CN105567627A - 使用含高浓度氨基酸的培养基的细胞培养方法 - Google Patents

使用含高浓度氨基酸的培养基的细胞培养方法 Download PDF

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Abstract

提供一种用于通过培养生产所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质的新的培养方法，该方法采用极力排除生物来源的培养基成分的培养基。也就是说，提供一种特征在于将培养液中特定的氨基酸维持在高浓度进行培养的培养方法以及该方法中使用的细胞培养用流加培养基。

Description

使用含高浓度氨基酸的培养基的细胞培养方法
本申请是申请号为200880013018.8、申请日为2008.04.25的同名申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于通过培养生产所希望的蛋白质的细胞来制造这种蛋白质的方法和该方法中使用的培养基。详细的是，本发明涉及一种无血清培养法及蛋白质制造方法，其特征在于在通过培养生产所希望的蛋白质的细胞来制造这种蛋白质的方法中，通过将培养液中的丝氨酸维持在高浓度来进行培养，还提供了在该方法中使用的细胞培养用流加培养基。
背景技术
在通过培养动物细胞要获得该动物细胞产生的天然型蛋白质时、或者在通过培养导入了编码所希望的蛋白质的基因的动物细胞制造所希望的蛋白质等时，除了盐类、糖类、氨基酸类和维生素类等基础营养物外，为了该动物细胞的增殖，一直以来，在培养基中在5～20％的范围内添加哺乳动物来源的抽出物、具体是胎儿牛血清等血清，这种哺乳动物来源的血清占培养基的成本的75～95％，由于品质上存在批次差异，因此存在无法获得稳定增殖的缺点。而且，哺乳动物来源的血清由于无法用高压灭菌器等灭菌，因此有可能被病毒或支原体污染，尽管大多无害，但从稳定生产的观点出发，这会形成额外的未知的重要因素。
近年来，人们担忧哺乳动物来源的成分与疯牛病(madcowdisease)、牛脑海绵状病(BovineSpongiformEncephalopathy:BSE)、感染性海绵状脑病(TransmissibleSpongiformEncephalopathy:TSE)、以及克雅(氏)病(Creutzfeld-JakobDisease:CJD)等之间的关系，因此从安全性方面考虑理想的是出现不含这些哺乳动物来源成分的动物细胞培养用培养基。此外，血清中含有500种以上的蛋白质，因此这使得从培养培养基中分离纯化作为细胞产物的所希望的蛋白质复杂化。
以往，为了解决上述问题，进行了用于在无血清存在下培养动物细胞的无血清培养法的开发。无血清培养法中，逐步开发了添加了胎球蛋白(fetuin)、转铁蛋白、白蛋白等血浆蛋白质、类固醇激素、胰岛素等激素类、增殖因子、氨基酸、维生素等营养因子等作为代替血清效果的物质的无血清培养液。
无血清培养法中使用的胎球蛋白(fetuin)、胰岛素、转铁蛋白、增殖因子等利用血清来源的纯化的蛋白质或重组生物来源的重组体蛋白质。通过使用这些物质，存在以下问题：即使微量，也包括生物来源成分，必须使用高价制品，批次差异导致培养的偏差等问题。
近年来，尽管开发了利用蛋白质加水分解物的无血清培养法，但其存在与上述相同的含有生物来源成分，高价，批次差异导致制造偏差等问题，很难说足以进行有用蛋白质的生产。
因此，理想的是使用尽可能不含生物来源成分，便宜而且批次差异小的蛋白质产量增强的合成培养基的培养法。近年来，对流加培养时培养液中的葡萄糖和氨基酸的举动进行分析，清楚了通过在流加培养时增量谷氨酸，有助于增加抗凝血酶的产量(非专利文献1)。然而，这些认识，由于只通过表达谷氨酰胺合成酶的CHO细胞进行研究，因此在通常的CHO细胞中没有验证，而且，其它氨基酸各自的效果也不清楚。此外，蛋白质产量也还不能说充分。因此，强烈期望使用产量进一步增强的合成培养基的培养法。
非专利文献1:JournalofBioscienceandBioengineering(2005),100(5),502-510
发明的内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，在通过极力排除了生物来源的培养基成分的培养基进行流加培养时，通过改良培养基，使细胞中生产高产量的蛋白质。
用于解决问题的方法
本发明人为了实现上述课题，反复进行了积极的研究，结果发现，通过使无血清培养液中往往枯竭的特定氨基酸的浓度维持在高浓度，可以使细胞生产高产量的蛋白质，基于这种认识，完成了本发明。
也就是说，本发明提供以下内容。
(1)细胞的培养方法，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内，培养液中的丝氨酸的浓度在1mM以上。
(2)上述(1)的方法中，其还至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内，培养液中的酪氨酸的浓度在1mM以上，和/或半胱氨酸的浓度在起始培养基的浓度以上或0.4mM以上。
(3)动物细胞培养用培养基，其含有1mM以上的丝氨酸或其盐。
(4)动物细胞培养用培养基，其含有1mM以上的丝氨酸或其盐，并且至少含有1mM以上的酪氨酸，和/或0.4mM以上的半胱氨酸。
(5)所希望的蛋白质的制造方法，其特征在于使用上述(3)或(4)所述的动物细胞培养用培养基，培养产生所希望的蛋白质的细胞，制造该蛋白质。
(6)细胞的培养方法，其特征在于在培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在培养的细胞能够充分增殖时或产生的所希望的蛋白质能够充分产生的时间内的一部分或所有时间内培养液中丝氨酸的浓度在1mM以上。
(7)上述(6)的方法中，其还至少在培养的细胞能够充分增殖时或产生的所希望的蛋白质能够充分产生的时间内的一部分或所有时间内，培养液中酪氨酸的浓度在1mM以上，和/或半胱氨酸的浓度在起始培养基的浓度以上或0.4mM以上。
(8)细胞的培养方法，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在细胞的对数增殖期的一部分或全部时间内，培养液中丝氨酸的浓度在1mM以上。
(9)上述(8)的方法中，其还至少在细胞的对数增殖期的一部分或全部时间内，培养液中的酪氨酸浓度在1mM以上，和/或半胱氨酸浓度在起始培养基的浓度以上或0.4mM以上。
(10)上述(8)或(9)的方法，其至少在细胞的对数增殖期的一部分或全部时间内培养液中丝氨酸浓度在2mM以上。
