CN106661557B - 用于增加真核细胞的比生产率的方法 - Google Patents

用于增加真核细胞的比生产率的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106661557B
CN106661557B CN201580042225.6A CN201580042225A CN106661557B CN 106661557 B CN106661557 B CN 106661557B CN 201580042225 A CN201580042225 A CN 201580042225A CN 106661557 B CN106661557 B CN 106661557B
Authority
CN
China
Prior art keywords
meta
tyr
tyrosine
cell
cho
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580042225.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106661557A (zh
Inventor
O·波普
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=51298668&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN106661557(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN106661557A publication Critical patent/CN106661557A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106661557B publication Critical patent/CN106661557B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
    • C12N5/0025—Culture media for plant cell or plant tissue culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/32—Amino acids
    • C12N2500/33—Amino acids other than alpha-amino carboxylic acids, e.g. beta-amino acids, taurine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明报告了间‑酪氨酸用于增加产生/表达多肽的真核细胞的比生产率的用途。在本发明方法中，不需要进行温度变换、重量摩尔渗透压浓度变换或pH变换或添加药物如丙戊酸或丁酸钠来调节所培养细胞的比生产率。该方法不影响细胞成活力或产物滴度。

Description

用于增加真核细胞的比生产率的方法
本发明属于多肽生产和细胞培养基领域。本文中报导了细胞培养基中间-酪氨酸用于增加比生产率(specific productivity；qP)的用途、在包含间-酪氨酸的细胞培养基中产生多肽的方法和包含间-酪氨酸的细胞培养基。
发明背景
细胞培养物用于发酵过程中以产生多种物质、特别是产生蛋白质。对细胞培养物在遗传上未修饰并且形成自身代谢产物的方法和其中生物以这种方式经遗传修饰，从而它们产生较大数量的自身物质如蛋白质或产生外来(异源)物质的方法之间进行了区分。向产生多种物质的生物供应营养培养基，所述营养培养基保障生物存活并且使得能够产生所需的目标化合物。已知使得能够最佳培养特定宿主的众多培养基用于这些目的。
认为蛋白质生物治疗药(如单克隆抗体)是充分确立的治疗严重疾病和病症如癌症、多发性硬化症和类风湿性关节炎的药物(参见来自Leader等人的综述(Leader等人,2008))。不得不密切监测这些高活性化合物的关键分子质量属性以确保患者的安全性和功能有效性。在始自微生物和细胞培养物合成的整个生产过程期间、在蛋白质纯化、配制和储存期间能发生对目标蛋白的非预期化学修饰。对蛋白质药物最常观察到的化学降解途径是天冬酰胺脱酰胺化、天冬氨酸异构化(Wakankar和Borchardt,2006；Diepold等人,2012；Dengl等人2013)和氧化(Li等人,1995；Ji等人,2009；Hensel等人,2011)。最近，几项研究报告了一种额外的相关的酶生成的副产物，重组合成的生物治疗药的所谓蛋白质SV(Khetan等人,2010；Wen等人,2009；Feeney等人,2013)。SV是在遗传预计的位置处非预期的氨基酸替换，所述氨基酸替换源自内在的核苷酸突变(Bridges,2001)或翻译期间替代性氨基酸错误并入(Zeck等人,2012)。认为由内生底物限制过程中氨酰基-tRNA合成酶(aaRS)对结构相关的氨基酸的混乱引起了翻译的错误并入(Feeney等人,2013；Jakubowski,2001)。Gurer-Urhan等人(2006)报道了游离间-酪氨酸错误并入细胞蛋白作为氧化型氨基酸的潜在细胞毒机制。
发明概述
已经发现用间-酪氨酸补充培养基为产生(非内源)多肽的真核(宿主)细胞提供增加的比生产率(qP)。已经发现向真核细胞培养物添加间-酪氨酸不导致细胞成活力或终产物滴度显著降低。这种培养物中的细胞生长以不利方式减少/受影响(由减少的活细胞密度(VCD)和总体生物量产生(如CTI所指示)代表)。在本发明方法中，不需要进行温度变换、重量摩尔渗透压浓度变换或pH变换以增加所培养细胞的比生产率。也不需要通过添加药物如丙戊酸或丁酸钠调节比生产率。通过额外输入非限制性浓度的苯丙氨酸控制mRNA翻译期间在间-酪氨酸存在下替代性氨基酸错误并入所致的氨基酸序列变体(SV)的出现。
如本文中报道的一个方面是间-酪氨酸用于增加产生/表达/分泌(非内源/外源)多肽的真核宿主细胞的比生产率的用途。
