CN104781389A

CN104781389A - 蛋白质生产促进剂

Info

Publication number: CN104781389A
Application number: CN201380043529.5A
Authority: CN
Inventors: 户村美沙代; 岩间武久; 猿桥康一郎; 西野泰斗; 堀川雅人; 川原浩治
Original assignee: INDEPENDENT ADMINISTRATIVE Corp NATIONAL ADVANCED SPECIAL SCHOOL ORGAN; Nissan Chemical Corp
Current assignee: INDEPENDENT ADMINISTRATIVE Corp NATIONAL ADVANCED SPECIAL SCHOOL ORGAN; Nissan Chemical Corp; Institute of National Colleges of Technologies Japan
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2033-08-23
Also published as: WO2014030726A1; TW201414840A; EP2889368A1; EP2889368A4; TWI612135B; JPWO2014030726A1; KR20150054850A; EP2889368B1; CN104781389B; JP6218285B2

Abstract

本发明涉及蛋白质生产促进剂，所述促进剂使得对含有血清或血清替代物的动物细胞培养基添加多糖并且极大地增加生产的期望的蛋白质的量成为可能。本发明进一步涉及使用含有该蛋白质生产促进剂的培养基生产蛋白质的方法。

Description

蛋白质生产促进剂

技术领域

本发明涉及细胞培养，特别地，涉及适合用于通过动物细胞（例如CHO细胞）高生产蛋白质的蛋白质生产促进剂和含有所述促进剂的培养基。此外，本发明涉及使用所述蛋白质培养促进剂和含有所述促进剂的培养基的蛋白质生产方法。

技术背景

近年来，在生命科学领域，通过大量培养生产有用蛋白质的动物细胞在工业水平生产目标的有用蛋白质变得非常重要。当天然或重组蛋白质等通过培养所述动物细胞或导入编码期望蛋白质的基因的动物细胞生产时，为了所述动物细胞的生长，在基本营养物（诸如盐、糖类、氨基酸、维他命等）以外使用动物细胞生长因子。作为动物细胞生长因子，血清组分诸如胎牛血清、小牛血清等是通常使用的。通常的，当使用胎牛血清或小牛血清时，其需要以约5-20%体积添加至基础培养基。

然而，诸如胎牛血清、小牛血清等的血清受到供应限制并且通常非常昂贵。这导致有用蛋白质的生产成本的增加。

此外，来自哺乳动物来源的生长因子和血清存在问题，因为它们涉及疯牛病、牛绵状脑病、传染性海绵状脑病，和进一步的，朊病毒相关疾病诸如克雅氏病（Creutzfeldt-Jakob disease），并且来自哺乳动物的血清可以被病毒或支原体污染，因为其不能在高压灭菌器等中灭菌。因此，从安全方面，已经发展出无血清培养方法，其中动物细胞培养在不含血清的环境中。在无血清培养方法中，使用天然存在的纯化的蛋白质，诸如胰岛素、转铁蛋白、生长因子等，重组蛋白质等作为血清（血清替代物）效果的替代品。然而，这些蛋白质通常比胎牛血清或小牛血清更加昂贵，并且其供应受到限制。

如上文提及的，因为血清和血清代替物是昂贵的，并且其供应受到限制，因此期望发展用于仍更高效地生产有用蛋白质的技术。

发明概述

通过本发明解决的问题

本发明的问题是提供蛋白质生产促进剂，用于通过使用动物细胞生产期望的蛋白质。本发明的进一步的问题是提供通过使用含有所述蛋白质生产促进剂的培养基的蛋白质生产方法。

解决问题的方法

本发明人已进行了深入研究以试图解决上文提及的问题并且发现向用于动物细胞的含有血清或血清替代物的培养基添加多糖显著地增加了期望的蛋白质生产的量，这导致了本发明的完成。

因此，本发明涉及以下[1]至[15]。

[1] 用于动物细胞的培养基添加物，其包含多糖。

[2] [1]的添加物，所述添加物通过培养的动物细胞促进期望的蛋白质的生产。

[3] [2]的添加物，所述添加物促进上文所述动物细胞的每一个细胞的蛋白质生产。

[4] [1]的添加物，其中上文所述多糖具有阴离子官能团。

[5] [4]的添加物，其中上文所述阴离子官能团选自羧基、磺酸基和磷酸基中至少一种。

[6] [5]的添加物，其中上文所述多糖选自透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、黄原胶、角叉菜胶、迪特胶、藻酸、岩藻依聚糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李糖聚糖及其盐中至少一种。

[7] [6]的添加物，其中上文所述多糖是脱酰基结冷胶或其盐。

[8] 用于动物细胞的培养基，其包含根据 [1]至[7]中任一项的所述添加物。

[9] [8]的培养基，所述培养基具有不低于1% (w/v) 并且不高于15%(w/v)的血清浓度。

[10] [8]的培养基，具有血清替代物的浓度不低于1% (w/v) 并且不高于15%(w/v)，其中所述血清替代物选自血浆蛋白质、激素、生长因子和盐。

[11] [8]至[10]中任一项的培养基，所述培养基进一步包含选自氨基酸、维他命、能源、渗透压调节剂、铁源和pH缓冲液中的至少一种。

[12] 通过使用动物细胞培养生产蛋白质的方法，所述方法包括在[1]至[7]中任一项的添加物的存在下或在根据[8]至[11]中任一项的培养基中培养所述动物细胞。

[13] [12]的方法，其中所述动物细胞在至少（a）或（b）时期培养：

（a）当所述培养的动物细胞可以充分地生长的部分或全部时期，

（b）当所述动物细胞可以充分地生产期望的蛋白质的部分或全部时期。

[14] 促进在培养基中的细胞生产的蛋白质的量的方法，其包括在[1]至[7]中任一项的添加物的存在下或在根据[8]至[11]中任一项的培养基中培养所述动物细胞。

[15] [14]的方法，所述方法促进所述动物细胞的每一个细胞的生产的蛋白质的量。

本发明效果

本发明用于动物细胞的培养基添加物可以增加期望的蛋白质的生产量，当将所述添加物添加至用于动物细胞的培养基时，能够生产蛋白质的动物细胞使用获得的培养基培养，并且从培养基和/或动物细胞中收集生产的蛋白质。特别地，所述添加物可以增加每一个细胞生产的蛋白质的量。

