DE3734632A1 - Verfahren zur herstellung von t-pa - Google Patents
Verfahren zur herstellung von t-paInfo
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Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung
von t-PA (tissue plasminogen activator), insbesondere eine
Methode zur Steigerung der Produktivität von Zellkulturen
(z. B. CHO-Zellen) für die Synthese von t-PA.
Plasminogenaktivatoren sind eine Klasse von Serinproteasen,
die das Proenzym Plasminogen durch Spaltung der Peptidbindung
zwischen Arg-560 und Val-561 zum aktiven Enzym Plasmin
aktivieren. Plasmin seinerseits ist die letzte Stufe des
Fibrinolysesystems der Blutbahn, das das Fibringerüst eines
Thrombus in lösliche Peptide spaltet.
Bei pathogenetischen Störungen, wie die Koronarerkrankung,
werden Blutgerinnsel nicht schnell genug aufgelöst, um eine
ausreichende Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff zu gewährleisten.
Die Folge des Verschlusses der Koronararterien
durch ein Blutgerinnsel ist ein Infarkt, wobei durch Sauerstoffunterversorgung
des Herzmuskels die Nekrose des betroffenen
Gewebes erfolgt.
Eine rasche Rekanalisation der Gefäße kann die Durchblutung
des Herzmuskels in kürzester Zeit sicherstellen und so das
Absterben ganzer Muskelpartien des Herzens sicherstellen.
Bei der Therapie werden bislang Streptokinase und Urokinase
eingesetzt. Eigenschaften von t-PA bieten jedoch einige Vorteile
gegenüber jenen bekannten Plasminogenaktivatoren: die
fibrinspezifische lokale Lyse, keine systemischen lytischen
Effekte durch Fibrinogenabbau, hohe Reperfusionsraten und
keine Antikörperbildung.
t-PA ist ein Glykoprotein mit einem Molekulargewicht von ca.
65 000 Dalton, das als einkettiges und zweikettiges Enzym
vorkommt und aus 527 Aminosäuren zusammengesetzt ist.
Die Affinität von t-PA für Plasminogen ist in Gegenwart von
Fibrin um ein 100faches größer als in dessen Abwesenheit.
Diese hohe Affinität von t-PA für Plasminogen in Gegenwart
von Fibrin sichert die effektive Aktivierung, ohne freies
Plasminogen in der Peripherie zu aktivieren.
Humanes t-PA wurde zuerst aus Uteri in reiner Form gewonnen.
In anderen Geweben und Zellen, z. B. endothelialen Zellen
einschließlich arteriell und venös endothelialen Zellen,
konnte gleichfalls t-PA nachgewiesen werden. Die gebildeten
t-PA-Mengen sind jedoch so gering, daß ihre kommerzielle Gewinnung
unmöglich ist.
Eine weitere natürliche Quelle für t-PA ist die Zellkultur.
Mehrere Zell-Linien wurden auf eine mögliche t-PA-Produktion
untersucht (Gronow M. et al., Trends in Biotechnology 1:
26-29, 1983). Aus einer humanen Zell-Linie, den Bowes-Melanoma-Zellen,
konnten größere Mengen an t-PA für begrenzte
klinische Studien sowie zur Aufklärung der Struktur gewonnen
werden (Wallen et al., European Journal of Biochemistry 132:
681-686, 1983).
Für die Großproduktion von t-PA zur breiten klinischen Anwendung
sind diese Ausbeuten allerdings zu gering. Erst die
Gentechnik machte es möglich, größere Mengen rekombinantes
t-PA für den therapeutischen Einsatz herzustellen.
1983 wurde das t-PA kloniert und die Aminosäuresequenz ermittelt
(Pennica, Nature 301: 214-221, 1983).
Versuche, um t-PA aus E. coli, in dem die genetischen Informationen
für t-PA aus Melanoma-Zellen integriert wurden, zu
erhalten, waren nicht erfolgreich, da das resultierende Protein
nicht glykosyliert ist und damit dem nativen t-PA nicht
entspricht.
Aus diesem Grund haben verschiedene Forschungsgruppen für
die Produktion von humanem t-PA permanente Säugetier-Zell-Linien
von verschiedenen Quellen ausgesucht. Einige von diesen
Zell-Linien sind humane Zell-Linien mit angeblich verbesserter
Ausbeute von t-PA. Eine andere Zell-Linie ist die
normale chinesische Hamsterovarzelle.
In der Europäischen Offenlegungsschrift 0 093 619 ist die Herstellung
von t-PA von transformierten chinesischen Hamsterovarzellen
(CHO-Zellen) beschrieben. Das resultierende t-PA
(r-tPA) unterscheidet sich in keiner Weise vom natürlich
vorkommenden t-PA.
In vielen Publikationen ist der Einfluß von verschiedenen
Substanzen auf die Produktivität von Zellkulturen für die
Synthese von t-PA beschrieben worden.
Bei verschiedenen Zellsystemen wird von einem Zusammenhang
zwischen intrazellulärem c-AMP-Spiegel und der t-PA-Synthese
berichtet (siehe z. B. Kooistra et al. in Thrombosis and
Haemostasis, 54(1): 192, Abstract P 1133), daß Dibutyryl
c-AMP die Produktion von t-PA in humanen endothelialen Zellen
um das 2- bis 3fache erhöht, aber keinen Einfluß auf
die Synthese von t-PA in Bowes-Melanoma-Zellen aufweist. In
Nierenzellen wurde die t-PA-Synthese durch Phosphodiesterase-Inhibitoren
gesteigert (Journal of Cell Biology 91):
195-200, 1981). Andererseits hemmt c-AMP die t-PA-Synthese
in Makrophagen (Vassalli et al., Cells, 8: 271-281, 1976)
und ist indifferent in Teratocarcinoma-Zellen (Nishimune et al.,
Experimental Cell Research 146: 439-444, 1983).
Buttersäure induziert die Synthese von t-PA in Teratocarcinomia-Zellen
(Nishimune - siehe oben), zeigt aber in renalen
Tumorzellen eine inhibitorische Wirkung auf (Nelson et al.
Proc. Am. Ass. for Cancer Research, 26: 35, 1985), und von
einer indifferenten Wirkung in embryonalen Lungenzellen
wurde von Brouty-Boye et al. Biotechnology 12: 10, 1984, berichtet.
In humanen Endothelzellen kann die t-PA-Synthese durch
Thrombin (Levin et al., Thrombosis and Haemostasis, 56(2):
115-119, 1986), Alkohol (Laug, Jama, 250(6): 772-776,
1983 B), Vitamin C und Vitamin A (Inada et al., Biochemical
and Biophysical Communications 130(1): 182-187, 1985) stimuliert
werden. Die t-PA-Sekretion in bovinen Endothelzellen
wird jedoch durch Thrombin (Loskutoff, Journal of Clinical
Investigations, 64: 329-332, 1976) und Endotoxin (Crutchley
et al., Journal of Biological Chemistry, 261(1): 154-159,
1086) gehemmt.