在这个方面的一个实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。在这个方面的一个实施方案中，真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这个方面的一个实施方案中，CHO细胞是正在悬浮生长的CHO细胞/细胞系(＝CHO悬浮细胞/细胞系)。在这个方面的一个实施方案中，CHO细胞是CHO-K1细胞。
在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.2mM至0.7mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.25mM至0.6mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.5mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.4mM的(终)浓度。
在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产方法相比，比生产率增加了至少5％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少10％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少20％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少25％。
在这个方面的一个实施方案中，在无蛋白质的培养基中进行使用。在这个方面的一个实施方案中，在化学定义的培养基中进行使用。在这个方面的一个实施方案中，在无蛋白质的化学定义的培养基中进行使用。
在这个方面的一个实施方案中，在以非限制性浓度额外包含苯丙氨酸的培养基中进行使用。在这个方面的一个实施方案中，在以非限制性浓度额外包含苯丙氨酸的培养基中进行使用，其中通过连续输入或通过发酵过程开始时或期间一次或多次独立推注(bolusshots)Phe母液，添加苯丙氨酸。
在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。这意味着5％或更少的间-酪氨酸残基相对于正确并入的苯丙氨酸残基错误并入蛋白质序列中。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.25。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.125。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.125并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.025。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.025并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。
在这个方面的一个实施方案中，在恒定温度进行使用。
在这个方面的一个实施方案中，在使用过程中以降低的温度进行使用。
在这个方面的一个实施方案中，是在恒定的pH进行使用。
在这个方面的一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人源化抗体。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人源化单克隆抗体。
如本文中报道的一个方面是一种在表达编码多肽的核酸的真核宿主细胞中产生多肽的方法，所述方法包括在包含间-酪氨酸的培养基中培养真核宿主细胞。
在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.2mM至0.7mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.25mM至0.6mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.5mM的(终)浓度。在这个方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.4mM的(终)浓度。
在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少5％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少10％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少20％。在这个方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少25％。
在这个方面的一个实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。在这个方面的一个实施方案中，真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在这个方面的一个实施方案中，CHO细胞是CHO悬浮细胞/以悬浮方式生长的CHO细胞。在这个方面的一个实施方案中，CHO细胞是CHO-K1细胞。
在这个方面的一个实施方案中，在无蛋白质的培养基中进行所述方法。在这个方面的一个实施方案中，在化学定义的培养基中进行所述方法。在这个方面的一个实施方案中，在无蛋白质的化学定义的培养基中进行所述方法。
在这个方面的一个实施方案中，在以非限制性浓度额外包含苯丙氨酸的培养基中进行所述方法。在这个方面的一个实施方案中，在以非限制性浓度额外包含苯丙氨酸的培养基中进行所述方法，其中通过连续输入或通过发酵过程开始时或期间一次或多次独立推注Phe母液，添加苯丙氨酸。
在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。这意味着5％或更少的间-酪氨酸残基相对于正确并入的苯丙氨酸残基错误并入蛋白质序列中。