此外，因为本发明用于动物细胞的培养基添加物可以通过简单地添加至培养基促进期望蛋白质的生产量，其在操作和处理方面是有优势的。

此外，因为所述添加物可以更高效地生产期望的蛋白质，所以其同样在生产成本方面是有优势的，并且可以极大地有助于，例如，生物制药产品（诸如抗体药物等）的大量供应等。

附图简述

图1显示当人骨髓瘤源细胞系SC-01MFP在脱酰基结冷胶（0.015%）存在和其不存在（对照）的情况下培养时，细胞数量的增加和λ链生产量的比较。

图2显示在脱酰基结冷胶（0.015%）存在下和如图1中对照存在下λ链生产量在图中面积的比较，其中λ链生产量在图中的面积使用细胞数量增加在图中的面积进行修正，通过梯形试样法计算当SC-01MFP培养于脱酰基结冷胶存在（0.015%）和其不存在（对照）情况下时，细胞数量增加（左图）和λ链生产量（右图）的图中面积获得所述修正，在测试中使用图1中描述的SC-01MFP（图中λ链生产量面积/图中细胞数量增加面积）。

图3显示了当在存在脱酰基结冷胶（0.025%）和其不存在（对照）的情况下培养通过将人干扰素β（IFN-β）基因掺入CHO-K1中获得的中国仓鼠卵巢源细胞系（CHO-K1）时，细胞数量增加和IFN-β产量的比较。

图4显示在脱酰基结冷胶（0.025%）存在下和如图1中对照存在下IFN-β生产量在图中面积的比较，其中IFN-β生产量在图中的面积使用细胞数量增加在图中的面积进行修正，通过梯形试样法计算当CHO-K1培养于脱酰基结冷胶存在（0.025%）和其不存在（对照）的情况下时，细胞数量增加（左图）和IFN-β生产量（右图）的图中面积获得所述修正，在测试中使用图3中描述的CHO-K1（图中IFN-β生产量面积/图中细胞数量增加面积）。

图5显示当凝胶在经超声处理和添加至培养基重悬时，凝胶微粉化处理对细胞增殖的效果。

图6显示当凝胶在经超声处理和添加至培养基重悬时，凝胶微粉化对细胞IFN-β生产的效果。

图7显示滚瓶材料的区别对凝胶中细胞增殖潜能的效果。

图8显示滚瓶材料的区别对凝胶中细胞IFN-β生产的影响。

实施方案描述

1. 培养基添加物/蛋白质生产促进剂

本发明是基于发现当使用动物细胞生产蛋白质时，通过至少在当培养的细胞可以充分生长的一段时期内或当待生产的期望的蛋白质可以充分生产的部分或全部时期内对培养基添加多糖，所述目标蛋白质至少可以部分地高生产。因此，本发明提供了含有多糖的用于动物细胞的培养基添加物、用于促进动物细胞的蛋白质生产的试剂（在下文中有时缩写为“本发明的培养基添加剂/蛋白质生产促进剂”）。

用于本发明的多糖优选地具有阴离子官能团。作为阴离子官能团，可以提及羧基、磺酸基、磷酸基及其盐，并且羧基或其盐是优选的。

本发明中使用的多糖，其中不小于10个单糖（例如，丙糖、丁糖、戊糖、己糖、庚糖等）是聚合的，更优选地，酸性单糖具有阴离子官能团。所述酸性单糖不是特别限定的，只要在其结构中具有阴离子官能团，并且包括，例如，具有糖醛酸（例如，葡糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖醛酸、甘露糖醛酸）的多糖，在其部分结构中具有磺酸基或磷酸基的多糖，和具有所述两种结构的多糖，和不但包含天然获得的多糖还包含通过微生物生产的多糖、通过遗传工程生产的多糖和使用酶人工合成的多糖。

更特别地，所述多糖的实例包括由选自透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、鼠李聚糖胶、迪特胶（diutan gum）、黄原胶、角叉菜胶、黄原胶、己糖醛酸、岩藻依聚糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李聚糖及其盐的一种或多种构成的聚合物。

所述盐包括，例如，碱金属盐，诸如锂、钠、钾，具有碱土金属的盐，诸如钙、钡、镁和具有铝、锌、铜、铁、铵、有机碱和氨基酸等盐的盐。其优选的实例包括，但不限于，二价金属盐，诸如钙、镁、锌、铁、铜等。

这些的重均分子量优选地为10,000 至 50,000,000，更优选地为100,000 至 20,000,000、更优选地为1,000,000 至 10,000,000。本发明中的分子量，可以通过凝胶渗透色谱（GPC）基于支链淀粉测量。

本发明中使用的多糖的更优选的特定的实例包括脱酰基结冷胶、角叉菜胶和黄原胶，最优选的实例包括脱酰基结冷胶。本发明中的脱酰基结冷胶是含有以1-3键合的葡萄糖、1-4键合的葡糖醛酸、1-4键合的葡萄糖和1-4键合的鼠李糖的4分子糖作为组成单元的线性聚合物多糖，其是下文式（I）的多糖，其中R1、R2各自是氢原子，并且n是两个或更多个的整数。R1可以含有丙三基，R2可以含有乙酰基，并且乙酰基和丙三基的含量优选地不多于10%，更优选地不多于1%。

本发明的多糖可以通过化学合成方法获得。当所述化合物是天然存在的物质时，其优选地通过常规技术，通过提取、分离和纯化从含有所述化合物的各种植物、各种动物、各种微生物中获得。对于提取，所述化合物可以通过使用水和超临界气体高效地提取。例如，作为结冷胶的生产方法，在发酵培养基中培养生产结冷胶的微生物，在真菌外产生的粘膜物质通过一般的纯化方法回收，并且在干燥步骤后，磨成粉状等，使之粉末化。当它是脱酰基结冷胶时，当前文提及的粘膜物质回收时应用碱处理，将键合到1-3键合的葡萄糖残基上的所述丙三基和所述乙酰基脱酰并回收。纯化方法的实例包括液液分离、分段沉淀、结晶化、各种离子交换层析、使用Sephadex LH-20等的凝胶过滤层析、使用活性炭、硅胶等的吸附层析、通过薄层色谱的活性物质的吸附和解吸处理、使用反相柱等的高效液相色谱，并且可以移除杂质并且化合物可以通过单独地或以任何顺序组合或重复地使用上述方法进行纯化。生产结冷胶的微生物的实例包括，但不限于，少动鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas elodea）和通过改变少动鞘氨醇单胞菌基因获得的微生物。此外，当它是脱酰基结冷胶时，可以使用商业上可获得的产品，例如，SANSHO Co., Ltd.生产的“KELCOGEL (CP Kelco的注册商标) CG-LA”，San-Ei Gen F.F.I., Inc.生产的“KELCOGEL (CP Kelco的注册商标)”等。

