TWI601823B - Cell culture methods using media containing high concentrations of amino acids - Google Patents

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Kunihiko Kodaira
Makoto Sadamitsu
Yoshinori Takagi
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Description

使用含高濃度胺基酸之培養基的細胞培養方法
本發明係關於培養產生所期望之蛋白質的細胞而製造蛋白質之方法，以及有關使用於該方法之培養基。更詳細地，本發明係有關於培養產生所期望之蛋白質的細胞而製造該蛋白質之方法中，特徵為維持培養液中之絲胺酸於高濃度再進行培養之無血清培養法及蛋白質製造方法，以及使用該方法之細胞培養用饋料批次培養基。
欲以培養動物細胞而獲得該動物細胞所產生的天然型蛋白質時，或是培養經導入編碼所期望蛋白質之基因的動物細胞，而製造所期望的蛋白質等時，除鹽類、糖類、胺基酸類以及維他命類等基礎營養物之外，為促使該細胞增殖，過去即添加來自哺乳動物的萃取物，具體而言為以5~20%之範圍於培養基中添加牛胎兒血清等血清，但相關來自哺乳動物的血清，佔培養基成本的75~95%，且品質會因不同批組間而有所差異，而出現無法獲得安定的增殖的缺點。另外，來自哺乳動物的血清，無法以高壓滅菌等進行滅菌，可能被病毒或黴漿菌污染，雖然其多數無害，但自安定產生此點而言，係一附加的未知的重要因素。
近年來針對來自哺乳動物的成分，擔憂其與狂牛病(mad cow disease)、牛海綿狀腦病(Bovine Spongiform Encephalopathy：BSE)、傳染性海綿狀腦病 (Transmissible Spongiform Encephalopath：TSE)及庫賈氏病(Creutzfeld－Jakob Disease：CJD)等之關係，自安全性的觀點而言，希望出現不含有該等來自哺乳動物的成分之動物細胞培養用培養基。進而由於血清中含有500種以上的蛋白質，而使得自培養基中分離、純化細胞產物亦即所期望的蛋白質更加複雜化。
以往為解決上述問題，進行為於不存在血清之情況下培養動物細胞之無血清培養法之開發。無血清培養法已開發經添加代替血清之效果之物質如胎球蛋白、轉鐵蛋白、白蛋白等血漿蛋白質、類固醇荷爾蒙、胰島素等荷爾蒙類、增殖因子、胺基酸、維他命等營養因子等之無血清培養液。
無血清培養法所使用之胎球蛋白、胰島素、轉鐵蛋白、增殖因子等係利用來自血清經純化之蛋白質或來自重組生物之重組體蛋白質。該等物質於使用上會在雖微量但含有來自生物體之成分，必須使用昂貴製品，以及因批次間的差異而使培養不一致等出現問題點。
近年來亦已開發利用蛋白質水解物之無血清培養法，但因具有如上所述之含有來自生物體之成分，昂貴，以及因批次間的不同而使培養不一致等問題點，難以定論其可充分產生適用的蛋白質。
因此，期望一種使用增強儘可能不含有來自生物體之成分，低價且因批次間的差異少之蛋白質產生量之合成培養基之培養法。近年來，針對饋料批次培養之培養液中之 葡萄糖及胺基酸加以分析，明確得知藉由增量饋料批次培養之麩胺酸，可期待抗凝血酶產生量增加(非專利文件1)。然而，因該知識僅於藉由表現麩胺酸合成酵素之CHO細胞進行調查，並未以一般的CHO細胞進行檢証，進而，針對其他胺基酸各別效果並不明確。另外，蛋白質的產生量亦仍無法稱之為充分。因而更加熱切期盼使用可增強產生量之合成培養基之培養法。
非專利文件1：Journal of Bioscience and Bioengineering(2005),100(5),502－510。
本發明係以藉由極力排除來自生物體培養基成分之培養基進行饋料批次培養時，藉由改良培養基，而使細胞大量產生蛋白質為目的。
本發明之發明者們，為達成上述課題專心研究後，發現藉由維持於無血清培養液中總是乾涸的特定的胺基酸於高濃度，可使細胞大量產生蛋白質，以該發現為基礎而完成本發明。
亦即，本發明係提供如下所述者。
(1)一種細胞之培養方法，其係於培養產生所期望之蛋白質的細胞並製造該蛋白質時，至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上。
(2)如上述(1)之方法，其中進而至少於細胞增殖期 開始時期以後的一定期間內，使培養液中的酪胺酸濃度為1mM以上，及/或使半胱胺酸的濃度為初始培養基之濃度以上或為0.4mM以上。
(3)一種動物細胞培養用培養基，其係含有1mM以上之絲胺酸或其鹽。
(4)一種動物細胞培養用培養基，其係含有1mM以上之絲胺酸或其鹽，進而至少含有1mM以上之酪胺酸，及/或0.4mM以上之半胱胺酸。
(5)一種所期望之蛋白質的製造方法，其係使用上述(3)或(4)之動物細胞培養用培養基，培養產生所期望的蛋白質之細胞，而製造該蛋白質。
(6)一種細胞之培養方法，其係於培養產生所期望之蛋白質的細胞而製造該蛋白質時，至少於培養細胞可充分增殖期間或可充分產生所期望產生的蛋白質期間之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上。
(7)如上述(6)之方法，其中進而至少於培養細胞可充分增殖期間或可充分產生所期望產生的蛋白質期間之一部分或全部期間，使培養液中的酪胺酸濃度為1mM以上，及/或使半胱胺酸的濃度為初始培養基之濃度以上或為0.4mM以上。
(8)一種細胞之培養方法，其係於培養產生所期望之蛋白質的細胞並製造該蛋白質時，至少於細胞之對數增殖期之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上。
(9)如上述(8)之方法，其中進而至少於細胞之對數增殖期之一部分或全部期間，使培養液中的酪胺酸濃度為1mM以上，及/或使半胱胺酸的濃度為初始培養基之濃度以上或為0.4mM以上。
(10)如上述(8)或(9)之方法，其中至少於細胞之對數增殖期之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為2mM以上。
(11)一種細胞之培養方法，其係於培養產生所期望之蛋白質的細胞並製造該蛋白質時，至少於培養第3~10天之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上。
(12)如上述(11)之方法，其中進而至少於培養第3~10天之一部分或全部期間，使培養液中的酪胺酸濃度為1mM以上，及/或使半胱胺酸的濃度為初始培養基之濃度以上或為0.4mM以上。
(13)如上述(11)或(12)之方法，其中至少於培養第3~10天之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為2mM以上。
(14)如上述(1)、(2)、(5)~(13)任一項之培養方法或製造方法，其中細胞係以批次培養法(batch culture)、重複批次培養法(repeated batch culture)、饋料批次培養法(fed－batch culture)或重複饋料批次培養法(repeated fed－batch culture)、連續培養法(continuous culture)、滲流式培養法(perfusion culture)進行培養。
(15)如上述(1)、(2)、(5)~(13)任一項之培養方法或製造方法，其中細胞以饋料批次培養法進行培養。
(16)如上述(15)之方法，其中將絲胺酸及酪胺酸及/或半胱胺酸，以逐次地複數回，或連續地饋料批次方式供給於培養液中。
(17)如上述(1)、(2)、(5)~(16)中任一項之方法，其中細胞係已導入編碼所期望的蛋白質之基因。
(18)如(17)之方法，其中所期望的蛋白質係抗體。
(19)如上述(1)、(2)、(5)~(18)中任一項之方法，其中細胞係哺乳動物細胞。
(20)如上述(19)之方法，其中哺乳動物細胞係CHO細胞。
(21)一種細胞培養用饋料批次培養基，其係含有濃度為10mM~1000mM之絲胺酸。