(11)细胞的培养方法，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内，培养液中的丝氨酸浓度在1mM以上。
(12)上述(11)的方法中，其还至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内，培养液中的酪氨酸浓度在1mM以上，和/或半胱氨酸的浓度在起始培养基的浓度以上或0.4mM以上。
(13)上述(11)或(12)的方法，其至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内培养液中丝氨酸的浓度为2mM以上。
(14)上述(1)、(2)、(5)～(13)任何一项的培养方法或制造方法中，其通过分批培养法(batchculture)、重复分批培养法(repeatedbatchculture)、流加培养法(fed-batchculture)、或重复流加培养法(repeatedfed-batchculture)、连续培养法(continuousculture)、灌流培养法(perfusionculture)培养细胞。
(15)上述(1)、(2)、(5)～(13)任一项的培养方法或制造方法，其通过流加培养法培养细胞。
(16)上述(15)的方法，其通过逐次多次和连续流加向培养液提供丝氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸。
(17)上述(1)、(2)、(5)～(16)任一项的培养方法或制造方法，所述细胞导入了编码所希望的蛋白质的基因。
(18)上述(17)的方法，所述所希望的蛋白质是抗体。
(19)上述(1)、(2)、(5)～(18)任一项的方法，所述细胞是哺乳动物细胞。
(20)上述(19)的方法，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
(21)含有浓度为10mM～1000mM的丝氨酸的细胞培养用流加培养基。
(22)含有浓度为20mM～500mM的丝氨酸的细胞培养用流加培养基。
(23)上述(21)或(22)的流加培养基，其还添加了半胱氨酸和/或酪氨酸。
(24)上述(21)或(22)的流加培养基，其还添加了半胱氨酸和酪氨酸。
(25)一种通过流加培养法培养细胞的方法，其特征在于添加上述(21)～(24)任一项所述的流加培养基。
(26)一种蛋白质的制造方法，其特征在于在通过培养细胞制造所希望的蛋白质的方法中，使用上述(1)、(2)、(6)～(20)任一项所述的方法进行培养。
(27)一种药物的制造方法，其以用上述(5)或(26)中所述的制造方法制造的蛋白质作为有效成分。
发明的效果
本发明，可对于生理活性肽或蛋白质的生产极为有利地使用。本发明的特征在于，通过采用不含生物来源的成分的合成培养基进行培养，可以增大蛋白质的生产性。此外，本发明中使用的流加培养基由于添加极纯的氨基酸，因此是成分组成清楚，批次间差异小，而且均一的培养基。因此获得更均一的蛋白质的可能性高，是有利于工业生产的培养基。具体的是，例如可极大有助于药品用抗体等的大量供应。
附图的简要说明
[图1]表示培养期间抗体浓度的变化。(实施例1)
[图2]表示培养期间的存活率的变化。(实施例1)
[图3]表示培养期间乳酸浓度的变化。(实施例1)
[图4]表示培养期间抗体浓度的变化。(实施例2)
[图5]表示培养期间存活率的变化。(实施例2)
[图6]表示培养期间乳酸浓度的变化。(实施例2)
[图7]表示培养期间抗体浓度的变化。(实施例3)
[图8]表示培养期间丝氨酸浓度的变化。(实施例3)
[图9]培养期间的酪氨酸浓度的变化。(实施例3)
[图10]表示牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列和编码其的基因的碱基序列。(参考例1)
[图11]表示牛磺酸转运蛋白的结构。(参考例1)
[图12]表示表达质粒pHyg/TauT的结构。(参考例2)
用于实施发明的最佳方式
以下，对本发明的实施方式进行更详细的说明。
本发明的方法的特征在于，在通过培养生产所希望的蛋白质的细胞，制造该蛋白质时，通过培养液中的丝氨酸维持在高浓度进行培养。具体的是，特征在于至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内培养液中的丝氨酸浓度在1mM以上、优选在2mM以上。
因此，含有1mM以上的丝氨酸或其盐的动物培养用培养基是本发明的一个方式。本发明中，所谓“含有1mM以上的丝氨酸(或其盐)的动物培养用培养基”，不仅包括起始培养基的丝氨酸浓度在1mM以上的培养基，还包括通过添加流加培养基等，至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内培养液中丝氨酸的浓度调整到1mM以上、优选2mM以上的培养基。
此外，本发明的方法中，特征在于在培养液中，除了高浓度的丝氨酸外，还补充酪氨酸和/或半胱氨酸进行培养。具体是，至少在细胞的增殖期开始时之后的一定时间内，设法使培养液中的酪氨酸的浓度在1mM以上、和/或半胱氨酸的浓度在起始培养基的浓度以上。其中，由于起始培养基的半胱氨酸浓度通常在0.4mM左右，因此前述半胱氨酸浓度无论起始培养基的半胱氨酸浓度怎样，至少在细胞的增殖期开始时之后的一定时间内培养液中半胱氨酸的浓度可以在0.4mM以上，优选在1mM以上。
因此，含有1mM以上的丝氨酸或其盐，还至少含有1mM以上的酪氨酸、和/或0.4mM以上的半胱氨酸的动物培养用培养基是本发明的一种方式。本发明中，所谓“含有1mM以上的酪氨酸的动物培养用培养基”，不仅包括起始培养基的酪氨酸浓度为1mM以上的培养基，还包括通过添加流加培养基等，至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内培养液中酪氨酸的浓度调整到1mM以上的培养基。同样，所谓“含有0.4mM以上的半胱氨酸的动物培养用培养基”，不仅包括起始培养基的半胱氨酸浓度为0.4mM以上的培养基，还包括通过添加流加培养基等，至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内培养液中的半胱氨酸的浓度调整到0.4mM以上的培养基。
这样一来通过维持培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度进行培养，在培养的细胞能够充分增殖时或产生的所希望的蛋白质能够充分产生的时间内的一部分或所有时间内，培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上，就可以使细胞中产生高产量的蛋白质。
