KR101574355B1

KR101574355B1 - 고농도 아미노산 함유 배지를 사용한 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR101574355B1
Application number: KR1020097024422A
Authority: KR
Inventors: 사토시 가타야마; 쇼우헤이 기시시타; 구니히코 고다이라; 마코토 사다미츠; 요시노리 다카기; 히로키 마츠다
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2007-04-26
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2015-12-11
Also published as: WO2008136398A1; US20190276795A1; CN101663391A; EP2154244B1; CN105567627B; US11661579B2; JP5576115B2; EP2154244A1; EP2154244A4; TW200914614A; CN105567627A; HK1224337A1; DK2154244T3; ES2624185T3; US20230272336A1; TWI601823B; US20110137012A1; KR20100017298A; JPWO2008136398A1

Abstract

원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하기 위한, 생물 유래 배지 성분을 최대한 배제한 배지에 의한 신규 배양 방법을 제공한다. 즉, 배양액 중의 특정한 아미노산을 고농도로 유지하여 배양하는 것을 특징으로 하는 배양 방법 및 이 방법에 사용하는 세포 배양용 유가 배지를 제공한다.

Description

고농도 아미노산 함유 배지를 사용한 세포의 배양 방법 {CELL CULTURE METHOD USING AMINO ACID-ENRICHED MEDIUM}

본 발명은 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하기 위한 방법 및 그 방법에 사용하는 배지에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 배양액 중의 세린을 고농도로 유지하여 배양하는 것을 특징으로 하는 무혈청 배양법 및 단백질 제조 방법, 그리고 이 방법에 사용하는 세포 배양용 유가 (流加) 배지에 관한 것이다.

동물 세포를 배양하여 그 동물 세포가 생산하는 천연형 단백질을 얻고자 하는 경우, 혹은 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 동물 세포를 배양하여 원하는 단백질 등을 제조하는 경우에는, 염류, 당류, 아미노산류, 및 비타민류 등의 기초 영양물 이외에, 그 동물 세포의 증식을 위하여, 종래, 포유 동물 유래의 추출물, 구체적으로는 소 태아 혈청 등의 혈청이 5 ∼ 20 ％ 의 범위에서 배지에 첨가되었는데, 이러한 포유 동물 유래의 혈청은 배지 비용의 75 ∼ 95 ％ 를 차지한다는 점, 품질에 로트간 차이가 있기 때문에 안정적인 증식이 얻어지지 않는다는 결점이 있다. 또, 포유 동물 유래의 혈청은 오토 클레이브 등으로 멸균시킬 수 없기 때문에, 바이러스 또는 마이코플라스마 오염될 가능성이 있고, 그 대부분은 무해하지만, 안정 생산이라는 면에서는 부가적인 미지의 요인이 될 수 있다.

최근, 포유 동물 유래의 성분에 대해서는, 광우병 (mad cow disease), 소 해면상 뇌증 (Bovine Spongiform Encephalopathy : BSE), 감염성 해면상 뇌증 (Transmissible Spongiform Encephalopathy : TSE), 나아가서는 크로이츠펠트-야콥병 (Creutzfeld-Jakob Disease : CJD) 등과의 관계가 우려되어, 안전성면에서 이들 포유 동물 유래의 성분을 함유하지 않는 동물 세포 배양용 배지의 출현이 요망되고 있다. 또한, 혈청에는 500 종 이상의 단백질이 함유되어 있고, 이 때문에 배양 배지로부터의 세포 산물인 원하는 단백질의 단리, 정제를 복잡화한다.

종래, 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여, 동물 세포를 혈청의 비존재하에서 배양하기 위한 무혈청 배양법의 개발이 이루어지고 있다. 무혈청 배양법에서는, 혈청의 효과를 대체하는 물질로서 페투인, 트랜스페린, 알부민 등의 혈장 단백질, 스테로이드 호르몬, 인슐린 등의 호르몬류, 증식 인자, 아미노산, 비타민 등의 영양 인자 등을 첨가한 무혈청 배양액이 개발되었다.

무혈청 배양법에서 사용되는 페투인, 인슐린, 트랜스페린, 증식 인자 등은 혈청 유래의 순화된 단백질 혹은 재조합 생물 유래의 재조합체 단백질의 이용이 이루어지고 있다. 이들을 사용하는 데에 있어서, 미량이지만, 생물 유래 성분을 함유한다는 점, 고가의 제품을 사용해야 한다는 점, 로트간 차이에 의한 배양의 불균일 등의 문제점이 있다.

최근, 단백질 가수 분해물을 이용한 무혈청 배양법도 개발되고 있는데, 상기 와 마찬가지로 생물 유래 성분을 함유한다는 점, 고가인 점, 로트의 차이에 의한 제조의 불균일 등의 문제점이 있어, 유용 단백질의 생산에 충분하다고 하기는 어렵다.

그래서, 가능한 한 생물 유래 성분을 함유하지 않고, 저렴하고 또한 로트간 차이가 적은 단백질 생산량을 증강하는 합성 배지를 사용하는 배양법이 요망되고 있다. 최근, 유가 배양에 있어서의 배양액 중의 글루코오스나 아미노산의 거동에 대하여 분석하여, 유가 배양으로 글루탐산을 증량함으로써, 안티트롬빈의 생산량증가에 기여하는 것이 밝혀졌다 (비특허 문헌 1). 그러나, 이들 지견은, 글루타민 합성 효소를 발현한 CHO 세포에 의해서만 조사되었기 때문에, 통상적인 CHO 세포로는 검증되어 있지 않고, 또한 다른 아미노산의 개개의 효과에 대해서는 불명확하다. 또한, 단백질 생산량도 아직 충분하다고 하기는 어렵다. 그래서, 추가로 생산량을 증강하는 합성 배지를 사용하는 배양법이 강하게 열망되고 있다.

비특허 문헌 1 : Journal of Bioscience and Bioengineering (2005), 100 (5), 502 - 510

발명의 개시

발명이 해결하고자하는 과제

본 발명은 생물 유래 배지 성분을 최대한 배제한 배지에 의한 유가 배양을 실시할 때, 배지를 개량함으로써 세포에 단백질을 고생산시키는 것을 목적으로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

본 발명자들은 상기와 같은 과제를 달성하기 위하여 예의 연구를 거듭한 결과, 무혈청 배양액에 있어서 고갈되기 쉬운 특정한 아미노산의 농도를 고농도로 유지함으로써, 세포에 단백질을 고생산시킬 수 있는 것을 알아내고, 이 지견에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 것을 제공한다.

(1) 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서, 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(2) 상기 (1) 의 방법에 있어서, 추가로 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서, 배양액 중의 티로신의 농도를 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도를 초발 배지의 농도 이상 혹은 0.4 mM 이상으로 하는 방법.

(3) 1 mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하는 동물 세포 배양용 배지.

(4) 1mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하고, 추가로 적어도, 1 mM 이상의 티로신, 및/또는 0.4 mM 이상의 시스테인을 함유하는 동물 세포 배양용 배지.

(5) 상기 (3) 또는 (4) 에 기재된 동물 세포 배양용 배지를 사용하여 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 원하는 단백질의 제조 방법.

(6) 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 적어도 배양하는 세포를 충분히 증식시킬 수 있는 기간 혹은 생산되는 원하는 단백질을 충분히 생산할 수 있는 기간의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 1mM 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(7) 상기 (6) 의 방법에 있어서, 추가로 적어도 배양하는 세포를 충분히 증식시킬 수 있는 기간 혹은 생산되는 원하는 단백질을 충분히 생산할 수 있는 기간의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 티로신의 농도를 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도를 초발 배지의 농도 이상 혹은 0.4 mM 이상으로 하는 방법.

(8) 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 적어도 세포의 대수 증식기의 일부 혹은 전체 기간에서, 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(9) 상기 (8) 의 방법에 있어서, 추가로 적어도 세포의 대수 증식기의 일부 혹은 전체 기간에서, 배양액 중의 티로신의 농도를 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도를 초발 배지의 농도 이상 혹은 0.4 mM 이상으로 하는 방법.

(10) 적어도 세포의 대수 증식기의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 2 mM 이상으로 하는 상기 (8) 또는 (9) 의 방법.

(11) 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서, 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 하는 세포의 배양 방법.

(12) 상기 (11) 의 방법에 있어서, 추가로 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서, 배양액 중의 티로신의 농도를 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도를 초발 배지의 농도 이상 혹은 0.4 mM 이상으로 하는 방법.