在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.25。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。
在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.125。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.125并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。
在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.025。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.025并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。
在这个方面的一个实施方案中，在恒定温度进行所述方法。在这个方面的一个实施方案中，在使用过程中以降低的温度进行所述方法。
在这个方面的一个实施方案中，在恒定的pH进行所述方法。
在这个方面的一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人免疫球蛋白或人源化免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人源化抗体。在这个方面的一个实施方案中，多肽是人源化单克隆抗体。
如本文中报道的一个方面是以低于或等于1.25的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基。如本文中报道的一个方面是以低于或等于1.25的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。这意味着5％或更少的间-酪氨酸残基相对于正确并入的苯丙氨酸残基错误并入蛋白质序列中。
如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.25的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基。如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.25的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。
如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.125的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基。如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.125的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。
如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.025的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基。如本文中报道的一个方面是以低于或等于0.025的摩尔比包含间-酪氨酸和苯丙氨酸的培养基并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。
在这个方面的一个实施方案中，培养基是无蛋白质的培养基。在这个方面的一个实施方案中，培养基是化学定义的培养基。在这个方面的一个实施方案中，培养基是无蛋白质的化学定义的培养基。
发明的详细描述
认为调节真核细胞的比生产率(qP)是解决产品质量属性(如蛋白质N-糖基化微观不均一性、电荷变体、蛋白质聚集物和片段特征)改变的有力工具。例如，假定中等qP支持翻译后N-糖基化，原因是目标蛋白可以在聚糖形成区室即内质网(ER)和高尔基体具有较长停留时间(Hossler等人,2009)。
目前，生物技术实践中通过药物如组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂丙戊酸和丁酸钠(Lee等人,2009；Murray-Beaulieu等人,2009)或通过化学-物理参数如温度变换(Hendrick等人,2001)、pH变换(Yoon等人,2005)和增加重量摩尔渗透压浓度(Han等人,2009)，实现对qP的调节。这些方案具有明显缺点。HDAC抑制剂在一方面严重降低细胞成活力并诱导凋亡，这可能造成次生问题如目标蛋白片段化和在蛋白质纯化期间宿主细胞蛋白和DNA清除不良。在另一方面，化学-物理参数难以在GMP设施中控制并且经常因容器限制和不同传质(mass transfer)而在不同生物反应器的变换动力学方面变动。本文中报道了向生物技术工艺特别补充间-酪氨酸是一个在不影响细胞成活力和不需要化学物理调节情况下增加真核细胞qP、尤其CHO细胞qP的有前景的现有工艺替代项。
但是，Gurer-Orhan等人,(2006)已经报道，某些水平的间-酪氨酸浓度在贴壁生长的CHO细胞中诱导细胞毒效应。
如本文中报道的本发明至少部分地基于以下观察结果：用间-酪氨酸补充培养基导致产生外源多肽的真核悬浮细胞、尤其CHO悬浮细胞的比生产率(qP)增加。
与Gurer-Orhan等人的观察结果相反，添加间-酪氨酸不导致细胞毒效应(即细胞成活力和终产物滴度未受显著影响，不过细胞生长以不利方式受到影响，如可以依据降低的活细胞密度(VCD)和总生物量产生(如CTI所指示)见到(参见图1至图5)。
因此，如本文中报道的一个方面是间-酪氨酸增加产生多肽的真核宿主细胞的比生产率的用途。
如本文中报道的一个方面是一种在表达编码多肽的核酸的真核宿主细胞中产生多肽的方法，所述方法包括在包含间-酪氨酸的培养基中培养真核宿主细胞。
