CN101490245B - 无血清培养基及其在软骨细胞扩增中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于培养成纤维细胞、特别是关节软骨细胞的确定的无血清细胞培养基，避免了使用含血清培养基所固有的问题。确定的培养基包含血小板衍生生长因子(PDGF)、化学上确定的脂、制瘤素M(OSM)、白介素-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、或这些化合物的组合。另一方面，本发明还提供组织培养方法，包括在确定的无血清培养基中孵育软骨细胞。所述方法增强以低密度接种的软骨细胞的附着和增殖扩增，同时维持其再分化的潜力。

Description

无血清培养基及其在软骨细胞扩增中的用途
本申请要求于2006年6月20日递交的美国申请号60/805,307的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及细胞和组织培养领域。更具体地，本发明涉及细胞离体增殖的方法和组合物，所述细胞能够形成软骨组织用于治疗或修复软骨缺陷。
发明背景
关节软骨由包围在由软骨细胞产生的复杂的细胞外基质中的软骨细胞组成。此基质独特的生物化学组成提供了光滑的、几乎无摩擦运动的关节连接表面。随年龄增长，由于生物化学的变化，人关节软骨的拉伸性质随之改变。三十岁以后，关节软骨的拉伸强度显著降低。由于创伤或疾病例如类风湿和骨关节炎而对软骨造成的损伤，能够导致严重的身体虚弱。
由于软骨无法自身修复，于是人们研发了若干外科策略以减轻与软骨损伤相关的临床症状。仅在美国，每年就要进行多于500,000次关节造形术和关节置换术。自体软骨细胞移植是已经被批准用于治疗关节软骨缺陷的方法。该方法包括：从股骨髁的非承重部位获取一块软骨，离体增殖分离的软骨细胞，然后植回同一患者的体内。Brittberg等人，New Engl.J.Med.331：889-895(1994)。
关节软骨细胞表达关节软骨特异性细胞外基质成分。关节软骨细胞一经收集并通过酶消化与组织分离后，就可以单层培养用于增殖扩增。然而在组织培养过程中，这些细胞形成成纤维细胞形态，不再产生透明样关节软骨特有的II型胶原和蛋白聚糖。这样的“去分化”细胞快速增殖，并产生纤维组织特有的I型胶原。但是，当处于适当环境如体外悬浮培养基(Aulthouse等人，In Vitro Cell.& Devel.Biology 25：659-668(1989))或体内软骨缺陷环境(Shortkroff等人，Biomaterials 17：147-154(1996))时，细胞再分化，即再次表达关节软骨特异性基质分子。去分化的可逆性是用培养的自体软骨细胞成功修复关节软骨的关键。
人软骨细胞通常在补加10％(v/v)胎牛血清(FBS)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中培养。Aulthouse等人，In Vitro Cell.& Devel.Biology，25：659-668(1989)；Bonaventure等人，Exp.Cell Res.，212：97-104(1994)。然而，尽管血清广泛用于哺乳动物细胞培养，但使用血清却存在若干问题：(1)血清含有许多未经确定的或非定量的成分，因此不是“确定的”；(2)血清的组成依批次而有所变化，使得对于实验或细胞培养的其它用途来说，难以进行标准化；(3)许多血清成分影响细胞附着、增殖和分化，使得这些参数难以控制；(4)一些血清成分对于特定细胞的增殖是抑制性的，在一定程度上可能抵消其增殖效果，导致生长欠佳；及(5)血清可能含有病毒和其它病原体，可能影响实验结果，或如果培养细胞预期植入人体，则可能带来潜在的健康危害。Freshney(1994)Serum-free media.于：Culture of Animal Cells，约翰威立公司(John Wiley & Sons)，纽约，91-99。
因此，使用确定的无血清培养基对于用于治疗软骨缺陷的软骨细胞离体扩增特别有利。然而，这样确定的无血清培养基必须足以支持以低密度接种的成人关节软骨细胞的附着，支持增殖直到得到汇合培养物，并维持软骨细胞再表达关节软骨表型的能力。
为研发生物化学上确定的培养基(DM)用于细胞培养已经付出了一些努力。DM通常包括营养素、生长因子、激素、附着因子和脂。对于设计为用于特定细胞类型的培养基，必须调整其精确组成。一些细胞类型包括成纤维细胞、角质细胞和上皮细胞在多种DM中实现了成功生长。Freshney，1994和Butler M.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.68：283-91(2005)。
可以得到的用于自体软骨细胞移植的起始细胞材料的量通常是有限的。因此，期望以最小亚汇合密度接种关节软骨细胞。以亚汇合密度在DM中培养关节软骨细胞的尝试仅取得了部分成功。尽管已研发了能够支持以低密度接种的软骨细胞增殖能力的DM，但使用这些培养基时，接种之后细胞对组织培养瓶的初始附着仍需要血清。Adolphe等人，Exp.Cell Res.155：527-536(1984)和美国专利号6,150,163。
因此，为了用于医学用途，特别是用于人体，需要优化、标准化和控制能够再分化的软骨细胞附着、增殖和维持的条件。
发明概述
本发明提供化学上确定的培养基(DM)组合物，制备这样的培养基的方法，和使用这样的培养基例如培养细胞的方法，特别是培养用于修复软骨缺陷的人关节软骨细胞。本发明的DM的区别特征之一是具有一种或多种基本上纯的IL-6家族细胞因子，例如制瘤素M(OSM)、白介素-6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)。
本发明的优点之一是可以在软骨细胞培养中避免使用血清，在无血清条件下增强细胞附着和增殖，和/或维持软骨细胞再表达软骨特异性表型的能力。一方面，本发明提供了足以支持细胞对培养基质的初始附着的DM，从而免除了细胞培养初期对于含血清培养基的需要。本发明另一方面提供了确定的无血清细胞培养基，其促进细胞如软骨细胞的增殖，在细胞培养的任何阶段都不需使用血清。本发明再一方面提供细胞培养基，可以用于在植入受试者之前准备软骨细胞，或纳入作为支持软骨细胞再分化的培养基，包埋在预期植入软骨缺陷的基质中。本发明另一方面提供培养软骨细胞直至其适合用于治疗患有软骨缺陷的患者的方法。本发明的其它优点一部分将在下文的说明书中阐明，一部分将通过说明书而显而易见，或可以通过本发明的实施而得到认识。
本发明的DM包含补加了一种或多种补加物的基础培养基，补加物包括一种或多种IL-6家族的细胞因子，例如OSM、IL-6和LIF。