(13) 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 2 mM 이상으로 하는 상기 (11) 또는 (12) 의 방법.

(14) 상기 (1), (2), (5) ∼ (13) 중 어느 하나의 배양 방법 혹은 제조 방법에 있어서, 세포를 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 또는 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture), 관류 배양법 (perfusion culture) 으로 배양하는 배양 방법 혹은 제조 방법.

(15) 세포를 유가 배양법으로 배양하는 상기 (1), (2), (5) ∼ (13) 중 어느 하나의 배양 방법 혹은 제조 방법.

(16) 세린 및 티로신 및/또는 시스테인이 순차적으로 복수회, 또는 연속적으로 유가함으로써 배양액 중에 공급되는 상기 (15) 의 방법.

(17) 세포가 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 것인 상기 (1), (2), (5) ∼ (16) 중 어느 하나의 배양 방법 혹은 제조 방법.

(18) 원하는 단백질이 항체인 상기 (17) 의 방법.

(19) 세포가 포유 동물 세포인 상기 (1), (2), (5) ∼ (18) 중 어느 하나의 방법.

(20) 포유 동물 세포가 CHO 세포인 상기 (19) 의 방법.

(21) 10 mM ∼ 1000 mM 의 농도의 세린을 함유하는 세포 배양용 유가 배지.

(22) 20 mM ∼ 500 mM 의 농도의 세린을 함유하는 세포 배양용 유가 배지.

(23) 추가로 시스테인 및/또는 티로신이 첨가되어 있는 상기 (21) 또는 (22) 의 유가 배지.

(24) 추가로 시스테인 및 티로신이 첨가되어 있는 상기 (21) 또는 (22) 의 유가 배지.

(25) 상기 (21) ∼ (24) 중 어느 하나에 기재된 유가 배지를 첨가하는 것을 특징으로 하는 배양 세포를 유가 배양법으로 배양하는 방법.

(26) 세포를 배양하여 원하는 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 배양을 상기 (1), (2), (6) ∼ (20) 중 어느 하나에 기재된 방법을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 단백질의 제조 방법.

(27) 상기 (5) 또는 (26) 에 기재된 제조 방법으로 제조된 단백질을 유효 성분으로 하는 의약의 제조 방법.

발명의 효과

본 발명은 생리 활성 펩티드 또는 단백질의 생산에 매우 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 특징으로서, 생물 유래 성분을 함유하지 않은 합성 배지를 사용한 배양에 의해 단백질의 생산성을 증대시킬 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용하는 유가 배지는 매우 순수한 아미노산을 첨가하기 때문에, 성분 조성이 분명하며 로트간 차이가 적은 균일한 배지이다. 그 때문에 보다 균일한 단백질이 얻어질 가능성이 높아, 공업 생산에 유리한 배지이다. 구체적으로는 예를 들어, 의약품용 항체 등의 대량 공급에 크게 공헌할 수 있다.

도 1 은 배양 기간 중의 항체 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 1)

도 2 는 배양 기간 중의 생존률의 추이를 나타낸다. (실시예 1)

도 3 은 배양 기간 중의 락트산 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 1)

도 4 는 배양 기간 중의 항체 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 2)

도 5 는 배양 기간 중의 생존률의 추이를 나타낸다. (실시예 2)

도 6 은 배양 기간 중의 락트산 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 2)

도 7 은 배양 기간 중의 항체 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 3)

도 8 은 배양 기간 중의 세린 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 3)

도 9 는 배양 기간 중의 티로신 농도의 추이를 나타낸다. (실시예 3)

도 10 은 햄스터 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열 및 이것을 코딩하는 유전자의 염기 배열을 나타낸다. (참고예 1)

도 11 은 햄스터 타우린 트랜스포터의 구조를 나타낸다. (참고예 1)

도 12 는 발현 플라스미드 pHyg/TauT 의 구조를 나타낸다. (참고예 2)

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 방법은 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 배양액 중의 세린을 고농도로 유지하여 배양하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상, 바람직하게는 2 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 한다.

따라서, 1 mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하는 동물 배양용 배지가 본 발명의 1 양태이다. 본 발명에 있어서, 「1 mM 이상의 세린 (또는 그 염) 을 함유하는 동물 배양용 배지」 란, 초발 배지의 세린 농도가 1 mM 이상인 배지 뿐만 아니라, 유가 배지 등의 첨가에 의해 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서 배양액 중의 세린의 농도가 1 mM 이상, 바람직하게는 2 mM 이상으로 조제되는 배지도 포함된다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서는, 배양액 중에, 고농도의 세린에 더하여, 티로신 및/또는 시스테인을 보충하여 배양하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로는, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 배양액 중의 티로신의 농도가 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도가 초발 배지의 농도 이상이 되도록 한다. 여기서, 초발 배지의 시스테인 농도가 통상 0.4 mM 정도이기 때문에, 상기 시스테인 농도는 초발 배지의 시스테인 농도에 관계없이, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 배양액 중의 시스테인의 농도가 0.4 mM 이상, 바람직하게는 1 mM 이상이어도 된다.

따라서, 1 mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하고, 추가로 적어도 1 mM 이상의 티로신, 및/또는 0.4 mM 이상의 시스테인을 함유하는 동물 배양용 배지도 본 발명의 1 양태이다. 본 발명에 있어서, 「1 mM 이상의 티로신을 함유하는 동물 배양용 배지」 란, 초발 배지의 티로신 농도가 1 mM 이상인 배지 뿐만 아니라, 유가 배지 등의 첨가에 의해 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서 배양액 중의 티로신의 농도가 1 mM 이상으로 조제되는 배지도 포함된다. 동일하게, 「0.4 mM 이상의 시스테인을 함유하는 동물 배양용 배지」 란, 초발 배지의 시스테인 농도가 0.4 mM 이상인 배지 뿐만 아니라, 유가 배지 등의 첨가에 의해 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에 있어서 배양액 중의 시스테인의 농도가 0.4 mM 이상으로 조제되는 배지도 포함된다.

이와 같이 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 유지하여 배양함으로써, 배양하는 세포를 충분히 증식시킬 수 있는 기간 혹은 생산되는 원하는 단백질을 충분히 생산할 수 있는 기간의 적어도 일부 기간에 있어서, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도가 소정 농도 이상으로 유지되게 되어, 세포에 단백질을 고생산시킬 수 있게 되는 것이다.

이와 같이, 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양할 때에, 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도가 소정 농도 이상으로 조제되는 배지를 사용하여 배양함으로써 당해 단백질을 제조하는 방법도, 본 발명의 하나의 측면이 된다. 따라서, 상기 서술한 1 mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하는 동물 배양용 배지를 사용하여 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는 원하는 단백질의 제조 방법도 본 발명의 1 양태이다. 또, 1 mM 이상의 세린 또는 그 염을 함유하고, 추가로 적어도 1 mM 이상의 티로신, 및/또는 0.4 mM 이상의 시스테인을 함유하는 동물 배양용 배지를 사용하여 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조하는 것을 특징으로 하는, 원하는 단백질의 제조 방법도 본 발명의 1 양태이다.

본 발명에 있어서, 상기 서술한 바와 같이 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/ 또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 유지하는 기간으로는, 증식기 개시 시기에서 종료 시기까지의 일부 기간만이어도 되고, 혹은 증식기 개시 시기에서 종료 시기까지의 전체 기간에 걸쳐, 혹은 배양 기간의 전체 기간에 걸쳐 유지되어도 된다.

여기서, 「증식기 개시 시기」 란, 배양 세포의 증식 유도기에서 가속기로 이행되는 시기를 말한다. 그 후, 가속기에서 대수 증식기, 감속기, 정지기, 사멸기로 이행된다. (코바야시 타케시, 혼다 히로유키 저, 「생물 화학 공학」, 토쿄 화학 동인, 응용 생명 과학 시리즈 8, 발간년 「2002년」)

본 발명의 다른 측면에 있어서, 본 발명의 배양법에서는, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 유지하는 기간은 배양하는 세포를 충분히 증식시킬 수 있는 기간 혹은 생산되는 원하는 단백질을 충분히 생산할 수 있는 기간의 일부 혹은 전체에서 유지되어 있으면 되고, 구체적으로는 배양하는 세포의 증식기 개시 시기에서 종료 시기까지의 일부 혹은 전체 기간에서 유지되어 있으면 된다. 특히, 배양 3 일째 이후에 있어서 초발 배지 중의 아미노산 함량이 고갈되어 가므로, 배양 3 일째 이후의 일정 기간 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 해 두는 것이 중요하다. 따라서, 본 발명의 이 측면에 있어서, 더욱 구체적으로는, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 유지해 둘 필요가 있는 기간은 적어도 배양 3 일째로부터 배양 세포의 감속기에서 정지기에 이르기까지의 기간의 일부 혹은 전체 기간, 바람직하게는 배양 3 일째로부터 배양 세포의 대수 증식기에서 감속기에 이르기까지의 기간의 일부 혹은 전체 기간이면 된다.