Die t-PA-Sekretion aus dem Schwein-Endothel wird durch Heparin
vermittelt (Marchwardt et al., Thrombosis Research, 8:
217-223, 1976), bei den humanen embryonalen Lungenzellen hat
Heparin allerdings einen minimalen Effekt.
Die t-PA-Synthese wurde weiterhin durch Concanavalin A in
embryonalen Lungenzellen (Brouty-Boye - siehe oben) und Epithelzellen
(Electricwala et al., Thrombosis and Haemostasis,
53: 200-203, 1985), 5-Azacytidin in Epithelzellen (Electricwala
- siehe oben) und Melanoma-Zellen (Silagi et al., Biological
Medicine, 57: 418, 1984), Tizabrine in Melanoma-Zellen
(Roba et al., Thrombosis and Haemostasis 50(1): 83, 1983)
und Aphidicolin in Hepatoma-Zellen (Orfanoudakis et al.,
Biological Chemistry, Hoppe-Seyler, 336(9): 832, 1985) positiv
beeinflußt.
In der Europäischen Offenlegungsschrift 0 219 270 wird beschrieben,
daß eine Kombination von Heparin und Endothelialzellwachstumsfaktor
(ECGF) die Produktion von t-PA und einkettigem
Urokinaseplasminogenaktivator aus normalen humanen
diploiden Lungenfibroblastzellen in serumfreiem Medium
erhöht.
Über den Einfluß von Buttersäure auf chinesische Hamsterovarzellen
wurde von Storrie et al., Journal of Cell Physiology,
94: 69-76, 1978, und Wright, Experimental Cell Research,
78: 456-460, 1978, berichtet. Jene Untersuchungen
wurden allerdings mit nicht transformierten Zell-Linien
durchgeführt und die Ergebnisse wurden im großen und ganzen
auf die Änderungen der Morphologie und Wachstumsrate der
Zellen gerichtet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Methode zur
Steigerung der Produktion von t-PA in Kulturen von t-PA-produzierenden
Zellen, wobei man der Zellkultur eine Substanz,
die die Produktion des t-PA induziert, zusetzt, dadurch gekennzeichnet,
daß man als t-PA-induzierende Substanz Thioglykolsäure,
Thiodiglykolsäure, L-Cystein, Glutathion,
Butyrylcholinbromid, Butyrylcholinchlorid, Nonactinsäure,
Furanfettsäure, Ascorbinsäure, Aphidicolin, 6-Hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on,
Fusarinsäure, Mevalonsäure, Transanhydromevalonsäure,
Anhydromevalonsäurelacton, cis-Anhydromevalonsäurelacton
oder D-α-hydroxysubstituierte (C₃ oder
C₄) aliphatische Mono- oder Di-carbonsäure oder deren
Salze verwendet.
Die Methode der Erfindung wird vorzugsweise mit transformierten
CHO-Zellen durchgeführt.
Außerdem wurde gefunden, daß die C₃-C₅ aliphatische Monocarbonsäuren
und deren Salze die Produktion von t-PA in
Kulturen von t-PA-produzierenden transformierten CHO-Zellen
steigern können.
Als bevorzugte t-PA-produktionssteigernde Substanzen kommen
Thioglykolsäure, Nonactinsäure, Buttersäure und Propionsäure
in Frage.
Die t-PA-Produktion steigernden Substanzen sind Handelsprodukte
oder literaturbekannte Produkte oder können durch bekannte
Methoden hergestellt werden.
Die Verbindungen Butyrylcholinbromide und -chloride, Fusarinsäure,
Mavalonsäurelacten sind Handelsprodukte und z. B.
bei der Firma Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA,
erhältlich.
Nonactinsäure und Verfahren zu deren Herstellung ist in z. B.
Helv. Chim. Acta, Vol. XLV, (1962), No. 15-16, S. 129-138;
Tetrahedron, Vol. 36, No. 1, S. 46-49 und J. Org. Chem.,
1980, 45, S. 4259-4260 beschrieben.
Verschiedene Publikationen beschreiben die Furanfettsäuren,
z. B. Lipids, 1977, 12(10), 828-36, J. Chem. Soc. Chem. Commun.,
1976, (16), S. 630-1, Lipids, 1975, 10(11), S. 695-702,
und Fette, Seifen, Anstrichmittel, No. 8, 1986, S. 290-292.
Nutzbare Säuren dieses Typs sind auch durch Umsetzung gemäß
folgendem Reaktionsschema herstellbar:
wobei m = 2 bis 5, vorzugsweise 4, n = 7 bis 12, vorzugsweise
8 oder 10,
Die Herstellung der Verbindungen 2 und 6 ist in Voß et al.,
Helv. Chim. Acta, 1983, 66, 2294, beschrieben.
Vorzugsweise ist m 4 und n 8 oder 10.
Die Herstellung von Trans-anhydromavalonsäure ist von
H. Dieckmann in "Die Isolierung und Darstellung von trans-
5-Hydroxy-3-methyl-pentan-2-säure", Archiv für Mikrobiologie,
62, 322-327 (1986) beschrieben. Die Verbindungen Anhydromavalonsäurelacten
und cis-Anhydromavalonsäurelacten und
ihre Herstellung sind von Keder et al. in "Die Bildung von
/₂-Anhydromavalonsäurelacten durch verschiedene Pilze",
Biochem. Zeitschrift, 341, 378-386 (1965) beschrieben.
Die Verbindung 6-Hydroxy-4,6-dimethyl-3-hepten-2-on ist
durch Verfahren nach dem Stand der Technik herstellbar. Sie
ist auch ein Naturstoff und isolierbar aus Capiscum annuns
var angulosum, wie in C. A. 97: 159552f und Eiyo to Shokuryo,
1982, 35(2) 95-101, beschrieben. Diese Verbindung ist ebenfalls
in der Dissertation "Neue Sekundärstoffe aus Streptomycesten:
Isolierung und Strukturaufklärung der Colabomycine,
Pyrrolame und des Pyridazomycins" von Grote, R., Universität
Göttingen, 1987, beschrieben, sowie ihre Herstellung
durch die Züchtung von Streptomyces olivaceus (Stamm
Tü 3028) und Isolierung. Sie hat folgendes NMR-Spektrum:
C₉H₁₆O₂ (156,23)
EI-MS: m/e = 138 (M⁺-H₂O, Hochauflösung, C₉H₁₄O, 6%); 123 (M⁺-CH₅O, 8%); 98 (Hochauflösung, C₆H₁₀O, 48%); 83 (100%)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1,27 (s, 7-H₃ u. 8-H₃); 1.43 (s, breit, HO, tauscht mit MeOD aus); 2,21 (s, 1-H₃); 2,35 (d. J = 1,3 Hz, 9-H₃); 2,32 (s, breit, 5-H₂); 6,13 (s, breit, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50,3 MHz, CDCl₃): δ = 22,0 (o, C-9); 30,0 (o, 2 C, C-7 u. C-8); 32,0 (o, C-1); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6); 127,2 (o, C-3); 155,1 (u, C-4); 198,6 (u, C-2) ppm
EI-MS: m/e = 138 (M⁺-H₂O, Hochauflösung, C₉H₁₄O, 6%); 123 (M⁺-CH₅O, 8%); 98 (Hochauflösung, C₆H₁₀O, 48%); 83 (100%)
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃): δ = 1,27 (s, 7-H₃ u. 8-H₃); 1.43 (s, breit, HO, tauscht mit MeOD aus); 2,21 (s, 1-H₃); 2,35 (d. J = 1,3 Hz, 9-H₃); 2,32 (s, breit, 5-H₂); 6,13 (s, breit, 3-H) ppm
¹³C-NMR (50,3 MHz, CDCl₃): δ = 22,0 (o, C-9); 30,0 (o, 2 C, C-7 u. C-8); 32,0 (o, C-1); 54,4 (u, C-5); 71,1 (u, C-6); 127,2 (o, C-3); 155,1 (u, C-4); 198,6 (u, C-2) ppm
Als Salze der genannten Säuren kommen insbesondere Salze der
Alkalimetalle, vorzugsweise der Natrium- und Kaliumsalze, in
Frage.
