − 温度：３０℃ − 酸素飽和度：２０％ − ｐＨ調節：ｐＨ７ − スタート（ｔ_0h）：接種量５０，０００細胞／ｍｌ；バッチ方式による培養 − 連続発酵の開始：ｔ_51hでＤ＝１； − 連続発酵の継続：ｔ_78hからＤ＝１．５；ｔ_98hからＤ＝２．４培養開始時に、培地に約５０，０００個の細胞を接種し、細胞集団が増殖期の
終点及び定常期に入る直前になるまで、この開始カルチャーをバッチ法により培
養した。この時点［この実施例では接種後５１時間（ｔ_51h）］で発酵を連続反応へ切換えた。即ち、細胞含有培地を連続除去し、同量の無細胞培地を加えた。
連続発酵の開始時は、細胞抽出又は希釈率（＝１日あたりの培地交換量／発酵槽
の稼動量をＤ＝１とした。つまり、１日につき、発酵槽（２リットル）の全量を
一度交換し、繊毛虫含有培地２リットルを得た。この培地は１ｍｌあたり約１０
０万個の細胞を含有した。

【００２４】連続発酵の開始後２７時間（接種後７８時間＝ｔ_78h）の時点で、細胞抽出率又は希釈率をＤ＝１．５へ増加させた。即ち、この時点以降、１日あたり約３ｌ
の繊毛虫含有培地を得た。細胞密度は細胞数約１００万個／ｍｌでほとんど変わ
らなかった。さらに２０時間後（接種後９８時間＝ｔ_98h）、細胞抽出率又は希釈率をさらにＤ＝２．４へ増加させた。即ち、１日あたり約５リットルの繊毛虫
含有培地を得た。細胞密度は、前と同じように、細胞数約１００万個／ｍｌでほ
とんど変わらなかった。

【００２５】この発酵法の結果を図１に図式的に示す。そこに示されたプロットから、細胞
を連続的に抽出しても、繊毛虫は希釈されずに永続的かつ連続的に増殖すること
が明らかである。換言すれば、比較的高い細胞抽出（Ｄ＝２．４）でも、培養物
は細胞抽出と細胞増殖との動的平衡状態にあった。実施例２：テトラヒメナ・サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の連続発酵テトラヒメナ・サーモフィラを以下の条件下で、ＢｉｏｓｔａｔＭＤタイプ
（ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈ．Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）の２リットル発酵槽で培
養した。培地：以下のものを水に加える。 − ５ｇ／ｌのプロテオースペプトン − １ｇ／ｌの酵母抽出物 − １ｍｌ／ｌの微量の鉄 − １重量％の液状デンプン糖の形態のグルコース発酵条件： − 温度：３０℃ − 酸素飽和度：２０％ − ｐＨ調節：ｐＨ７ − スタート（ｔ_0h）：接種量５０，０００細胞／ｍｌ；バッチ方式による培養 − 連続発酵の開始：ｔ_45hでＤ＝１．２； − 連続発酵の継続：ｔ_178hからＤ＝２．４；ｔ_198hからＤ＝３この方法は、ほぼ実施例１の記載通りに実行した。

【００２６】図２に、上記発酵条件下での繊毛虫集団の成長又は増殖行動を図式的に示す。
示されたプロットから、細胞抽出又は希釈率のＤ＝１．２からＤ＝２．４への増
加（同一２検体）により細胞密度が細胞数約１００万個／ｍｌから細胞数約５０
万個／ｍｌへ減少（半減）したが、その後この細胞密度が比較的一定な状態を保
ち、細胞抽出又は希釈率をさらにＤ＝２．４からＤ＝３へ増加させてもそれ以上
減少しなかったことが明らかである。実施例３：テトラヒメナ・サーモフィラ（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）の連続発酵培地：以下のものを水に加える。 − ２０ｇ／ｌの脱脂粉乳 − １０ｇ／ｌのグルコース − ５ｇ／ｌの酵母抽出物 − １ｍｌ／ｌの微量の鉄発酵条件： − 温度：３０℃ − 酸素飽和度：２０％ − 撹拌装置：２と同じ。酸素調節用カスケード（ｃａｓｃａｄｅ） − ｐＨ調節：ｐＨ７ − スタート（ｔ_0h）：接種量５０，０００細胞／ｍｌ；バッチ方式による培養 − 連続発酵の開始：ｔ_20hでＤ＝１．１２５； − 連続発酵の継続：ｔ_68hからＤ＝１．９；ｔ_139hからＤ＝４．１４；ｔ_168hからＤ＝４．９４この方法は、ほぼ実施例１の記載通りに実行した。

【００２７】図３に、上記発酵条件下での繊毛虫集団の成長又は増殖行動を図式的に示す。
示されたプロットは、連続発酵の開始時に、細胞密度が最初の細胞数約１００万
個／ｍｌから細胞数約６０万個／ｍｌへ減少したことを示す。しかしながら、細
胞抽出又は希釈率が上昇しても、細胞集団は１．５日（約３６時間）以内に回復
し、連続発酵の開始から約４日（９０時間）後、再びその最初の細胞密度である
細胞数１００万個／ｍｌに再び達した。細胞抽出又は希釈率がさらにＤ＝４．１
へ、最終的にはＤ＝４．９へ増加しても、実測値は決してこの数値以下にはなら
なかった。