더욱 구체적인 양태로는, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 유지해 두는 바람직한 기간으로서, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 (통상은 배양 1 일째 무렵) 의 4 일 후 (통상은 배양 5 일 후) 이후, 바람직하게는 적어도 증식기 개시 시기의 3 일 후 (통상은 배양 4 일 후) 이후, 더욱 바람직하게는 적어도 증식 개시 시기의 2 일 후 (통상은 배양 3 일 후) 이후, 더욱 바람직하게는 증식기 개시 시기 이후이면 된다. 또, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 농도를 소정 농도 이상으로 유지해 둘 필요가 있는 기간으로는, 배양 기간이 2 주 이내인 경우, 적어도 배양이 종료되기 5 일 전까지, 바람직하게는 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 3 일 전까지이면 된다. 배양 기간이 2 주일을 초과하는 경우, 적어도 배양 10 일째까지, 바람직하게는 배양이 종료되기 5 일 전까지, 보다 바람직하게는 배양이 종료되기 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 배양이 종료되기 3 일 전까지이면 된다.

본 발명의 또 다른 측면에 있어서, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 연속 유지해 두는 바람직한 기간으로는, 적어도 세포의 대수 증식기의 일부 기간이면 된다. 구체적으로는, 대수 증식기 개시 시기의 4 일 후 이후, 바람직하게는 대수 증식기 개시 시기의 3 일 후 이후, 더욱 바람직하게는 대수 증식기 개시 시기 이후이다. 여기서, 「세포의 대수 증식기의 일부 기간」 이란, 대수 증식기의 일부 기간만이어도 되고, 혹은 대수 증 식기 개시 시기에서 종료 시기까지의 전체 기간에 걸쳐, 혹은 배양 기간의 전체 기간에 걸쳐 유지되어도 된다는 의미이다.

전형적인 세포 배양에 있어서, 대수 증식기 개시 시기는 통상은 배양 3 일째 무렵이다. 따라서, 본 발명의 더욱 구체적인 양태에 있어서는, 적어도 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 배양 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상, 바람직하게는 2 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 한다. 또한, 티로신 및/또는 시스테인의 농도도 소정 농도 이상으로 하는 경우에는, 적어도 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 배양 기간에서 배양액 중의 티로신의 농도가 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도가 초발 배지의 농도 이상이 되도록 한다. 여기서, 초발 배지의 시스테인 농도가 통상 0.4 mM 정도인 점에서, 상기 시스테인 농도는 초발 배지의 시스테인 농도에 관계없이, 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 배양 기간에서 배양액 중의 시스테인의 농도가 0.4 mM 이상, 바람직하게는 1 mM 이상이어도 된다.

본 발명에 있어서의 「적어도 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 배양 기간」 이란, 배양 4 일째, 5 일째, 6 일째 혹은 7 일째 이후의 배양 기간 등이어도 되고, 반대로 배양 개시시, 배양 1 일째 혹은 2 일째 이후이며 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 배양 기간이 포함되어 있는 배양 기간이면 된다.

또한 배양 기간이 2 주 이내인 경우, 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 연속 유지해 두는 바람직한 기간으로는, 적어도 배양이 종료되는 5 일 전까지, 바람직하게는 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 3 일 전까지이면 된다. 배양 기간이 2 주일을 초과하는 경우, 적어도 배양 10 일째까지, 바람직하게는 배양이 종료되는 5 일 전까지, 보다 바람직하게는 배양이 종료되는 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 배양이 종료되는 3 일 전까지이면 된다.

따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서는, 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상, 바람직하게는 2 mM 이상으로 하는 것을 특징으로 한다. 또한, 티로신 및/또는 시스테인의 농도도 소정 농도 이상으로 하는 경우에는, 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 티로신의 농도가 1 mM 이상, 및/또는 시스테인의 농도가 초발 배지의 농도 이상이 되도록 한다. 초발 배지의 시스테인 농도가 통상 0.4 mM 정도인 점에서, 상기 시스테인 농도는 초발 배지의 시스테인 농도에 관계없이, 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 시스테인의 농도가 0.4 mM 이상, 바람직하게는 1 mM 이상이어도 된다.

본 발명에 있어서의 「적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 배양 기간」 이란, 배양 4 일째, 5 일째, 6 일째 혹은 7 일째 이후의 배양 기간 등이어도 되고, 반대로 배양 개시시, 배양 1 일째 혹은 2 일째 이후이며 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 배양 기간이 포함되어 있는 배양 기간이면 된다.

또, 전술한 양태에서는, 적어도 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도가 소정 농도 이상으로 유지되어 있으면 되고, 만일 배양 기간이 10 일보다 짧은 경우라도 배양 3 일째 이후의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도가 소정 농도 이상으로 유지되어 있으면 본 발명에 포함된다.

이러한 본 발명의 방법으로 세포를 배양함으로써, 세포 산물인 단백질을 고생산시킬 수 있게 되고, 배양 배지로부터 당해 단백질을 단리하고 이를 정제함으로써 원하는 단백질을 제조할 수 있다.

배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 소정 농도로 유지하여 배양하기 위한 수단으로는, 세포 배양의 최초 단계부터 배지 중에 고농도의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 함유시켜 두는 것, 혹은 고농도의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 함유하는 배지를 배양 중에 추가하고 이들 아미노산을 보급하는 것, 모두가 가능하다.

배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 소정 농도 이상으로 유지하기 위하여, 배양액에 아미노산의 보급을 개시하는 시기로는, 적어도 배양액 중의 상기 아미노산이 소정 농도 이하가 되고 3 일 이내에, 바람직하게는 1 일 이내, 가장 바람직하게는 아미노산이 소정 농도 이하가 되기 전에 보급을 개시하는 것이 바람직하다. 아미노산의 보급 방법으로는 1 회 또는 단속적으로 수회로 나누어 보급해도 되고, 계속적으로 보급해도 된다. 또, 초발 배지에서 배양 기간에 걸쳐 소정 농도를 유지하는 데에 필요한 아미노산양의 전부를 포함하고 있어도 된다.

일반적으로, 세포 배양 방법은 회분 배양법 (batch culture), 연속 배양법 (continuous culture), 유가 배양법 (fed-batch culture) 으로 분류된다. 본 발명의 방법에 있어서는, 어느 배양 방법을 사용해도 되지만, 바람직하게는 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용되고, 특히 바람직하게는 유가 배양법이 사용된다.

회분 배양법은 배지에 소량의 종배양액을 첨가하고, 배양 중에 새롭게 배지를 첨가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 본 발명에 있어서 회분 배양법을 사용하는 경우에는, 세포 배양의 최초 단계부터 배지 중에 고농도의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 함유시켜 둔다.

연속 배양법은 배양 중에 연속적으로 배지를 첨가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또한, 연속법에는 관류 배양 (perfusion culture) 도 포함된다.

유가 배양법은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되기 때문에, 반회분 배양법 (semi-batch culture) 으로도 불리며, 배양 중에 연속적으로 또는 순차적으로 배지가 첨가되지만, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액을 배출하지 않는 배양 방법이다. 유가 배양시에 첨가되는 배지 (이하, 유가 배지라고 한다) 는 이미 배양에 사용되고 있는 배지 (이하, 초발 배지라고 한다) 와 동일한 배지일 필요는 없으며, 상이한 배지를 첨가해도 되고, 특정한 성분만을 첨가해도 된다.

본 발명에 있어서 초발 배지란, 통상 세포 배양의 최초 단계에서 사용되고 있는 배지를 말한다. 단, 유가 배지를 복수회로 나누어 첨가하는 경우에는, 유가 배지를 각각 첨가하기 전의 배지를 초발 배지로 해도 된다.