这样一来，在培养产生所希望的蛋白质的细胞时，通过使用将丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度调整到预定浓度以上的培养基进行培养，制造该蛋白质的方法是本发明的一个侧面。因此，所希望的蛋白质的制造方法也是本发明的一个方式，该方法的特征在于通过使用上述的含有1mM以上的丝氨酸或其盐的动物培养用培养基培养产生所希望的蛋白质的细胞来制造该蛋白质。此外，特征在于通过使用含有1mM以上的丝氨酸或其盐，还至少含有1mM以上的酪氨酸和/或0.4mM以上的半胱氨酸的动物培养用培养基培养产生所希望的蛋白质的细胞来制造该蛋白质的所希望的蛋白质的制造方法也是本发明的一个方式。
本发明中，如上所述培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上的时期，可以只维持增殖期开始时开始到终止时的一部分时间，或者可以在从增殖期开始时一直到终止时的所有时间或培养期的整个时间里都维持。
其中，所谓“增殖期开始时期”是指培养细胞的增殖的诱导期开始移行到加速期的时期。然后，从加速期开始移行到对数增殖期、减速期、停止期、死亡期。(小林猛、本多裕之著、「生物化学工学」、东京化学同人、应用生命科学系列8、发刊年「2002年」)
本发明的另一个侧面中，本发明的培养法中，培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)浓度维持在预定浓度以上的时期，可以在培养细胞能够充分增殖的时期或产生的所希望的蛋白质能够充分产生的时期的一部分或全部维持，具体可以在培养细胞的增殖期开始时一直到结束时的一部分或全部时间里维持。尤其是，由于在培养第3天后起始培养基中的氨基酸含量逐渐减少，培养第3天后的一定时间内将培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)浓度维持在预定浓度以上十分重要。因此，本发明的这个侧面中，更具体的是，在需要将培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上的时期，可以是至少在培养第3天起培养细胞的减速期到停止期这一时期的一部分或整个时期，优选培养第3天起培养细胞的对数增殖期一直到减速期这一段时期的一部分或整个时期。
作为更具体的方式，作为将培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上的优选时期，可以是从至少细胞的增殖期开始时(通常在培养第1天时)的4日后(通常在培养5天后)，优选至少在增殖期开始时的3天后(通常在培养4天后)后，更优选在至少增殖开始时的2天后(通常在培养3天后)后，更优选在增殖期开始之后。此外，作为需要将培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上的时期，在培养期在两周内时，可以是至少一直维持到培养结束的5天前，优选4天前，更优选3天前。培养期超过两周时，可以至少维持到培养第10天，优选到培养结束的5天前，更优选培养结束的4天前，更优选培养结束的3天前。
本发明的另一个侧面中，作为将培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度连续维持在预定浓度以上的优选时期，可以是至少在细胞对数增殖期的一部分时间内。具体是，对数增殖期开始时的4天以后，优选对数增殖期开始时的3天后，更优选对数增殖期开始时以后。其中，所谓“细胞的对数增殖期的部分时期”是指，可以只维持对数增殖期的部分时间，或在对数增殖期开始时开始直到终止时的所有时间内，直到终止时为止的所有时间，或整个培养期的所有时间内维持。
典型的细胞培养中，对数增殖期开始时间通常是培养第3天时。因此，本发明更具体的方式中，特征在于在至少培养第3天后部分或整个培养时期中培养液中的丝氨酸的浓度为1mM以上，优选2mM以上。此外，酪氨酸和/或半胱氨酸的浓度在预定浓度以上时，至少在培养第3天后的部分或所有培养时期中，设法使培养液中酪氨酸的浓度达到1mM以上，和/或半胱氨酸的浓度达到起始培养基的浓度以上。其中，起始培养基的半胱氨酸浓度通常在0.4mM左右，因此前述半胱氨酸浓度无论起始培养基的半胱氨酸浓度怎样，在培养第3天后的部分或整个培养时期中培养液中半胱氨酸的浓度可以是0.4mM以上，优选在1mM以上。
本发明中，所谓“至少在培养第3天后的部分或整个培养时期”可以是培养第4天、第5天、第6天或第7天以后的培养时期等，相反，可以是包括培养开始时，培养第1天或第2天后，培养第3天后的部分或整个培养时期的培养时期。
此外，培养时期在两周以内时，作为培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度连续维持在预定浓度以上的优选时期，可以是至少到培养结束5天前为止，优选4天前，更优选3天前。培养时期超过两周时，可以是至少到培养第10天为止，优选到培养结束5天前为止，更优选到培养结束4天前为止，更优选到培养结束3天前为止。
因此，本发明的另一个方式的特征在于至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内培养液中的丝氨酸浓度在1mM以上，优选在2mM以上。此外，在酪氨酸和/或半胱氨酸的浓度在预定浓度以上时，至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内设法使培养液中酪氨酸的浓度达到1mM以上、和/或半胱氨酸的浓度达到起始培养基的浓度以上。由于起始培养基的半胱氨酸浓度通常在0.4mM左右，因此前述半胱氨酸浓度无论起始培养基的半胱氨酸浓度如何，在培养第3～10天的部分或整个时期中培养液中半胱氨酸的浓度可以在0.4mM以上，优选在1mM以上。
本发明中所谓“至少在培养第3～10天的部分或整个时期”可以是培养第4天、第5天、第6天或第7天以后的培养时期等，相反，可以是包括培养开始时，培养第1天或第2天以后培养第3～10天的部分或整个培养时期的培养时期。
此外，在前述方式中，至少在培养第3天后的部分或整个时期培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上，如果培养期短于10天时，在培养第3天后的部分或整个时期中培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度如果维持在预定浓度以上就包含在本发明中。
通过这种用本发明的方法培养细胞，就可以使细胞产物生产高产量蛋白质，通过从培养基中分离该蛋白质进行纯化，可以制造所希望的蛋白质。