Die Methode der Erfindung kann in serumhaltigem oder vorzugsweise
in serumfreiem Medium durchgeführt werden.
Wenn die Methode in serumhaltigem Medium durchgeführt wird,
ist die Verwendung von z. B. Thioglykolsäure, Nonactinsäure
oder Furanfettsäure oder deren Salze bevorzugt.
Falls die Methode in serumfreiem Medium durchgeführt wird,
wird man vorzugsweise eine C₃-C₅ aliphatische Monocarbonsäure,
insbesondere Buttersäure oder Propionsäure, oder
deren Salze verwenden.
Es wurde gefunden, daß die t-PA steigernde Verbindung ihre
Wirksamkeit bei Konzentrationen von 10 µM bis 500 mM, z. B.
1 mM bis 10 mM, aufzeigt. Die (C₃-C₅) aliphatische Monocarbonsäure,
Thioglykolsäure, Thiodiglykolsäure, L-Cystein
und Glutathion oder deren Salze sind insbesondere bei 1 mM
bis 10 mM wirksam.
Die t-PA-Produktion steigernden Substanzen können am entsprechenden
Tage der Kultivierung zugesetzt werden, z. B. am
Tag 0, das heißt am Anfang der Kultivierung, bis zum Ende
des dritten Tages der Kultivierung.
Man kann auch die t-PA-Produktion steigernde Substanz bei
mehrfachen Applikationen verwenden. Also kann man in Anwesenheit
einer Substanz die Zellen kultivieren, die Zellen
von der Kultur entfernen, dann wieder in neues Kultivierungsmedium
geben und in Anwesenheit von einer t-PA-Produktion
steigernden Substanz kultivieren. Bei dieser Mehrfachapplikation
zeigen insbesondere C₃-C₅ aliphatische
Monocarbonsäuren oder deren Salze, vorzugsweise Buttersäure
und Thioglykolsäure oder deren Salze, einen Steigerungseffekt.
Bei Mehrfachapplikation ist es nicht nötig, daß man die
gleiche Substanz für alle Applikationen verwendet, sondern
man kann eine der Substanzen in einer Applikation und eine
andere in einer weiteren Applikation verwenden. Diese Mehrfachapplikation
zeigt ebenfalls auch einen Steigerungseffekt,
wie insbesondere die Verwendung von Aphidicolin in
einer Applikation und eine der anderen Substanzen, z. B. Buttersäure,
Propionsäure, Butyrylcholinchlorid oder Butyrylcholinbromid
oder deren Salze, in einer weiteren Applikation
belegen.
Man kann auch Kombinationen von zwei oder mehr Substanzen
verwenden. Bevorzugt verwendet man nicht mehr als eine Substanz,
die das Zellwachstum hemmt. Man kann z. B. eine C₃-C₅
aliphatische Monocarbonsäure, vorzugsweise Buttersäure
und Thioglykolsäure, oder deren Salze verwenden, wobei die
Monocarbonsäure oder deren Salz als 2. Substanz der Zellkultur
bevorzugt zugegeben wird.
Transformierte chinesische Hamsterovarzellen bedeuten CHO-Zellen,
die mit einem für t-PA codierenden Vektor transformiert
sind, wobei sie unter Züchtung t-PA synthetisieren und
exprimieren können. Solche transformierte CHO-Zellen sind
literaturbekannt.
Als transformierte chinesische Hamsterovarzellen kann man
z. B. die Zellen, die in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 093 619
beschrieben sind, verwenden. Die Wirtszelle unter
dem Kennzeichen CHO-K1 wurde 1957 von Puck aus Biopsie-Material
isoliert und 1970 vom American Type Culture Collection
(ATCC) unter der Bezeichnung CCL-61 aufgenommen.
Der Vektor für die t-PA-Produktion wurde in einem Subklon,
CHO-K1-DUX B11, integriert (Urlaub et al., Proceedings of
the National Academy of Science, USA, 77: 4216-4220, 1980).
Diese Zell-Linie, eine Dihydrofolat Reduktase negative Mutante
(DHFR-), ist für eine DHFR-abhängige Selektion der
transfizierten Zellklone geeignet. Der Vektor für die humane
c-DNA ist ein bekannter Plasmid-Vektor pBR-322 von Escherichia
coli. Die Promotorregion für das t-PA-Gen und für
das DHFR-Gen stammt aus SV 40 und die Terminationsregion für
beide Gene von einem Hepatitis B-Oberflächenantigen.
Als serumfreies Medium stehen verschiedene bekannte Produkte
zur Verfügung (siehe z. B. BMFT-Statusseminar 12, 13. November
1985, Bundesministerium für Forschung und Technologie,
5300 Bonn 2, Seite 111-120). Im folgenden Beispiel wird ein
nachseziertes DMEM/Ham's F 12 Medium (1 : 1) (Gibco) als serumfreies
Medium verwendet. Als Zusatz wird fötales Kälberserum
(FKS) in einer Konzentration von 7,5% oder 1-2% verwendet.
Die Zellkulturen werden bei 37°C in einem Hereaus-Brutschrank
inkubiert und mit einem Kohlendioxid-Luftgemisch von
7,5% CO₂ in einer relativen Luftfeuchtigkeit von 100% belüftet.
Je nach Verfahrensansatz werden unterschiedliche
Kulturgefäße benutzt: Spinnergefäße für 100-1000 ml Medium,
Roux-Schalen (Nunc) 175 cm² (70-100 ml Medium), 75 cm²
(30-50 ml Medium), 25 cm² (7-10 ml Medium) und Mehrfachkulturschalen
von Costar mit 2 cm² für 1 ml Kulturen. Für
die Stammhaltung werden die Zellen in einer Dichte von
0,2-0,3 × 10⁶ Zellen/ml eingesetzt und alle 2-3 Tage subkloniert.