(22)一種細胞培養用饋料批次培養基，其係含有濃度為20mM~500mM之絲胺酸。
(23)如上述(21)或(22)之饋料批次培養基，其中進而添加半胱胺酸及/或酪胺酸。
(24)如上述(21)或(22)之饋料批次培養基，其中進而添加半胱胺酸及酪胺酸。
(25)一種以饋料批次培養法培養培養細胞之方法，其係添加如上述(21)~(24)中任一項之饋料批次培養基。
(26)一種該蛋白質之製造方法，其係於培養細胞並製造所期望的蛋白質之方法中，使用如上述(1)、(2)、(6) ~(20)項中任一項之方法而進行培養。
(27)一種醫藥之製造方法，其係使以如上述(5)或(26)之方法所製造之蛋白質為有效成分。
本發明係可極有利地使用於生理活性多肽或蛋白質之產生。本發明之特徵係使用不含有來自生物成分之合成培養基進行培養，而可使蛋白質之產生性增大。進而於本發明所使用之饋料批次培養基，因添加極純的胺基酸，係一種可明確得知其成份組成，且批次間的差異少之均一的培養基。藉此可獲得均一的蛋白質的可能性變高，為有利於工業產生之培養基。具體而言例如對醫藥品用抗體等大量供應有極大的貢獻。
以下針對本發明之實施方式更詳細地加以說明。
本發明之方法的特徵係於培養產生所期望之蛋白質的細胞並製造該蛋白質時，維持培養亦中之絲胺酸於高濃度而進行培養。具體而言至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的絲胺酸為1mM以上，2 mM以上更佳。
因此，含1mM以上的絲胺酸或其鹽之動物培養用培養基係本發明之一個方式。
於本發明中，「含1mM以上的絲胺酸(或其鹽)之動物培養用培養基」係不僅初始培養基之絲胺酸濃度為1mM以上之培養基，亦包含藉由添加於饋料批次培養基等至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的絲胺酸為1mM以上，2 mM以上更佳而調製之培養基。
進而於本發明之方法中，特徵為於培養液中補充高濃度之絲胺酸、酪胺酸以及/或半胱胺酸而進行培養。具體而言，至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的酪胺酸濃度為1mM以上，以及/或半胱胺酸的濃度為初始培養基之濃度以上。因初始培養基之半胱胺酸濃度一般為0.4mM，前述之半胱胺酸濃度與初始培養基中之半胱胺酸濃度無關，以至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的半胱胺酸濃度為0.4mM以上，1 mM以上更佳。
因此含有1mM以上之絲胺酸或其鹽，進而至少含有1mM以上之酪胺酸，及/或0.4mM以上之半胱胺酸之動物培養用培養基係本發明之一個方式。於本發明中，「含有1mM以上之酪胺酸之動物培養用培養基」係不僅初始培養基之酪胺酸濃度為1mM以上之培養基，亦包含藉由添加於饋料批次培養基等至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的酪胺酸為1mM以上而調製之培養基。同樣的，「含有0.4mM以上之半胱胺酸之動物培養用培養基」係不僅初始培養基之半胱胺酸濃度為0.4mM以上之培養基，亦包含藉由添加於饋料批次培養基等至少於細胞增殖期開始時期以後的一定期間內，使培養液中的半胱胺酸為0.4mM以上而調製之培養基。
藉由維持培養液中之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度而進行培養，於培養的細胞可充分增殖期間或可充分產生產生所期望的蛋白質之期間之至少一部分期間 內，使培養液中之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度維持於規定濃度以上，而可使細胞大量產生蛋白質。
如此，培養產生所期望之蛋白質的細胞時，藉由使用使絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上所調製之培養基而進行培養，製造該蛋白質之方法亦為本發明之一個面相。因此以使用上述之含有1mM以上之絲胺酸之動物培養用培養基，培養產生所期望的蛋白質之細胞，而製造該蛋白質為特徵，所期望的蛋白質之製造方法亦為本發明之一種方式。另外，使用含有1mM以上之絲胺酸或其鹽，進而至少使用含1mM以上之絲胺酸及/或0.4mM以上之半胱胺酸之動物培養用培養基，培養產生所期望的蛋白質之細胞，而製造該蛋白質為特徵，所期望的蛋白質之製造方法亦為本發明之一種方式。
本發明中，如上所述維持絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度於規定濃度以上之期間，不僅自細胞增殖期開始時期至終止時期的一部分期間，亦可於自增殖期開始時期至終止時期的全部期間，或培養期間之全部期間均加以維持。
此處「增殖期開始時期」係指培養細胞自增殖之誘導期演變為加速期之時期。其後，自加速期演變至對數增殖期、減速期、停止期、死滅期。(小林 猛、多本裕之著，「生物化學工學」，東京化學同人，應用生命科學系列8，發行年「2002年」)
本發明之其他面相中，本發明之培養法維持培養液中 絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之期間，係以維持培養的細胞可充分增殖期間或可充分產生所期望的蛋白質之期間之一部分或全部為佳，具體而言，以維持自培養細胞之增殖期開始時期至終止時期的一部分或全部期間為佳。特別係於進行培養第3天以後因初始培養基中之胺基酸含量逐漸乾涸，故相當重要的是於進行培養第3天以後之一定期間內，維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上。因此，本發明於此面相中，進而具體而言，必須維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之期間，至少為自進行培養第3天培養細胞之減速期至停止期期間之一部分或全部期間為佳，自進行培養第3天培養細胞之對數增殖期至減速期期間之一部分或全部期間更佳。
進而具體的實施方式，維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之最佳期間，係至少在細胞之增殖期開始時期(一般為培養的第1天)之4天後(一般為培養5天後)，至少於增殖期開始時期3天後(一般為培養4天後)後為佳，至少在增殖期開始時期之2天後(一般為培養3天後)後更佳，進而為於增殖期開始時期以後最佳。必須維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之期間，培養期為2週以內時，至少須至培養終止5天前為佳，4天前更佳，3天前最佳。培養期超過2週時，至少須至培養終止10 天前為佳，5天前更佳，培養終止4天前，培養終止3天前最佳。
本發明進而於其他面相中，連續維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之最佳期間，係至少於細胞之對數增殖期之一部分期間為佳。具體而言為對數增殖期開始時期之4天以後為佳，對數增殖期開始時期之3天以後為佳，對數增殖期開始時期之後更佳。此處「細胞之對數增殖期之一部分期間」係指不僅於對數增殖期之一部分期間，更可於自對數增殖期開始時期至終止時期的全部期間，或培養期間之全部期間均加以維持之意。
於典型之細胞培養中，對數增殖期開始時期一般為培養之第3天。因此，於本發明更具體的方式中，特徵為至少於培養第3天以後之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上，為2mM以上更佳。進而使酪胺酸以及/或半胱胺酸之濃度為規定之濃度以上時，至少於培養第3天以後之一部分或全部期間，使培養液中之酪胺酸濃度為1mM以上，以及/或使半胱胺酸之濃度為初始培養基之濃度以上。因初始培養基之半胱胺酸濃度一般為0.4mM，前述之半胱胺酸濃度與初始培養基中之半胱胺酸濃度無關，以至少於培養第3天以後之一部分或全部的培養期間，使培養液中的半胱胺酸濃度為0.4mM以上為佳，1 mM以上更佳。