本发明的培养基添加物/蛋白质生产促进剂除任何前文提及的多糖之外，还可以含有通常添加至培养基添加物的多种组分。可选地，多糖本身可以单独地作为本发明的培养基添加物/蛋白质生产促进剂使用。

本发明的培养基添加剂可以在对动物细胞培养没有非优选的影响的范围内合适地添加至培养基，只要其可以展示作为蛋白质生产促进剂的功能，也就是，只要其通过动物细胞生产，相比于不添加多糖的生产显著地增加了目标蛋白质的产量。例如，只需要添加本发明培养基的培养基添加物，使得上文提及的多糖在培养基中的浓度为0.001%至1.0%（重量/体积，在下文中有时缩写为w/v），优选地为0.002% 至 0.4%（重量/体积），更优选地为0.005% 至 0.2%（重量/体积），仍更优选地为0.005% 至 0.05%（重量/体积）。例如，当使用脱酰基结冷胶作为多糖时，其在0.001%至1.0% （重量/体积）添加至培养基，优选地为0.001% 至 0.5%（重量/体积），更优选地为0.005% 至 0.1% （重量/体积），最优选地为0.01% 至 0.05%（重量/体积）。浓度可以通过以下公式计算。

浓度 (%) = 特定化合物的重量(g)/培养基组合物的体积(ml) x 100。

2.培养基组合物

本发明培养基添加物可以使用的培养基不是特别限定的，只要其是用于动物细胞的培养基。根据通过培养基组合物的分类，可以提及例如天然培养基、半合成培养基和合成培养基。根据通过形状的分类，可以提及半固体培养基、液体培养基等。

其实例包括，但不限于，Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）、hamF12培养基（Ham氏营养混合物F12）、DMEM/F12培养基、McCoy氏 5A 培养基、Eagle MEM 培养基(Eagles氏极限必需培养基; EMEM)、αMEM 培养基(α改良的Eagles氏极限必需培养基; αMEM)、MEM 培养基(极限必需培养基)、RPMI 1640 培养基、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)、MCDB131 培养基、William 培养基E、IPL41 培养基、Fischer氏培养基、E-RDF 培养基(由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO.、LTD.生产)、Ultra CHO (注册商标) 培养基(由Lonza生产)、EX-CELL (注册商标) 302 培养基(由Sigma Aldrich生产)、EX-CELL (注册商标) 325-PF 培养基(由Sigma Aldrich生产)、EX-CELL (注册商标) ACF CHO 培养基(由Sigma Aldrich生产)、EX-CELL (注册商标) CHO DHFR 培养基(由Sigma Aldrich生产)、EX-CELL (注册商标) CD CHO 培养基(由Sigma Aldrich生产)、EX-CELL (注册商标) CD CHO-2 培养基(由Sigma Aldrich)、EX-CELL (注册商标) CD CHO-3 培养基(由Sigma Aldrich生产)、CD OptiCHO (注册商标) 培养基(由Life Technologies生产)、CD CHO 培养基(由Life Technologies生产)、CD CHO AGT (注册商标) 培养基(由Life Technologies生产)、CD FortiCHO (注册商标) 培养基(由Life Technologies生产)、CHO-S-SFMII 培养基(由Life Technologies生产)、CD DG44 培养基(由Life Technologies生产)、HyClone CDM4CHO 培养基(由Thermo Scientific生产)、HyClone SFM4CHO 培养基(由Thermo Scientific生产)、CD-ACP-CHO (由Sigma Aldrich生产)、HyClone SFM4CHO-Utillity 培养基(由Thermo Scientific生产)、KBM270 培养基(由Kohjin Bio Co.、Ltd.)、KBM240 培养基(由Kohjin Bio Co.、Ltd.)、KBM230 培养基(由Kohjin Bio Co.、Ltd.生产)、KBM306 培养基(由Kohjin Bio Co.、Ltd.生产)、BD Select CHO 培养基(由Becton、Dickinson and Company生产)、CHOMACS CD 培养基(由Miltenyi Biotec生产)、ESF SFM 培养基(由Expression Systems生产)、Daigo氏T培养基(由NIHON PHARMACEUTICAL CO.、LTD.生产)、IS CHO-V 培养基(注册商标) (Irvin Scientific)、IS CHO-V-GS 培养基(注册商标) (Irvin Scientific)、Opti-Pro (由Invitrogen生产)等。

本领域普通技术人员可以对上文提及的培养基添加各种氨基酸、各种维他命、能源、渗透压调节剂、铁源、pH缓冲液、抗生素等中的一种，或其两种或更多种的组合。此外，本领域普通技术人员同样可以根据目标以组合添加一种或多种其它化学组分或生物组分。

对于各种氨基酸，可以使用L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等，对于各种维他命，可以使用生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、烟酸、对氨基苯甲酸、泛酸钙盐、盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维他命B12、抗坏血酸等，对于能源，可以使用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，对于渗透压调节剂，可以使用氯化钠、氯化钾、硝酸钾等，对于铁源，可以使用Fe-EDTA、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硝酸铁等，对于pH缓冲剂，可以使用碳酸氢钠、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等。本领域普通技术人员可以根据培养的细胞种类等适当地调节添加的浓度。