基础培养基可以是任何适合的培养基。在优选实施方案中，基础培养基为cDRF(表3)或cDRFm(表4)。cDRF和cDRFm是通过以1∶1∶1的比例混合DMEM、RPMI-1640和Ham’s F-12制备，或通过适当地组合预混合的培养基，并加入某些生长补加物以得到表3和4中分别定义的基础培养基。
在其它优选实施方案中，基础培养基额外补加了血小板衍生生长因子(PDGF)和/或一种或多种脂。在一些实施方案中，脂为化学上确定的脂混合物(CDLM；表5)或一种或多种CDLM中的脂(例如硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和α-生育酚醋酸酯)。在一些实施方案中，本发明的DM可以包括基础培养基(例如cDRF或cDRFm)，所述基础培养基补加了：
(a)基本上纯的PDGF和CDLM其中之一或两者；和
(b)基本上纯的OSM、基本上纯的IL-6和基本上纯的LIF中的一种或多种。
例如，在优选实施方案中，本发明的DM可以包括：(a)基础培养基；(b)0.1-100ng/ml PDGF；(c)0.05-5％CDLM；(d)0.01-10ng/ml OSM；和/或(e)0.01-10ng/ml IL-6。
应理解上文的发明概述和下文的发明详述仅为示例性和说明性的，而不是限制性所要求保护的发明。
附图简述
图1对比在(1)DMEM+10％FBS或(2)E93培养基(如表4中定义的cDRFm，补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM)中培养的原代人软骨细胞经三次传代的生长。
图2对比在(1)DMEM+10％FBS或(2)E93培养基(如表4中定义的cDRFm，补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM)中培养的原代人软骨细胞经三次传代的细胞产率。
图3在E93(泳道2、3、4)或DMEM+10％FBS(泳道5、6、7)中生长的软骨细胞裂解物的RPA。在所有样品中均表达软骨标记物：胶原2和聚集蛋白聚糖。
发明详述
本发明提供化学上确定的培养基(DM)组合物、制备这样的培养基的方法、和使用这样的培养基例如用于培养细胞的方法，如培养人关节软骨细胞用于修复软骨缺陷。本发明至少部分基于这样的发现：称为cDRFm的基础培养基补加PDGF和CDLM及一种或多种IL-6家族的细胞因子后，足以支持能够再分化的软骨细胞培养中的附着、增殖和维持，并能够在细胞培养的所有阶段取代含血清培养基。IL-6家族的细胞因子包括例如OSM、IL-6和LIF。
因此，一方面，本发明提供培养基，其包含补加了一种或多种补加物的基础培养基，补加物包括一种或多种IL-6家族的细胞因子，例如OSM、IL-6和LIF。
术语“补加”表明在起始材料中加入了补加物以得到最终材料。除非特别说明，补加物不需要在特定时间或以特定顺序加入。术语“补加”不排除在任何时间点、在补加当前补加物之前或之后在起始材料中额外补加其它补加物。除非特别说明，补加物以“基本上纯的”形式加入培养基中。术语“基本上纯的”表明补加物基本上不含其在自然中天然共同存在的成分。例如，基本上纯的细胞因子可以是纯化的细胞因子或重组生产的细胞因子。
I.制备基础培养基
本发明的确定的、无血清培养基(DM)制备的第一步是得到基础培养基。基础培养基可以是任何适合的培养基。在举例说明性实施方案中，基础培养基为如表3中定义的cDRF。cDRF可以由下文所述的可商购的起始成分制备得到。cDRF是对DM的改良，由Adolphe等人(Exp.Cell Res.155：527-536(1984))和McPherson等人(美国专利号6,150,163)研发。
cDRF的三种起始成分是DMEM、RPMI-1640和Ham’s F12(英骏公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加州)。起始成分以1∶1∶1的比例组合。全部三种培养基可以同时组合，或者任意两种培养基可以预混合，然后与适宜量的第三种培养基组合。起始成分的精确组成在表1中显示。得到的培养基(在表2中定义，称为DRF)而后补加ITS(10μg/ml胰岛素、5.5μg/ml转铁蛋白、7ng/ml硒和任选的2.0μg/ml乙醇胺；英骏公司(Invitrogen)，卡尔斯巴德，加州)、人纤连蛋白(碧迪公司(BD Biosciences)；圣约瑟，加州)、人血清白蛋白(HSA)(格里福尔公司(Grifols)；洛杉矶，加州；或百特公司(Baxter)；西湖村市(Westlake Village)，加州)、亚油酸(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)、人碱性胎儿生长因子(bFGF)(安迪生物科技有限公司(R&D Systems)，明尼阿波利斯，明尼苏达州)、庆大霉素(英骏公司(Invitrogen)；卡尔斯巴德，加州)和氢化可的松(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)以得到cDRF。所有材料经重构、稀释并依厂商建议储存。组合成分以得到最终培养基的精确顺序并不重要。可以用标准实验技术制备培养基，优选在2-8℃储存待用。在优选实施方案中，基础培养基基本上按上文制备，对人血清白蛋白、亚油酸和氢化可的松的量有所调整以得到如表4中定义的改良的cDRF(cDRFm)。
在一些实施方案中，基础培养基是包含表3中列出的cDRF所有必需成分的培养基。对于表3中列出的成分或成分集合而言，如果当其浓度降低或消除该成分时，而培养基关于软骨细胞附着、增殖、和/或再分化的性质基本上保持相同，则该成分或成分集合是非必需的。对于特定的细胞培养条件，可以调整个别成分标明的浓度。本领域技术人员用常规技术能够容易地进行这样的调整。
如果期望，并且对软骨细胞附着、增殖和再分化没有负面影响，可以在培养基添加额外成分。这样的成分包括但不限于生长因子、脂、血清蛋白质、维生素、矿物质和糖类。例如在培养基中补加促进软骨细胞再分化的生长因子或激素可能是有利的，如美国专利号6,150,163所述的TGF-β(TGF-β1、-β2、-β3)、IGF和胰岛素。这样的生长因子和激素是可商购的。补加物的其它实例包括但不限于骨形态发生蛋白(BMP)，其至少有15种结构和功能相关的蛋白。BMP已显示参与多种细胞类型的生长、分化、趋化性和凋亡。例如重组BMP-4和BMP-6可以购自安迪生物科技有限公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)。可以用最少的实验确定本发明的DM中多种这样的补加物的浓度。例如，本发明的DM中BMP的浓度选自0.01-0.1ng/ml、0.1-1ng/ml、1-10ng/ml、100ng/ml、10-50ng/ml、50-100ng/ml和0.1-1μg/ml。