本發明中「至少於培養第3天以後之一部分或全部的 培養期間」係可為培養第4天、第5天、第6天或第7天以後之培養期間等、反之亦可包含培養開始時，培養第1天或第2天以後為培養第3天以後之一部分或全部的培養期間之培養期間。
培養期為2週以內時，連續維持培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上之最佳期間，係至少須至培養終止5天前為佳，4天前更佳，3天前最佳。培養期超過2週時，至少須至培養終止10天前為佳，5天前更佳，培養終止4天前，培養終止3天前最佳。
因此，於本發明的方式中，特徵為至少於培養第3天~第10天以後之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸濃度為1mM以上，為2mM以上更佳。進而使酪胺酸以及/或半胱胺酸之濃度為規定之濃度以上時，至少於培養第3天~第10天以後之一部分或全部期間，使培養液中之酪胺酸濃度為1mM以上，以及/或使半胱胺酸之濃度為初始培養基之濃度以上。因初始培養基之半胱胺酸濃度一般為0.4mM，前述之半胱胺酸濃度與初始培養基中之半胱胺酸濃度無關，以至少於培養第3天~第10天以後之一部分或全部的培養期間，使培養液中的半胱胺酸濃度為0.4mM以上為佳，1 mM以上更佳。
本發明中「至少於培養第3天~第10天之一部分或全部的培養期間」係可為培養第4天、第5天、第6天或第7天以後之培養期間等、反之亦可包含培養開始時，培 養第1天或第2天以後為培養第3天~第10天之一部分或全部的培養期間之培養期間。
於前述之方式中，可為至少於培養第3天以後之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)濃度維持為規定濃度以上，假定即使培養期間較10天為短時，至少於培養第3天以後之一部分或全部期間，使培養液中的絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)濃度維持為規定濃度以上亦包含於本發明。
如此，以本發明之方法藉由培養細胞，可大量產生細胞產物之蛋白質，而藉由自培養基分離該蛋白質並將其進行純化，可製造所期望的蛋白質。
維持培養液中的絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)為規定的濃度而進行培養之方法，可為自細胞培養最初之階段預先使培養基中含有高濃度之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)，或對含有高濃度之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之培養基，於培養中追加並補給該等胺基酸的任何一種方式。
為維持培養液中的絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度為規定濃度以上，對培養液補給胺基酸之開始時期，為至少於培養液中之上述胺基酸變為規定濃度以下之3天內，1天內更佳，胺基酸變為規定濃度以下之前開始進行補給為最佳。胺基酸之補給方法係可以一次或分為斷續的數次進行補給，亦可為連續地進行補給。另外，亦可使初始培養基中含有全部於培養期間內維持規定濃度所必 須的胺基酸量。
通常細胞培養方法可分類為批次培養法(batch culture)、連續培養法(continuous culture)、饋料批次培養法(fed－batch culture)。本發明之方法中可使用任一種培養方法，但以使用饋料批次培養法或連續培養法為佳，使用饋料批次培養更佳。
批次培養法係於培養基中加入少量的種培養液，不於培養中再加入新的培養基或排出培養液，而使細胞增殖之培養方法。於本發明中使用批次培養法時，自細胞培養最初之階段，預先使培養基中含有高濃度之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)。
連續培養法係於培養中連續地加入培養基，且連續地使其排出之培養方法。另外連續培養法中亦包含滲流式培養法(perfusion culture)。
因饋料批次培養法係一種介於批次培養法與連續培養法的中間，亦稱作半批次培養法(semi－batch culture)，可於培養中連續地或逐次地加入培養基，但並不如同連續培養法一般連續地排出培養液之培養方法。進行饋料批次培養時可加入之培養基(以下稱作饋料批次培養基)，無需與已在使用之培養基(以下稱作初始培養基)相同，可添加相異之培養基，或僅添加特定的成分。
本發明中初始培養基係指於細胞培養最初階段所使用之培養基。但分複數回添加饋料批次培養基時，亦可將分別加入饋料批次培養基之前之培養基稱作初始培養基。
於本發明中使用饋料批次培養法或連續培養法時，於培養途中添加之培養基中，可使其含有高濃度之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)，亦可自細胞培養最初之階段使培養基中含有高濃度之絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)。重要的是需如上所述，至少於培養所規定的階段，使絲胺酸之濃度，或絲胺酸與酪胺酸之濃度，或絲胺酸與半胱胺酸之濃度，或絲胺酸與酪胺酸與半胱胺酸之濃度維持在規定濃度以上。其目的係在於例如適時地分析培養液中絲胺酸(及酪胺酸以及/或半胱胺酸)之濃度，再藉由於欲加入之培養基中調整該等胺基酸之濃度，而可控制培養液中該等胺基酸之濃度。或可採用例如自細胞數來判斷培養中細胞增殖的階段，而控制胺基酸之補給之方法。
其次，針對本發明特徵之培養液中成分之絲胺酸、酪胺酸以及半胱胺酸詳細地加以描述。
絲胺酸可使用單品、其衍生物、鹽類之任何一種。亦可使用天然的絲胺酸或使用合成法及基因重組法所製造之絲胺酸。存在於溶液中之濃度特徵為例如至少於培養中規定期間，於培養液中絲胺酸之濃度為1mM以上，為2mM以上更佳。因以往所使用典型之含絲胺酸之培養基係含0.5mM，本發明中絲胺酸的濃度可稱為極高的濃度(Dulbecco,R.,Freeman,G.Virology 8,p396(1959),Nature,New Bioloy(1971)230,p52)。
針對酪胺酸同樣的可使用單品、其衍生物、鹽類之任何一種。亦可使用天然的酪胺酸或使用合成法及基因重組 法所製造之酪胺酸。半胱胺酸可使用單品、其衍生物、鹽類之任何一種，亦包含為半胱胺酸之雙體之胱胺酸。可使用天然的半胱胺酸或使用合成法及基因重組法所製造之半胱胺酸。存在於溶液中之濃度特徵為例如至少於培養中規定期間，於培養液中酪胺酸之濃度為1mM以上以及/或半胱胺酸為初始培養基所含之濃度以上。
本發明中細胞培養法使用饋料批次培養法時，預先使饋料批次培養基中之高濃度絲胺酸以及酪胺酸以及/或半胱胺酸溶解，藉由於進行培養中連續地或逐回地追加饋料批次培養基，而可維持該等胺基酸之濃度為規定濃度以上。具體而言，例如可使用之饋料批次培養基以含L－絲胺酸之濃度為約10~1000mM為佳，20~500mM更佳，50~200mM最佳。另外，可使用以含L－酪胺酸濃度約0.01~1000mM為佳，1~200mM更佳，10~100mM最佳之培養基，L－半胱胺酸則可使用以含濃度約0.01~500mM為佳，0.1~50mM更佳，1~10mM最佳之培養基。
本發明中於前述之饋料批次培養基中添加培養液時，可使用以相對於初始培養基量為1~150%為佳，5~50%更佳，8~20%最佳之量，於培養期間連續地或於一定時期、或逐回地進行添加。
於本發明中，將培養液添加於前述之饋料批次培養基之期間，包含至少自培養細胞之增殖開始時期，至終止時期之一部分或全部的期間。合適的期間為至少於培養中細胞之對數增殖期開始時期(一般為培養的第3天左右)之4 天以後為佳，對數增殖期開始時期之3天以後更佳，對數增殖期開始時期(一般為培養的第3天左右)以後最佳。或者，至少於上述培養液中之胺基酸濃度變為規定濃度以下的3天以內為佳，1天以內更佳，於胺基酸濃度變為規定濃度以下之前即開始進行添加則為最佳。實行饋料批次或繼續之時期，當培養期為二週以內時，以至少於培養終止前5天為佳，4天前更佳，3天前最佳。當培養期超過二週時，以至少於進行培養的第10天為佳，培養終止前5天更佳，培養終止前4天亦佳，培養終止前3天最佳。