본 발명에 있어서, 유가 배양법 또는 연속 배양법을 사용하는 경우에는, 배양 도중에 첨가하는 배지 중에 고농도의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 함 유시켜 두어도 되고, 세포 배양의 최초 단계부터 배지 중에 고농도의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 을 함유시켜 두어도 된다. 중요한 것은 상기 서술한 바와 같이, 배양의 적어도 소정 단계에서 세린의 농도, 혹은 세린 및 티로신의 농도, 혹은 세린 및 시스테인의 농도, 혹은 세린 및 티로신 및 시스테인의 농도가 소정 농도 이상으로 유지되도록 하는 것이다. 이를 위해서는, 예를 들어, 적시 배양액 중의 세린 (및 티로신 및/또는 시스테인) 의 농도를 분석하고, 첨가하는 배지 중에서의 이들 아미노산의 농도를 조정함으로써, 배양액 중의 이들 아미노산의 농도를 제어할 수 있다. 혹은, 예를 들어 세포수로부터 배양 중의 세포 증식의 단계를 판단하여 아미노산의 보급을 제어하는 방법도 채용할 수 있다.

다음으로, 본 발명을 특징 짓는 배양액 중의 성분인 세린, 티로신 및 시스테인에 대하여 상세하게 서술한다.

세린으로는 단품, 그 유도체, 그 염 중 어느 것을 사용해도 된다. 또, 천연의 세린 또는 합성법이나 유전자 재조합법을 사용하여 제조한 세린을 사용할 수 있다. 용액 중의 농도로는, 예를 들어 적어도 배양 중의 소정 기간에 있어서 배양액 중의 세린의 농도가 1 mM 이상, 바람직하게는 2 mM 이상인 것이 특징이다. 종래 사용되고 있는 세린을 함유하는 배지는 전형적으로는 약 0.5 mM 를 함유하는 것이기 때문에, 본 발명에 있어서의 세린 농도는 매우 고농도라고 할 수 있다 (Dulbecco, R., Freeman, G. Virology 8, p396 (1959), Nature, New Biology (1971) 230, p52).

티로신에 대해서도 동일하게 단품, 그 유도체, 그 염 중 어느 것을 사용해도 된다. 또, 천연의 티로신, 또는 합성법이나 유전자 재조합법을 사용하여 제조한 티로신을 사용할 수 있다. 시스테인에 대해서도 단품, 그 유도체, 그 염 중 어느 것을 사용해도 되고, 시스테인의 2 량체, 시스틴도 포함된다. 천연의 시스테인 또는 합성법이나 유전자 재조합법을 사용하여 제조한 시스테인을 사용할 수 있다. 용액 중의 농도로는, 예를 들어 적어도 배양 중의 소정 기간에 있어서 배양액 중의 티로신의 농도가 1 mM 이상, 및/또는 시스테인이 초발 배지의 농도 이상인 것이 특징이다.

본 발명에 있어서, 세포 배양 방법으로서 유가 배양법을 사용하는 경우에는, 유가 배지 중에 고농도의 세린 및 티로신 및/또는 시스테인을 용해시켜 두고, 배양 중에 연속적 또는 순차적으로 유가 배지를 추가함으로써, 이들 아미노산의 농도를 소정 농도 이상으로 유지할 수 있다. 구체적으로는 예를 들어, 유가 배지의 농도에 있어서, L-세린으로서 약 10 ∼ 1000 mM, 바람직하게는 20 ∼ 500 mM, 더욱 바람직하게는 50 ∼ 200 mM 함유하는 것을 유가 배지로서 사용할 수 있다. 또, L-티로신으로서 약 0.01 ∼ 1000 mM, 바람직하게는 1 ∼ 200 mM, 더욱 바람직하게는 10 ∼ 100 mM 함유하는 유가 배지, 또 L-시스테인 염산염으로서 약 0.01 ∼ 500 mM, 바람직하게는 0.1 ∼ 50 mM, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 10 mM 함유하는 유가 배지를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 유가 배지를 배양액에 첨가하는 경우, 초발 배지량의 1 ∼ 150 ％, 바람직하게는 5 ∼ 50 ％, 더욱 바람직하게는 8 ∼ 20 ％ 를, 배양 기간에 걸쳐 연속적으로, 또는 일정 기간, 또는 순차적으로 첨가하는 유가 배지량 으로 하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 유가 배지를 배양액에 첨가하는 기간으로는, 적어도 배양하는 세포의 증식기 개시 시기에서 종료 시기까지의 일부 혹은 전체 기간을 포함한다. 바람직한 기간으로는, 적어도 배양 중의 세포가 대수 증식기 개시 시기 (통상은 배양 3 일째 무렵) 의 4 일 후 이후, 바람직하게는 대수 증식기 개시 시기의 3 일 후 이후, 더욱 바람직하게는 대수 증식기 개시 시기 (통상은 배양 3 일째 무렵) 이후이다. 혹은, 적어도 배양액 중의 상기 아미노산이 소정 농도 이하가 되고 3 일 이내에, 바람직하게는 1 일 이내, 가장 바람직하게는 아미노산이 소정 농도 이하가 되기 전에 유가를 개시하는 것이 바람직하다. 또, 유가를 실행 혹은 계속하는 시기로는, 배양 기간이 2 주 이내인 경우, 적어도 배양이 종료되기 5 일 전까지, 바람직하게는 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 3 일 전까지이면 된다. 배양 기간이 2 주일을 초과하는 경우, 적어도 배양 10 일째까지, 바람직하게는 배양이 종료되는 5 일 전까지, 보다 바람직하게는 배양이 종료되는 4 일 전까지, 더욱 바람직하게는 배양이 종료되는 3 일 전까지이면 된다.

본 발명의 방법에서 사용하는 배양액 중의 다른 성분으로는, 통상, 세포 (바람직하게는, 동물 세포) 배양 배지에서 사용되고 있는 각 성분을 적절히 사용할 수 있는데, 이들에는 아미노산, 비타민류, 지질 인자, 에너지원, 침투압 조절제, 철원, pH 완충제를 포함한다. 상기 성분 이외에, 예를 들어 미량 금속 원소, 계면 활성제, 증식 보조 인자, 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다. 또, 본 발명에서 사용하는 특징적인 성분도 포함하여 배지 성분을 분할하고 따로 따로 첨가하여 세포 배양에 사용해도 된다. 구체적으로는, 예를 들어 고농도 세린 단독과 배지 성분을 동시에 또는 시간을 바꾸어 세포 배양에 사용해도 된다.

배양액 중의 다른 성분으로서 구체적으로는, 예를 들어 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-오르니틴, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린 등, 바람직하게는 L-알라닌, L-알기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-트레오닌, L-트립토판, L-발린 등의 아미노산류 ; i-이노시톨, 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴아미드, 니코틴산, p-아미노벤조산, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 염산 피리독신, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등, 바람직하게는 비오틴, 엽산, 리포산, 니코틴산 아미드, 판토텐산 칼슘, 염산 피리독살, 리보플라빈, 염산 티아민, 비타민 B12, 아스코르브산 등의 비타민류 ; 염화 콜린, 타르타르산 콜린, 리놀산, 올레산, 콜레스테롤 등, 바람직하게는 염화 콜린 등의 지질 인자 ; 글루코오스, 갈락토오스, 만노오스, 프룩토오스 등, 바람직하게는 글루코오스 등의 에너지원 ; 염화 나트륨, 염화 칼륨, 질산 칼륨 등, 바람직하게는 염화 나트륨 등의 침투압 조절제) ; EDTA 철, 시트르산 철, 염화 제 1 철, 염화 제 2 철, 황산 제 1 철, 황산 제 2 철, 질산 제 2 철 등, 바람직하게는 염화 제 2 철, EDTA 철, 시트르산 철 등의 철원류 ; 탄산 수소 나트륨, 염화 칼슘, 인산 2수소 나트륨, HEPES, MOPS 등, 바람직하게는 탄산 수소 나트륨 등의 pH 완충제를 예시할 수 있다.