在全部方面的一个实施方案中，真核宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞选自以下哺乳动物细胞，包括CHO细胞(例如CHO-K1或CHO DG44)、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、PER.C6细胞和COS细胞。在全部方面的一个实施方案中，哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在全部方面的一个实施方案中，CHO细胞是CHO悬浮细胞。在全部方面的一个实施方案中，CHO细胞是CHO-K1细胞。
已经发现可以在添加至培养基的间-酪氨酸的某个浓度范围实现比生产率的增加。
在全部方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.2mM至0.7mM的浓度。在全部方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.25mM至0.6mM的浓度。在全部方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.5mM的浓度。在全部方面的一个实施方案中，添加间-酪氨酸以产生0.3mM至0.4mM的浓度。
在全部方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少5％。在全部方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少10％。在全部方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少20％。在全部方面的一个实施方案中，与不补充间-酪氨酸的相同生产过程相比，比生产率增加了至少25％。
已经发现为了实现增加的比生产率，不需要进行温度变换、重量摩尔渗透压浓度变换或pH变换，并且也不需要添加药物如丙戊酸或丁酸钠调节比生产率，如本领域中报道。然而，本领域技术人员理解，也可以额外地在如本文报道的方法中进行/包括对培养过程的这些调整。
在全部方面的一个实施方案中，在恒定温度进行所述使用或方法。在全部方面的一个实施方案中，在使用过程中以降低的温度进行所述使用或方法。
在全部方面的一个实施方案中，在恒定的pH进行所述使用或方法。
通过额外输入非限制性浓度的苯丙氨酸控制因翻译期间添加间-酪氨酸至培养基时可能出现的替代性氨基酸错误并入所致的可能氨基酸序列变体(SV)。
在表1中，显示示踪肽的Phe→xTyr(x意指间-Tyr和/或邻-Tyr)序列变体形成数量/频率/分数(在第14天补充0.1mM、0.3mM和0.4mM邻-Tyr和间-Tyr时Phe→xTyr错误并入的最大水平)。
从补充实验的上清液间-Tyr、邻-Tyr和L-Phe以及相应Phe→xTyr错误并入的数据，可以计算出间-Tyr/Phe和邻-Tyr/Phe的阈值比率，所述比率导致99.9％、99.5％、99.0％和95.0％的所产生序列最终精确度(指邻-Tyr和间-Tyr错误并入)。
表1
Figure BDA0001220689730000091
已经发现，培养基中调节的间Tyr/Phe最大阈值比率1.25、0.25、0.125或0.025可以在产生的多肽中控制/避免不想要的SV(分别具有95.0％、99.0％、99.5％或99.9％序列精确度)，同时比生产率增加。无论是否进行额外的Phe补充，比生产率仍增加(参见图8)。
在全部方面的一个实施方案中，培养基以非限制性浓度额外包含苯丙氨酸。
在全部方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25。在全部方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于95.0％。
在全部方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.25。在全部方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.0％。
在全部方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.125。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.5％。
在全部方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于0.025。在这个方面的一个实施方案中，相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。在这个方面的一个实施方案中，间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25并且相对于Phe→m-Tyr错误并入的蛋白质序列最终精确度高于或等于99.9％。
定义
如本文所用的“生物量”指培养基中培养的细胞的量或重量。可以通过确定活细胞密度、总细胞密度、(相对于活细胞密度和总细胞密度的)细胞时间积分、(相对于活细胞密度和总细胞密度的)细胞体积时间积分、细胞压积、干重或湿重直接或间接地测量生物量。
如本文所用的“生物反应器”指用于哺乳动物细胞培养物生长的任何容器。一般地，生物反应器将至少是1升并且可以是10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、12000升或更大或它们之间的任何体积。生物反应器的内部条件包括但不限于pH、溶解氧和温度，一般在培养时间期间控制。生物反应器可以包括适于容纳在本发明的培养条件下悬浮于培养基中的哺乳动物细胞培养物任何材料，所述材料包括玻璃、塑料或金属。
如本文所用的“细胞密度”指在给定培养基体积中存在的细胞数目。
“细胞成活力”指相对于特定时间处培养物中活和死细胞总数而言在该时间活着的细胞的部分。