Um die Stimulierung der t-PA-Synthese hervorzurufen, wurden
Zellen einer exponentiell wachsenden Kultur entnommen und in
Plastikröhrchen (Falcon) 10 Min. bei 1000 × g in einer Beckmann
T 3-6 Zentrifuge abzentrifugiert. Nach Dekantieren des
Überstandes wurde das Zellpellet mit frischem Medium resuspendiert.
Für die Produktion von t-PA in serumhaltigem Medium wurde
als frisches Medium F12/DMEM + 7,5% FKS + Gentamycin verwendet.
Die resultierende Suspension wurde in 2 cm²
24-Wells-Platten bei einer Zelldichte von 0,2-0,3 × 10⁶
Zellen/ml angesetzt.
Für die Produktion von t-PA in serumfreiem Medium wurden die
Zellen zuvor 3-4 Tage in einem Medium von 1-2% FKS adaptiert,
wieder abzentrifugiert und das Zellpellet in serumfreiem
Medium resuspendiert und anschließend in 2 cm²
24-Wells-Platten in einer Zelldichte von 0,4-0,5 × 10⁶
Zellen/ml überführt.
Die t-PA-Produktion stimulierenden Substanzen wurden zu den
verschiedenen Zeitpunkten jeweils einer 1 : 100 Verdünnung
zugegeben, d. h. sie wurden zuerst in Medium gelöst oder,
wenn sie schwerlöslich sind, erst in Äthylalkohol gelöst und
danach in Medium zugesetzt und dann das diese Substanz enthaltende
Medium dem zellenthaltenden Medium im Verhältnis
1 : 100 v/v zugegeben.
Aliquots von Zellüberständen und Zellextrakten wurden zu
verschiedenen Zeitpunkten abgenommen bzw. hergestellt. Die
Messung der Proben erfolgte entweder sofort oder nach Aufbewahrung
bei -20°C mit folgenden Methoden:
Von dem synthetischen Peptidsubstrat S-2288 (D-H-Ile-Pro-Arg-p-Nitroanilin)
der Firma Kabi Diagnostica wird durch das
t-PA p-Nitroanilin als Reaktionsprodukt gebildet. Die Aktivität
von t-PA ist zur Bildung von p-Nitroanilin proportional,
die bei 405 mn, 37°C, gemessen wird.
Die spektrophotometrische Bestimmung der Enzymkinetik wurde
mit einem ACP-5O10-Analysegerät der Firma Eppendorf automatisch
durchgeführt.
Die Aktivität des Enzyms wurde anhand dieses vorgegebenen
Standards berechnet. Eine t-PA-Standardreihe von 1-15 µg/ml
wurde mit einem Laborstandard hergestellt, der zu 72% aus
1kettigem Material besteht.
Die Substratlösung (100 mM Tris/106 mM NaCl) wurde in einer
Konzentration von 50 mM eingesetzt.
Mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-linked-immuno-sorbent-assay)
wurden die t-PA-Proben des Überstandes und des Zellextraktes
quantitativ bestimmt. Als Standard diente ein Laborstandard
in einer Konzentrationsreihe von 0,038-5 µg/ml. Die Proben
wurden 1 : 10 bis 1 : 1000 vorverdünnt.
Die CHO-Zellen werden mit 0,2-0,3 × 10⁶ Zellen/ml in Kulturschalen
(in Medium mit 7,5% FKS) angeimpft und vermehren
sich zu Anfang sehr langsam. Erst nach einer lag-Phase von
24 h beginnt das logarithmische Zellwachstum. Bei einer
Zelldichte von 1,3±0,04 × 10⁶ Zellen/ml treten am 4. Tag
die ersten nicht vitalen Zellen in der Kultur auf; ihr Anteil
an der Gesamtzellenzahl beträgt 13,2±1,3%. Die maximale
Zelldichte wird am 5. Tag mit 1,8±0,05 × 10⁶ Zellen/ml
erreicht (Abb. 1).
Die Zahl der lebenden Zellen stellt nach 7 Tagen noch 72±3%
der gesamten Zellmasse dar.
Die stationäre Phase, die sich an das exponentielle Zellwachstum
anschließt, wird von verschiedenen Faktoren eingeleitet.
Durch eine hohe Populationsdichte und Verbrauch
essentieller Nährstoffe teilen sich die Zellen nicht weiter.
Die Dauer der stationären Phase variiert stark und ist abhängig
von Medienkomponenten wie Serum. Eine Anhäufung von
Säuren und toxischen Stoffwechselprodukten sowie Änderungen
von Milieufaktoren (saurer pH, niedriger O₂-Partialdruck,
mangelnde Durchlüftung), bedingen ebenfalls das Absterben
der Zellen.
Zwischen Zellwachstum und t-PA-Synthese besteht eine lineare
Beziehung.
Der Zeitverlauf der t-PA-Produktion zeigt 2 Phasen. In der
1. Phase steigt die t-PA-Konzentration im Überstand stetig
an. In der 2. Phase kommt die Enzymsynthese praktisch zum
Stillstand und die t-PA-Konzentration im Medium bleibt annähernd
konstant (Abb. 2A). Die maximale t-PA-Konzentration
am 4. Tag beträgt 11,1±0,7 µg/ml im Elisa. Die gemessenen
t-PA-Konzentrationen liegen mit dem chromogenen assay etwas
höher, was vermutlich durch 2kettiges t-PA verursacht wird,
mit der Elisa-Methode jedoch verlaufen die Kurven mit beiden
Nachweismethoden bis zum 4. Tag parallel.
Die intrazelluläre t-PA-Konzentration verläuft ebenfalls
parallel zum Zellwachstum und ist relativ gering bezogen auf
die gesamte synthetisierte t-PA-Menge. Am 4. Tag beträgt
deren Anteil 7% an der Gesamtaktivität (Abb. 2B).
Wie Abb. 3A zeigt, steigt die t-PA-Synthese, bezogen auf die
Zellzahl, bis zum 4. Tag leicht an; mit der Elisa-Methode
wird ein Maximum von 8,1±1,2 µg t-PA/1 × 10⁶ Zellen bestimmt.
Zellulär gebundenes t-PA wurde nur mit der Elisa-Methode
bestimmt, da diese geringen t-PA-Konzentrationen
(< 1 µg) mittels DCA nicht zu bestimmen sind.
Der intrazelluläre t-PA-Gehalt, bezogen auf die Zellzahl,
ist während der log-Phase des Zellwachstums etwas höher und
liegt zwischen 500 und 900 ng t-PA/1 × 10⁶ Zellen, ab
dem 4. Tag liegt der t-PA-Wert bei ca. 450 ng/1 × 10⁶ Zellen
(Abb. 3B).
Die Zellen wurden mit 0,25 × 10⁶ Zellen/ml und verschiedenen
Serumkonzentrationen in Medium angesetzt.
Eine Serumkonzentration unter 5% im Medium wirkt sich auf
die Zellteilung gleichfalls negativ aus, die Produktivität
wird hingegen nur gering beeinflußt.