상기 성분 이외에, 예를 들어 황산 구리, 황산 망간, 황산 아연, 황산 마그네슘, 염화 니켈, 염화 주석, 염화 마그네슘, 아규산 나트륨 등, 바람직하게는 황산 구리, 황산 아연, 황산 마그네슘 등의 미량 금속 원소 ; Tween80, 플루로닉 F68 등의 계면 활성제 ; 및 재조합형 인슐린, 재조합형 IGF, 재조합형 EGF, 재조합형 FGF, 재조합형 PDGF, 재조합형 TGF-

, 염산 에탄올아민, 아 (亞) 셀렌산 나트륨, 레티노인산, 염산 푸트레신 등, 바람직하게는 아셀렌산 나트륨, 염산 에탄올아민, 재조합형 IGF, 염산 푸트레신 등의 증식 보조 인자 ; 데옥시아데노신, 데옥시시티딘, 데옥시구아노신, 아데노신, 시티딘, 구아노신, 우리딘 등의 뉴클레오시드 등을 첨가해도 된다. 또한 상기 본 발명의 적합예에 있어서는, 스트렙토마이신, 페니실린 G 칼륨 및 겐타마이신 등의 항생 물질이나, 페놀 레드 등의 pH 지시약을 포함하고 있어도 된다.

또, 배양액 중의 그 밖의 성분의 함량은 아미노산은 0.05 - 1500 ㎎/ℓ, 비타민류는 0.001 - 10 ㎎/ℓ, 지질 인자는 0 - 200 ㎎/ℓ, 에너지원은 1 - 20 g/ℓ, 침투압 조절제는 0.1 - 10000 ㎎/ℓ, 철원은 0.1 - 500 ㎎/ℓ, pH 완충제는 1 - 10000 ㎎/ℓ, 미량 금속 원소는 0.00001 - 200 ㎎/ℓ, 계면 활성제는 0 - 5000 ㎎/ℓ, 증식 보조 인자는 0.05 - 10000 ㎍/ℓ 및 뉴클레오시드는 0.001 - 50 ㎎/ℓ 의 범위가 적당하고, 배양하는 세포의 종류, 원하는 단백질의 종류 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

배양액의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이한데, 일반적으로는 pH 6.8 ∼ 7.6, 대부분의 경우 pH 7.0 ∼ 7.4 가 적당하다.

본 발명에서는, 상기 서술한 성분을 용해한 완전 합성 배지를 사용하여 세포를 배양할 수 있다. 혹은, 종래 공지된 동물 세포 배양용 배지를 기초 배지로서 사용하고, 이것에 본 발명에서 사용하는 특징적인 성분을 보충할 수도 있다. 동물 세포 배양용 배지로서 시판되는 기초 배지를 예시하면, D-MEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), D-MEM/F-12 1 : 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen 사), CHO-SF (Sigma-Aldrich 사), EX-CELL 301 (JRH biosciences 사), CD-CHO (Invitrogen 사), IS CHO-V (Irvine Scientific 사), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich 사) 등을 사용할 수 있다. 유가 배양법으로 세포를 배양하는 경우에는, 세포 배양의 최초 단계에서 사용되는 초발 배지로서, 이러한 시판되는 배지를 사용할 수 있다. 그리고, 초발 배지에 사용하는 배지를 고농도로 조제한 것에, 추가로 세린 및 티로신 및/또는 시스테인을 보충한 것을 유가 배지로서 사용할 수 있다.

본 발명의 배양 방법은 특별히 한정되지 않고 여러 세포 (예를 들어, 세균 세포, 진균 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포 등) 의 배양에 사용할 수 있다. 예를 들어, 유전자 공학적 조작에 의해 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 주입한 COS 세포나 CHO 세포, 혹은 항체를 생산하는 마우스-인간, 마우스-마우스, 마우스-래트 등의 하이브리드머로 대표되는 융합 세포를 배양할 수 있다. 본 발명의 방법은, 동물 세포를 배양하여 그 동물 세포가 생산하는 천연형 단백질을 얻고자 하는 경우에도 사용할 수 있으며, 상기 서술한 세포 이외에 BHK 세포, HeLa 세포 등의 배양에도 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서 특히 바람직한 동물 세포는 원하는 단백질을 코딩하는 유전자가 도입된 CHO 세포이다. 원하는 단백질은 특별히 한정되지 않고, 천연 항체, 항체 단편, 저분자화 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등의 항체 (예를 들어, 항 IL-6 리셉터 항체, 항글리피칸-3 항체, 항 CD3 항체, 항 CD20 항체, 항 GPIIb/IIIa 항체, 항 TNF 항체, 항 CD25 항체, 항 EGFR 항체, 항 Her2/neu 항체, 항 RSV 항체, 항 CD33 항체, 항 CD52 항체, 항 IgE 항체, 항 CD11a 항체, 항 VEGF 항체, 항 VLA4 항체 등) 나 생리 활성 단백질 (과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴, 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 인터류킨, t-PA, 유로키나아제, 혈청 알부민, 혈액 응고 인자 등) 등 어떤 단백질이어도 되는데, 특히 항체가 바람직하다.

본 발명의 제조 방법으로 생산되는 항체로는 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 원숭이 등의 동물 유래의 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체, bispecific 항체 등 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체도 포함된다. 또, 항체의 면역 글로불린 클래스는 특별히 한정되는 것이 아니고, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 등 어느 클래스여도 되는데, 의약으로서 사용하는 경우에는 IgG 및 IgM 이 바람직하다. 또한, 본 발명의 항체로는 whole 의 항체 뿐만 아니라, Fv, Fab, F(ab)₂ 등의 항체 단편이나, 항체의 가변 영역을 펩티드 링커 등의 링커로 결합시킨 1 가 또는 2 가 이상의 1 개 사슬 Fv(scFv, sc(Fv)₂등) 의 저분자화 항체 등도 포함된다.

배양 조건은 사용하는 세포의 종류에 따라 상이한데, 적절히 바람직한 조건을 결정할 수 있다. 예를 들어 CHO 세포이면 통상, 기상의 CO₂ 농도가 0 - 40 ％, 바람직하게는 2 - 10 ％ 의 분위기하, 30 - 39 ℃, 바람직하게는 37 ℃ 정도에서, 1 - 50 일간 배양, 더욱 바람직하게는 1 - 14 일간 배양해도 된다.

또, 동물 세포 배양용의 각종 배양 장치로는, 예를 들어 발효조형 탱크 배양 장치, 에어리프트형 배양 장치, 컬쳐 플라스크형 배양 장치, 스피너 플라스크형 배양 장치, 마이크로 캐리어형 배양 장치, 유동층형 배양 장치, 할로우 파이버형 배양 장치, 롤러 보틀형 배양 장치, 충전조형 배양 장치 등을 사용하여 배양할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 세포 (바람직하게는, 동물 세포) 를 배양함으로써, 단백질을 고생산시킬 수 있게 된다.

동물 세포의 단백질의 생산은 단순히 그것을 배양하기만 하면 되는 것이나, 특수한 조작을 필요로하는 것도 존재하지만, 그들 조작 또는 조건 등은 배양하는 동물 세포에 의해 적절히 결정하면 된다. 예를 들어 유전자 공학적 조작에 의해 마우스-인간 키메라 항체를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 트랜스폼된 CHO 세포에서는, 상기와 같은 조건하에서 배양을 실시함으로써, 1 - 50 일간, 바람직하게는 5 - 21 일, 더욱 바람직하게는 7 - 14 일간 정도로 원하는 단백질을 배지 중에 얻을 수 있다. 이것을 통상적인 방법 (예를 들어, 항체 공학 입문, 치진쇼칸, (1994) p. 102 - 104 ; Affinity Chromatography Principles & Methods, GE 헬 스케어 (주), (2003) p. 56 - 60 등 참조) 에 따라 단리, 정제함으로써, 원하는 단백질을 얻을 수 있다.

본 발명에 의해, 재조합 항체 (천연 항체, 항체 단편, 저분자화 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, bispecific 항체 등), 유전자 재조합 단백질 (과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구 매크로파지 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 에리트로포이에틴, 인터페론, IL-1 이나 IL-6 등의 인터류킨, t-PA, 유로키나아제, 혈청 알부민, 혈액 응고 인자 등) 등을 높은 생산량으로 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 단백질 또는 폴리펩티드 (본 발명의 단백질이라고도 한다) 가 의약으로서 이용 가능한 생물학적 활성을 갖는 경우에는, 그러한 단백질 또는 폴리펩티드를 의약적으로 허용되는 담체 또는 첨가제와 혼합하여 제제화함으로써 의약품을 제조할 수 있다. 본 발명의 단백질 및 본 발명의 단백질을 유효 성분으로 하는 의약품도 본 발명의 범위에 포함된다.