作为用于将培养液中的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)维持在预定浓度进行培养的手段，可以在细胞培养的最初阶段起使培养基中含有高浓度的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)，或通过在培养中追加含有高浓度的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的培养基来补充这些氨基酸。
为了使培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度维持在预定浓度以上，作为开始向培养液中补充氨基酸的时期，理想的是至少在培养液中的上述氨基酸降低到预定浓度以下的3天以内，优选1天以内、最优选氨基酸降低到预定浓度以下前开始补充。作为补充氨基酸的方法，可以一次或连续多次分开补充，也可以连续补充。此外，还可以在起始培养基中含有整个培养期间，维持预定浓度所必需的氨基酸量的全部。
一般来说，细胞培养方法被分为分批培养法(batchculture)、连续培养法(continuousculture)、流加培养法(fed-batchculture)。本发明的方法中可以使用任意一种方法，但优选使用流加培养法或连续培养法，尤为优选使用流加培养法。
分批培养法是这样的方法，即向培养基中加入少量种子培养液，并且培养中不新添加培养基或不排出培养液，使细胞增殖的培养方法。本发明中使用分批培养法时，从细胞培养的最初阶段起使培养基中含有高浓度的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)。
连续培养法是培养中连续添加培养基，且连续使之排出的培养方法。而且，连续法还包括灌流培养(perfusionculture)。
流加培养法由于处于分批培养法和连续培养法之间，因此也称为半分批培养法(semi-batchculture)，培养中连续地或逐次地添加培养基，但不进行连续培养法的这种连续的培养液排出的培养方法。流加培养时添加的培养基(以下称为流加培养基)不需要与已经在培养中使用的培养基(以下称为起始培养基)相同，可以添加不同的培养基，也可以只添加特定成分。
本发明中所谓起始培养基通常是指在细胞培养的最初阶段使用的培养基。但是，在多次分别添加流加培养基时，分别添加流加培养基前的培养基也可以作为起始培养基。
本发明中，在使用流加培养法或连续培养法时，可以使在培养途中添加的培养基中含有高浓度的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)，还可以使从细胞培养的最初阶段起在培养基中含有高浓度的丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)。重要的是，如上所述，在培养的至少预定阶段内设法使丝氨酸的浓度，或丝氨酸和酪氨酸的浓度，或丝氨酸和半胱氨酸的浓度，或丝氨酸和酪氨酸和半胱氨酸的浓度维持在预定浓度以上。因此，例如，通过适时分析培养液中丝氨酸(和酪氨酸和/或半胱氨酸)的浓度，添加的培养基中这些氨基酸的浓度，可以控制培养液中这些氨基酸的浓度。或者，可以采用例如，根据细胞数判断培养中的细胞增殖的阶段，从而控制氨基酸的补给的方法。
下面，就具有本发明的特征的培养液中的成分-丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸进行详细说明。
丝氨酸可以采用单品、其衍生物、其盐中的任一种。此外，还可以使用天然丝氨酸或采用合成法或基因重组法制造的丝氨酸。溶液中的浓度的特征是，例如至少在培养中的预定时期中培养液中丝氨酸的浓度在1mM以上，优选在2mM以上。由于以往一直使用的含丝氨酸的培养基，典型的是含有约0.5mM丝氨酸，因此可以说本发明中丝氨酸浓度是极高浓度(Dulbecco,R.,Freeman,G.Virology8,p396(1959),Nature,NewBiology(1971)230,p52)。
就酪氨酸而言，同样也可使用单品、其衍生物、其盐中的任意一种。此外，还可以使用天然酪氨酸或采用合成法或基因重组法制造的酪氨酸。就半胱氨酸而言，可以采用单品、其衍生物、其盐中的任一种，包括半胱氨酸的二聚体、胱氨酸。还可以使用天然半胱氨酸或采用合成法或基因重组法制造的半胱氨酸。溶液中的浓度的特征是，例如至少在培养中的预定时期中培养液中酪氨酸的浓度在1mM以上、和/或半胱氨酸的浓度在起始培养基的浓度以上。
本发明中，在使用流加培养法作为细胞培养方法时，通过使高浓度的丝氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸溶解于流加培养基中，向培养中中连续的或逐次的追加流加培养基，可以将这些氨基酸的浓度维持在预定浓度以上。具体而言，例如在流加培养基的浓度中，可使用含有约10～1000mM，优选20～500mM、更优选50～200mM的L-丝氨酸的流加培养基。此外，可以使用含有约0.01～1000mM、优选1～200mM、更优选10～100mM的L-酪氨酸的流加培养基、而且，可以使用含有约0.01～500mM、优选0.1～50mM、更优选1～10mM的L-半胱氨酸盐酸盐的流加培养基。
本发明中在培养液中添加前述流加培养基时，流加培养基量，可以使用在整个培养时期，连续的或一定时期、或逐次地添加起始培养基量的1～150％、优选5～50％、更优选8～20％。
本发明中，向培养液中添加前述流加培养基的时期，包括至少从培养的细胞的增殖期开始时期开始直到终止时期为止的部分或整个时期。作为优选时期，至少是培养中的细胞的对数增殖期开始时期(通常为培养第3天时)的4天后，优选对数增殖期开始时的3天之后，更优选对数增殖期开始时(通常是培养第3天时)以后。或，理想的是至少在培养液中的上述氨基酸降低到预定浓度以下的3天以内，优选1天以内，最优选氨基酸降低到预定浓度以下前开始流加。此外，作为实行或继续流加的时期，在培养时期在两周以内时，可以是至少到培养结束5天为止，优选直到4天前，更优选直到3天前。培养期超过两周时，可以至少到培养第10天为止、优选直到培养结束5天前为止，更优选到培养结束4天日前为止，更优选可以到培养结束3天前为止。
本发明的方法中使用的培养液中的其它成分，通过可以适当使用细胞(优选动物细胞)培养培养基中使用的各成分，它们包括氨基酸、维生素类、脂质因子、能源、浸透压调节剂、铁源、pH缓冲剂。除上述成分外，还可以添加例如微量金属元素、表面活性剂、增殖辅助因子、核苷等。此外，还可以分批分别添加含有本发明中使用的特征成分的培养基成分，再用于细胞培养。具体的是，可以在细胞培养中同时或变化时间使用例如单独的高浓度丝氨酸和培养基成分。