技术人员会认识到除了避免使用血清，本发明的DM还有其它的优点。而对于可以接受使用未确定成分的用途，也可能期望使用本发明的DM。因此，本发明的DM可以补加血清例如胎牛血清，或化学上未确定的成分例如动物或植物组织提取物。因此，在某些实施方案中，本发明的DM可以补加10％或更少、例如8％或更少、6％或更少、4％或更少、2％或更少、或1％或更少的血清。
技术人员会认识到cDRF的等同物可以由多种已知培养基制备，例如伊格尔基础培养基(Eagle，Science，122：501(1955))、最低基础培养基(Dulbecco等人，Virology，8：396(1959))、Ham’s培养基(Ham，Exp.CellRes.29：515(1963))、L-15培养基(Leibvitz，Amer.J.Hyg.78：173(1963))、McCoy 5A培养基(McCoy等人，Proc.Exp.Biol.Med.100：115(1959))、RPMI培养基(Moore等人，J.A.M.A.199：519(1967))，Williams培养基(Williams，Exp.Cell Res.69：106-112(1971))，NCTC 135培养基(Evans等人，Exp.Cell Res.36：439(1968))，Waymouth培养基MB752/1(Waymouth，Nat.Cancer Inst.22：1003(1959))等。这些培养基可以单独使用，或作为混合物以适当比例制备成等同于cDRF的基础培养基。可选地，cDRF或其等同物可以用个别化学品、或用其它培养基和生长补加物制备。本发明不限于具有任何特定稠度(consistency)的培养基，包括使用从液体到半固体的培养基，并包括固化的培养基和适于重构的固体组合物。
表1.起始培养基的组成
Figure G2007800274495D00081
Figure G2007800274495D00091
Figure G2007800274495D00101
Figure G2007800274495D00102
Figure G2007800274495D00111
Figure G2007800274495D00121
表3.cDRF的组成
Figure G2007800274495D00131
表4.cDRFm的组成
Figure G2007800274495D00132
II.基础培养基的补充
A.血小板衍生生长因子(PDGF)
在一些实施方案中，基础培养基中补加了基本上纯的PDGF。
PDGF是主要的促有丝分裂因子，存在于血清而不是血浆中。PDGF是二聚体分子，包含两条结构上相关的链，命名为A和B。二聚体同工型PDGF-AA、AB和BB在多种细胞类型中差异表达。一般而言，所有的PDGF同工型均为结缔组织细胞的有效促分裂原，结缔组织细胞包括表皮成纤维细胞、神经胶质细胞、动脉平滑肌细胞、及一些上皮和内皮细胞。
重组生产的PDGF可以从多种来源商购。下文实施例中使用的人重组PDGF-BB(hrPDGF-BB)购自安迪生物科技有限公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州；目录号220-BB)，根据厂商说明书进行重构和操作。Johnson等人(EMBO J.3：921(1984))描述了hrPDGF-BB的大肠杆菌表达和编码109氨基酸残基的成熟人PDGF-B链蛋白(C端加工，以前体序列中的苏氨酸残基190结束)的DNA序列。以二硫键连接的同型二聚体rhPDGF-BB包含两条109氨基酸残基的B链，分子量约为25kDa。Raines等人(Meth.Enzymol.109：749-773(1985))描述了通过PDGF刺激3H-胸苷掺入静止NR6R-3T3成纤维细胞的能力来测量PDGF的活性。此测定法中PDGF的ED50通常为1-3ng/ml。
PDGF的浓度选自0.1-1ng/ml、1-5ng/ml、5-10ng/ml、10ng/ml、10-15ng/ml、15-50ng/ml和50-100ng/ml。在某些实施方案中，cDRF中补加1-25ng/ml、更优选5-15ng/ml、最优选约10ng/ml PDGF。在特定实施方案中，PDGF为PDGF-BB。可选地，PDGF可以是另一种类型，例如PDGF-AB、PDGF-BB或任何PDGF类型的混合。在相关实施方案中，本发明的DM还包含或可选地包含下述额外的补加物。
B.脂
在一些实施方案中，基础培养基补加了CDLM(表5)，或可选地补加了一种或多种CDLM中的脂。
脂作为结构成分和潜在的能量来源在活细胞中十分重要。多数细胞能够由培养基中存在的葡萄糖和氨基酸在体外合成脂。然而，如果可利用细胞外的脂，则脂的生物合成被抑制，细胞利用培养基中的游离脂肪酸，脂族酯和胆固醇。血清富含脂，是培养细胞的细胞外脂的主要来源。已发现基于海洋石油的化学上未确定的脂制品在若干系统中有效促进无血清培养基中的细胞生长。见例如Weiss等人，In Vitro 26：30A(1990)；Gorfien等人，In Vitro 26：37A(1990)；Fike等人，In Vitro 26：54A(1990)。因此，为无血清培养基补充多种脂来替换通常由血清提供的脂可能是期望的。
适合在本发明的DM中使用的脂包括硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和α-生育酚醋酸酯。在一个实施方案中，基础培养基补加了表5所示的化学上确定的脂混合物(CDLM)。CDLM可从英骏公司(Invitrogen)购得。除了脂成分以外，英骏公司(Invitrogen)所提供的CDLM还包含乙醇(100g/L)及乳化剂PluronicF68
Figure G2007800274495D00151
(100g/L)和Tween 80
Figure G2007800274495D00152
(2.2g/L)。
实施本发明的方法时，表5中所示的CDLM中个别脂成分的浓度可以依特定的细胞培养条件有所调整。本领域技术人员用常规技术能够容易地进行这样的调整。此外，可能不是CDLM的所有成分均为必需的。对于某成分或成分集合而言，如果当其浓度降低或消除该成分时，而培养基关于软骨细胞附着、增殖、和/或再分化的性质基本上保持相同，则该成分或成分集合是非必需的。
在某些实施方案中，本发明的DM包含CDLM的至少一种、两种、四种、六种、八种或全部脂成分。在一个实施方案中，DM包含PDGF和表5中定义的CDLM。在其它非限制性实施方案中，DM包含PDGF和表6中显示的脂组合。
表5.化学上确定的脂混合物(CDLM)的组成
Figure G2007800274495D00161
表6.举例说明性脂组合
Figure G2007800274495D00162
Figure G2007800274495D00171
Figure G2007800274495D00181