术语“细胞培养物”指在转瓶、烧瓶、玻璃或不锈钢培养容器等中以悬浮或贴壁方式生长的细胞。术语“细胞培养物”还涵盖大规模方案，如生物反应器。本发明涵盖用于大规模和小规模产生多肽的细胞培养方法。可以使用和备选地以分批、分瓶分批(split-batch)、补料分批或灌流模式运行多种方法，所述方法包括但不限于流化床生物反应器、摇瓶培养或搅拌罐生物反应器系统。
如本发明内部可互换使用的术语“细胞培养基”、“培养用培养基”或“培养基”指用于生长哺乳动物细胞的营养液。这种营养液通常包括对于生长和维持细胞环境必需的多种因子。例如，常见的营养液可以包括基础培养基制剂、取决于培养类型和偶而取决于选择剂的多种补充物。一般地，这类溶液提供细胞最低生长和/或存活所需要的必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、能量源、脂质和痕量元素。这种溶液还可以含有增强生长和/或存活高于最低速率的补充性组分，包括但不限于激素和/或其他生长因子、特定离子如钠、氯、钙、镁和磷酸盐、缓冲组分、维生素、核苷或核苷酸、痕量元素、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其他能量源。培养基有利地配制为对细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。培养基可以是无蛋白质的培养基，即这种培养基将不含全长蛋白质，而将含有未限定的肽，例如来自植物水解物的肽。培养基可以包含人血清白蛋白和人转铁蛋白，但潜在地包含动物衍生的胰岛素和脂质，或含有人血清白蛋白、人转铁蛋白、人胰岛素和化学限定脂质的无外来物培养基(xeno-free medium)。备选地，培养基可以是化学成分确知的培养基，即其中全部物质均确定并且以确定浓度存在的培养基。这些培养基可以仅含有重组蛋白和/或激素或无蛋白质的化学成分确知培养基，即如果需要，仅含有低分子量组分和合成肽/激素。化学成分确知的培养基还可能完全不含任何蛋白质。
术语“细胞”或“宿主细胞”指可以向其中引入/转染核酸(例如编码异源多肽的核酸)的细胞。宿主细胞包括用于增殖载体/质粒的原核细胞和用于表达核酸的真核细胞。在一个实施方案中，真核细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物宿主细胞选自以下哺乳动物细胞，包括CHO细胞(例如CHO-K1或CHO DG44)、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、HEK 293细胞、HEK 293EBNA细胞、PER.C6细胞和COS细胞。为了宿主细胞发酵并且因此为了表达目的多肽，使用培养基。通常，CHO细胞广泛用于以小规模在实验室中或以大规模在生产过程中表达药物多肽。归因于其广泛分布和使用，CHO细胞的特征性属性和遗传背景是熟知的。因此，CHO细胞由监管当局批准用来生产用于人类的治疗性蛋白。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO悬浮细胞系/以悬浮方式生长的CHO细胞系。
本发明的方法适用于以大规模即产业方式生产分泌型异源多肽。
用来以大规模生产所需多肽的细胞的培养通常由一系列独立培养组成，其中除最终培养(即大规模培养，即这个系列中的最后一个培养)之外的全部培养均进行直至培养容器中达到某个细胞密度。如果预定的细胞密度达到，则整个培养物或其级分用来接种下一个培养容器，所述培养物具有更大的体积，其体积至多100倍于先前的培养物。以更大体积充当至少一个进一步培养之基础的全部培养称作“种子发酵”或“种子培养”。仅在大规模培养中，即在不意在以更大体积充当进一步培养之基础的培养(又称作“主要发酵”)中才有根据培养基或培养时间中产生的分泌型异源免疫球蛋白的浓度所确定的培养终点。如本申请中使用的术语“大规模”指工业生产过程的最终培养。在一个实施方案中，大规模培养以至少100升体积、在另一个实施方案中以至少500升、在又一个实施方案中以至少1000升体积直至25,000升体积进行。在一个实施方案中，最终(即大规模)培养基不含真核选择剂。
如本文所用的“分瓶(splitting)”又称作细胞的传代或继代培养。这包括将小数目的细胞转移入新鲜的培养基，从而分瓶的细胞接种所述新的培养物。在悬浮培养物中，含有一些细胞的少量培养物稀释于更大体积的新鲜培养基中。
如本文所用的“滴度”指由给定量的培养基体积中哺乳动物细胞培养物产生的重组表达的多肽总量。滴度一般以如下单位表述：毫克多肽/毫升培养基。
“基因”指作为例如染色体上或质粒上可以实现肽、多肽或蛋白质表达的区段的核酸。在编码区(即结构基因)旁边，基因包含其他功能性元件，例如信号序列、启动子、内含子和/或终止子。
“结构基因”指无信号序列的基因区域，即编码区。
如本文所用，术语“表达”指细胞内部出现的转录和/或翻译。宿主细胞中目的产物的转录水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量确定。例如，从选定核酸转录的mRNA可以通过PCR或通过RNA印迹杂交定量(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))。由选定核酸编码的蛋白质可以通过多种方法定量，例如通过ELISA、通过测定该蛋白质的生物学活性或通过使用识别并结合于该蛋白质的抗体，采用与这类活性无关的测定法(如蛋白质印迹法或放射免疫测定法)定量(参见Sambrook等人，1989，上文)。
术语“多肽”是由肽键接合的氨基酸残基组成的聚合物，无论是否为天然或合成地产生。少于约20个氨基酸残基的多肽可以作“肽”。包含两条或更多条氨基酸链或包含长度为100个氨基酸或更大的氨基酸链的多肽可以称作“蛋白质”。多肽或蛋白质还可以包含非肽组分，如糖基团或金属离子。糖和其他非肽取代基可以由产生该蛋白质的细胞添加至该蛋白质，并且可以随细胞的类型变动。蛋白质和多肽在本文中根据它们的氨基酸主链结构定义；附加物如糖基团通常不指明，然而可以存在。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，多肽是免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链或片段、其融合物或缀合物。“外源”或“非内源”多肽是不源自所用宿主细胞内部的多肽。