本發明所使用培養液中之其他成份，一般可適當地使用使用於細胞(以動物細胞為佳)之培養基之各成份，包含胺基酸、維他命類、脂質因子、能量來源、滲透壓調節劑、鐵質來源、pH緩衝劑。除前述成分之外，亦可添加例如微量金屬元素、界面活性劑、增殖輔助因子、核苷酸等。另外亦可將本發明所使用之包含具特徵的成分之培養基成分分開，分別進行添加而使用於進行細胞培養時。具體而言為例如將高濃度的絲胺酸單獨，或與培養基成分一同，或於不同的時間點使用於細胞培養。
培養液中之其他成份具體而言可舉出為例如L－丙胺酸、L－精胺酸、L－天門冬醯胺、L－天門冬胺酸、L－麩胺醯胺、L－麩醯胺酸、甘胺酸、L－組胺酸、L－異白胺酸、L－白胺酸、L－離胺酸、L－甲硫胺酸、L－苯丙胺酸、L－脯胺酸、L－丁胺酸、L－色胺酸、L－纈胺酸等，以L－丙胺酸、L－精胺酸、L－天門冬醯胺、L－天門冬胺酸、L－麩胺醯胺、L－麩醯 胺酸、甘胺酸、L－組胺酸、L－異白胺酸、L－白胺酸、L－離胺酸、L－甲硫胺酸、L－苯丙胺酸、L－脯胺酸、L－丁胺酸、L－色胺酸、L－纈胺酸等胺基酸類為佳；i－肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼酸、尼古丁酸、對胺基安息香酸、泛酸鈣、吡哆醛鹽酸鹽、吡哆醇鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫胺、維他命B12、抗壞血酸等，以生物素、葉酸、硫辛酸、菸鹼酸、泛酸鈣、吡哆醛鹽酸鹽、核黃素、鹽酸硫胺、維他命B12、抗壞血酸等維他命類為佳；氯化膽鹼、酒石酸膽鹼、亞麻油酸、油酸、膽固醇等，以氯化膽鹼等脂質因子為佳；葡萄糖、半乳醣、甘露糖、果糖等，以葡萄糖等能量來源為佳；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，以氯化鈉等滲透壓調節劑為佳；EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化亞鐵、氯化鐵、硫酸亞鐵、硫酸鐵、硝酸鐵等，以氯化鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵質來源為佳；碳酸氫鈉、氯化鈣、磷酸二氫鈉、HEPES、MOPS等，以碳酸氫鈉等pH緩衝劑為佳。
除上述之成分外，亦可添加硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化亞錫、氯化鎂、亞矽酸鈉等，以硫酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素為佳；Tween80、Pluronic F68等界面活性劑；以及重組型胰島素、重組型IGF、重組型EGF、重組型FGF、重組型PDGF、重組型TGF－α、乙醇胺鹽酸鹽、亞硒酸鈉、維生素甲酸、鹽酸四甲烯二胺等，較佳為亞硒酸鈉、乙醇胺鹽酸鹽、重組型IGF、鹽酸四甲烯二胺等增殖輔助因子；去 氧腺、去氧胞、去氧鳥糞嘌呤、腺苷、胞嘧啶、鳥糞嘧啶、尿嘧啶等核苷酸等。於上述本發明之適合例中亦可含有鏈黴素、青黴素G鉀以及見大黴素等抗生素，及酚紅等pH指示藥劑。
培養液中之其他成份的含量胺基酸為0.05－1500 mg/L、維他命類為0.001－10mg/L、脂質因子為0－200mg/L、能量來源為1－20g/L、滲透壓調節劑為0.1－10000mg/L、鐵質來源為0.1－500mg/L、pH緩衝劑為1－10000mg/L、微量金屬元素為0.00001－200mg/L、界面活性劑為0－5000mg/L、增殖輔助因子為0.05－10000μg/L以及核苷酸為0.001－50mg/L係適當的範圍，可根據培養細胞之種類、所期望的蛋白質之種類等適當地加以決定。
培養液之pH因培養之細胞而異，一般為pH6.8~7.6，大多以pH7.0~7.4為合適。
於本發明中係使用將上述成分完全溶解之合成培養基且可進行細胞培養。或可使用以往周知之動物細胞培養用培養基做為基礎培養基，再將本發明中所使用的具特徵之成分補充於其中。動物細胞培養用培養基以市售之基礎培養基為例可使用D－MEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、D－MEM/F－12 1：1 Mixture(Dulbecco's Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F－12)、RPMI 1640、CHO－S－SFM II(Invitrogen公司)、CHO－SF(Sigma－Aldrich公司)、EX－CELL 301(JRH biosciences公司)、CD－CHO(Invitrogen公司)、IS CHO－V(Irvine Scientific公 司)、PF－ACF－CHO(Sigma－Aldrich公司)等。以饋料批次培養法培養細胞時，於細胞培養最初階段所使用之初始培養基，可使用如前所述之市售的培養基。因此，可使用以高濃度調製之培養基為初始培養基，再將補充絲胺酸以及酪胺酸及/或半胱胺酸者使用為饋料批次培養基。
本發明之培養方法並無特別限定，可使用於各種細胞(例如細菌細胞、真菌細胞、昆蟲細胞、植物細胞、動物細胞等)之培養。例如可培養藉由基因工程學上的操作，將編碼所期望蛋白質之基因重組之COS細胞及CHO細胞，或產生抗體之小鼠－人類、小鼠－小鼠、小鼠－大鼠等融合瘤所代表之融合細胞。本發明之方法亦可使用於培養動物細胞以獲得該動物細胞所產生之天然型蛋白質，除前述之細胞外，亦可使用於BHK細胞、HeLa細胞等之培養。
本發明中最佳之動物細胞係經導入可編碼所期望蛋白質之基因之CHO細胞。並無特別限定所期望之蛋白質，可為天然抗體、抗體片段、低分子化抗體、嵌合抗體、人類化抗體等抗體(例如抗IL－6接受器－抗體、抗磷脂肌醇蛋白－3抗體、抗CD3抗體、抗CD20抗體、抗GP Ⅱ b/Ⅲ a抗體、抗TNF抗體、抗CD25抗體、抗EGFR抗體、抗Her2/neu抗體、抗RSV抗體、抗CD33抗體、抗CD52抗體、抗IgE抗體、抗CD11a抗體、抗VEGF抗體、抗VLA4抗體等)，及具生理活性蛋白質(白血球生長激素G－CSF)、顆粒性單核球生長激素(GM－CSF)、紅血球生 成素、干擾素、IL－1及IL－6等干擾素、t－PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等任何一種蛋白質，但以抗體為佳。
以本發明之製造方法所生產之抗體不僅為來自人類、小鼠、大鼠、倉鼠、兔子、猴子等動物之單株抗體，亦包含嵌合抗體、人類化抗體、bispecific抗體等經人為改變基因重組型之抗體。另外並無特別限定抗體的免疫球蛋白之類別，可為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等IgG、IgA、IgD、IgE、IgM等任一種類別，使用為醫藥時以IgG及IgM為佳。進而本發明之抗體不僅為whole抗體，亦包含Fv、Fab、F(ab)2 等抗體片段，及抗體可變區域與肽鍵結等鍵結結合時1價或2價以上之單鏈Fv(scFv、sc(Fv)2 等)低分子化抗體。
因培養條件依使用之細胞種類而異，可適宜地選擇合適之條件。例如使用CHO細胞時一般以氣體CO2 濃度為0－40%，2－10%更佳，以30－39℃為佳，37℃下更佳，進行培養1－50天，1－14更佳。
動物細胞培養用之各種培養裝置可使用例如發酵型槽鋼桶培養裝置、airlift型培養裝置、培養瓶型培養裝置、旋轉角瓶型培養裝置、微載體細胞型培養裝置、流動層型培養裝置、中空纖維型培養裝置、旋轉瓶型培養裝置、填充槽型培養裝置等進行培養。
藉由根據本發明之方法進行細胞(以動物細胞為佳)培養，可大量生產蛋白質。