对培养基添加的抗生素的实例包括，但不限于，磺酰胺类和制备物、青霉素、苯氧乙基青霉素、甲氧西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、萘夫西林、氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林、环己西林、羧苄西林、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、美西林、andinocillin、头孢菌素和其衍生物、噁喹酸、安氟沙星、替马沙星、萘啶酸、吡咯米酸、环丙沙星、西诺沙星、诺氟沙星、甲氟哌酸、Rosaxacin、氧氟沙星、依诺沙星、吡哌酸、舒巴坦、棒酸、β-溴青霉烷酸（β-bromopenisillanic acid）、β-氯青霉烷酸、6-乙酰亚甲基-青霉烷酸、头孢噁唑、舒他西林（sultampicillin）、adinoshirin和、他唑巴坦、氨曲南、sulfazethin、isosulfazethin、norcardicin、间羧基苯基、苯基乙酰氨基膦酸甲酯、金霉素、土霉素、四环素、地美环素、强力霉素、甲烯土霉素和二甲胺四环素。本领域普通技术人员可以根据培养的细胞种类等适当地调节添加的浓度。

当本发明的培养基添加物添加至上文提及的培养基时，当使用时将培养基添加物溶解于适当的溶剂中，并且将添加物溶液添加至培养基中使得培养基中多糖的浓度降低至上文提及的范围内。在此，合适的溶剂的实例包括，但不限于，水、二甲基亚砜（DMSO）、各种醇（例如，甲醇、乙醇、丁醇、丙醇、丙三醇、丙二醇、丁二醇等）等。

在上文提及的培养基添加溶液的制备方法中，培养基添加物首先添加至上文提及的溶剂中，并且通过在可以溶解多糖的温度加热（例如，60℃、 80℃、 90℃或以上）同时搅拌进行溶解。溶解后，该混合物允许使用搅拌冷却，经过灭菌（例如，在121℃高压灭菌器消毒20分钟），并冷却至室温。将经前文提及的灭菌后的溶液添加至培养基，并且将该混合物均匀混合。例如，当制备脱酰基结冷胶时，将脱酰基结冷胶以0.1%至2.0%（重量/体积）、0.2%至1.0%（重量/体积）、优选地0.2%至0.5%（重量/体积）、更优选地0.2%至0.4%（重量/体积）添加至离子交换水或超纯水。随后，将该混合物搅拌并加热至任何前文提及的脱酰基结冷胶可以溶解的温度，所述温度不低于60℃，优选地不低于80℃，更优选地不低于90℃，以允许其溶解至透明状态。在溶解后，该混合物允许使用搅拌冷却，并灭菌（例如，在121℃高压灭菌器消毒20分钟），在冷却至室温后，将该水溶液添加至培养基并且将该混合物均匀混合。混合方法不是特别受到限制，并且例如，可以经手动混合诸如经移液等，或者使用仪器诸如磁力搅拌器、机械搅拌器、均相混合机和均化器混合。此外，该培养基混合物可以在混合后通过过滤器过滤。

如上文提及的制备的并且在凝胶状态的脱酰基结冷胶可以经微粉化并用于细胞培养。微粉化方法是，例如，物理化学方法。例如，可以提及使用EDTA、草酸钾等的化学方法，和使用UV、超声处理等的物理方法，所述方法在下文提及的实施例中描述。通过这些方法微粉化的凝胶可以当添加至培养基时通过重悬使用。

显示了含有本发明的培养基添加物/蛋白质生产促进剂并如上文提及的制备的本发明用于动物细胞的培养基组合物中的血清和血清替代物的浓度。

例如，在血清的情况中，可以提及不含血清的培养基或具有血清浓度为1%-15%（重量/体积）、1%-10%（重量/体积）、5%-15%（重量/体积）、5%-10%（重量/体积）的血清培养基。在血清替代物的情况中，可以提及不含替代物的培养基或含有某一浓度替代物的培养基，在该浓度下以上述浓度范围（例如，1%-15%（重量/体积）、1%-10%（重量/体积）、5%-15%（重量/体积）、5%-10%（重量/体积））的血清的功能被取代。

3.

细胞培养方法

在本发明中，可以使用分批培养法、连续培养法和补料分批培养法中的任何培养方法，所述培养方法是一般细胞培养方法。优选地，使用补料分批培养法或连续培养法，特别优选地，使用补料分批培养法。

分批培养法是这样的培养方法，其中将少量的种子培养基添加至培养基并且培养细胞，在培养期间没有新添加的培养基或丢弃培养基。当在本发明中使用分批培养法时，含有本发明培养基添加物的培养基可以作为种子培养基使用。

连续培养法是这样的培养方法，其中培养基在培养过程中是连续添加和连续丢弃的。连续培养法还包括灌注培养。

补料分批培养法也称为半分批培养法，因为其介于分批培养法和连续培养法之间，其中在培养过程中连续地或顺序地添加培养基，但是培养基并不像连续培养法连续地丢弃。补料分批培养期间添加的培养基（下文中的补料分批培养基）不需要和已用于所述培养的培养基一样（下文中的初始培养基），并且可以添加不同的培养基或者可以添加单独的特定组分。

在本发明中，所述初始培养基指的是通常在细胞培养初始阶段使用的培养基。然而，当补料分批培养基以复数部分添加时，在添加补料分批培养基前的培养基可以作为初始培养基使用。可以使用含有上文提及的本发明的培养基添加物的培养基作为初始培养基培养细胞。向初始培养基添加的多糖的浓度只需是能够增加生产的目标蛋白质的量的浓度。例如，向培养基添加多糖以达到 0.001% 至 1.0%（重量/体积），优选地为0.002% 至 0.4%（重量/体积），更优选地为0.005% 至 0.2%（重量/体积），仍更优选地为0.005% 至 0.05%（重量/体积）。

在本发明中，当使用补料分批培养法或连续培养法时，含有上文提及的本发明的培养基添加物的培养基可以用作培养基在培养期间添加。添加至补料分批培养（补料分批培养基）中的培养基期望是高浓度培养基，以防止培养体积的增加。特别地，例如，具有多糖浓度为0.001% 至 1.0%（重量/体积），优选地为0.002% 至 0.4%（重量/体积），更优选地为0.005% 至 0.2%（重量/体积），仍更优选地为0.005% 至 0.05%（重量/体积）的补料分批培养基，可是作为补料分批培养基使用。