如本文所用的术语“核酸”是由独立核苷酸组成的聚合物，即多核苷酸。它指天然存在的核酸或部分或完全非天然存在的核酸，所述核酸例如编码可以重组产生的多肽。核酸可以由分离的或通过化学手段合成的DNA片段构成。核酸可以整合至另一个核酸中，例如整合在宿主细胞的表达质粒或基因组/染色体中。质粒包括穿梭载体和表达载体。一般地，质粒也将包含原核增殖单元，其包含分别用于细菌中复制和选择载体的复制起点(例如ColE1复制起点)和选择标记(例如氨苄青霉素或四环素抗性基因)。
术语“免疫球蛋白”指包含至少两个所谓轻链多肽(轻链)和两个所谓重链多肽(重链)的分子。每个重链多肽和轻链多肽包含可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基端部分)，所述可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。每个重链多肽和轻链多肽还包含恒定区(通常是羧基端部分)。重链的恒定区介导免疫球蛋白i)与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(如吞噬细胞)或ii)与携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称作Brambell受体)的细胞结合。它还介导与某些因子的结合，包括经典补体系统的因子如组分C1q。
术语“免疫球蛋白”在本文中以最广意义使用并且涵盖多种免疫球蛋白结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和免疫球蛋白片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
取决于重链恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白划分为不同类别：IgA类、IgD类、IgE类、IgG类和IgM类。这些类别中的某些类别进一步划分成亚类(同种型)，即IgG的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，或IgA的IgA1和IgA2。根据免疫球蛋白所属的类别，重链恒定区分别称作α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG类免疫球蛋白。在另一个实施方案中，免疫球蛋白具有人恒定区或衍生自人源的恒定区。在又一个实施方案中，免疫球蛋白属于IgG4亚类或IgG1、IgG2或IgG3亚类，所述抗体以这样的方式受到修饰，从而不能检测到Fcγ受体(例如FcγRIIIa)结合作用和/或C1q结合作用。在一个实施方案中，免疫球蛋白是人IgG4亚类或突变的人IgG1亚类。在一个实施方案中，免疫球蛋白是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。在另一个实施方案中，就Fcγ受体结合作用而言，免疫球蛋白是IgG4亚类或IgG1或IgG2亚类，在L234、L235、和/或D265中具有突变，和/或含有PVA236突变。在又一个实施方案中，免疫球蛋白具有选自S228P、L234A、L235A、L235E、SPLE(S228P和L235E)和/或PVA236的突变(PVA236意指从IgG1的氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG(按单字母氨基酸代码给出)或IgG4的EFLG由PVA替换)。在一个实施方案中，免疫球蛋白是IgG4亚类并且具有IgG4的突变S228P，或免疫球蛋白是IgG1亚类并且具有突变L234A和L235A。
免疫球蛋白的轻链或重链的可变结构域转而包含不同区段，即4个构架区(FR)和3个高变区(CDR)。
“免疫球蛋白片段”指包含结构域群组的至少一个结构域的多肽，所述结构域群组包括免疫球蛋白重链的可变结构域、CH1结构域、铰链区、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域或免疫球蛋白轻链的可变结构域或CL结构域。还包括其衍生物及变体。额外地，可以存在可变结构域，其中缺失一个或多个氨基酸或氨基酸区域。
“免疫球蛋白缀合物”指借助肽键与其他多肽缀合的包含免疫球蛋白重链或轻链至少一个结构域的多肽。其他多肽是非免疫球蛋白肽，如激素、生长受体、抗融合肽(antifusogenic peptide)等。
如本文所用，“Phe非限制性”或“Phe非限制”浓度意指苯丙氨酸以过多的量输入，即始于第6日直至第14日每天用例如0.6mM Phe补充培养物。在不额外输入的情况下，截至第10或第11日，Phe通常将是限制性的(“Phe限制”)。可以通过连续输入或备选地通过发酵过程开始时或期间一次或多次独立推注Phe母液，添加苯丙氨酸补充物。
术语“增加的比生产率(specific productivity)”意指在本文所述的条件下，相应宿主细胞的比生产率相对于不补充间-酪氨酸的相同生产过程更高。作为细胞每日生产能力(产生的多肽/蛋白质的量，例如以皮克计)的测量，比生产率(qP)如实施例中所反映的那样计算。
附图简述
图1间-Tyr调节Phe限制条件下的CHO生物量生成。(A)补料分批法，使用两种系列连续进料：进料1和进料2。在过程开始时，对CHO补料分批培养不补充(对照)、补充0.1mM、0.3mM或0.4mM对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr。作为CHO细胞生物量生成的测量，显示了对-Tyr(B)、邻-Tyr(C)和间-Tyr(D)补充的细胞时间积分(CTI)。