使動物細胞產生蛋白質可適宜地選擇僅培養該種細胞，或存在有必須進行的特殊步驟之操作或條件等而培養該動物細胞。例如利用基因工程學的操作，將經轉殖含有編碼小鼠－人類嵌合抗體基因之載體之CHO細胞，藉由實施於前述條件下之培養，以培養1－50天，5－21天為佳，7－14天更佳而可於培養基中獲得所期望的蛋白質。再將其依據常用方法(例如參照抗體工學入門，地人書館，(1994)p.102－104；Affinity Chromatography Principles & Methods，GE HealthCare(股份有限)，(2003)p.56－60等)進行分離、純化，而可得所期望的蛋白質。
根據本發明可以高生產量製造重組抗體(天然抗體、抗體片段、低分子化抗體、嵌合抗體、人類化抗體、bispecific抗體等)、基因重組蛋白質(白血球生長激素(G－CSF)、顆粒性單核球生長激素(GM－CSF)、紅血球生成素、干擾素、IL－1及IL－6等干擾素、t－PA、尿激酶、血清白蛋白、血液凝固因子等)等。
將根據本發明之方法所製造之蛋白質或多肽(亦稱作本發明之蛋白質)，利用為醫藥品而具有可能的生物學上之活性時，藉由將該等蛋白質或多肽與醫藥上所容許之擔體或混合劑進行混合而製劑化，可製造為醫藥品。本發明之蛋白質以及以本發明之蛋白質為有效成分之醫藥品，亦包含於本發明之範圍。
醫藥上所容許之擔體或混合劑可舉出例如水、醫藥上所容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷 酮、羧基乙烯聚合物、羧基甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、藻酸鈉、水溶性葡萄聚糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、黃原膠、阿拉伯膠、酪蛋白、洋菜、聚乙烯醇、二甘油、甘油、丙烯二醇、凡士林、石蠟、硬酯醇、硬酯酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、醫藥添加物所容許之界面活性劑等。
實際的添加物可因應本發明之醫藥品之治療劑之劑型，自上述各物質中選擇單獨或適當的組合，但當然並不僅限於該等物質。例如，使用為注射用劑時，可將經純化之多肽溶解於溶劑，例如生理食鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等中，再加入防止吸附劑之Tween80、Tween20、明膠、人血清白蛋白等而加以使用。或為形成於使用前溶解再構成之劑型，而可為經冷凍乾燥者，冷凍乾燥之賦形劑可使用例如甘露糖醇、葡萄糖等糖醇及糖類。
多肽的有效投予量可根據多肽之種類、做為治療及預防對象之疾病之種類、疾病的嚴重程度等加以適當的選擇。例如本發明之蛋白質為抗磷脂肌醇蛋白抗體等抗體，期有效投予量可選擇一回以每1公斤體重自0.001mg至1000mg之範圍。或可選擇每位患者0.01~100000 mg/body之投予量。然而該等投予量並無限制。
本發明醫藥之投予方法經口、非經口投予之任何一種，以非經口投予為佳，具體而言可舉出注射(例如藉由靜脈內注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射等而對全身或局部進行投予)、經鼻投予、經肺投予、經皮投予等。
 實施例
以下根據參考例及實施例具體說明本發明。該等實施例等係為說明本發明用，本發明之範圍並未限定於此。
〔實施例1〕藉由含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養
(抗體基因導入CHO細胞株) 培養基組成及調製法如下所述。
初始培養基：將市售之動物細胞培養用培養基於溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入50mM之絲胺酸，1.8mM之半胱胺酸鹽一水合物，14.5mM之酪胺酸，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.5左右)，確認培養基成分完全溶解後經過濾滅菌者。
細胞：可產生人類化IgG(抗磷脂肌醇蛋白－3抗體)之CHO細胞株(參照國際公開第WO 2006/006693號冊子)。
於罐型細胞培養裝置中加入初始培養基，將上述之CHO細胞株調整為2×105 cells/mL後再加入其中，於37℃，10%CO2 之條件下開始進行培養。於培養期間14天中進行pH下限值為7.0，溶存氧氣濃度為40%之自動控 制。自培養的第3天將饋料批次培養基以一定流速(相對於1L之初始培養基為1.0g/小時)進行饋料批次培養，進行至第14天。於開始培養時以及第3、5、7、10、12、14天進行檢體取樣。針對各檢體之培養上清液，藉由使用Protein A之Affinity Chromatography，測定所產生之抗體濃度，以及使用Trypan blue染色法觀察其生存率，再藉由固定化酵素法測定乳酸。如圖1所示，使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Control)，於培養第14天之抗體濃度為1.6g/L。反之，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Ser、Cys、Tyr)，於培養第14天之抗體濃度為2.2g/L，可得高約40%之抗體濃度。圖2係顯示培養期間生存率之改變。另外如圖3所示，乳酸濃度於進行培養第3天以後，與使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時相比，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時，改變為低乳酸濃度。
〔實施例2〕藉由含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養
(導入抗體基因以及倉鼠．牛磺酸轉運蛋白基因之CHO細胞株) 培養基組成及調製法如下所述。
初始培養基：將市售之動物細胞培養用培養基於溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入50mM之絲胺酸，1.8mM之半胱胺酸鹽一水合物，14.5mM之酪胺酸，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.5左右)，確認培養基成分完全溶解後經過濾滅菌者。
細胞：經導入牛磺酸轉運蛋白基因之產生人類化IgG之CHO細胞株。
於罐型細胞培養裝置中加入初始培養基，將上述之CHO細胞株調整為2×105 cells/mL後再加入其中，於37℃，10%CO2 之條件下開始進行培養。於培養期間14天中進行pH下限值為7.0，溶存氧氣濃度為40%之自動控制。自培養的第3天將饋料批次培養基以一定流速(相對於1L之初始培養基為1.5g/小時)進行饋料批次培養，進行至第14天。於開始培養時以及第3、5、7、10、12、14天進行檢體取樣。針對各檢體之培養上清液，藉由使用Protein A之Affinity Chromatography，測定所產生之抗體濃度，以及使用Trypan blue染色法觀察其生存率，再藉由固定化酵素法測定乳酸。如圖4所示，使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Control)，於培養第14天之抗體濃度為1.3g/L。反之，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸 之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Ser、Cys、Tyr)，於培養第14天之抗體濃度為2.0g/L，可得高約54%之抗體濃度。如圖5所示，使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時，經過14天之培養於第14天之生存率為52%。反之，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時，經過14天之培養於第14天之生存率為78%，可維持高生存率。另外如圖6所示，乳酸濃度於進行培養第3天以後，與使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時相比，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時，改變為低乳酸濃度。