在本发明中，当前文提及的补料分批培养基添加至培养基中时，可以使用1%至150%、优选地5% 至 50%、更优选地8%至20%的初始培养基体积作为补料分批培养基体积连续地，或在给定的一段时间，或顺序地在整个培养期间添加。

本发明的培养方法不是特别地受限制并且可以用于培养多种动物细胞。例如，所述方法可以培养人癌细胞、由生产抗体的杂交瘤代表的融合细胞，诸如小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等，或通过遗传工程操作，掺入编码期望蛋白质基因的COS细胞或CHO细胞。

例如，培养在下文提及的实施例中描写的SC-01MFP（细胞系保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构专利微生物保藏中心，FERM BP-10077），由此通过所述动物细胞可以获得天然产生的天然类型蛋白质（WO2005/083060）。此外，所述方法也可以用于培养高生产期望蛋白质的细胞系，所述细胞系通过使用含有编码所述蛋白质的核酸的表达载体转染获得。

在本发明中，特别优选的动物细胞是使用编码期望蛋白质的基因导入的CHO细胞。CHO的实例包括，但不限于，CHO-K1 细胞 (ATCC CCL-61 (商标))、CHO-S 细胞、DG44 细胞等。所述期望蛋白质不是特别地受限制，并且可以是含有抗体，诸如天然抗体、抗体片段、低分子量抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体等（例如，抗-IL-6 受体抗体、抗-磷脂酰肌醇聚糖-3 抗体、抗-CD3 抗体、抗-CD20 抗体、抗-GPIIb/IIIa 抗体、抗-TNF 抗体、抗-CD25 抗体、抗-EGFR 抗体、 Her2/neu 抗体、抗-RSV 抗体、抗-CD33 抗体、抗-CD52 抗体、抗-IgE 抗体、抗-CD11a 抗体、抗-VEGF 抗体、抗-VLA4 抗体等）和生理活性蛋白质（粒细胞集落刺激因子（GCSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激剂（GM-CSF）、红细胞生成素、干扰素、IL-1和IL-6等、白介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、凝血因子等），和细胞因子的任何蛋白质。特别地，优选含有可用作药物产品的抗体或细胞因子的免疫相关的蛋白质、涉及细胞增殖分化的蛋白质、膜蛋白等。

因为培养条件取决于使用的细胞种类而变化，其可能合适地决定优选的条件。通常，例如，用于CHO细胞的培养条件可以是CO₂ 浓度为0% - 40%的气相气氛，优选地为2% - 10%，培养基pH为6.5 - 7.2，优选地为6.7 - 7.0，更优选地为6.8 - 6.9，在30℃ - 39℃，优选地在约37℃，培养1天-50天，更优选地1天-14天。

用于动物细胞培养的多种培养设备的实例包括，但不限于，发酵容器类罐培养设备、气升式培养设备、培养瓶类培养设备、反应器类培养设备、微载体类培养设备、流化床类培养设备、中空纤维类培养设备、滚瓶类培养设备、填充容器类培养设备、生物反应器类培养设备等。

当细胞通过本发明的培养方法培养时，通常用于细胞培养的培养工具诸如培养皿、烧瓶、塑料袋、特氟隆（注册商标）袋、皿、培养皿、用于组织培养的皿、孔板、微孔板（microplate）、微孔板（microwell plate）、多孔板、多层板、载玻片、细胞培养瓶、转瓶、管、托盘、培养袋、滚瓶等可以用于培养。

这些培养工具的材料是，例如，可以提及玻璃、塑料（诸如聚氯乙烯）、纤维素聚合物（诸如乙基纤维素、醋酸纤维素等）、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚砜、聚氨酯、聚酯、聚酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚丁二烯、聚（乙烯 - 乙酸乙烯酯）共聚物、聚（丁二烯 - 苯乙烯）共聚物、聚（丁二烯 - 丙烯腈）共聚物、聚（乙烯丙烯酸乙酯）共聚物、聚（乙烯 - 甲基丙烯酸酯）共聚物、聚氯丁二烯、苯乙烯树脂、氯磺化聚乙烯、乙烯醋酸乙烯酯、丙烯酸系嵌段共聚物等。如下文提及的实施例描述的，因为滚瓶工具在本发明的凝胶中影响细胞增殖等，所以优选聚苯乙烯。

4.蛋白质生产方法

通过前文提及的细胞培养方法培养动物细胞，可以高生产蛋白质。

通常，通过动物细胞的蛋白质生产可以需要对其简单的培养或特别的操作。所述操作、条件等因此可以根据培养的动物细胞合适地确定。同样所述蛋白质的种类也不受限制，例如，在通过遗传工程操作使用含有编码小鼠-人嵌合抗体的载体转化CHO细胞的情况下，在前文所述的条件下的培养在1天-50天，优选地5天-21天，更优选地7天-14天在培养基中提供了期望的蛋白质。通过根据常规方法（参见，例如，Introduction to antibody engineering, Chijinshokan, (1994), p.102-104; Affinity Chromatography Principles & Methods, GE Healthcare, (2003), p.56-60等）分离和纯化，可以获得期望的蛋白质。

根据本发明，重组抗体（天然抗体、抗体片段、低分子量抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体等）、基因重组蛋白质（粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激剂（GM-CSF）、红细胞生成素、干扰素、白介素诸如IL-1和IL-6等、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、凝血因子等）等可以以高生产量生产。

通过本发明的生产方法生产的抗体不但包括源自动物，诸如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴等的单克隆抗体，同样包括人工修改基因的重组抗体，诸如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体等。此外，抗体的免疫球蛋白类型不是特别受限的，并且可以是任何类型诸如IgG (例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 等)、IgA、IgD、IgE、IgM等。当作为药剂使用时，优选IgG和IgM。此外，本发明的抗体不但包括全部抗体，还包括抗体片段诸如Fv、Fab、F(ab)₂等、低分子量抗体诸如单价或二价或更多单链Fv (scFv, sc(Fv)₂ 等)等，其中抗体的多个区域与接头诸如连接肽等相连。