图2在Phe限制条件下间-Tyr和邻-Tyr在CHO细胞生长调节中的不同作用。显示对-Tyr(A)、邻-Tyr(B)和间-Tyr(C)补充的活细胞密度。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
图3在CHO补料分批培养中补充间-Tyr和邻-Tyr不改变Phe限制条件下的产物产率。显示对-Tyr(A)、邻-Tyr(B)和间-Tyr(C)补充的产物浓度。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
图4在Phe限制条件下间-Tyr补充增加细胞特异性产物形成率qP。显示对-Tyr(A)、邻-Tyr(B)和间-Tyr(C)补充的细胞特异性产物形成率qP。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
图5间-Tyr和邻-Tyr对Phe限制条件下CHO细胞成活力的不同作用。显示对-Tyr(A、D)、邻-Tyr(B、E)和间-Tyr(C、F)补充的细胞成活力和上清液LDH活性。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
图6间-Tyr调节Phe非限制条件下的CHO生物量生成。(A)补料分批法使用两种系列连续进料：进料1和高Phe浓度的进料2。在过程开始时，对CHO补料分批培养不补充(对照)、补充0.1mM、0.3mM或0.4mM对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr。作为CHO细胞生物量生成的测量，显示对-Tyr(B)，邻-Tyr(C)和间-Tyr(D)补充的细胞时间积分(CTI)。
图7在CHO补料分批培养中补充间-Tyr和邻-Tyr不改变Phe非限制条件下的产物产率。显示对-Tyr(A)、邻-Tyr(B)和间-Tyr(C)补充的产物浓度。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
图8在Phe非限制条件下间-Tyr补充增加细胞特异性产物形成率qP。显示对-Tyr(A)、邻-Tyr(B)和间-Tyr(C)的细胞特异性产物形成率qP。显示不补充对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr的补料分批培养作为对照。
提供以下实施例和附图以辅助理解本发明，本发明的真实范围在所附权利要求书中阐述。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。
试剂和材料
从Sigma-Aldrich(慕尼黑，德国)获得DL-邻-酪氨酸(2-羟基-DL-苯丙氨酸)、DL-间-酪氨酸(3-羟基-DL-苯丙氨酸)、L-对-酪氨酸、L-苯丙氨酸和盐酸胍。L-邻-酪氨酸(2-羟基-L-苯丙氨酸)和L-间-酪氨酸(3-羟基-L-苯丙氨酸)购自RSP Amino Acids,LLC(Shirley,MA,USA)。全部其他试剂均购自Merck(达姆施塔特，德国)和Sigma-Aldrich(慕尼黑，德国)。
细胞和细胞培养
对于全部细胞培物实验，使用表达人源化单克隆抗体的重组CHO-K1细胞系，称作克隆1。使用L-蛋氨酸亚砜亚胺(L-methionine sulfoximine)敏感性CHO-K1宿主细胞系(Lonza，Cologne，德国)生成重组CHO-K1细胞系。在种子系列培养期间，将细胞在补充有50μM L-蛋氨酸亚砜亚胺(Sigma Aldrich，慕尼黑，德国)的无蛋白质、化学成分确知的CD-CHO培养基(Life Technologies，达姆施塔特，德国)中培育。使用增湿培养箱，7％CO2和37℃环境在摇瓶中进行种子系列培养。每3天至4天将细胞分瓶以继代培养和扩充培养物。对于全部实验，使用直至实验开始时培养物中年龄相同(大约21代)的细胞。
间-Tyr和邻-Tyr补充实验
全部补充实验均使用摇瓶培养系统、无选择压力L-蛋氨酸亚砜亚胺的化学成分确知CD-CHO培养基和两个适宜的系列连续施加的进料(进料1和进料2)进行。将产生人源化单克隆抗体的重组CHO-K1细胞用3×105个活细胞/mL接种并且培养14天。接种前，用0.1mM、0.3mM或0.4mM邻-Tyr、间-Tyr或对-Tyr无菌补充CD-CHO基础培养基。使用未补充邻-Tyr、间-Tyr或对-Tyr的对照培养作为参照。通过增加进料2中的Phe浓度，实现苯丙氨酸(Phe)非限制条件。
活细胞密度、成活力和细胞时间积分(Cell Time Integral)
为了分析活细胞密度和总细胞密度，使用自动化Cedex HiRes系统(RocheDiagnostics，曼海姆，德国)。使用台盼蓝拒染法并且根据制造商的说明书分析每份样品和每天超过10张照片，评价活细胞密度和总细胞密度的区别。活细胞密度(VCD)和细胞成活力分别如等式1(Equ1)和等式2(Equ2)中所述那样计算。
(Equ1) 活细胞密度＝N台盼蓝阴性×(105个活细胞/ml)
(Equ2) 细胞成活力＝N台盼蓝阴性/(N台盼蓝阴性+N台盼蓝阳性细胞)×100％
作为过程中生成的总生物量的指标，如下计算累积性细胞时间积分(CTI)(Equ3)。
(Equ3) 细胞时间积分＝Σ(0.5×(VCDn-1+VCDn)×(tn–tn-1))×(105个活细胞×d/ml)
使用Cobas Integra 400plus系统(Roche Diagnostics，曼海姆，德国)，分析无细胞上清液中的乳酸脱氢酶(LDH)活性。
IgG滴度定量和qP的计算
通过Cobas Integra 400plus系统(Roche，曼海姆，德国)根据制造商的方案或通过如先前所描述的PorosA HPLC法(Zeck等人,2012)，定量产物滴度。根据等式4计算总比生产率qP以分析细胞生产能力。
(Equ 4)qP＝(滴度n-滴度n-1)/(CTIn–CTIn-1)×(pg/(活细胞×d))
确定肽序列变体和用合成肽鉴定间-Tyr和邻-Tyr序列变体