〔實施例3〕為確認含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸對大量產生抗體有所貢獻進行之饋料批次培養(導入抗體基因以及倉鼠．牛磺酸轉運蛋白基因之CHO細胞株)
培養基組成及調製法如下所述。
初始培養基：將市售之動物細胞培養用培養基於溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基(Ser、Cys、Tyr)：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入50mM之絲胺酸，1.8mM之半胱胺酸鹽一水合物，14.5mM之酪胺酸，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.5左右)，確認培養基成分完全 溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基(Ser、Cys)：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入50mM之絲胺酸，1.8mM之半胱胺酸鹽一水合物，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.0左右)，確認培養基成分完全溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基(Ser、Tyr)：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入50mM之絲胺酸，14.5mM之酪胺酸，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.0左右)，確認培養基成分完全溶解後經過濾滅菌者。
饋料批次培養基(Cys、Tyr)：將用於初始培養基之動物細胞培養用培養基，以相對於初始培養基3倍濃度進行溶解後，再加入1.8mM之半胱胺酸鹽一水合物，14.5mM之酪胺酸，全部培養基成分溶解後以鹽酸調整pH(至pH1.0左右)，確認培養基成分完全溶解後經過濾滅菌者。
細胞：經導入牛磺酸轉運蛋白基因之產生人類化IgG之CHO細胞株。
於罐型細胞培養裝置中加入初始培養基，將上述之CHO細胞株調整為2×105 cells/mL後再加入其中，於37℃，10%CO2 之條件下開始進行培養。於培養期間14天中進行pH下限值為7.0，溶存氧氣濃度為40%之自動控制。自培養的第3天將饋料批次培養基以一定流速(相對於1L之初始培養基為1.5g/小時)進行饋料批次培養，進 行至第14天。於開始培養時以及第3、5、7、10、12、14天進行檢體取樣。針對各檢體之培養上清液，藉由使用Protein A之Affinity Chromatography，測定所產生之抗體濃度，使用離子交換管柱藉由胺基酸分析進行絲胺酸及酪胺酸之胺基酸濃度測定。如圖7所示，使用未增量絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Control)，於培養第14天之抗體濃度為1.16g/L。反之，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Ser、Cys、Tyr)，於培養第14天之抗體濃度為1.87g/L，使用含高濃度絲胺酸、半胱胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Ser、Cys)，於培養第14天之抗體濃度為1.47g/L，使用含高濃度絲胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Ser、Tyr)，於培養第14天之抗體濃度為1.41g/L，使用含高濃度半胱胺酸、酪胺酸之低pH饋料批次培養基進行饋料批次培養時(Cys、Tyr)，可於培養第14天得抗體濃度為1.18g/L之抗體濃度測定結果。因此顯示依照高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸之順序，對大量產生抗體有所貢獻。另外亦顯示了同時將含高濃度絲胺酸、半胱胺酸、酪胺酸添加於饋料批次培養基時，可最大之對大量產生抗體之貢獻。
圖8、圖9係顯示14天之培養期間中絲胺酸及酪胺酸濃度之改變。於Control培養之第5天，絲胺酸為0.63mM，酪胺酸為0.34mM，於培養第7天以後，絲胺酸 為0.4mM以下，酪胺酸變為0.4mM以下，但使用補充絲胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時，絲胺酸為2mM以上，使用補充酪胺酸之饋料批次培養基進行饋料批次培養時，酪胺酸之濃度維持在1mM以上。
於下述之參考例，係針對於上述實施例2以及3中所使用之導入牛磺酸轉運蛋白基因之產生人類化IgG之CHO細胞株之製作加以記載。
〔參考例1〕來自CHO細胞株之倉鼠．牛磺酸轉運蛋白基因之轉殖
自於CHO DXB11細胞導入抗IL－6接受器－抗體基因之產生抗IL－6接受器－抗體細胞(特開平8－99902號公報)進行萃取total RNA後，合成依賴Poly A之cDNA。再將以Sal I、Xho I、EcoR I三種限制酶進行斷片化後之cDNA做為鑄型，藉由PCR而得倉鼠．牛磺酸轉運蛋白(Hamster TauT)基因。PCR引子係使用已知之設計成保存了於Rat/Mouse TauT間之基因序列，含有5’，3’之引子。決定經轉殖基因之鹼基序列，由與已知生物種TauT之相似性，確認編碼出Hamster TauT(圖10)。Hamster TauT胺基酸序列相似性為Mouse(96% Identity)、Rat(96% Identity)、Human(93% Identity)之高TauT相似性，預測其為具有12個膜貫穿領域之轉運蛋白質(圖11)。
〔參考例2〕製作導入倉鼠．牛磺酸轉運蛋白基因之CHO細胞株
將藉由進行參考例1之轉殖而取得之Hamster TauT(以下稱TauT)基因，加入Kozak序列中，構築CMV啟動子表現質體pHyg/TauT(圖12)。將去除pHyg/TauT或TauT基因之控制質體pHyg，以電穿孔法導入做為親株之可產生抗磷脂肌醇蛋白－3抗體之CHO細胞(參照國際公開第WO 2006/006693號冊子)。於Hygromycin(400 μ g/ml)存在下，選拔經導入表現質體之細胞後，將安定後且增殖之細胞株全部進行擴大(pHyg/TauT：8株，pHyg：7株)。調製TauT mRNA後以TaqMan法可確認對親株表現為優勢之7株為導入pHyg/TauT之細胞。導入細胞(7株)之mRNA平均表現量為控制組(7株)之約40倍。
序列表內容
<序列編號1>序列編號1係表示編碼倉鼠牛磺酸轉運蛋白基因之鹼基序列。
<序列編號2>序列編號2係表示倉鼠牛磺酸轉運蛋白之胺基酸序列。
[圖1]顯示培養期間抗體濃度之改變。(實施例1)
[圖2]顯示培養期間生存率之改變。(實施例1)
[圖3]顯示培養期間乳酸濃度之改變。(實施例1)
[圖4]顯示培養期間抗體濃度之改變。(實施例2)
[圖5]顯示培養期間生存率之改變。(實施例2)
[圖6]顯示培養期間乳酸濃度之改變。(實施例2)
[圖7]顯示培養期間抗體濃度之改變。(實施例3)
[圖8]顯示培養期間絲胺酸濃度之改變。(實施例3)
[圖9]顯示培養期間酪胺酸濃度之改變。(實施例3)
[圖10]倉鼠牛磺酸轉運體之胺基酸序列以及編碼其之基因之鹼基序列。(參考例1)
[圖11]倉鼠牛磺酸轉運體之構造。(參考例1)
[圖12]表現質體pHyg/TauT之構造。(參考例2)