의약적으로 허용되는 담체 및 첨가제의 예로서 물, 의약적으로 허용되는 유기 용제, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아 고무, 카세인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 의약 첨가물로서 허용되는 계면 활성제 등을 들 수 있다.

실제 첨가물은 본 발명의 의약품인 치료제의 제형에 따라 상기 중에서 단독 으로 또는 적절히 조합하여 선택되는데, 물론 이들에 한정하는 것은 아니다. 예를 들어, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 폴리펩티드를 용제, 예를 들어 생리 식염수, 완충액, 포도당 용액 등에 용해하고, 이것에 흡착 방지제, 예를 들어 Tween80, Tween20, 젤라틴, 인간 혈청 알부민 등을 첨가한 것을 사용할 수 있다. 혹은, 사용 전에 용해 재구성하는 제형으로 하기 위하여 동결 건조시킨 것이어도 되고, 동결 건조를 위한 부형제로는, 예를 들어 만니톨, 포도당 등의 당 알코올이나 당류를 사용할 수 있다.

폴리펩티드의 유효 투여량은 폴리펩티드의 종류, 치료나 예방의 대상으로 하는 질환의 종류, 환자의 연령, 질환의 중증도 등에 따라 적절히 선택된다. 예를 들어, 본 발명의 단백질이 항글리피칸 항체 등의 항체인 경우, 그 유효 투여량은 1 회에 대하여 체중 1 ㎏ 당 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎ 의 범위에서 선택된다. 혹은, 환자 당 0.01 ∼ 100000 ㎎/body 의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 이들 투여량에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 의약품의 투여 방법은 경구, 비경구 투여 중 어느 것이어도 가능한데, 바람직하게는 비경구 투여이고, 구체적으로는 주사 (예를 들어, 정맥 내 주사, 근육 내 주사, 복강 내 주사, 피하 주사 등에 의한 전신 또는 국소 투여), 경비 투여, 경폐 투여, 경피 투여 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예 및 참고예에 의해 구체적으로 설명한다. 또한, 이들 실시예 등은 본 발명을 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1] 고농도 세린, 시스테인, 티로신 함유 저 pH 유가 배지에 의한 유가 배양 (항체 유전자 도입 CHO 세포주)

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

초발 배지 : 시판되는 동물 세포 배양용 배지를 용해한 후 여과 멸균시켰다.

유가 배지 : 초발 배지에 사용하는 동물 세포 배양용 배지를 초발 배지에 대하여 3 배 농도로 하여 용해한 후, 세린 50 mM, 시스테인 염산염 1 수화물 1.8 mM, 티로신 14.5 mM 를 첨가하고, 염산에 의해 pH 를 배지 성분이 모두 용해될 때까지 떨어뜨리고 (pH 1.5 근처), 배지 성분이 모두 용해된 것을 확인한 후 여과 멸균시켰다.

세포 : 인간화 IgG (항글리피칸-3 항체) 생산 CHO 세포주 (국제 공개 제 WO 2006/006693호 팜플렛을 참조).

자 (jar) 형 세포 배양 장치에 초발 배지를 첨가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를, 2 × 10⁵ cells/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37 ℃, 10 ％ CO₂ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 기간 14 일에 걸쳐, pH 하한 7.0, 용존 산소 농도 40 ％ 의 자동 제어를 실시하였다. 배양 3 일째부터 유가 배지를 일정 유속 (초발 배지 1 ℓ 에 대하여, 1.0 g/시간) 으로 유가하고, 14 일째까지 배양하였다. 배양 개시시 및 3, 5, 7, 10, 12, 14 일째에 샘플링하였다. 각 샘플의 배양 상청액에 대하여, 프로테인 A 를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 생산된 항체 농도, 트리판 블루 염색법에 의해 생존률, 고정화 효소법에 의해 락트산을 측정하였다. 도 1 에 나타낸 바와 같이, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Control) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.6 g/ℓ 정도였다. 이에 반해, 고농도 세린, 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Ser, Cys, Tyr) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 2.2 g/ℓ 정도로 약 40 ％ 나 높은 항체 농도를 얻을 수 있었다. 도 2 에는 배양 기간에 있어서의 생존률의 추이를 나타내었다. 또한 도 3 에 나타낸 바와 같이, 락트산 농도는 배양 3 일째 이후, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우에 비해, 고농도 세린, 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우에는 저락트산 농도를 추이하였다.

[실시예 2] 고농도 세린, 시스테인, 티로신 함유 저 pH 유가 배지에 의한 유가 배양 (항체 유전자 및 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자 도입 CHO 세포주)

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

세포 : 타우린 트랜스포터 유전자를 도입한 인간화 IgG 생산 CHO 세포주.

자형 세포 배양 장치에 초발 배지를 첨가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를 2 × 10⁵ cells/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37℃, 10 ％ CO₂ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 기간 14 일에 걸쳐, pH 하한 7.0, 용존 산소 농도 40 ％ 의 자동 제어를 실시하였다. 배양 3 일째부터 유가 배지를 일정 유속 (초발 배지 1 ℓ 에 대하여, 1.5 g/시간) 으로 유가하고, 14 일째까지 배양을 실시하였다. 배양 개시시 및 3, 5, 7, 10, 12, 14 일째에 샘플링하였다. 각 샘플의 배양 상청액에 대하여, 프로테인 A 를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 생산된 항체 농도, 트리판 블루 염색법에 의해 생존률, 고정화 효소법에 의해 락트산을 측정하였다. 도 4 에 나타낸 바와 같이, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Control) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.3 g/ℓ 정도였다. 이에 반해, 고농도 세린, 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Ser, Cys, Tyr) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 2.0 g/ℓ 정도로 약 54 ％ 높은 항체 농도를 얻을 수 있었다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우, 14 일간의 배양으로 14 일째의 생존률은 52 ％ 였다. 이에 반해, 고농도 세린, 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우, 14 일간의 배양으로 14 일째의 생존률은 78 ％ 로 높은 생존률을 유지할 수 있었다. 또한 도 6 에 나타낸 바와 같이, 락트산 농도는 배양 3 일째 이후, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우에 비해, 고농도 세린, 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양의 경우에는 저락트산 농도를 추이하였다.

[실시예 3] 고농도 세린, 시스테인, 티로신의 항체 고생산화에 대한 기여를 확인하기 위한 유가 배양 (항체 유전자 및 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자 도입 CHO 세포주)

배지 조성 및 조제법은 이하와 같다.

유가 배지 (Ser, Cys, Tyr) : 초발 배지에 사용하는 동물 세포 배양용 배지를 초발 배지에 대하여 3 배 농도로 하여 용해한 후, 세린 50 mM, 시스테인 염산염 1 수화물 1.8 mM, 티로신 14.5 mM 를 첨가하고, 염산에 의해 pH 를 배지 성분이 모두 용해될 때까지 떨어뜨리고 (pH 1.5 근처), 배지 성분이 모두 용해된 것을 확인한 후 여과 멸균시켰다.

유가 배지 (Ser, Cys) : 초발 배지에 사용하는 동물 세포 배양용 배지를 초발 배지에 대하여 3 배 농도로 하여 용해한 후, 세린 50 mM, 시스테인 염산염 1 수화물 1.8 mM 를 첨가하고, 염산에 의해 pH 를 배지 성분이 모두 용해될 때까지 떨어뜨리고 (pH 1.0 근처), 배지 성분이 모두 용해된 것을 확인한 후 여과 멸균시켰다.

유가 배지 (Ser, Tyr) : 초발 배지에 사용하는 동물 세포 배양용 배지를 초발 배지에 대하여 3 배 농도로 하여 용해한 후, 세린 50 mM, 티로신 14.5 mM 를 첨 가하고, 염산에 의해 pH 를 배지 성분이 모두 용해될 때까지 떨어뜨리고 (pH 1.0 근처), 배지 성분이 모두 용해된 것을 확인한 후 여과 멸균시켰다.

유가 배지 (Cys, Tyr) : 초발 배지에 사용하는 동물 세포 배양용 배지를 초발 배지에 대하여 3 배 농도로 하여 용해한 후, 시스테인 염산염 1 수화물 1.8 mM, 티로신 14.5 mM 를 첨가하고, 염산에 의해 pH 를 배지 성분이 모두 용해될 때까지 떨어뜨리고 (pH 1.0 근처), 배지 성분이 모두 용해된 것을 확인한 후 여과 멸균시켰다.