本发明在以下通过实施例和参考实施例的方法具体解释。这些实施例等是为了解释本发明，并且不限制本发明的范围。

实施例1

样品

在本实施例中使用的细胞系是人骨髓瘤源细胞系SC-01MFP，显示了对抗体λ轻链蛋白质（WO 2005/083060）的特征的生产能力。

使用含有脱酰基结冷胶培养基的培养评估系统

脱酰基结冷胶粉（KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co., Ltd.生产）以3g/L溶解于超纯水（Milli-Q水）中。该溶液在热水中加温，并且在确认脱酰基结冷胶粉溶解后，通过高压灭菌器灭菌。灭菌后溶液静置并允许冷却至室温，并制备关于含有10%胎牛血清的E-RDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）的含有浓度为0.015%（w/v，同样对下文中脱酰基结冷胶浓度）的脱酰基结冷胶的混合培养基。对于对照组，使用不含脱酰基结冷胶的含有10%胎牛血清的E-RDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）。随后，所述细胞在制备的含有脱酰基结冷胶的培养基中以100 μL，1×10⁴细胞/孔涂布于96孔酶标板。每24小时，以10 μL/孔添加Cell Counting Kit8（由DOJINDO LABORATORIES生产），并且孵育该混合物1.5小时。转移培养基（100μl）至另一个96孔板，并且在450-595 nm测量吸光度。结果如图1，左侧所示，相比未添加脱酰基结冷胶（对照），SC-01MFP细胞从开始培养后的第二天和其后，在通过添加0.015%脱酰基结冷胶的培养基培养的细胞数量增加上没有显示出显著的差异。

通过酶抗体方法测量生产的λ链的量

通过酶抗体方法（ELISA；酶联免疫吸附试验）测量在上文提及的培养上清液中生产的λ链的量。使用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释山羊抗人λ链抗体（BIOSORCE）2000倍并按100 μL/孔分配至98孔酶标板以包被板。在37℃静置1小时后，将通过使用PBS（0.5% BSA/PBS）稀释牛血清白蛋白（BSA;ICN）至0.5%获得的溶液，以300 μL/孔分配用于封闭，以防止非特异性反应。此后，将该板在37℃静置1小时，并且使用0.5% BSA/PBS将含有待定量的IFN-β抗体的培养上清液稀释1/10、1/100并以50 μL/孔分配。相似地，将从1μg/mL以1/3增加至152 ng/mL的连续稀释的标准溶液以50 μL/孔分配，并且将该板在37℃静置1小时。其后，使用0.5% BSA/PBS溶液将辣根过氧化物酶标记的人λ链抗体（BIOSORCE）稀释5,000倍，以100 μL/孔分配并且在37℃静置1小时。作为显色溶液，将0.006% H₂O₂-0.2 M柠檬酸盐缓冲液（pH4.0）、6 mg/mL ABTS-(NH₄)₂ (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)和超纯水（Milli-Q水）按照10:1:9的比例混合并且以100 μL/孔分配溶液。30分钟后，在414nm波长测量吸光度。在各反应之间，使用通过用PBS将聚乙烯（20）山梨醇酐单月桂酸酯(Tween 20; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)稀释至浓度为0.05%获得的溶液将板洗涤3次。图1中右图是显示了通过SC-01MFP细胞生产的λ链的量的结果的图。关于生产的λ链的量，当将脱酰基结冷胶以0.015%的浓度添加时相比对照试验，抗体的生产量从开始培养后第3天和此后显著地增加。图1中左图和右图获得的图面积，通过梯形试样法计算，并且从抗体生产量图获得的面积除以从细胞数量图获得的面积（抗体生产量图获得的面积/细胞数量图获得的面积≒每个细胞的抗体生产当量），并且其比较在图2中显示（转化为添加0.015%脱酰基结冷胶相对于如图1对照的比例）。通过添加脱酰基结冷胶，每一个细胞λ链的生产量增加约3倍。

实施例2

样品

在本实施例中使用的宿主细胞株是中国仓鼠卵巢源细胞系CHO-K1（ATCC CCL-61（商标））。对于物质生产力的评价，将人干扰素β（IFN-β）基因掺入CHO-K1，并且如下文显示的，在培养上清液中制备IFN-β-生产细胞系。

首先，IFN-β基因是从人皮肤源正常二倍体成纤维细胞株TIG-108获得，所述细胞是IFN-β生产细胞。将TIG-108（5×10⁶ 细胞）在400x g离心5分钟，并且移除上清液。添加核酸提取剂ISOGEN （1 mL，NIPPON GENE CO., LTD.），和氯仿（ 0.2 mL，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）以允许DNA、蛋白质沉淀在有机层。在12000×g离心15分钟后，获得水相（RNA层），添加异丙醇（0.5 mL，Wako Pure Chemical Industries, Ltd.），并且在12000×g对所述混合物离心15分钟以允许RNA沉淀。沉淀的RNA溶解于无菌水中，添加第一链反应混合珠(Amersham Biosciences) 和pd(N)6 随机六聚体( 1 μL，Amersham Biosciences) ，并且将混合物在室温下静置1分钟并在37℃进行反转录60分钟以合成cDNA。

随后，尝试通过PCR扩增IFN-β基因。首先在0.2 mL管中将无菌水（35.5 μL）、掺合Taq缓冲液 (5 μL)、dNTP 混合物(4 μL)、引物F（5’-ATGACCAACAAGTGTCTCCT-3’;SEQ ID NO: 1）(1 μL, 10 皮摩尔)、引物R（5’-TCAGTTTCGGAGGTAACCTG-3’; SEQ ID NO: 2） (1 μL, 10 皮摩尔)、Taq DNA聚合酶（0.25 μL, Takara Bio Inc），和cDNA(3 μL, 50 ng) 混合。将管放置于程序温度控制系统(ASTEC CO., LTD.)中，并实施PCR。通过1%琼脂糖凝胶电泳确认PCR产物，并通过Freeze’N Squeese吸附柱 (BIO RAD Laboratories Inc.)纯化。纯化的PCR产物（2 μL）和pTARGET 载体（1 μL, 50 ng）与 TaKaRa DNA 连接试剂盒(Takara Bio Inc., 3 μL)混合，并且该混合物在16℃ 经历连接反应30分钟。随后，经过连接的pTARGET 载体通过热激反应导入至JM109细胞（Promega），涂布于LB培养基平板上。获得生长的菌落，在LB培养基（1 mL）中在37℃下进行振荡培养过夜，并且使用QIA prep Spin Miniprep试剂盒(QIAGEN)提取pTARGET 载体。随后，使用在IFN-β基因序列上具有识别序列的限制性内切酶 PstI (TOYOBO CO., LTD.) 切割pTARGET 载体，由此确认通过pTARGET载体的IFN-β基因的克隆。