Der Einfluß der Serumkonzentration in Medium auf das Zellwachstum
und die t-PA-Produktion nach 48-h-Inkubation der
Zellen ist in Tabelle 1 dargestellt. Die Werte sind in % der
maximalen Werte (7,5% FKS in Medium) angegeben. Der Maximalwert
für die Zellzahl liegt bei 0,56±0,03 × 10⁶ Zellen
und für die t-PA-Konzentration 5,7±0,5 µg/ml. Die t-PA-Bestimmungen
wurden mittels DCA durchgeführt (Mittelwert ± SE,
n = 4).
Die Zellen wurden in serumfreiem Medium in einer Zelldichte
von 0,4-0,5 × × 10⁶ Zellen/ml angesetzt. Die Zellen teilen
sich bis zum 4. Tag, und die höchste Lebendzellzahl wird
ebenfalls am 4. Tag mit 1,0±0,2 × 10⁶ Zellen/ml erreicht
(Abb. 4).
Die t-PA-Konzentration im Überstand steigt bis zum 7. Tag
ständig an und erreicht mit der Elisa-Methode ein Maximum
von 13,6±0,54 µg/ml. Die mittels DCA ermittelten t-PA-Werte
liegen am 1.-3. Tag unter, und ab dem 4. Tag über den
t-PA-Werten, die mittels Elisa bestimmt wurden (Abb. 5).
Die t-PA-Synthese pro Zelle ist in serumfreiem Medium
ungefähr gleich hoch wie in Medium mit Serum und liegt
zwischen 7,2±3,6 und 10,3±2,8 µg/1 × 10⁶ Zellen (Elisa)
(Abb. 6).
Der prozentuale Anteil von t-PA in serumfreiem Medium an der
Gesamtproteinmenge des Überstandes liegt zwischen 10,9±1,0
und 12,5±1,4%. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
Die t-PA-Werte wurden mittels Elisa bestimmt (Mittelwert ±
SE, n = 4).
Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen in Medium mit
7,5% FKS durch verschiedene aliphatische Monocarbonsäuren
sind in Tabelle 3 angegeben. Alle Säuren wurden in einem
Konzentrationsbereich von 10 mM bis 500 mM verwendet. Der
optimale Dosisbereich für alle Monocarbonsäuren liegt zwischen
1 bis 10 mM. Die Wirksamkeit der Säuren hängt von der
Kettenlänge ab.
Alle wirksamen Monocarbonsäuren hemmen das Zellwachstum.
Propion-, Butter-, Isobutter- und Isovaleriansäuren sind in
einem größeren Konzentrationsbereich wirksam, da die konzentrationsabhängige
Inhibition des Primärstoffwechsels, die
zur Hemmung des Zellwachstums führt, sich mit der Steigerung
der t-PA-Synthese überlagert.
Die Werte in Tabelle 3 beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand
und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben. Die
t-PA-Bestimmung erfolgte mittels DCA (Mittelwert ± SE, n = 3-24).
Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe.
Daten für die einzelnen Proben sind in Klammern angegeben.
Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge
von 3 bis 4 Tagen, wobei die Monocarbonsäuren am
Tag 0 bis Tag 3 der Kultivierung zugegeben worden sind, wie
unten in Tabelle 3A dargestellt. Daten für die einzelnen
Proben sind in Klammern angegeben.
In Abb. 7 ist der zeitliche Verlauf der t-PA-Produktionssteigerung
in Medium mit 7,5% FKS durch C3-C5-Monocarbonsäuren
dargestellt. Nach 24 h ist schon eine Stimulierung der
t-PA-Produktion von 18,1±5,7% (C4) bis 24,8±0,5% (C5)
nachweisbar. Bei Isobuttersäure zeigte sich eine Produktionssteigerung
erst nach 48 h. Eine maximale Steigerung der
t-PA-Produktion wurde für die C3- und die C4-Carbonsäure am
3. Tag erreicht, mit 37,2±5,1% für Na-Butyrat. Die Produktionssteigerung
ist für die Butter- und Isobuttersäure nur
kurzzeitig, ein Effekt ist am 4. Tag nicht mehr zu beobachten.
Die steigernde Wirkung von Propionsäure und Isovaleriansäure
hingegen ist am 4. Tag noch vorhanden und manifestiert
sich in einer Steigerung der t-PA-Produktion um
31,8% für C3 und 8,5% für C5.
Die Effekte sind außerdem vom physiologischen Zustand der
Zelle abhängig. Während des exponentiellen Wachstums sind
die Zellen für eine Stimulierung am empfindlichsten.
In Tabelle 4 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen
mit Medium mit 7,5% FKS durch C3-C5-Monocarbonsäuren
in Abhängigkeit vom Applikationstag der Carbonsäuren nach
48 h Wachstum der Zellen in Medium mit 7,5% FKS dargestellt.
Die Konzentration war für Buttersäure und Isovaleriansäure
1 mM und für Propionsäure und Isovaleriansäure 5 mM. Die
Werte beziehen sich auf 1 mM Zellüberstand und sind in % gegenüber
der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, 3 = 3-5).
Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.
Der Stimulierungseffekt ist an einer Steigerung sowohl der
intrazellulären t-PA-Konzentration als auch der extrazellulären
t-PA-Konzentration zu verfolgen.
Wie aus Abb. 8 hervorgeht, ist die Zunahme des intrazellulären
t-PA-Gehaltes in butyrat-behandelten Kulturen nach
24-h-Inkubation gegenüber der Kontrolle am größten (43,8±9,8%).
Im Überstand fällt die prozentuale Steigerung nach
24 h etwas geringer aus mit durchschnittlich 19,2% (DCA und
Elisa) gegenüber den Kontrollwerten. Dieser Effekt hält im
Überstand 72 h an.
In Abb. 9A-C ist die t-PA-Synthese, bezogen auf die Zellzahl
dargestellt, und sie zeigen, daß die Stimulierung der t-PA-Synthese
durch Na-Butyrat trotz der Hemmung des Zellwachstums
über 7 Tage anhält. Während der ersten 4 Tage nimmt die
Enzymsynthese pro Zelle stetig zu. Die t-PA-Konzentration
steigt von 7,5±1,1 µg bis 28,9±5,3 µg t-PA/1 × 10⁶
Zellen (Elisa) im Überstand an (Abb. 8A). Mit der DCA-Methode
wird ein maximaler t-PA-Gehalt von 47,4±7,4 µg t-PA/1 × 10⁶
Zellen bestimmt (Abb. 9B). Gleichzeitig nimmt der intrazelluläre
t-PA-Gehalt ab und fällt von 1,5±0,2 µg t-PA/1 × 10⁶
Zellen am 5. Tag ab (Abb. 9C).
In Tabelle 5 ist die Stimulierung der t-PA-Synthese durch
Na-Butyrat in Medium mit 7,5% FKS bezogen auf die Zellzahl
angegeben. Na-Butyrat wurde am Tag 0 in einer Konzentration
von 1 mM zugegeben. Die Werte an den Tagen 1-4 sind in % gegenüber
der Kontrolle (0%) angegeben und beziehen sich auf 1 × 10⁶
Zellen. Der t-PA-Gehalt im Überstand und im Zellextrakt
wurde mittels Elisa bestimmt (Mittelwert ± SE, n = 5-10).