在某些实施方案中，培养基中脂的浓度(v/v)选自0.05-0.1％、0.1-0.5％、0.5％、0.5-1％、1-2％、和2-5％。在某些其它实施方案中，DM额外补加了1到25ng/ml、更优选5到15ng/ml、最优选约10ng/ml PDGF。在特定实施方案中，DM包含约0.5％(v/v)CDLM和10ng/ml PDGF。
C.IL-6家族细胞因子
IL-6家族的细胞因子的各成员可以利用共同的信号传导受体亚单位gp130，其在许多细胞类型中均存在。见例如，Hirano等人(2001)IL-6Ligand and Receptor Family.于：Cytokine Reference，学术出版社，圣地亚哥，523-535。IL-6家族细胞因子的实例包括但不限于制瘤素M(OSM)、白介素-6(IL-6)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、白介素-11(IL-11)、心肌营养素1(CT-1)和神经营养素1/B细胞刺激因子3(NNT-1/BSF-3)。已发现IL-6家族的细胞因子在许多生物系统中调节细胞生长和分化，包括造血作用、神经发生和骨发生。Bruce等人，Prog.GrowthFactor Res.4：157-170(1992)。
1.制瘤素M(OSM)
人OSM是分泌的糖蛋白，最初翻译为252个氨基酸的多肽，N端具有25个残基的疏水信号序列，在分泌过程中被移除。额外的翻译后切割事件除去31个C端残基，留下192氨基酸的二硫键连接的成熟蛋白。Rose等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 88：8641-8645(1991)；Robinson等人，Cell77：1101-1116(1994)。在人类中，OSM与两种不同的受体复合物结合并传导信号：LIF受体(LIFR)/gp130异二聚体和OSM受体(OSMR)/gp130异二聚体。与任一受体复合物的结合导致Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374：1-20(2003)。
已报道OSM抑制一些、但不是所有的人肿瘤细胞系的生长。相反，还报道OSM刺激一些正常成纤维细胞如人包皮成纤维细胞或WI-38细胞的生长。Zarling等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 83：9739-9743(1986)。因此，OSM可能对于刺激某些细胞的体外生长有用。对于OSM的更详细说明可以在美国专利号5,202,116和5,814,307中找到。
OSM可容易地从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的196个氨基酸的重组OSM购自安迪生物科技有限公司(R&DSystems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)(目录号295-OM，也见Linsley等人，Mol.Cell.Biol.10：1882-1890(1990))。OSM的生物活性可以通过人红白血病细胞系增殖测定法测定，例如Kitamura等人，J.Cell Physiol.140：323-334(1989)对此有所描述。在优选实施方案中，人OSM用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的OSM、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。
2.白介素-6(IL-6)
IL-6有很多互用名称，包括：干扰素β2；B细胞分化因子；B细胞刺激因子2；肝细胞刺激因子；杂交瘤生长因子；和CTL分化因子。人IL-6为186个氨基酸的分泌糖蛋白，合成时是212个氨基酸的前体蛋白。Matsuda等人，(2001)IL-6。于：Cytokine Reference，学术出版社，圣地亚哥，538-563。在人类中，IL-6与IL-6受体(IL-6R)和gp130同型二聚体的复合物结合并传导信号。IL-6与IL-6R受体的结合导致Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374：1-20(2003)。
已报道IL-6诱导PC12神经元细胞的分化、诱导骨髓祖细胞的无性系成熟、及诱导T细胞的生长。相反，还显示IL-6抑制髓样白血病细胞和乳腺癌细胞的生长。因此，IL-6可能对于刺激某些细胞的体外生长有用。对于IL-6生物学更详细说明可以在美国专利号5,188,828中找到。
IL-6可以从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的184个氨基酸的重组IL-6购自安迪生物科技有限公司(R&D Systems)(明尼阿波利斯，明尼苏达州)(目录号206-IL，也见Hirano等人，Nature 324：73-76(1986))。IL-6的生物活性通过浆细胞瘤增殖测定法测定，例如Nordan等人，J.Immunol.139：813(1987)对此有所描述。在优选实施方案中，人IL-6用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的IL-6、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。
3.白血病抑制因子(LIF)
LIF有若干互用名称，包括：胆碱能分化因子；DA细胞中的人白介素；分化刺激因子；MLPLI；和恩非勒明(Emfilermin)。人LIF是180个氨基酸的分泌糖蛋白。Kondera-Anasz等人，Am.J.Reprod.Immunol.52：97-105(2004)。在人类中，LIF与LIF受体(LIFR)/gp130异二聚体结合并传导信号。LIF与LIF受体的结合导致Janus激酶/信号转导和转录激活子(JAK/STAT)和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号传导途径的活化。Heinrich等人，Biochem.J.374：1-20(2003)。
已报道LIF抑制M1髓样白血病细胞的增殖。见例如，美国专利号5,443,825。相反，还报道LIF刺激神经元的生长，以及促进神经元从肾上腺髓质表型向乙酰胆碱能表型的分化。见例如，美国专利号5,968,905。向已切断的神经加入LIF还能够增强神经再生。见例如美国专利号6,156,729。因此，LIF可能对于促进某些细胞的体外生长有用。