作为培养液中其它成分，具体可以列举，例如L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等、优选L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸等氨基酸类；i-环已六醇、生物素、叶酸、硫辛酸、烟碱、烟酸、p-氨基苯酸、泛酸钙、盐酸吡哆醛、盐酸维生素B6、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等、优选生物素、叶酸、硫辛酸、烟酰胺、泛酸钙、盐酸吡哆醛、核黄素、盐酸硫胺素、维生素B12、抗坏血酸等维生素类；氯化胆碱、酒石酸胆碱、亚油酸、油酸、胆固醇等、优选氯化胆碱等脂质因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等、优选葡萄糖等能源；氯化钠、氯化钾、硝酸钾等、优选氯化钠等浸透压调节剂；EDTA铁、柠檬酸铁、氯化亚铁、氯化铁、硫酸亚铁、硫酸铁、硝酸铁等、优选氯化铁、EDTA铁、柠檬酸铁等铁源类；碳酸氢、氯化钙、磷酸二氢钠、HEPES、MOPS等、优选碳酸氢等pH缓冲剂。
除上述成分外，还可以添加例如硫酸铜、硫酸锰、硫酸锌、硫酸镁、氯化镍、氯化锡、氯化镁、亚硅酸钠等、优选硫酸铜、硫酸锌、硫酸镁等微量金属元素；Tween80、PluronicF68等表面活性剂；和重组型胰岛素、重组型IGF、重组型EGF、重组型FGF、重组型PDGF、重组型TGF-α、盐酸乙醇胺、亚硒酸钠、视黄酸、盐酸腐胺等、优选亚硒酸钠、盐酸乙醇胺、重组型IGF、盐酸腐胺等增殖辅助因子；脱氧腺苷、脱氧胞啶、脱氧鸟苷、腺嘌呤核苷、胞啶、鸟苷、尿苷等核苷等。而且在上述本发明的合适的例子中还可以含有链霉素、青霉素G钾和庆大霉素等抗生物质、或酚红等pH指示剂。
此外，培养液中其他成分的含量，氨基酸在0.05-1500mg/L、维生素类在0.001-10mg/L、脂质因子在0-200mg/L、能源在1-20g/L、浸透压调节剂在0.1-10000mg/L、铁源在0.1-500mg/L、pH缓冲剂在1-10000mg/L、微量金属元素在0.00001-200mg/L、表面活性剂在0-5000mg/L、增殖辅助因子在0.05-10000μg/L和核苷在0.001-50mg/L的范围是合适的，这可以根据培养细胞的种类、所希望的蛋白质的种类等来适当确定。
培养液的pH根据培养细胞而不同，一般而言pH6.8～7.6、许多情况下pH7.0～7.4是合适的。
本发明中，可以使用溶解了上述成分的完全合成培养基来培养细胞。或者，使用以往公知的动物细胞培养用培养基作为基础培养基，还可以向其中补充本发明中使用的特征成分。作为动物细胞培养用培养基，如果要举例市售的基础培养基，可以使用D-MEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)、D-MEM/F-121:1Mixture(Dulbecco'sModifiedEagleMedium:NutrientMixtureF-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen社)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL301(JRHbiosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、ISCHO-V(IrvineScientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等。在通过流加培养法培养细胞时，作为细胞培养的最初阶段中使用的起始培养基，可以使用这种市售的培养基。而且，为了将起始培养基中使用的培养基调制成高浓度，可以使用还补充了丝氨酸和酪氨酸和/或半胱氨酸的培养基作为流加培养基。
本发明的培养方法没有特别限定，可以用于各种细胞(例如、细菌细胞、真菌细胞、昆虫细胞、植物细胞、动物细胞等)的培养。例如，可以培养通过基因工程操作整合了编码所希望的蛋白质的基因的COS细胞或CHO细胞、或产生抗体的以小鼠-人、小鼠-小鼠、小鼠-大鼠等的杂交瘤为代表的融合细胞。本发明的方法可以在培养动物细胞要获得该动物细胞所产生的天然型蛋白质时使用，除上述细胞外，还可以用于培养BHK细胞、HeLa细胞等。
本发明中特别优选的动物细胞是导入了编码所希望的蛋白质的基因的CHO细胞。所希望的蛋白质没有特别限定，可以是天然抗体、抗体片段、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体等抗体(例如、抗IL-6受体抗体、抗Glypican-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体、抗VLA4抗体等)或生理活性蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、干扰素、IL-1或IL-6等白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等任何蛋白质，尤为优选抗体。
作为本发明的制造方法生产的抗体，包括人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猴等动物来源的单克隆抗体，还包括嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等人为进行了改变的基因重组型抗体。而且，抗体的免疫球蛋白类型没有特别限定，可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等中的任一类型，但作为药品使用时优选IgG和IgM。而且本发明的抗体不仅包括完整的抗体，还包括Fv、Fab、F(ab)2等抗体片段、用肽连接子等连接子结合了抗体的可变区域的1价或2价以上的单链Fv(scFv、sc(Fv)2等)低分子化抗体等。
由于培养条件根据使用细胞的种类而不同，因此可以确定适当的合适条件。例如，如果是CHO细胞，则通常可以在气相的CO2浓度为0-40％，优选2-10％的气氛下、30-39℃、优选在37℃左右，培养1-50天，更优选1-14天培养。
此外，作为动物细胞培养用的各种培养装置，可以使用例如发酵槽型罐培养装置、气升型培养装置、培养瓶型培养装置、搅拌瓶(spinnerflask)型培养装置、微载体型培养装置、流动层型培养装置、中空纤维型培养装置、转瓶型培养装置、充填槽型培养装置等进行培养。
通过用本发明的方法培养细胞(优选动物细胞)，可以高产蛋白质。