자형 세포 배양 장치에 초발 배지를 첨가하고, 이것에 상기 CHO 세포주를 2 × 10⁵ cells/㎖ 가 되도록 첨가하고, 37℃, 10 ％ CO₂ 의 조건에서 배양을 개시하였다. 배양 기간 14 일에 걸쳐, pH 하한 7.0, 용존 산소 농도 40 ％ 의 자동 제어를 실시하였다. 배양 3 일째부터 유가 배지를 일정 유속 (초발 배지 1 ℓ 에 대하여, 1.5 g/시간) 으로 유가하고, 14 일째까지 배양을 실시하였다. 배양 개시시 및 3, 5, 7, 10, 12, 14 일째에 샘플링하였다. 각 샘플의 배양 상청액에 대하여, 프로테인 A 를 사용한 어피니티 크로마토그래피에 의해 생산된 항체 농도 측정, 이온 교환 칼럼을 사용한 아미노산 분석에 의해 세린과 티로신의 아미노산 농도를 측정하였다. 도 7 에 나타낸 바와 같이, 세린, 시스테인, 티로신을 증량하지 않은 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Control) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.16 g/ℓ 정도였다. 이에 반해, 고농도 세린, 시스테인, 티 로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Ser, Cys, Tyr) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.87 g/ℓ, 고농도 세린, 시스테인 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Ser, Cys) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.47 g/ℓ, 고농도 세린, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Ser, Tyr) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.41 g/ℓ, 고농도 시스테인, 티로신 증량 저 pH 유가 배지를 사용한 유가 배양 (Cys, Tyr) 의 경우, 14 일간의 배양으로 항체 농도는 1.18 g/ℓ 라는 항체 농도 측정 결과가 얻어졌다. 따라서 고농도 세린, 시스테인, 티로신의 순서로, 항체 고생산화에 기여하는 것이 시사되었다. 또 고농도 세린, 시스테인, 티로신을 동시에 유가 배지에 첨가하는 것이 가장 항체 고생산화에 기여하는 것이 시사되었다.

도 8, 도 9 는 14 일간의 배양 기간 중의 세린 및 티로신의 농도 추이를 나타낸다. Control 에서는 배양 5 일째에서, 세린은 0.63 mM 및 티로신은 0.34 mM, 배양 7 일째 이후 세린은 0.4 mM 이하 및 티로신은 0.4 mM 이하가 되었는데, 세린을 보충한 유가 배지를 사용한 배양에서는 세린의 농도는 2 mM 이상, 티로신을 보충한 유가 배지를 사용한 배양에서는 티로신의 농도는 1 mM 이상으로 유지되었다.

이하의 참고예에서는, 상기 서술한 실시예 2 및 3 에서 사용한 타우린 트랜스포터 유전자를 도입한 인간화 IgG 생산 CHO 세포주의 제조에 대하여 기재한다.

[참고예 1] CHO 세포 유래 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자 클로닝

CHO DXB11 세포에 항 IL-6 리셉터 항체 유전자를 도입한 항 IL-6 리셉터 항 체 생산 세포 (일본 공개특허공보 평8-99902호) 로부터 total RNA 를 추출한 후, 폴리 A 에 의존하는 cDNA 를 합성하였다. SalI, XhoI, EcoRI 의 3 종류의 제한 효소로 단편화된 cDNA 를 주형함으로써, 햄스터 타우린 트랜스포터 (Hamster TauT) 유전자를 PCR 에 의해 얻었다. PCR 프라이머는 공지된 Rat/Mouse TauT 사이에서 유전자 배열이 보존되어 있는 5',3' 를 함유하는 것을 설계하여 사용하였다. 클로닝된 유전자는 염기 배열을 결정하고, 공지된 생물종의 TauT 와의 상동성면에서 Hamster TauT 를 코딩하는 것을 확인하였다 (도 10). Hamster TauT 아미노산 배열은 Mouse (96 ％ Identity), Rat (96 ％ Identity), Human (93 ％ Identity) TauT 에 대하여 높은 상동성을 갖고 있으며, 12 의 막 관통 영역을 갖는 트랜스포터인 것이 예상되었다 (도 11).

[참고예 2] 햄스터 타우린 트랜스포터 유전자 도입 CHO 세포주의 제조

참고예 1 의 클로닝에 의해 취득한 Hamster TauT (이하 TauT) 유전자에 Kozak 배열을 첨가하고, CMV 프로모터 발현 플라스미드 pHyg/TauT (도 12) 를 구축하였다. pHyg/TauT 혹은 TauT 유전자를 제외한 컨트롤 플라스미드 pHyg 를, 친주인 항글리피칸-3 항체 생산 CHO 세포 (국제 공개 제 WO 2006/006693호 팜플렛을 참조) 에 일렉트로포레이션법으로 도입하였다. 발현 플라스미드 도입 세포를 Hygromycin (400 ㎍/㎖) 존재하에서 선발한 후, 안정적으로 증식하는 세포주 모두를 확대하였다 (pHyg/TauT : 8 주, pHyg : 7 주). TauT mRNA 를 조제한 후 TaqMan 법에 의해, 친주에 대하여 우위의 발현을 확인할 수 있는 7 주를 pHyg/TauT 도입 세포로 하였다. 도입 세포 (7 주) 의 mRNA 평균 발현량은 컨트롤 (7 주) 의 약 40 배였다.

[배열표 프리 텍스트]

<배열 번호 1> 배열 번호 1 은 햄스터 타우린 트랜스포터를 코딩하는 유전자의 염기 배열을 나타낸다.

<배열 번호 2> 배열 번호 2 는 햄스터 타우린 트랜스포터의 아미노산 배열을 나타낸다.