Eine optimale Produktionssteigerung wurde erreicht, wenn
Na-Butyrat während des exponentiellen Wachstums der Zelle
zugegeben wurde. Der maximale Effekt von Na-Butyrat tritt
bei einem Applikationszeitraum von Tag 0 bis 2 immer am 3. Tag
auf (Abb. 10).
Durch eine Applikation von Na-Butyrat alle 2-3 Tage nach Mediumwechsel
in derselben Zellpopulation konnte die t-PA-Produktion
über längere Zeit auf einem höheren Niveau gehalten
werden.
In Tabelle 6 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen,
die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert wurden, dargestellt.
1 mM Na-Butyrat wurde bei jedem Mediumwechsel bzw.
nur am Tag 0 zugegeben. Die Werte von 2, 4, 7 bzw. 9 Tagen
nach Mediumwechsel sind in % gegenüber der Kontrolle (0%)
angegeben und beziehen sich auf 1 mM Zellüberstand. Die
t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt (Mittelwert ± SE,
n = 3).
Im Gegensatz zu dem Kurzzeiteffekt der butyrat-stimulierten
t-PA-Synthese in serumhaltigem Medium hält der Effekt in serumfreiem
Medium länger an und beträgt 1 Tag nach Applikation
von Na-Butyrat 44,1±7,1% gegenüber der Kontrolle.
Eine maximale Steigerung wurde 3 Tage nach Applikation von
Na-Butyrat erreicht mit 143,3±12,8%. Der Steigerungseffekt
ist noch 8 Tage nach Na-Butyrat-Zugabe mit 49,9±7,0% nachzuweisen
(Abb. 11 und 12).
Die t-PA-Synthese, bezogen auf 1 × 10⁶ Zellen, ist in serumfreiem
Medium ebenfalls höher als in serumhaltigem Medium
und steigt auf über 50 µg/1 × 10⁶ Zellen (Abb. 13).
Die C3-Carbonsäure zeigt sehr ähnliche Effekte auf die t-PA-Synthese
wie die Buttersäure. Die prozentuale Steigerung
fällt jedoch ca. 14% niedriger aus und für die t-PA-Stimulierung
sind höhere Konzentrationen (5-10 mM) notwendig.
Weiterhin hemmt Propionsäure in geringerem Maße das Zellwachstum
und führt daher zu einer länger anhaltenden Steigerung
der t-PA-Synthese.
Eine Stimulierung der t-PA-Synthese durch Propionsäure
scheint, im Gegensatz zur Buttersäure, sehr spezifisch zu
sein, da in serumfreiem Medium der extrazelluläre Proteingehalt
gegenüber der Kontrolle nur gering erhöht wurde und der
Einbau von [³H]-Leucin nur geringfügig gesteigert wurde.
Hydroxycarbonsäuren, wie Milchsäure, Glycerinsäure, Apfelsäure
und Weinsäure zeigen nur eine leichte Steigerung der
t-PA-Synthese, die zwischen 6 und 10% lag, wobei die Weinsäure
in einer Konzentration von 10 mM die t-PA-Synthese am
besten stimulierte (10,3±2,9% gegenüber der Kontrolle).
Die Zellteilung wird von Hydroxycarbonsäuren nicht beeinflußt,
und der Effekt auf die t-PA-Synthese ist noch nach
96 h nachzuweisen.
Die Wirkung der Ascorbinsäuren bei 10 mM auf die t-PA-Produktion
hält 72 h an und zeigt bei einer Applikation am Tag 0
eine 15,2±3,1%-Steigerung der t-PA-Synthese nach 24 h
(Abb. 14).
Es wurde gefunden, daß auch langkettige Fettsäuren wie
Nonactinsäure mit 10 C-Atomen und Furanfettsäuren eine Steigerung
hervorrufen konnten (Tabelle 7). In diesem Beispiel
wurde eine Furanfettsäure gemäß Formula 4, in der m = 4 und
n = 8, verwendet.
In serumfreiem Medium war jedoch keine Steigerung der t-PA-Synthese
bzw. der Proteinsynthese nachzuweisen.
Die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen durch langkettige
Fettsäuren ist in Tabelle 8 dargestellt. Die Zellen
wurden in Medium mit 7,5% FKS kultiviert. Die Säuren wurden
in einem Konzentrationsbereich von 10 µM bis 10 mM getestet,
wobei eine Konzentration von 1 mM optimal war. Die Werte
beziehen sich auf 1 mM Zellüberstand und sind in % gegenüber
der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-9). Der
maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Die t-PA-Bestimmung
wurde mittels DCA durchgeführt.
Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge
von 4 Tagen, wobei die Säuren am Tag 0 zugegeben
wurden, wie in Tabelle 8A dargestellt. Daten für die Einzelproben
sind in Klammern angegeben.
Vier schwefelhaltige Verbindungen, die Derivate oder Substitutionsprodukte
von Carbonsäuren darstellen, zeigten eine
Steigerung der t-PA-Produktion zwischen 16% und 31,2%, ohne
das Zellwachstum negativ zu beeinflussen (Tabelle 8). Die
substituierten Carbonsäuren zeigten ihre optimale Wirkung im
gleichen Konzentrationsbereich (1-10 mM) wie die anderen
wirksamen Carbonsäuren. Nur Glutathion war in einem niedrigeren
Konzentrationsbereich von 1-10 µM effektiv. Thioglykolsäure
erwies sich als bevorzugter Stimulator der t-PA-Synthese
in CHO-Zellen.
In diesem Beispiel wurden die Zellen in Medium mit 7,5% FKS
kultiviert. Alle Substanzen wurden in einem Konzentrationsbereich
von 1 µM bis 10 mM getestet. Die Werte in Tabelle 9
beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber
der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 6-19).
Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe. Die
t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt. Die Konzentration
der Substanz ist in Klammern angegeben.
Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge
von 3 Tagen, wobei die Substanzen vom Tag 0 bis
Tag 2 zugegeben worden sind wie in Tabelle 9A angegeben. Daten
für die einzelnen Proben sind in Klammern dargestellt.
Die Vorteile von Thiocarbonsäuren gegenüber Monocarbonsäuren
sind das Fehlen eines inhibitorischen Effekts auf die Zellproliferation,
jedoch konnte die Produktion von t-PA mit
diesen Substanzen nicht weiter gesteigert werden als mit
Buttersäure. Die Dauer des Steigerungseffektes ist ebenso
kurz und erreicht den Maximalwert nach 24 h für Thioglykolsäure
und nach 48 h für Cystein. Nach 4 Tagen Inkubation der
Zellen ist der Effekt auf die t-PA-Produktion nur noch
gering (Abb. 15).