<110> 中外製藥股份有限公司<120> 使用含高濃度胺基之培養基的細胞培養方法<130> C－1－1369 <150> JP 2007－117426 <151> 2007－04－26 <160> 2 <170> Patentln version 3.1 <210> 1 <211> 1869 <212> DNA <213> 中國條紋倉鼠<400> 1 <210> 2 <211> 622 <212> PRT <213> 中國條紋倉鼠<400> 2

Claims (7)

  1. 一種CHO細胞之培養方法，其特徵係於培養產生所期望之蛋白質的CHO細胞而製造該蛋白質時，係藉由饋料批次培養法培養細胞，饋料批次培養基中之絲胺酸濃度為10~1000mM，以及於培養第4~10天之全部期間，維持培養液中的絲胺酸濃度為2mM以上、酪胺酸濃度為1mM以上、以及至少於培養的第3~10天維持半胱胺酸濃度為0.4mM以上。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中將絲胺酸、酪胺酸及半胱胺酸，以逐次地複數回，或連續地饋料批次方式供給於培養液中。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中饋料批次培養基中之絲胺酸濃度為50mM~200mM。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中請料批次培養基中之酪胺酸濃度為10mM~100mM。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中細胞係已導入編碼所期望的蛋白質之基因者。
  6. 如申請專利範圍第5項之方法，其中所期望的蛋白質係抗體。
  7. 一種培養CHO細胞而製造所期望的蛋白質之方法，其特徵係於該蛋白質之製造方法中，使用如申請專利範圍第1~6項中任一項之方法而進行培養。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101574355B1 (ko) 2007-04-26 2015-12-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 고농도 아미노산 함유 배지를 사용한 세포의 배양 방법
US8252557B2 (en) 2008-10-28 2012-08-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide-containing culture medium for culturing animal cell
KR20190018041A (ko) 2009-08-06 2019-02-20 제넨테크, 인크. 단백질 정제 시의 바이러스 제거의 개선방법
US20110262965A1 (en) 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
EP3330370B1 (en) * 2010-04-26 2021-02-24 Novartis AG Process for cultivation of cho cells
US20130130317A1 (en) 2010-08-02 2013-05-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method for producing substance
EP2611904A2 (en) * 2010-08-31 2013-07-10 Friesland Brands B.V. Culture medium for eukaryotic cells
BR112014008303A2 (pt) 2011-09-16 2017-04-11 Amgen Inc alimentação contínua controlada pré-programada sem feedback de culturas celulares
KR101318498B1 (ko) * 2012-03-08 2013-10-16 한화케미칼 주식회사 재조합 단백질의 생산성 향상을 위한 배양용 배지 첨가용 조성물
US11390663B2 (en) 2013-10-11 2022-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Metabolically optimized cell culture
CN106661557B (zh) * 2014-08-11 2022-01-18 豪夫迈·罗氏有限公司 用于增加真核细胞的比生产率的方法
AU2017206012A1 (en) * 2016-01-06 2018-07-26 Outlook Therapeutics, Inc. Reduction of high molecular weight species, acidic charge species, and fragments in a monoclonal antibody composition
CN109563161A (zh) 2016-02-03 2019-04-02 安口生物公司 用于提高抗体稳定性的缓冲制剂
EP3483254B1 (en) * 2016-07-22 2021-03-10 Nissan Chemical Corporation Method and device for producing liquid culture medium composition
WO2018018613A1 (zh) * 2016-07-29 2018-02-01 广东东阳光药业有限公司 一种提高抗体纯度的细胞培养基和培养方法
EP4056678A4 (en) 2019-11-05 2023-12-06 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING A PROTEIN
CN113337562B (zh) * 2021-05-24 2022-06-03 宁波人健药业集团股份有限公司 使用CHO细胞高效发酵生产rhCG的方法
ES2944758B2 (es) * 2021-12-23 2023-11-14 Stirmot S L Rastrillo hilerador

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0481791A2 (en) * 1990-10-17 1992-04-22 The Wellcome Foundation Limited Culture medium for CHO-cells and adapted CHO-cells
US6103529A (en) * 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
US6900056B2 (en) * 2001-02-15 2005-05-31 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
WO2006108455A1 (en) * 2004-11-02 2006-10-19 Ares Trading S.A. Serum-free cell culture medium for mammalian cells

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3734632A1 (de) * 1987-10-13 1989-04-27 Thomae Gmbh Dr K Verfahren zur herstellung von t-pa
ES2064336T3 (es) * 1987-10-13 1995-02-01 Thomae Gmbh Dr K Procedimiento para la preparacion de proteinas.
US6048728A (en) * 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