LIF可以从商业来源获得。在下文实施例中，在大肠杆菌中生产的181个氨基酸的重组人LIF购自西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)(目录号L 5283，也见Gearing等人，EMBO J.6：3995(1987))。LIF的生物活性通过测试其刺激M1小鼠髓样白血病细胞分化的能力而测定，例如Gearing等人，EMBO J.6：3995(1987)对此有所描述。在优选实施方案中，人LIF用于生产本发明的培养基。然而，本领域技术人员会认识到其它物种的LIF、天然存在的突变体和工程化的突变体可以同样有效。
在某些实施方案中，本发明的DM为cDRF，补加了PDGF，一种或多种脂：选自硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和α-生育酚醋酸酯，及一种或多种细胞因子。在特定实施方案中，本发明的DM为cDRF，补加了PDGF，一种或多种脂：选自硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和α-生育酚醋酸酯，及OSM、IL-6和LIF中的一种或多种。细胞因子的浓度选自0.01-0.1ng/ml、0.1-1ng/ml、1-5ng/ml、5-10ng/ml、10-15ng/ml、15-50ng/ml和50-100ng/ml。在某些实施方案中，cDRF补加了0.01-10ng/ml、更优选0.1-2ng/ml、最优选0.5-1ng/mlOSM、IL-6和/或LIF。在优选实施方案中，cDRF补加了约10ng/ml PDGF、0.5％CDLM、1ng/ml IL-6和0.5ng/ml OSM。在相关实施方案中，本发明的DM还包含下述额外补加物。
在某些实施方案中，本发明的DM包含OSM、IL-6和LIF中的至少一种、两种或全部三种。在其它非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6和LIF组合。在另外的非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6和LIF的任意组合、PDGF和表5中定义的CDLM。在另外的非限制性实施方案中，DM包含表7中列出的OSM、IL-6、LIF、PDGF和脂的任意组合。在优选实施方案中，DM包含OSM、IL-6、PDGF和如表5中定义的CDLM。在另外的优选实施方案中，DM为如表4中定义的cDRFm。例如，培养基可包含cDRFm、OSM、IL-6、PDGF和CDLM。
表7.OSM、IL-6和LIF的举例说明性组合
  补加IL-6-家族细胞因子   补加PDGF   补加CDLM或表6的脂
  1   OSM   否   否
  2   OSM   是   否
  3   OSM   否   是
  4   OSM   是   是
  5   IL-6   否   否
  6   IL-6   是   否
  7   IL-6   否   是
  8   IL-6   是   是
  9   LIF   否   否
  10   LIF   是   否
  11   LIF   否   是
  12   LIF   是   是
  13   OSM、IL-6   否   否
  14   OSM、IL-6   是   否
  15   OSM、IL-6   否   是
  16   OSM、IL-6   是   是
  17   OSM、LIF   否   否
  18   OSM、LIF   是   否
  19   OSM、LIF   否   是
  20   OSM、LIF   是   是
  21   IL-6、LIF   否   否
  22   IL-6、LIF   是   否
  23   IL-6、LIF   否   是
  24   IL-6、LIF   是   是
  25   OSM、IL-6、LIF   否   否
  26   OSM、IL-6、LIF   是   否
  27   OSM、IL-6、LIF   否   是
  28   OSM、IL-6、LIF   是   是
D.额外补加物
本发明的DM可以任选地补加促进培养细胞生长所需的任意数目的额外补加物。这样的补加物可以包括但不限于BMP家族成员、TGF-β家族成员、IGF和胰岛素。
本发明的培养基可以用于能够再分化的软骨细胞在培养中的接种、生长和维持，而不使用血清。对于特定的细胞培养条件，可能需要调整PDGF、脂、OSM、IL-6和LIF所标明的浓度范围。本领域技术人员用常规技术能够容易地进行这样的调整。
在一些实施方案中，本发明的培养基不补加基本上纯的jagged 1(JAG1)和/或基本上纯的白介素-13(IL-13)。
在一些实施方案中，本发明的培养基不补加美国专利申请公开号US2005/0265980A1(例如于59到68段)和US 2005/0090002A1(例如于10到14段)列出的补加物的任意特定组合，但可能补加了其中公开的任意组合的子集，只要培养基从该组合中排除了至少一种或多种补加物即可。例如在一些实施方案中，本发明的培养基不补加任意特定的一种、两种、三种、四种或更多以下补加物：基本上纯的表皮生长因子(EGF)、基本上纯的干细胞因子(SCF)、基本上纯的胰岛素样生长因子1(IGF-1)、基本上纯的脑源性神经营养因子(BDNF)、基本上纯的促红细胞生成素(EPO)、基本上纯的FMS相关酪氨酸激酶-3(Flt-3/Flk-2)配体、和/或基本上纯的无翅型MMTV整合位点(WNT)家族成员。在一些实施方案中，本发明的培养基不含地塞米松。
III.软骨细胞和其它适合的细胞
本发明的方法能够用于任何适合的细胞。所述方法特别适合能够产生软骨组织的细胞如软骨细胞的离体增殖。
软骨细胞为存在于多种类型软骨中的细胞，例如透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。软骨细胞为具有独特表型的间充质细胞，该表型主要基于其产生的细胞外基质的类型。前体细胞产生I型胶原，但当它们定向为软骨细胞谱系后，则停止产生I型胶原而开始合成II型胶原，II型胶原构成了细胞外基质的主要部分。另外，定向软骨细胞产生蛋白聚糖聚集物，称为聚集蛋白聚糖，具有高度硫酸化的糖胺聚糖。
本文使用的术语“软骨细胞”，指从软骨得到的分化的细胞，包括培养的去分化软骨细胞，其保留了分化成软骨细胞的能力。术语“软骨细胞”指软骨细胞，无论其是否为原代或传代的、自体、异源、同种异体、异种等。
本发明使用的软骨细胞可以用任何适合方法分离。对于软骨细胞分离有多种起始材料和方法为本领域熟知。Freshney，Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Techniques，第2版，A.R.Liss公司，纽约，137-168页(1987)；Klagsburn，Methods Enzymol.58：560-564(1979)；R.Tubo和L.Brown，Articular Cartilage.于：Human Cell Culture；第五卷，Koller等人(编)(2001)；和Kandel等人，Art.Cells，Blood Subs.，and Immob.Biotech.25(5)，565-577(1995)。作为例子，关节软骨可以从捐赠人的股骨髁获取，通过在0.1％胶原酶/DMEM中过夜消化，软骨细胞可以从软骨中释放出来。释放的细胞作为原代细胞在适合的培养基中扩增，如本发明的DM或含有10％FBS的DMEM。