In serumfreiem Medium ist die stimulierende Wirkung auf die
t-PA-Synthese aber geringer als in Medium mit Serum, da alle
Substanzen die Zellteilung zwischen 10% und 20% hemmen.
Die t-PA-Produktion ist nach der Thioglykolsäure-Behandlung
72 h erhöht und vom Applikationstag unabhängig. Die prozentuale
Steigerung der Enzymsynthese ist jeweils nach 24 h am
höchsten und fällt dann kontinuierlich ab.
In Tabelle 9 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen,
die 24-96 h in Medium mit 7,5% FKS und 1 mM Thioglykolsäure
kultiviert wurden, in Abhängigkeit vom Applikationstag,
dargestellt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml
Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%)
angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4-6). Die t-PA-Bestimmung
wurde mittels DCA durchgeführt.
Die t-PA-Produktion kann durch eine zweifache Applikation
von Thioglykolsäure gegenüber der einfachen Applikation erhöht
werden (Abb. 16).
In Abb. 17A und Abb. 17B (Elisa) ist der Verlauf der
t-PA-Synthese bezogen auf 1 × 10⁶ Zellen dargestellt. Die
t-PA-Synthese ist durch 1 mM Thioglykolsäure die ersten
3 Tage (DCA) gegenüber der Kontrolle erhöht. Die im Elisa
ermittelten t-PA-Werte bleiben hingegen über den ganzen
Zeitraum erhöht. Die Steigerungsrate beträgt am 4. Tag noch
ca. 35%. Der intrazelluläre t-PA-Gehalt pro Zelle wird durch
Thioglykolsäure ebenfalls erhöht. Die maximale intrazelluläre
t-PA-Konzentration beträgt 1,1±0,1 µg/1 × 10⁶ Zellen
nach 24 h und fällt innerhalb 96 h ungefähr auf die
Hälfte der ursprünglichen Konzentration herab (Abb. 17C).
Die extrazelluläre t-PA-Konzentration ist am 5. Tag 10,7%
gegenüber der Kontrolle gesteigert. Die prozentuale Steigerung
der t-PA-Synthese durch Thioglykol ist in serumfreiem
Medium etwas geringer, da die Zellteilung leicht gehemmt
wird (10-20%).
In der Gruppe der C4-Carbonsäurederivate wurden weitere Substanzen
gefunden, die eine Wirkung auf die t-PA-Synthese in
CHO-Zellen zeigen. Zu diesen Substanzen zählen in erster
Linie Butyrylcholinbromid (BCB) und -chlorid (BCC), die die
t-PA-Produktion zwischen 30% und 40% steigern. Diese C4-Derivate
zeigen in jeder Hinsicht die gleichen Effekte wie
Na-Butyrat und sind im gleichen Konzentrationsbereich wirksam.
In Tabelle 10 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in
CHO-Zellen durch die zwei oben erwähnten Derivate der Monocarbonsäuren
dargestellt. Die Zellen wurden in Medium mit
7,5% FKS kultiviert. Alle Substanzen wurden in einem Konzentrationsbereich
von 10 µM bis 10 mM getestet. Die Werte sind
in % gegenüber der Kontrolle (0%) und beziehen
sich auf 1 ml Zellüberstand (Mittelwert ± SE, n = 4-15). Die
Werte, die sich auf die Einzelproben beziehen, sind in Klammern
angegeben. Der maximale Wert bezieht sich auf eine Einzelprobe.
Die t-PA-Bestimmung wurde mittels DCA durchgeführt.
Die Durchschnittswerte beziehen sich auf mehrere Produktionsgänge
von 4 Tagen wie in Tabelle 10A dargestellt. Werte
für die Einzelproben sind in Klammern angegeben.
Bei Verwendung von Substanzkombinationen sollte mindestens
eine Substanz die Eigenschaft besitzen, daß sie das Zellwachstum
nicht hemmt.
Eine erhöhte Ausbeute wurde z. B. bei einer Kombination von
Thioglykolsäure und Buttersäure erreicht. Eine wichtige
Rolle kann dabei der Applikationszeitraum der einzelnen Substanzen
spielen, wobei z. B. Buttersäure immer als 2. Substanz
zugegeben wurde, um die inhibitorische Wirkung auf das
Zellwachstum zu verringern.
Bei einer gleichzeitigen Applikation der Substanzen am Tag 0
wird der Effekt von der Buttersäure nicht erhöht.
Für die Kombination Buttersäure und Thioglykolsäure ist der
Effekt additiv. Als Steigerungseffekt konnte maximal 70% erreicht
werden.
In serumfreiem Medium konnten die Effekte von Buttersäure
durch eine weitere Substanz nicht weiter gesteigert werden.
Die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen, die 3 Tage
in Medium mit 7,5% FKS kultiviert werden, ist in Tabelle 11
dargestellt. 1 ml Thioglykolsäure (TG) und 1 mM Buttersäure
wurden in Kombination zu verschiedenen Zeitpunkten den Zellen
zugesetzt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand
und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben
(Mittelwert ± SE, n = 4-8). Die t-PA-Bestimmung wurde mittels
DCA durchgeführt.
Aphidicolin, ein Diterpen aus Cephalosporium aphidicola,
hemmt spezifisch die DNA alpha-Polymerase und stimuliert die
t-PA-Synthese in CHO-Zellen in einer Konzentration von 1 bis
10 µM. Nach 24 h ist die t-PA-Ausbeute um 44,9±13,9% gesteigert.
Aphidicolin zeigte eine Stimulierung der t-PA-Synthese in
CHO-Zellen. Es kann die DNA-Synthese reversibel hemmen, dabei
wird die RNA- und Proteinsynthese nicht beeinflußt.
Aphidicolin eignet sich also einerseits, die t-PA-Synthese
zu stimulieren und andererseits die Zellen zu synchronisieren.
Der Effekt von Aphidicolin auf die t-PA-Synthese bei
längerer Inkubation der Zellen in Medium mit Aphidicolin ist
oben beschrieben. Dieser Passus umschreibt Arbeiten mit
CHO-Zellen, die 24 h dem Aphidicolin ausgesetzt waren und
anschließend in Medium ohne Aphidicolin weiterkultiviert
wurden. Die Phasen des Zellzyklus und der Einbau von
[³H]-Thymidin während der 24-h-Markierung und danach wurden
analysiert, um die Hemmung der DNA-Synthese und eine
Wiederaufnahme der Synthese nach Entfernen des Aphidicolin
zu verfolgen. Weiterhin wurde die RNA-, Protein- und die
t-PA-Synthese bestimmt.
Das Zellwachstum war durch Aphidicolin (1 µM) nach einer
24-h-Behandlung leicht gehemmt (5-10%). Beim Mediumwechsel
wurden die Aphidicolin-behandelten Kulturen jedoch wieder
auf die gleiche Zellzahl wie die Kontrollkulturen gesetzt.
Die t-PA-Synthese war in 1 µM Aphidicolin-synchronisierten
Zellen stimuliert. Ein Effekt war noch 96 h nach Mediumwechsel
zu sehen.