随后，CHO-K1 细胞系在含有10%胎牛血清的（胎牛血清 FBS, Trace）E-RDF（10% FBS - E-RDF）培养基中培养，调节至5×10⁶ 细胞/mL并且使用PBS替换培养基。随后，确认将IFN-β基因克隆至pTARGET载体。

添加基因（3 μg），并且在0.75 kV/cm，350 μF的条件下接通电压。恢复培养在10%FBS - E-RDF培养基中实施，细胞以100 μL/孔分配于96孔培养平板（Beckton&Dickinson）中。在孵育24小时后，选取转基因细胞并且在含有终浓度为500 μg/mL的G-418 (Geneticin, Invitrogen)的10% FBS- E-RDF培养基中培养。对确认生长的细胞确认IFN-β基因表达，由此制备生产IFN-β的CHO-K1细胞。

脱酰基结冷胶培养评估系统

将脱酰基结冷胶粉（KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co., Ltd.生产）以4 g/L溶解于超纯水中（Milli-Q水）。该溶液在热水中加温，并且在确认脱酰基结冷胶粉溶解后，通过高压灭菌器灭菌。将灭菌后的脱酰基结冷胶水溶液静置并且允许冷却至室温，并且作为不含血清培养基，制备相对于含有胰岛素（牛源，终浓度：5 μg/mL）、转铁蛋白（牛源，终浓度： 20 μg/mL）、乙醇胺（终浓度：20 μmol）和亚硒酸钠（终浓度：25 nmol）的E-RDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产），含有浓度为0.025%的脱酰基结冷胶的混合培养基。对于对照组，使用无脱酰基结冷胶的上文提及的不含血清的E-RDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.培养）。随后，细胞通过在制备的培养基中以100 μL，1×10⁴ 细胞/孔涂布于96孔酶标板上。每24小时，以10 μL/孔添加Cell Counting Kit8 （由DOJINDO LABORATORIES生产），并且将该混合物孵育1.5小时。将该培养基（100 μL）转移至另一个96孔板，并且在450-595 nm测量吸光度。结果，如在图3左图中显示，发现相比于不添加脱酰基结冷胶的培养系统，添加脱酰基结冷胶的培养系统确实影响了在不含血清的E-RDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中的细胞增殖效果。

通过酶抗体方法测量IFN-β生产量

在上文提及的培养上清液中的IFN-β生产量通过酶抗体方法（ELISA；酶联免疫吸附试验）测量。使用磷酸盐缓冲液（PBS）将山羊抗人IFN-β抗体（R&D System INC.）稀释至1 μg/mL，并且以100 μL/孔分配至96孔酶标板以包被该平板。在37℃静置1小时后，将通过使用PBS稀释牛血清蛋白（BSA;ICN）至0.5%（0.5% BSA/PBS）获得的溶液以300 μL/孔分配进行封闭以防止非特异性反应。其后，将该平板在37℃静置1小时，并且使用0.5% BSA/PBS将含有待定量IFN-β 抗体的培养上清液稀释1/10 并以50 μL/孔分配。相似地，0.33 μg/mL标准溶液以50 μL/孔分配并且在37℃将该平板静置1小时。此后，使用0.5% BSA/PBS将小鼠抗人IFN-β抗体（R&D System INC.）稀释至1 μg/mL，以100 μL/孔分配，并且将该平板在37℃静置1小时。此后，使用0.5% BSA/PBS溶液将辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体稀释5,000倍，以100 μL/孔分配，并且将该平板在37℃静置1小时。作为显色溶液，将10% 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）-二甲亚砜（DMSO）溶液/0.006% H₂O₂- 0.2M柠檬酸盐缓冲液（pH4.0）溶液以100 μL/孔分配，该反应在30分钟后使用1N-H₂SO₄溶液淬灭，在450nm波长测量吸光度。在各反应之间，使用通过用PBS将聚乙烯（20）山梨醇酐单月桂酸酯(Tween 20; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)稀释至浓度为0.05%获得的溶液将板洗涤3次。图3中左图显示细胞数目随时间进程的变化，并且右图显示通过CHO-K1的IFN-β生产量随时间进程的变化。如在图3中显示的，在右图中，相比于不添加脱酰基结冷胶的培养，在通过添加0.025%脱酰基结冷胶的不含血清的培养中的IFN-β生产量是增加的。通过梯形试样法计算图3左图和右图获得的图面积，并且从IFN-β的图获得的图面积除以从细胞数量的图获得的图面积（IFN-β图获得的面积/细胞数量图获得的图面积≒每一个细胞的IFN-β当量），并且其比较在图2中显示（转化为添加0.025%脱酰基结冷胶相对于如图1对照的比例）。通过添加脱酰基结冷胶，每个细胞的 IFN-β 生产量增加约44%。

实施例3

样品

在该实施例中使用的细胞系是在实施例2中使用的掺入人干扰素β 基因的CHO-K1细胞系，所述细胞在培养上清液中生产人干扰素β。

凝胶组织微粉化的方法

在超纯水中以1 g/100 mL溶解脱酰基结冷胶粉（KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co., Ltd.生产）。通过高压灭菌器将该溶液灭菌并将凝胶溶解。

随后，使用EDTA、草酸钾、UV和超声处理对该凝胶进行4种处理，以达到物理化学的微粉化，并检验在细胞增殖和细胞产物产量上的影响。

首先，EDTA（0.1g，由DOJINDO LABORATORIES生产）溶解于500 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，并且在高盐灭菌器灭菌后，将等量的凝胶和EDTA溶液混合并在室温下静置1天。其后，液体部分和凝胶部分通过在4000xg离心10分钟分离。凝胶部分以5%(w/v) 添加并且在含5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中培养。