在某些情况下，可能期望培养软骨细胞祖先干细胞如间充质干细胞，而不是来自软骨活组织检查已经分化为软骨细胞的细胞。软骨细胞可以在这样的细胞分化为软骨细胞时得到。可以分离出这样的干细胞的组织的实例包括滑膜、胎盘、脐带、骨髓、脂肪、皮肤、肌肉、骨膜或软骨膜。
除了软骨细胞和软骨细胞祖先干细胞，在某些情况下可能期望利用具有软骨细胞潜能的其它细胞，如能够转分化为软骨细胞的间充质谱系细胞。软骨细胞可以通过体外诱导这样的细胞分化为软骨细胞而得到。这样的具有软骨细胞潜能的其它细胞的实例包括成骨细胞、肌细胞、脂细胞、成纤维细胞、上皮细胞、角质细胞和神经元细胞。
可以培养软骨细胞、软骨细胞祖细胞和具有软骨细胞潜能的其它细胞至其达到适合治疗患有软骨缺陷的患者的阶段。这样在治疗上有用的软骨细胞应表达关节软骨特异性细胞外基质成分，包括但不限于：透明样关节软骨特有的II型胶原和蛋白聚糖。确定软骨细胞分化状态的测定法为本领域已知，在例如R.Tubo和L.Brown，Articular Cartilage.于：Human CellCulture；第五卷，Koller等人编(2001)和实施例中有所描述。
可以使用本发明的DM的其它细胞包括任何原代或传代细胞，或作为能够在DM中生长的培养组织的一部分的细胞。其它细胞的实例包括肝细胞、β细胞和胰岛细胞。
软骨细胞和其它细胞能够从任何哺乳动物分离，包括但不限于人、猩猩、猴、黑猩猩、狗、猫、大鼠、兔、小鼠、马、牛、猪、象等。可以使用本发明的DM的细胞包括任何原代或传代细胞、或作为能够在DM中生长的培养组织的一部分的细胞。
IV.细胞培养的方法
细胞可以用适合特定细胞类型和用途的任何适当细胞培养方法培养。细胞培养的方法为本领域熟知，例如J.M.Davis，Basic Cell Culture，第2版，牛津大学出版社，2002对此有所描述。
例如，软骨细胞可以在80-90％汇合时用0.05％胰蛋白酶-EDTA传代，稀释用于继代培养，为第二次和后来的传代重接种，以进行进一步扩增。胰蛋白酶和EDTA均可容易地购自英骏公司(Invitrogen)(卡尔斯巴德，加州)。可选地，细胞可以通过用含有螯合剂如EDTA的溶液孵育进行传代。用这样的螯合剂进行非酶的细胞分离的方法为本领域熟知。在特定实施方案中，在本发明的DM中生长的细胞用0.1mM到1mM EDTA传代。在优选实施方案中，在本发明的DM中生长的细胞用处于0.1mM到1mMEDTA中的少于0.0025％(或325单位/ml)、优选0.00025％(或32.5单位/ml)的重组胰蛋白酶进行传代。可以在任何时候收集并冷冻细胞于包含10％DMSO和40％HAS的DMEM中、或例如美国专利号6,365,405中描述的本领域已知的其它组合物中。
在一些实施方案中，细胞最初可以以低密度培养。术语“低密度”指接种密度少于20,000个细胞/cm2。
本发明的方法适合在多种条件下生长的培养细胞，包括但不限于单层、多层、在固体支持物上、在悬液中、和3D培养。
V.评估培养基的方法
在一些实施方案中，可以测试本发明的培养基维持细胞处于能够分化状态的能力，特别是对于处在容许环境下细胞能使之分化/再分化为软骨细胞。蛋白聚糖、聚集蛋白聚糖和胶原II是通常由软骨细胞在体内分泌的细胞外基质成分的实例，可以作为软骨细胞功能的标记物。培养基维持软骨细胞分化潜能的能力可以通过琼脂糖和/或藻酸盐测定法测定。琼脂糖测定法鉴定由在三维琼脂糖基质中生长的细胞形成的蛋白聚糖，在例如Benya等人，Cell 30：215-224(1982)中有所描述。藻酸盐测定法测量在藻酸盐悬液中培养的细胞中聚集蛋白聚糖和胶原II基因的表达，在例如Yaeger等人，Exp.Cell.Res.237(2)：318-25(1997)；和Gagne等人，J.Orthop Res.18(6)：882-890(2000)中有所描述。
VI.细胞的使用方法
本发明还提供用本发明的方法培养的细胞、和例如在治疗中使用这样的细胞的方法，例如用于通过对受试者施用这样的细胞治疗受试者。例如，所述方法包括通过施用按照本发明方法培养的软骨细胞(例如自体软骨细胞)修复软骨缺陷(例如由于创伤或骨关节炎造成)。
实施例
本发明的多个方面在下文的实施例中得到进一步描述和举例说明。
实施例1：IL-6增加原代人软骨细胞的细胞产率和增殖
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌(Streptomyces griseus))酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.2ng/ml IL-6
4)如表8中定义的cDRF/P/L，补加1.0ng/ml IL-6
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。在所有检测的传代中，生长在cDRF/P/L+IL-6中的细胞产率最高(表9)。在cDRF/P/L+IL-6中生长的细胞的生长指数与在DMEM+10％FBS中生长的细胞的生长指数大致相等，超过仅在cDRF/P/L中生长的细胞(表10)。这些结果表明补加了IL-6的cDRF/P/L是含血清培养基的有效代替物。
表8.cDRF/P/L的组成
Figure G2007800274495D00281
表9.
Figure G2007800274495D00291
表10.
Figure G2007800274495D00292
实施例2：OSM增加原代人软骨细胞的细胞产率和增殖
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.1ng/ml OSM
4)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.5ng/ml OSM
5)如表8中定义的cDRF/P/L，补加1.0ng/ml OSM
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。表11中的数据表明在所有检测的传代中，生长在cDRF/P/L+OSM中的细胞产率最高。在cDRF/P/L+OSM中的细胞的生长指数与在DMEM+10％FBS中的细胞的生长指数大致相等，超过仅在cDRF/P/L中生长的细胞(表12)。这些结果表明补加了OSM的cDRF/P/L是含血清培养基的有效代替物。
表11.
表12.