【００２８】図３の下のプロットは、培養継続中における細胞の乾燥重量（ｇ／ｌ）の定量
結果を示す。このプロットは、本質的に細胞増殖の曲線に本質的に平行となるが
、細胞増殖が個々の繊毛虫細胞の細胞サイズ又は細胞量を犠牲にして起こるので
はなく、より多くのバイオマスが実際に産生されていることを示す。

【００２９】実施例４：Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｙｌｕｍの連続発酵Ｃｏｌｐｉｄｉｕｍｃａｍｐｙｌｕｍを以下の条件下で、Ｂｉｏｓｔａｔ
ＭＤタイプ（ＢｒａｕｎＢｉｏｔｅｃｈ．Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ）の２ｌ発酵槽
で培養した。培地：以下のものを水に加える。 − ２０ｇ／ｌの脱脂粉乳 − １０ｇ／ｌのグルコース − ５ｇ／ｌの酵母抽出物 − １ｍｌ／ｌの微量の鉄発酵条件： − 温度：２５℃ − 酸素飽和度：２０％ − 撹拌装置：１０８ｒｐｍ − ｐＨ調節：ｐＨ７ − スタート（ｔ_0h）：接種量５０，０００細胞／ｍｌ；バッチ方式による培養 − 連続発酵の開始：ｔ_114.75hでＤ＝０．６６５； − 連続発酵の継続：ｔ_140hからＤ＝０．６３２；ｔ_159hからＤ＝０．４６２この方法は、ほぼ実施例１の記載通りに実行した。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年１２月８日（２０００．１２．８）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】複合無菌培地において繊毛虫細胞を培養することを含む、生
物由来の貴重物質を含有するバイオマスが連続細胞抽出により得られる、繊毛虫
（原生動物）の連続大量培養を用いて生物由来の貴重物質を生産する発酵法。
【請求項２】前記繊毛虫が、Ｈｏｌｏｔｒｉｃｈａ、Ｐｅｒｉｔｒｉｃｈ
ａ、Ｓｐｉｒｏｔｒｉｃｈａ及びＳｕｃｔｏｒｉａの生物分類群の１つ、特にＴ
ｅｔｒａｈｙｍｅｎａ、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ、Ｃｏｌｐｏｄａ、Ｇｌａｕｃｏ
ｍａ、Ｐａｒａｕｒｏｎｅｍａ、Ｅｎｇｅｌｍａｎｎｉｅｌｌａ、Ｓｔｙｌｏｎ
ｉｃｈｉａ、Ｅｕｐｌｏｔｅｓ及びＣｏｌｐｉｄｉｕｍの目に属し、野生株だけ
でなく、これらの株の突然変異体及び／又は組換え体を包含する、請求項１に記
載の発酵法。
【請求項３】撹拌又は泡沫カラム、又はエアリフト発酵槽において発酵が
実行される請求項１又は２に記載の発酵法。
【請求項４】ｐＨ４〜ｐＨ９の範囲のｐＨ、及び／又は約１５〜約４０℃
の範囲の発酵温度で発酵が実行される、請求項１〜３に記載の発酵法。
【請求項５】グルコース、フルクトース、キシロース、スクロース、マル
トース、デンプン、フコース、グルコサミン、ラクトース、糖蜜、デキストラン
、脂肪酸（例えば、オレイン酸）、大豆油、ひまわり油、グリセロール、グルタ
ミン酸、マンニトール、脱脂粉乳及び酢酸塩からなる群からの１つ又はそれ以上
の物質を含む炭素源を培地が含有する、請求項１〜４に記載の発酵法。
【請求項６】炭素源の濃度が培養基に対して約０．２〜約２０重量％の範
囲の値を有する、請求項５に記載の発酵法。
【請求項７】ペプトン、酵母抽出物、麦芽抽出物、肉抽出物、脱脂粉乳、
カサミノ酸、コーンスティープリカー、グルタミン酸ナトリウム、尿素、酢酸ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム及び硝酸アンモニウムからな
る群からの１つ又はそれ以上の物質を含む窒素源を培地が含有する、請求項１〜
６に記載の発酵法。
【請求項８】窒素源の濃度が培養基に対して約０．１〜約１０重量％の範
囲の値を有する、請求項７に記載の発酵法。
【請求項９】少なくとも１つのリン酸源、好ましくはリン酸カリウム及び
／又はリン酸二水素カリウムを培地が含有する、請求項１〜８に記載の発酵法。
【請求項１０】硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、マグネシウム、鉄、
銅、カルシウム、ビタミン、微量元素からなる群からの１つ又はそれ以上の物質
を培地が含有する、請求項１〜９に記載の発酵法。
【請求項１１】繊毛虫の餌生物の死滅バイオマスを培地が含有する、請求
項１〜１０に記載の発酵法。
【請求項１２】細胞抽出物（採取されたバイオマス）に含有される細胞が
、遠心分離及び／又は限外濾過及び／又はマイクロ濾過及び／又は沈降法及び／
又は浮上法により培養基から分離される、請求項１〜１１に記載の発酵法。
【請求項１３】細胞抽出率又は希釈率（１日あたりの交換量／発酵槽の稼
動量）が、０．１〜１２の範囲の値を有する、請求項１〜１２に記載の発酵法。
【請求項１４】生物由来の貴重物質が、ペプチド及びタンパク質、特に酵
素、脂肪酸及び脂質、多糖類、核酸、二次代謝物及びポリマーからなる群からの
１つ又はそれ以上の物質であるか、又はバイオマスそのものが貴重物質（例えば
動物飼料）である、請求項１〜１３に記載の発酵法。