Die Steigerung der t-PA-Produktion in 1 µM Aphidicolin-behandelten
CHO-Zellen, die in Medium mit 7,5% FKS kultiviert
wurden, ist in Tabelle 12 angegeben. Die Werte beziehen sich
auf 1 ml Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle
(0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung
wurde mittels DCA durchgeführt.
In Abb. 18 ist der zeitliche Verlauf der t-PA-Synthesesteigerung
in serumfreiem Medium dargestellt. Der Effekt erreicht
ein Maximum 48 h nach Mediumwechsel.
Die t-PA-Konzentration in serumfreiem Medium wurde nach 96,
120 und 144 h auch mittels Elisa bestimmt, die gegenüber den
Kontrollwerten wesentlich höher lagen als die im DCA ermittelten
Werte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 angegeben.
Der Test wurde mit 1 µM Aphidicolin-behandelten CHO-Zellen,
die in serumfreiem Medium kultiviert wurden, durchgeführt.
Die Werte beziehen sich auf 1 ml Zellüberstand und sind in %
gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben (Mittelwert ± SE, n = 4).
Die t-PA-Bestimmung wurde mittels Elisa durchgeführt.
Eine erhöhte intrazelluläre t-PA-Konzentration konnte nur
während der 24-h-Inkubation mit Aphidicolin beobachtet werden
und war ca. 30% erhöht.
Buttersäure, Propionsäure, Butyrylcholinchlorid und -bromid
konnten in diesem System die t-PA-Produktion noch weiter
steigern. Die Stimulierung war sowohl in serumfreiem als
auch in serumreichem Medium erfolgreich, wobei ein zusätzlicher
Steigerungseffekt in serumfreiem Medium nur bei
Applikation der Substanzen nach einer 24-h-Anpassung der
Zellen an diese Mediumbedingung erreicht wurde.
Tabelle 14 zeigt die prozentuale Steigerung der t-PA-Produktion
in Aphidicolin-behandelten Kulturen nach Applikation
von Na-Butyrat. Na-Butyrat steigert die t-PA-Synthese um
weitere 14% nach 96 h.
Der Test wurde mit 1 µM Aphidicolin-behandelten CHO-Zellen,
die mit und ohne Na-Butyrat kultiviert wurden, in serumfreier
Kultur durchgeführt. Die Werte beziehen sich auf 1 ml
Zellüberstand und sind in % gegenüber der Kontrolle (0%) angegeben
(Mittelwert ± SE, n = 4). Die t-PA-Bestimmung wurde
mittels Elisa durchgeführt.
Die t-PA-Produktion ist nach der Behandlung mit der obigen
Verbindung nach 144 h erhöht. Für die Stimulierung der
t-PA-Synthese waren Konzentrationen im micromolaren Bereich
wirksam z. B. 0,005 bis 100 µM.
In Abb. 19 ist die Steigerung der t-PA-Produktion in CHO-Zellen,
die bis zu 168 h in serumfreiem Medium und 7 mM bis
7 µM DHO kultiviert wurden, dargestellt. Die Werte wurden
mittels DCA durchgeführt. In Abb. 20 sind die entsprechenden
Werte, die mittels Elisa durchgeführt wurden, angegeben.
Zellkulturen, die durch die oben beschriebene Methode hergestellt
wurden, können in bekannter Weise umgearbeitet werden,
um das t-PA zu isolieren, z. B. nach der Produktionsphase
wird das Kulturmedium von der Zellmasse abgetrennt und
der Zellüberstand durch Ultrafiltration und chromatographische
Schritte gereinigt.
Das isolierte t-PA kann danach in pharmazeutische Präparate
formuliert werden, z. B. als Lösung oder Lyophilisat.
Claims (15)
1. Methode zur Steigerung der Produktion von t-PA in Kulturen
von t-PA produzierenden Zellen, wobei man der
Zellkultur eine Substanz, die die Produktion des t-PA
induziert, zusetzt, dadurch gekennzeichnet, daß man als
t-PA-induzierende Substanz Thioglykolsäure, Thiodiglykolsäure,
L-Cystein, Glutathion, Butyrylcholinbromid,
Butyrylcholinchlorid, Nonactinsäure, Furanfettsäure,
Ascorbinsäure, Aphidicolin, 6-Hydroxy-4,6-Dimethyl-3-hepten-2-on,
Fusarinsäure, Mevalonsäure, Trans-anhydromevalonsäure,
Anhydromevalonsäurelacton, cis-Anhydromevalonsäurelacton,
D-α-hydroxysubstituierte (C₃ oder
C₄) aliphatische Mono- oder Di-carbonsäure oder deren
Salze verwendet.
2. Methode zur Steigerung der Produktion von t-PA aus Kulturen
von transformierten CHO-Zellen, dadurch gekennzeichnet,
daß man eine C₃-C₄ aliphatische Monocarbonsäure
oder deren Salze der Kultur zusetzt.
3. Methode gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man transformierte CHO-Zellen kultiviert.
4. Methode gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
man als t-PA-induzierte Substanz Thioglykolsäure oder
deren Salz verwendet.
5. Methode gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß
man als t-PA induzierende-Substanzen Nonactinsäure oder
Furanfettsäure oder deren Salze verwendet.
6. Methode gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
man als t-PA-induzierte Substanz Buttersäure oder
deren Salz verwendet.
7. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Kultivierung in serumfreiem
Medium durchführt.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Kultivierung in serumhaltigem
Medium durchführt.
9. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß man die t-PA induzierende-Substanz in
der Kultur bei einer Konzentration von 0,005 µM bis
500 mM zusetzt.
10. Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
man eine C₃-C₄ aliphatische Monocarbonsäure oder
deren Salz in einer Konzentration von 1 mM bis 10 mM
zusetzt.
11. Methode gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Thioglykolsäure, Thiodiglykolsäure, L-Cystein
oder Glutathion oder deren Salze in einer Konzentration
von 1 mM bis 10 mM zusetzt.
12. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man die Zellen in Anwesenheit einer
der Substanzen kultiviert, die Zellen von der Kultur
entfernt und danach in neues Kultivierungsmedium gibt
und in Anwesenheit von einer der Substanzen kultiviert.
13. Methode gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß
Aphidicolin die zuerst erwähnte Substanz ist und die
zweite Substanz Buttersäure, Propionsäure, Butyrylcholinchlorid
oder Butyrylcholinbromid oder deren Salze.
14. Methode gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß man zwei oder mehr der Substanzen
gleichzeitig verwendet.
15. Methode gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
man Buttersäure und Thioglykolsäure oder deren Salze
verwendet, wobei die Buttersäure als 2. Substanz der
Zellkultur zugegeben wird.
Priority Applications (20)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19873734632 DE3734632A1 (de) | 1987-10-13 | 1987-10-13 | Verfahren zur herstellung von t-pa |
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| DE3851685T DE3851685D1 (de) | 1987-10-13 | 1988-10-10 | Verfahren zur Herstellung von Proteinen. |
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