Figure G2007800274495D00311
实施例3：LIF增加原代人软骨细胞的细胞产率和增殖
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.1ng/ml LIF
4)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.5ng/ml LIF
5)如表8中定义的cDRF/P/L，补加2.0ng/ml LIF
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。表13中的数据表明在第一次传代之后，生长在cDRF/P/L+LIF中的细胞产率最高。在第二次传代之后，在cDRF/P/L+LIF中的细胞的生长指数高于仅在cDRF/P/L中的细胞的生长指数(表14)。这些结果表明补加了LIF的cDRF/P/L是含血清培养基的有效代替物。
表13.
Figure G2007800274495D00321
表14.
Figure G2007800274495D00322
实施例4：IL-6和OSM一起增加原代人软骨细胞的细胞产率
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加1.0ng/ml IL-6
4)如表8中定义的cDRF/P/L，补加0.5ng/ml OSM
5)如表8中定义的cDRF/P/L，补加1.0ng/ml IL-6+0.5ng/ml OSM
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。表15中的数据表明在cDRF/P/L+IL-6、cDRF/P/L+OSM或cDRF/P/L+IL-6+OSM中生长的细胞产率最高。这些结果表明补加了IL-6和OSM的cDRF/P/L是含血清培养基的有效代替物。
表15.
Figure G2007800274495D00331
实施例5：JAG-1抑制软骨细胞在无血清培养基中的生长
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加2.0μg/ml JAG-1
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。表16中的数据表明cDRF/P/L中的细胞产率大致是DMEM+10％FBS中产率的两倍。然而，当cDRF/P/L中加入JAG-1时，细胞产率与仅用cDRF/P/L相比降低约16倍。同样，在JAG-1存在下生长的细胞的生长指数仅为0.004，相比之下在没有JAG-1的cDRF/P/L中细胞的生长指数为0.24。这些结果表明，在所测试的条件下，补加了JAG-1的cDRF/P/L不是含血清培养基的有效代替物。
表16.
培养基   细胞产率(/T75，×105)   生长指数(群体倍增数/天)
  DMEM+10％FBS   10.90   0.23
  cDRF/P/L   21.70   0.24
  cDRF/P/L+2μg/ml JAG-1   1.32   0.004
实施例6：IL-13抑制软骨细胞在无血清培养基中的生长
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表8中定义的cDRF/P/L
3)如表8中定义的cDRF/P/L，补加3.0ng/ml IL-13
4)如表8中定义的cDRF/P/L，补加10.0ng/ml IL-13
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。表17中的数据表明cDRF/P/L中的细胞产率大致是DMEM+10％FBS中产率的两倍。然而，当cDRF/P/L中加入IL-13时，细胞产率呈剂量依赖性减少。与仅用cDRF/P/L相比，3ng/ml和10ng/ml浓度的IL-13分别令细胞产率减少32％和46％。另外，在IL-13存在下，达到50％到80％汇合所需要的培养时间增加，使得生长指数仅为0.07或0.06。这些结果表明，在所测试的条件下，补加了IL-13的cDRF/P/L不是含血清培养基的有效代替物。
表17.
培养基   细胞产率(/T75，×105)   生长指数(群体倍增数/天)
  DMEM+10％FBS   6.84   0.40
  cDRF/P/L   14.90   0.21
  cDRF/P/L+3ng/ml IL-13   10.20   0.07
  cDRF/P/L+10ng/ml IL-13   7.98   0.06
实施例7：E93培养基增加软骨细胞的细胞产率和增殖
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)如表4中定义的cDRFm，补加了5μl/ml如表5中定义的CDLM、10ng/ml PDGF、1ng/ml IL-6和0.5ng/ml OSM(在此称为“E93”)。
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在E93中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM收获，计数并重接种。在每次传代结束时测定细胞产率并计算群体倍增数。在E93中的细胞的生长指数与在DMEM+10％FBS中的细胞的生长指数相等或更高(表18，图1)。生长在E93中的细胞产率比生长在DMEM+10％FBS中的细胞大幅增加(表19，图2)。这些结果表明补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM的cDRFm是含血清培养基的有效代替物。
表18.
Figure G2007800274495D00371
表19.
Figure G2007800274495D00372
实施例8：补加了IL-6和OSM的培养基维持三维培养中软骨细胞的再分化能力
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板，在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2的密度铺板。所有实验使用T75培养瓶。使用下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)实施例7中所述的无血清E93培养基
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在无血清培养基中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触于0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM收获，计数并重接种。
在第三次传代后，通过测量琼脂糖中的集落形成和蛋白聚糖的生产测试细胞再分化的能力(Benya等人，Cell 30：215-224(1982))。50,000个细胞在2％琼脂糖中重悬，在60mm培养皿中铺板。琼脂糖中的细胞在DMEM+10％FBS中37℃培养，铺板24小时后重新补料，之后每2到3天重新补料一次。培养21天后，用10％福尔马林固定板，冲洗，用0.2％番红染色，充分冲洗以除去背景染色。测定染色为蛋白聚糖阳性、尺寸等于或大于50微米的集落数。板中有多于6.8％的细胞形成蛋白聚糖阳性集落并达到最小尺寸标准的评为“通过”。所有株系均以一式三份测试。检测6次活组织检查的细胞株。如表20所示，所有6个株系无论在含血清或无血清培养基中生长，均通过了琼脂糖测定。这些结果进一步表明补加了CDLM、PDGF、IL-6和OSM的cDRFm是含血清培养基的有效代替物。
表20.
  株系号   DMEM+10％FBS   E93
  1   21.5％   14.8％
  2   13.5％   12.3％
  3   20.8％   11.8％
  4   36.2％   31.3％
  5   16.6％   17.3％
  6   15.0％   28.4％
实施例9：在补加了IL6和OSM的培养基中，10个软骨细胞株的平均细胞产率比在补加了血清的DMEM中的高
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板。在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2(高E93)或3,000个细胞/cm2(低E93)铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS；
2)实施例7所述的E93培养基。
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。生长在补加了10％FBS的DMEM中的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。生长在E93培养基中的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mM EDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。处理总共10次活组织检查样品以产生10个不同株系。在每次传代结束时测定细胞产率/培养瓶，相对于补加了10％FBS的DMEM的P1细胞产率进行标准化。与在补加了10％FBS的DMEM中生长的细胞相比，以高或低铺板密度在E93中生长的细胞平均细胞产率大幅增加(表21)。这些结果表明E93是含血清培养基的有效代替物。
表21.