<110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> CELL CULTURE METHOD USING AMINO ACID-ENRICHED MEDIUM <130> FA0001-08015 <150> JP 2007-117426 <151> 2007-04-26 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1869 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 atggccacca aggagaagct gcagtgtctg aaagacttcc acaaagacat cctgaagcct 60 tctccaggga agagcccagg cacacggcct gaggatgagg ctgaggggaa gccccctcag 120 agggagaagt ggtccagcaa gattgacttt gtgctgtctg tggccggagg cttcgtgggt 180 ttgggcaacg tttggcgttt cccgtacctc tgctacaaaa atggtggagg tgctttcctc 240 ataccgtatt ttattttcct gtttgggagt ggcctgcctg tgtttttcct ggaggtcata 300 ataggccagt acacctcaga agggggaatc acctgctggg agaagatctg ccccttgttc 360 tctggcattg gctacgcatc catcgtcatc gtgtccctcc tgaatgtgta ctacattgtc 420 atcctggcct gggccacata ctacctattt cactccttcc agacagagct tccctgggcc 480 cactgcaacc acagctggaa cacaccacat tgcatggagg acaccctgcg taggaatgag 540 agtctctggg tctcccttag cgcctccaac ttcacctcgc ctgtcatcga gttctgggag 600 cgcaatgtac tcagcctgtc ttccggaatc gacgaaccag gcgctctgaa atgggacctt 660 gcgctctgcc tcctcttagt ctggcttgtc tgttttttct gcatatggaa gggtgttcga 720 tccacaggca aggttgtcta cttcaccgcc actttcccgt ttgccatgct tctggtgctg 780 ctggtccgtg gactgaccct gccgggtgct ggcgaaggca tcaaattcta cctgtaccct 840 gacatcagcc gccttgagga cccacaggtg tggatcgacg ccggaaccca gatattcttt 900 tcctatgcca tctgcctggg ggccatgacc tcactgggaa gctacaacaa gtacaagtat 960 aactcgtaca gggactgtat gctgctggga tgcctgaaca gtggtaccag ttttgtgtct 1020 ggcttcgcag ttttttccat cctgggcttc atggcacaag agcaaggggt ggacattgct 1080 gatgtggctg agtcaggtcc tggcttggcc ttcattgcct atccaaaagc tgtgactatg 1140 atgccgctgc ccaccttttg gtccattctg ttttttatta tgctcctctt gcttggactg 1200 gacagccagt ttgttgaagt cgaaggacag atcacatcct tggttgatct ttacccgtcc 1260 ttcctaagga agggttatcg tcgggaagtc ttcatcgcca tcctgtgtag catcagctac 1320 ctgctggggc tgtcgatggt gacggagggt ggcatgtatg tgtttcaact ctttgactac 1380 tatgcagcta gtggtgtatg ccttttgtgg gttgcattct ttgaatgttt tgttattgcc 1440 tggatatatg gtggtgataa cttatatgac ggtattgagg acatgattgg ctatcggcct 1500 gggccctgga tgaagtacag ctgggctgtc atcactccag ttctctgtgc tggatgtttc 1560 atcttctctc ttgtcaagta tgtacccctg acctacaaca aagtctacgt gtatcctgat 1620 tgggcaattg ggctgggctg gggcctggcc ctatcctcca tggtgtgtat ccccttggtc 1680 attgccatcc tcctctgccg gacggaggga ccgttccgcg tgagaatcca atacctgata 1740 acccccaggg agcccaaccg ctgggctgtg gagcgtgagg gggccacacc cttccactcc 1800 cgcacaagcc tcgtcatgaa cggcgcactc atgaaaccca gtcacgtcat tgtggagacc 1860 atgatgtga 1869 <210> 2 <211> 622 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 2 Met Ala Thr Lys Glu Lys Leu Gln Cys Leu Lys Asp Phe His Lys Asp 1 5 10 15 Ile Leu Lys Pro Ser Pro Gly Lys Ser Pro Gly Thr Arg Pro Glu Asp 20 25 30 Glu Ala Glu Gly Lys Pro Pro Gln Arg Glu Lys Trp Ser Ser Lys Ile 35 40 45 Asp Phe Val Leu Ser Val Ala Gly Gly Phe Val Gly Leu Gly Asn Val 50 55 60 Trp Arg Phe Pro Tyr Leu Cys Tyr Lys Asn Gly Gly Gly Ala Phe Leu 65 70 75 80 Ile Pro Tyr Phe Ile Phe Leu Phe Gly Ser Gly Leu Pro Val Phe Phe 85 90 95 Leu Glu Val Ile Ile Gly Gln Tyr Thr Ser Glu Gly Gly Ile Thr Cys 100 105 110 Trp Glu Lys Ile Cys Pro Leu Phe Ser Gly Ile Gly Tyr Ala Ser Ile 115 120 125 Val Ile Val Ser Leu Leu Asn Val Tyr Tyr Ile Val Ile Leu Ala Trp 130 135 140 Ala Thr Tyr Tyr Leu Phe His Ser Phe Gln Thr Glu Leu Pro Trp Ala 145 150 155 160 His Cys Asn His Ser Trp Asn Thr Pro His Cys Met Glu Asp Thr Leu 165 170 175 Arg Arg Asn Glu Ser Leu Trp Val Ser Leu Ser Ala Ser Asn Phe Thr 180 185 190 Ser Pro Val Ile Glu Phe Trp Glu Arg Asn Val Leu Ser Leu Ser Ser 195 200 205 Gly Ile Asp Glu Pro Gly Ala Leu Lys Trp Asp Leu Ala Leu Cys Leu 210 215 220 Leu Leu Val Trp Leu Val Cys Phe Phe Cys Ile Trp Lys Gly Val Arg 225 230 235 240 Ser Thr Gly Lys Val Val Tyr Phe Thr Ala Thr Phe Pro Phe Ala Met 245 250 255 Leu Leu Val Leu Leu Val Arg Gly Leu Thr Leu Pro Gly Ala Gly Glu 260 265 270 Gly Ile Lys Phe Tyr Leu Tyr Pro Asp Ile Ser Arg Leu Glu Asp Pro 275 280 285 Gln Val Trp Ile Asp Ala Gly Thr Gln Ile Phe Phe Ser Tyr Ala Ile 290 295 300 Cys Leu Gly Ala Met Thr Ser Leu Gly Ser Tyr Asn Lys Tyr Lys Tyr 305 310 315 320 Asn Ser Tyr Arg Asp Cys Met Leu Leu Gly Cys Leu Asn Ser Gly Thr 325 330 335 Ser Phe Val Ser Gly Phe Ala Val Phe Ser Ile Leu Gly Phe Met Ala 340 345 350 Gln Glu Gln Gly Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Glu Ser Gly Pro Gly 355 360 365 Leu Ala Phe Ile Ala Tyr Pro Lys Ala Val Thr Met Met Pro Leu Pro 370 375 380 Thr Phe Trp Ser Ile Leu Phe Phe Ile Met Leu Leu Leu Leu Gly Leu 385 390 395 400 Asp Ser Gln Phe Val Glu Val Glu Gly Gln Ile Thr Ser Leu Val Asp 405 410 415 Leu Tyr Pro Ser Phe Leu Arg Lys Gly Tyr Arg Arg Glu Val Phe Ile 420 425 430 Ala Ile Leu Cys Ser Ile Ser Tyr Leu Leu Gly Leu Ser Met Val Thr 435 440 445 Glu Gly Gly Met Tyr Val Phe Gln Leu Phe Asp Tyr Tyr Ala Ala Ser 450 455 460 Gly Val Cys Leu Leu Trp Val Ala Phe Phe Glu Cys Phe Val Ile Ala 465 470 475 480 Trp Ile Tyr Gly Gly Asp Asn Leu Tyr Asp Gly Ile Glu Asp Met Ile 485 490 495 Gly Tyr Arg Pro Gly Pro Trp Met Lys Tyr Ser Trp Ala Val Ile Thr 500 505 510 Pro Val Leu Cys Ala Gly Cys Phe Ile Phe Ser Leu Val Lys Tyr Val 515 520 525 Pro Leu Thr Tyr Asn Lys Val Tyr Val Tyr Pro Asp Trp Ala Ile Gly 530 535 540 Leu Gly Trp Gly Leu Ala Leu Ser Ser Met Val Cys Ile Pro Leu Val 545 550 555 560 Ile Ala Ile Leu Leu Cys Arg Thr Glu Gly Pro Phe Arg Val Arg Ile 565 570 575 Gln Tyr Leu Ile Thr Pro Arg Glu Pro Asn Arg Trp Ala Val Glu Arg 580 585 590 Glu Gly Ala Thr Pro Phe His Ser Arg Thr Ser Leu Val Met Asn Gly 595 600 605 Ala Leu Met Lys Pro Ser His Val Ile Val Glu Thr Met Met 610 615 620

Claims

시스테인, 티로신, 및 50 mM ~ 200 mM의 농도의 세린을 함유하는 유가 배지를 첨가하는 것을 포함하는 유가 배양법 (fed-batch culture) 에 의해 CHO 세포를 배양하는 방법으로서, 여기서, 유가 배지는 순차적으로 또는 연속적으로 복수회 유가함으로써 배양액 중에 공급되고, 상기 방법은 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 당해 단백질을 제조할 때에, 적어도 세포의 증식기 개시 시기 이후의 일정 기간에서, 적어도 배양하는 세포를 충분히 증식시킬 수 있는 기간 혹은 생산되는 원하는 단백질을 충분히 생산할 수 있는 기간의 일부 혹은 전체 기간에서, 적어도 세포의 대수 증식기의 일부 혹은 전체 기간에서, 또는 적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서, 배양액 중의 세린의 농도를 1 mM 이상, 티로신의 농도를 1 mM 이상, 및 시스테인의 농도를 초발 배지의 농도 이상 또는 0.4 mM 이상으로 유지하는 것을 특징으로 하는 CHO 세포의 배양 방법.
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제 1 항에 있어서,

적어도 세포의 대수 증식기의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 2 mM 이상으로 하는 방법.
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제 1 항에 있어서,

적어도 배양 3 ∼ 10 일째의 일부 혹은 전체 기간에서 배양액 중의 세린의 농도를 2 mM 이상으로 하는 방법.
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제 1 항, 제 10 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

세포가 원하는 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한 것인 방법.
제 17 항에 있어서,

원하는 단백질이 항체인 방법.
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제 1 항, 제 10 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항의 방법에 사용하는,

시스테인, 티로신, 및 50 mM ~ 200 mM의 농도의 세린을 함유하는 세포 배양용 유가 배지.
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CHO 세포를 배양하여 원하는 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 배양을 제 1 항, 제 10 항 또는 제 13 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 사용하여 실시하는 것을 특징으로 하는 당해 단백질의 제조 방법.
제 26 항에 있어서,

의약의 제조에 유효성분으로 사용되는 단백질의 제조 방법.