动物细胞蛋白质的产生，可以单独进行培养，需要特殊操作时，这些操作或条件等可以根据培养的动物细胞适当确定。例如在通过基因工程操作转化了含有编码小鼠-人嵌合抗体的基因的载体的CHO细胞中，在前述这种条件下实施培养，1-50天、优选5-21天、更优选17-14天左右，就可以在培养基中获得所希望的蛋白质。通过常规方法(例如参照抗体工学入门、地人书馆、(1994)p.102-104；AffinityChromatographyPrinciples&Methods、GEHealthcare(株)、(2003)p.56-60等)对这些蛋白质进行分离、纯化，可以获得所希望的蛋白质。
根据本发明，可以以高产量制造重组抗体(天然抗体、抗体片段、低分子化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体等)、基因重组蛋白质(粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)、促红细胞生成素、干扰素、IL-1或IL-6等白细胞介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子、等)等。
按照本发明的方法制造的蛋白质或多肽(也称为本发明的蛋白质)在具有可作为药物利用的生物学活性时，通过将这种蛋白质或多肽与药物上允许的载体或添加剂混合再制剂化，可以制成药品。本发明的蛋白质和以本发明的蛋白质作为有效成分的药物也包含在本发明的范围中。
作为药物中可允许的载体和添加剂的例子，可以列举水、药物上允许的有机溶剂，骨胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、褐藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、作为药物添加物被允许的表面活性剂等。
实际的添加物，可以根据本发明的药物治疗剂的剂型，从上述物质中单独或适当组合地进行选择，当然并不限于这些。例如，作为注射用制剂使用时，将纯化的多肽溶解于溶剂，例如生理食盐水、缓冲液、葡萄糖溶液等中，向其中加入吸附防止剂、例如Tween80、Tween20、明胶、人血清白蛋白等后再使用。或者为了形成在使用前溶解再重新构成的剂型，可以是经冷冻干燥的剂型，作为用于冷冻干燥的赋形剂，例如，可以使用甘露醇、葡萄糖等糖醇或糖类。
多肽的有效给药量根据多肽的种类、作为治疗或预防的对象的疾病种类、患者的年龄、疾病的病重程度等适当选择。例如，本发明的蛋白质为抗Glypican抗体等抗体时，其有效给药量按每次体重每1kg，从0.001mg至1000mg的范围内选择。或者可以选择按每位患者0.01～100000mg/body的给药量。但是，也不限于这些给药量。
本发明的药物给药方法，可以是经口，非经口给药中的任意一种，但优选非经口给药，具体可以列举注射(例如，通过静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等进行的全身或局部给药)、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。
实施例
以下，通过实施例和参考例对本发明具体的说明。而且，这些实施例等是用于说明本发明，但并不限定本发明的范围。
〔实施例1〕通过含有高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的低pH流加培养基进行的流加培养(导入抗体基因的CHO细胞株)
培养基组成和制备方法如下所述。
起始培养基:对市售的动物细胞培养用培养基溶解后过滤灭菌。
流加培养基:起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入丝氨酸50mM、半胱氨酸盐酸盐一水合物1.8mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.5附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
细胞:人源化IgG(抗Glypican-3抗体)产生CHO细胞株(参照国际公开第WO2006/006693号小册子)。
在瓶型细胞培养装置中加入起始培养基，在其中按照2x105细胞/mL加入上述CHO细胞株，于37℃、10％CO2的条件下开始培养。培养期间，在整个14天，pH下限为7.0，进行溶解氧浓度40％的自动控制。从培养第3天开始以一定流速一定流速(向1L起始培养基,1.0g/小时)流加流加培养基，培养到第14天。在培养开始时和第3、5、7、10、12、14天时取样。对于各样品的培养上清，通过采用蛋白质A的亲和层析测定产生的抗体浓度，通过台盼蓝染色法测定存活率，通过固定化酶法测定乳酸。如图1所示，使用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基进行流加培养(对照)时，在14天的培养中，抗体浓度为1.6g/L左右。与之相对，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养(Ser,Cys,Tyr)时，在14天的培养中，如果抗体浓度为2.2g/L左右，则可以获得约40％的高抗体浓度。图2中表示了培养期间存活率的变化。此外，如图3所示，乳酸浓度在培养第3天后，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基的流加培养时低乳酸浓度，相对于使用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基的流加培养时的变化。
〔实施例2〕用含有高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的低pH流加培养基进行的流加培养(导入了抗体基因和仓鼠·牛磺酸转运蛋白基因的CHO细胞株)
培养基组成和制备方法如下。
起始培养基:将市售的动物细胞培养用培养基溶解后过滤灭菌。
流加培养基:起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入丝氨酸50mM、半胱氨酸盐酸盐一水合物1.8mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.5附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
细胞:导入了牛磺酸转运蛋白基因的人源化IgG产生CHO细胞株。