对于草酸钾（由Wako Pure Chemical Industries, Ltd.生产），使用超纯水制备5%的草酸钾溶液，在过滤除菌后，将等量的凝胶和草酸钾溶液混合并且在室温下静置1天。液体部分和凝胶部分通过在4000xg离心10分钟分离，并且该凝胶部分以5%(w/v)添加并且在含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中培养。

对于UV，将凝胶溶液置于距离可商业上获得的15W UV灯55cm的位置，并且使用UV辐射过夜。该样本以5%(w/v)添加并且在含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中培养。

最后，以20W的输出功率、28KHz的频率对凝胶溶液应用超声处理5分钟，并且以5%（w/v）添加并在含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中培养。

作为对照组，使用不含凝胶的含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）。

而且，最后，当向培养基添加经EDTA、草酸钾、UV、超声处理的各凝胶样品时，实施使用和不使用移液管强力的抽吸的两种模式以试图避免凝胶的再凝固。

细胞以1mL铺板在24孔培养板上，以在含有经过每种处理后的凝胶制备的培养基中实现1×10⁵ 细胞/孔。培养期间的细胞数通过血细胞计数器测量。结果如图5所示，当将凝胶超声处理并添加至培养基重悬时，在培养的第7天和其后观察到比对照和其它样品的细胞增殖明显更高的生长支持活性。

通过酶抗体方法测量IFN-β生产量

测量方法与实施例2中的相同

如在图6中显示的，当将凝胶超声处理并添加至培养基重悬时，在培养的第6天和其后观察到比对照和其它样品显著地更高的干扰素β产量。

实施例4

样品

脱酰基结冷胶培养评估系统

在超纯水中以1 g/100 mL溶解脱酰基结冷胶粉（KELCOGEL CG-LA，由SANSHO Co., Ltd.生产）。通过高压灭菌器将该溶液灭菌并将凝胶溶解。向含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）以5%(w/v)添加凝胶，并且将该混合物以200 mL分配至玻璃滚瓶（由WHEATON生产）和聚苯乙烯滚瓶（由BD生产），并且培养。两种所述滚瓶培养箱具有约850 cm²的表面积。

将涂布的细胞的密度调节至1×10⁵ 细胞/孔。

对照是只在没有凝胶的含有5%胎牛血清的ERDF培养基（由KYOKUTO PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD.生产）中培养的细胞。

将滚瓶的转速设置为1 rpm。

在开始滚瓶培养后，在第7天通过在1600xg 离心5分钟将各细胞回收，并且当培养开始时通过如使用过的相同的培养基重悬传代，并将细胞培养至第14天。细胞数量通过血细胞计数器测量。图7显示在培养第7天传代前和传代后细胞数量和存活率的变化。结果所有细胞显示传代后细胞数量增加，但是存活率在玻璃滚瓶中略低。

通过酶抗体方法对IFN-β量测量

用于在培养上清液生产IFN-β的量测量的酶抗体方法与实施例2中描述的一致。

图8显示干扰素β的生产量的差异取决于滚瓶的材料（由玻璃或聚苯乙烯制成）。在传代和培养的第7天之前，使用凝胶添加至玻璃滚瓶的实验系统显示出略低的IFN-β生产量，但是其它系统没有显示出在IFN-β生产量上的大的差异。在另一方面，在开始培养第7天传代后的培养后，使用凝胶添加至聚苯乙烯滚瓶的系统显示出IFN-β产量的显著改善，并且其效果达到了不添加凝胶的该系统的约1.5倍。

工业实用性

如上文详细描述的，使用本发明的用于动物细胞的培养基添加物，可以促进有用的蛋白质的产量。

此外，因为本发明的蛋白质的生产方法可以更有效地生产期望的蛋白质，其在生产成本中是有优势的，并且可以极大地有助于例如，生物制药产品（诸如抗体药物等）的大量供应等。

本申请基于于日本提交的专利申请号2012-184508（提交日期：2012年8月23日），其内容以其整体并入。

序列表

<110> NISSAN CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.

Institute of National Colleges of Technology, Japan

<120> 用于来自多种细胞的蛋白质生产的提高成分

<130> 092042

<150> JP 2012/184508

<151> 2012-08-23

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaccaaca agtgtctcct 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tcagtttcgg aggtaacctg 20

Claims

1.用于动物细胞的培养基添加物，其包含多糖。

2.根据权利要求1的添加物，所述添加物促进培养的动物细胞生产期望的蛋白质。

3.根据权利要求2的添加物，所述添加物促进所述动物细胞的每一个细胞的蛋白质生产。

4.根据权利要求1的添加物，其中所述多糖具有阴离子官能团。

5.根据权利要求4的添加物，其中所述阴离子官能团是选自羧基、磺酸基和磷酸基的至少一种。

6.根据权利要求5的添加物，其中所述多糖是选自透明质酸、结冷胶、脱酰基结冷胶、黄原胶、角叉菜胶、迪特胶、藻酸、岩藻依聚糖、果胶、果胶酸、果胶酯酸、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸类肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸鼠李糖聚糖及其盐中至少一种。

7.根据权利要求6的添加物，其中所述多糖是脱酰基结冷胶或其盐。

8.用于动物细胞的培养基，其包含根据权利要求1至7任一项的所述添加物。

9.根据权利要求8的培养基，所述培养基具有不低于1% (w/v) 并且不高于15%(w/v)的血清浓度。

10.根据权利要求8的培养基，所述培养基具有不低于1% (w/v) 并且不高于15%(w/v)的血清替代物浓度，其中所述血清替代物选自血浆蛋白质、激素、生长因子和盐。

11.根据权利要求8至10中任一项的培养基，所述培养基进一步包含选自氨基酸、维他命、能源、渗透压调节剂、铁源和pH缓冲剂的至少一种。

12.使用动物细胞培养生产蛋白质的方法，其包括在根据权利要求1至7任一项的添加物的存在下或在根据权利要求8至11中任一项的培养基中培养所述动物细胞。

13.根据权利要求12的方法，其中培养所述动物细胞至少（a）或（b）时期：

14.促进培养基中的动物细胞生产的蛋白质的量的方法，其包括在权利要求1至7任一项的添加物的存在下或在根据权利要求8至11任一项的培养基中培养所述动物细胞。

15.根据权利要求14的方法，其促进所述动物细胞的每一个细胞的生产的蛋白质的量。