DE68925971T2 (de) * 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
FR2657783B1 (fr) * 1990-02-07 1992-05-29 Fondation Nale Transfusion San Procede de preparation de derives sanguins et derives obtenus par ce procede.
GB2251249B (en) 1990-12-28 1995-06-21 Mogam Biotech Res Inst High-density medium for animal cell culture
DE4115722A1 (de) 1991-05-14 1992-11-19 Boehringer Mannheim Gmbh Serumfreies medium zur kultivierung von saeugerzellen
US5641678A (en) * 1994-01-18 1997-06-24 Smithkline Beecham Corporation Serum-free culture medium for drosphila insect cells
JP3630453B2 (ja) 1994-09-30 2005-03-16 中外製薬株式会社 Ｉｌ−６レセプター抗体を有効成分とする未熟型骨髄腫細胞治療剤
US20020012991A1 (en) 1997-04-07 2002-01-31 Florence Chua Nee Ho Kit Fong Cell culture media for enhanced protein production
AU7950400A (en) 1999-10-19 2001-04-30 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Process for producing polypeptide
DE10011998A1 (de) * 2000-03-11 2001-09-20 Forschungszentrum Juelich Gmbh Wirkstoffkombination sowie Verfahren zur Kultivierung von Zellen und Verfahren zur Herstellung der Wirkstoffkombination
ES2336647T3 (es) * 2000-10-20 2010-04-15 Bioneer A/S Metodo de fermentacion para la produccion de productos genicos heterologos en bacterias de acido lactico.
US20030087372A1 (en) 2001-06-13 2003-05-08 Genentech, Inc. Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells
CN100383238C (zh) 2003-05-09 2008-04-23 克鲁塞尔荷兰公司 E1-永生化的细胞培养物及培养所述细胞以提高从中获取的产物产量的方法
US6933137B2 (en) * 2003-05-16 2005-08-23 Aventis Pasteur Animal component free meningococcal polysaccharide fermentation and seedbank development
CN111925445A (zh) 2004-07-09 2020-11-13 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体
TWI374935B (en) * 2004-08-27 2012-10-21 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Production of α-abeta
US7300773B2 (en) 2004-08-27 2007-11-27 Wyeth Research Ireland Limited Production of TNFR-Ig
TWI384069B (zh) 2004-08-27 2013-02-01 Pfizer Ireland Pharmaceuticals 多胜肽之製法
AU2005302516A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-11 Centocor, Inc. Chemically defined media compositions
JP4710008B2 (ja) * 2005-04-20 2011-06-29 国立大学法人東北大学 高代謝能を有する培養筋細胞の作製方法
CN1778903A (zh) * 2005-09-29 2006-05-31 华东理工大学 一种动物细胞高密度连续灌注培养方法
AU2007239679B2 (en) * 2006-04-13 2012-10-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Taurine transporter gene
CN100569940C (zh) 2006-08-16 2009-12-16 华东理工大学 人胚胎肾(hek)293细胞无血清培养基
KR20090074040A (ko) * 2006-09-13 2009-07-03 아보트 러보러터리즈 세포 배양의 개선
ES2538986T3 (es) 2006-11-08 2015-06-25 Wyeth Llc Medios diseñados racionalmente para un cultivo celular
KR101574355B1 (ko) 2007-04-26 2015-12-11 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 고농도 아미노산 함유 배지를 사용한 세포의 배양 방법
US8252557B2 (en) * 2008-10-28 2012-08-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Peptide-containing culture medium for culturing animal cell

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0481791A2 (en) * 1990-10-17 1992-04-22 The Wellcome Foundation Limited Culture medium for CHO-cells and adapted CHO-cells
US6103529A (en) * 1996-10-10 2000-08-15 Life Technologies, Inc. Animal cell culture media comprising peptides derived from rice
US6900056B2 (en) * 2001-02-15 2005-05-31 Centocor, Inc. Chemically defined medium for cultured mammalian cells
WO2006108455A1 (en) * 2004-11-02 2006-10-19 Ares Trading S.A. Serum-free cell culture medium for mammalian cells

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