在瓶型细胞培养装置中加入起始培养基，在其中按照2x105细胞/mL加入上述CHO细胞株，于37℃、10％CO2的条件下开始培养。培养期间，在整个14天，pH下限为7.0，进行溶解氧浓度40％的自动控制。从培养第3天开始以一定流速(向1L起始培养基，1.5g/小时)流加流加培养基，培养到第14天。在培养开始时和第3、5、7、10、12、14天时取样。对于各样品的培养上清，通过采用蛋白质A的亲和层析测定产生的抗体浓度，通过台盼蓝染色法测定存活率，通过固定化酶法测定乳酸。如图4所示，使用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基进行流加培养(对照)时，在14天的培养中，抗体浓度为1.3g/L左右。与之相对，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养(Ser,Cys,Tyr)时，在14天的培养中，如果抗体浓度为2.0g/L左右，则可以获得约54％的高抗体浓度。如图5所示，使用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基进行流加培养时，在14天的培养中第14天的存活率为52％。与之相对，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养时，在14天的培养时，第14天的存活率可以维持78％这样高的存活率。此外，如图6所示，乳酸浓度在培养第3天后，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基的流加培养时低乳酸浓度相对于使用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基进行流加培养时的变化。
〔实施例3〕为了确认高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸对抗体高产化的作用而进行的流加培养(导入了抗体基因和仓鼠·牛磺酸转运蛋白基因的CHO细胞株)
培养基组成和制备方法如下。
起始培养基:将市售的动物细胞培养用培养基溶解后过滤灭菌。
流加培养基(Ser,Cys,Tyr):起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入丝氨酸50mM、半胱氨酸盐酸盐一水合物1.8mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.5附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
流加培养基(Ser,Cys):起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入丝氨酸50mM、半胱氨酸盐酸盐一水合物1.8mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.0附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
流加培养基(Ser,Tyr):起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入丝氨酸50mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.0附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
流加培养基(Cys,Tyr):起始培养基中使用的动物细胞培养用培养基以相对于起始培养基3倍浓度溶解后，加入半胱氨酸盐酸盐一水和物1.8mM、酪氨酸14.5mM，用盐酸降低pH直至培养基成分全部溶解(pH1.0附近)，确认培养基成分全部溶解后，过滤灭菌。
细胞:导入了牛磺酸转运蛋白基因的人源化IgG产生CHO细胞株。
在瓶型细胞培养装置中加入起始培养基，在其中按照2x105细胞/mL加入上述CHO细胞株，于37℃、10％CO2的条件下开始培养。培养期间，在整个14天，pH下限为7.0，进行溶解氧浓度40％的自动控制。从培养第3天开始以一定流速(向1L起始培养基，1.5g/小时)流加流加培养基，培养到第14天。在培养开始时和第3、5、7、10、12、14天时取样。对于各样品的培养上清，通过采用蛋白质A的亲和层析测定产生的抗体浓度，通过采用离子交换柱的氨基酸分析测定丝氨酸和酪氨酸的氨基酸浓度。如图7所示，采用丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸不增量的流加培养基进行流加培养(对照)时，在14天的培养中，抗体浓度为1.16g/L左右。与之相对，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养(Ser,Cys,Tyr)时，在14天的培养中抗体浓度为1.87g/L，使用高浓度丝氨酸、半胱氨酸增量的低pH流加培养基进行的流加培养(Ser,Cys)时，在14天的培养中抗体浓度为1.47g/L，使用高浓度丝氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养(Ser,Tyr)时，在14天的培养中抗体浓度为1.41g/L，在使用高浓度半胱氨酸、酪氨酸增量的低pH流加培养基进行流加培养(Cys,Tyr)时，在14天的培养中，可以获得抗体浓度为1.18g/L的抗体浓度测定结果。因此，这提示按照高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸的顺序，对抗体高产化作出贡献。而且，还提示同时在流加培养基中添加高浓度丝氨酸、半胱氨酸、酪氨酸，对抗体高产化贡献最大。
图8、图9表示14天的培养期中丝氨酸和酪氨酸的浓度变化。对照组中在培养第5天时，丝氨酸为0.63mM和酪氨酸为0.34mM，培养第7天以后丝氨酸为0.4mM以下和酪氨酸为0.4mM以下，在使用补充了丝氨酸的流加培养基进行的培养中，丝氨酸的浓度为2mM以上、使用补充了酪氨酸的流加培养基进行的培养中酪氨酸的浓度维持在1mM以上。
在以下的参考例中，记载了上述实施例2和3中使用的导入了牛磺酸转运蛋白基因的人源化IgG产生CHO细胞株的制作。
〔参考例1〕CHO细胞来源的仓鼠·牛磺酸转运蛋白基因克隆
从CHODXB11细胞中导入了抗IL-6受体抗体基因的抗IL-6受体抗体产生细胞(特开平8-99902号公报)中提取总RNA后，合成依赖于聚A的cDNA。以用SalI、XhoI、EcoRI这三种限制性酶片段化的cDNA作为模板，通过PCR获得仓鼠·牛磺酸转运蛋白(仓鼠TauT)基因。PCR引物采用设计成5’,3’含有已知在大鼠/小鼠TauT间保守的基因序列的引物。克隆的基因，测定碱基序列，根据与已知生物种的TauT的同源性，确认编码仓鼠TauT(图10)。仓鼠TauT氨基酸序列与小鼠(96％同一性)、大鼠(96％同一性)、人(93％同一性)TauT具有高同源性，预料其是具有12个跨膜区域的转运蛋白(图11)。