实施例10：补加了IL6和OSM的培养基维持在藻酸盐悬液培养中的软骨细胞再表达2型胶原和聚集蛋白聚糖的能力
如实施例9所述制备原代人软骨细胞。收获在DMEM+10％FBS或E93中生长的第三代细胞用于藻酸盐培养。通过在1.2％藻酸盐溶液中接种1×106个细胞建立藻酸盐培养物。每3-5天为藻酸盐培养物补料EGHIC(DMEM、20ng/mL rhIGF-1、25μg/mL抗坏血酸和1mM丙酮酸钠)。培养21天后，从藻酸盐珠子中提取软骨细胞，用核糖核酸酶保护测定法(RPA)检测I型胶原、II型胶原和聚集蛋白聚糖的mRNA。在此测定法中，II型胶原在胶上检测为310碱基对(bp)的条带，I型胶原为260bp的条带，聚集蛋白聚糖为210bp的条带。图3显示从在E93(泳道2、3和4)或补加了10％血清的DMEM(泳道5、6和7)中生长的细胞得到的、含有II型胶原和聚集蛋白聚糖mRNA的细胞裂解物的量渐增。这表明生长在E93培养基中的人软骨细胞能够再表达这些重要的软骨标记物。
实施例11：生长在补加了IL6和OSM的培养基中的软骨细胞的核型和衰老
例如，如果细胞是用于人类治疗的话，细胞在培养过程中维持正常核型和进入衰老可能很重要。生长在E93中的软骨细胞经至少10次传代仍显示正常核型，在约30次群体倍增后衰老。
实施例12：低水平的细胞因子刺激软骨细胞生长
原代人软骨细胞由关节软骨的活组织检查分离：切碎样品，然后在37℃用0.25％XIV型蛋白酶(灰色链霉菌)酶促消化一小时，再用0.1％胶原酶消化过夜。在1,000×g离心5分钟回收细胞，在适当实验培养基中重悬。在DMEM+10％FBS中生长的细胞以3,000个细胞/cm2的密度铺板。在无血清培养基中生长的细胞以5,000个细胞/cm2铺板。所有实验使用T75培养瓶。测试下列培养基：
1)DMEM+10％FBS
2)实施例7所述的E93培养基
3)含有0.5ng/ml IL-6和0.25ng/ml OSM的E93培养基
4)含有0.1ng/nl IL6和0.05ng/ml OSM的E93培养基
细胞在达到50％到80％汇合时进行传代。在DMEM+10％FBS中生长的细胞用PBS冲洗，通过接触EDTA中的325单位/ml胰蛋白酶收获，计数并重接种。在E93中培养基生长的细胞用PBS冲洗，通过接触0.5mMEDTA中的0.00025％TrypzeanTM(0.1×重组胰蛋白酶；西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)；圣路易斯，密苏里州)收获，计数并重接种。在每次传代结束时计算以群体倍增数/天表示的生长速率(表22)。这些结果表明E93中低水平的IL-6和OSM支持原代人软骨细胞的生长。
表22.
所有在说明书中引用的文献，其全部内容通过引用并入本文。

Claims (30)

1.制备用于治疗受试者的软骨缺陷的药物的方法，其中该方法包括通过用包含补加了制瘤素M，即OSM，的基础培养基的培养基孵育软骨细胞来增殖软骨细胞，和使用所述增殖的软骨细胞制备所述药物，
其中OSM在培养基中以0.1ng/ml到2ng/ml的浓度存在。
2.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基另外补加了白介素-6，IL-6。
3.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基另外补加了白血病抑制因子LIF。
4.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基另外补加了IL-6和LIF。
5.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中所述基础培养基另外补加了血小板衍生生长因子PDGF。
6.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中所述基础培养基另外补加了一种或多种脂，选自硬脂酸、肉豆蔻酸、油酸、亚油酸、棕榈酸、棕榈油酸、花生四烯酸、亚麻酸、胆固醇和α-生育酚醋酸酯。
7.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中所述基础培养基为cDRF。
8.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基为cDRF，另外补加了PDGF和化学上确定的脂混合物CDLM。
9.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基为cDRFm，另外补加了PDGF和CDLM。
10.权利要求1所述的方法，其中所述基础培养基为cDRFm，另外补加了IL-6、PDGF和CDLM。
11.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中基础培养基不补加纯的jagged 1，即JAG1，和/或纯的白介素-13，即IL-13。
12.权利要求1所述的方法，其中OSM在培养基中以0.5ng/ml到1ng/ml的浓度存在。
13.权利要求2所述的方法，其中IL-6在培养基中以0.01ng/ml到10ng/ml的浓度存在。
14.权利要求3所述的方法，其中LIF在培养基中以0.01ng/ml到10ng/ml的浓度存在。
15.权利要求4所述的方法，其中IL-6和LIF在培养基中各以0.01ng/ml到10ng/ml的浓度存在。
16.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中培养基无血清。
17.权利要求1-4之任一项所述的方法，其中培养基还包含血清。
18.权利要求1所述的方法，其中培养基包含：cDRFm；0.1-100ng/mlPDGF；0.05-5％CDLM；0.1-2ng/ml OSM；和0.01-10ng/ml IL-6。
19.权利要求1所述的方法，其中软骨细胞为去分化的细胞。
20.权利要求1所述的方法，其中软骨细胞来自间充质干细胞。
21.权利要求1所述的方法，其中软骨细胞为人软骨细胞。
22.权利要求21所述的方法，其中软骨细胞为人关节软骨细胞。
23.权利要求1和19-22之任一项所述的方法，其中软骨细胞为原代软骨细胞。
24.权利要求1所述的方法，还包括细胞传代的步骤。
25.权利要求24所述的方法，其中细胞通过用包含螯合剂的溶液孵育进行传代。
26.权利要求25所述的方法，其中螯合剂为EDTA。
27.权利要求26所述的方法，其中EDTA在溶液中以0.1mM到1mM的浓度存在。
28.权利要求24所述的方法，其中细胞通过用包含少于325单位/ml胰蛋白酶的溶液孵育进行传代。
29.权利要求28所述的方法，其中溶液含有0.1mM到1mM EDTA。
30.权利要求1所述的方法，其中，在孵育开始时，细胞以少于20,000个细胞/cm2的密度接种。
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