〔参考例2〕导入了仓鼠·牛磺酸转运蛋白基因的CHO细胞株的构建
在参考例1的通过克隆获得的仓鼠TauT(以下TauT)基因中加入Kozak序列，构建出CMV启动子表达质粒pHyg/TauT(图12)。通过电穿孔法在亲本株抗Glypican-3抗体产生CHO细胞(参照国际公开第WO2006/006693号小册子)中导入除去了pHyg/TauT或TauT基因的对照质粒pHyg。在潮霉素(400μg/ml)存在下选择表达质粒导入细胞，所有稳定增殖的细胞株扩大(pHyg/TauT:8株,pHyg:7株)。制备TauTmRNA后，通过TaqMan法，能够确认相对于亲本株有显著表达的7株为pHyg/TauT导入细胞。导入细胞(7株)的mRNA平均表达量是对照的(7株)的约40倍。
[序列表freetext]
<序列号1>序列号1表示编码牛磺酸转运蛋白的基因的碱基序列。
<序列号2>序列号2表示牛磺酸转运蛋白的氨基酸序列。

Claims (15)

1.通过流加培养法进行的细胞的培养方法，所述培养方法包括为了维持培养液中的丝氨酸的浓度为1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度为0.4mM以上，在培养途中添加含有丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的培养基的步骤，在培养途中添加的培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度比初始培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度高，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在细胞的增殖期开始时以后的一定时间内，使培养液中维持丝氨酸的浓度在1mM以上、酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度在0.4mM以上。
2.根据权利要求1所述的方法，其包括适时分析培养液中的丝氨酸的浓度，调整添加的培养基中的丝氨酸的浓度的步骤。
3.蛋白质的制造方法，其特征在于使用权利要求1或2的培养方法制造希望的蛋白质。
4.通过流加培养法进行的细胞的培养方法，所述培养方法包括为了维持培养液中的丝氨酸的浓度为1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度为0.4mM以上，在培养途中添加含有丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的培养基的步骤，在培养途中添加的培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度比初始培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度高，其特征在于在培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在培养的细胞能够充分增殖时或产生的所希望的蛋白质能够充分产生的时间内的一部分或所有时间内维持培养液中丝氨酸的浓度在1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度在0.4mM以上。
5.通过流加培养法进行的细胞的培养方法，所述培养方法包括为了维持培养液中的丝氨酸的浓度达到1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度为0.4mM以上，在培养途中添加含有丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的培养基的步骤，在培养途中添加的培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度比初始培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度高，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在细胞的对数增殖期的一部分或全部时间内，维持培养液中丝氨酸的浓度在1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度在0.4mM以上。
6.根据权利要求5所述的方法，其至少在细胞的对数增殖期的一部分或全部时间内培养液中丝氨酸浓度在2mM以上。
7.通过流加培养法进行的细胞的培养方法，所述培养方法包括为了维持培养液中的丝氨酸的浓度达到1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度为0.4mM以上，在培养途中添加含有丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的培养基的步骤，在培养途中添加的培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度比初始培养基中的丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的浓度高，其特征在于在通过培养产生所希望的蛋白质的细胞制造该蛋白质时，至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内，维持培养液中的丝氨酸浓度在1mM以上，酪氨酸的浓度为1mM以上，及半胱氨酸的浓度在0.4mM以上。
8.根据权利要求7所述的方法，至少在培养第3～10天的一部分和全部时间内使培养液中的丝氨酸的浓度在2mM以上。
9.权利要求1～2、4～8任一项所述的方法，其通过逐次多次和连续流加向培养液提供丝氨酸、酪氨酸和半胱氨酸。
10.权利要求1～2、4～9任一项所述的方法，所述细胞导入了编码所希望的蛋白质的基因。
11.权利要求10所述的方法，所述所希望的蛋白质是抗体。
12.权利要求1～2、4～11任一项所述的方法，所述细胞是哺乳动物细胞。
13.权利要求12所述的方法，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。
14.一种蛋白质的制造方法，其特征在于使用权利要求4～13任一项所述的培养方法制造所希望的蛋白质。
15.一种药物的制造方法，其以用权利要求3或14所述的制造方法制造的蛋白质作为有效成分。
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