如先前所述那样进行肽序列变体的定量(Zeck等人,2012)。简而言之，通过添加变性缓冲液(0.4M Tris，8M盐酸胍，pH 8)至终体积240μL，使抗体样品(250μg)变性。通过添加在变性缓冲液中新制备的20μL 0.24M DTT并在37℃温育60分钟，实现还原。随后，通过添加水中的20μL 0.6M碘乙酸在室温在暗处，使样品烷基化15分钟。通过添加30μL DTT溶液，失活过量的烷基化试剂。随后使用NAP 5 Sephadex G-25 DNA级柱(GE Healthcare，慕尼黑，德国)，将样品的缓冲液交换成大约480μL 50mM Tris/HCl，pH 7.5。用胰蛋白酶在37℃进行5小时(比率1:37)消化。将获得的肽混合物进样和在不预处理的情况下使用反相HPLC分离(Agilent 1100 Cap LC,Agilent Technologies,
Figure BDA0001220689730000181
德国)。来自Varian(达姆施塔特，德国)的Polaris 3 C18-醚柱(1x 250mm；3μm粒径，
Figure BDA0001220689730000182
孔径)用于分离。溶剂是水中(A)和乙腈中(B)的0.1％甲酸(SigmaAldrich，慕尼黑，德国)。在37℃在80分钟期间运行2％B至38％B的线性梯度。将HPLC洗脱物使用Triversa NanoMate(Advion，Ithaca，NY)和380nL/分钟分割，输入以正离子模式运行的LTQ Orbitrap经典串联质谱仪(ThermoFisherScientific，Dreieich，德国)。为了确认提取的离子层析图中的邻-Tyr峰和间-Tyr峰，我们使用以下合成肽：mAb HC66-72DQFTISR(未修饰的)、DQpYTISR、DQmYTISR和DQoYTISR。合成肽购自Biosyntan GmbH(柏林，德国)。
计算罚分系数和代用标记(Surrogate Makers)用于Phe→邻-Tyr和Phe→间-Tyr 序列变体预测
我们假设，并入间-Tyr和/或邻-Tyr而非Phe可以由这样的简化模型描述，所述简化模型假设惩罚使用间-Tyr和/或邻-Tyr而不惩罚使用Phe。这个罚分系数可以因不同来源如L-Phe更好转运入细胞和/或蛋白质合成期间尽力防止使用间-Tyr和/或邻-Tyr的编辑机制而产生。这种假设导致等式
(Equ 5)p×r×[x]＝[y]，
其中p是罚分系数，r是平均间-Tyr浓度或邻-Tyr浓度对Phe浓度的比率(在给定时间间隔期间)，[x]是(在时间区间中)产生的蛋白质的浓度)和[y]是具有序列变体的产生的蛋白质的浓度。注意这个模型不包括任何对导致例如相移的时间、过程阶段、Phe和间-Tyr浓度或邻-Tyr浓度比率的依赖性。罚分系数的计算简单明了(Equ7)。
(Equ 6)p＝[y]/(r×[x])
类似地，已知罚分系数，还可能就无序列变体的产物的目的百分数而言计算间-Tyr浓度或邻-Tyr浓度对Phe浓度的比率。
实施例1
间-酪氨酸补充对苯丙氨酸限制条件下比生产率(qP)调节的影响
Gurer-Orhan等人之前已报道了，向CHO细胞补充间-Tyr显示剂量依赖性细胞毒性。在浓度筛选中，当补充0.5mM间-Tyr时观察到MTX减少CHO细胞的能力为50％减少(Gurer-Orhan等人,(2006))。迄今尚未报告用于细胞培养物中邻-Tyr补充的数据或浓度。使用剂量依赖性培养方案，目的在于确定间-Tyr和邻-Tyr对CHO细胞生长性能的关联性和可耐受浓度。为此，对材料和方法中描述的CHO培养模型补充0.1mM、0.3mM或0.4mM对-Tyr、邻-Tyr或间-Tyr。遵循所谓“对照”或“阳性对照”，我们使用未补充的标准培养方法作为参比。这里，截至第10/11日将Phe进入限制。
在第一方案中，分析间-Tyr和邻-Tyr对宏观细胞生长标志物、活细胞密度(VCD)、细胞成活力和作为总生物量产生的细胞时间积分(CTI)的作用。在第9/10日，测试全部培养物，例外是补充间-Tyr的一个培养物，达到大约180x 105个细胞/ml的最大VCD，而间-Tyr处理的CHO克隆1显示剂量依赖性减少的最大VCD(图2)。观察到间-Tyr补充的CHO培养物的累积性CTI减少(图1)。
与Gurer-Orhan等人先前发表的数据相反，在我们的补料分批CHO培养模型中未观察到间-Tyr补充对细胞成活力的明显影响。然而，补充邻-Tyr显示细胞成活力较低，在第14日小于60％，并且与对照和间-Tyr补充以及对-Tyr补充相比，上清液中最终乳酸脱氢酶活性较高(图5)。
通过产物浓度分析确定的培养物总生产率揭示了各试验情形之间没有差异(图3)。全部培养物均显示滴度从第11/12日起停滞不升。另外，单一的间-Tyr显示总体较高的比生产率qP(图4)。与对照相比，Phe限制条件下补充0.1mM、0.3mM和0.4mM间-Tyr将qP分别增加+5％、+26％和+36％。
实施例2
间-酪氨酸补充对苯丙氨酸非限制条件下比生产率(qP)调节的影响
在第二方案中，分析了Phe非限制条件下间-Tyr和邻-Tyr补充在CHO补料分批培养中的作用。为此，增加进料2中Phe的量以防止Phe限制(图6)。
再次，测试全部培养物，例外是补充间-Tyr的一个培养物，达到大约35,000至40,000x 105个细胞*h/ml的相似CTI，而间-Tyr处理的CHO克隆1显示CTI的剂量依赖性减少(图6)。对全部试验的条件未观察到产物滴度差异(图7)。但是，与前文描述的Phe限制条件相比，向CHO培养物提供足够的Phe阻止了产物滴度的停滞不升。间-Tyr补充显示总体较高的比生产率qP(图4)，甚至在Phe非限制条件下也是如此(图8)。与对照相比，Phe非限制条件下补充0.1mM、0.3mM和0.4mM间-Tyr将qP分别增加+3％、+26％和+28％。
参考文献清单:
Leader B,Baca QJ,Golan DE.2008.蛋白质治疗:概述和药理学分类(Proteintherapeutics:a summary and pharmacological classification).Nat Rev DrugDiscov 7:21-39.
Wakankar AA,Borchardt RT.2006.易于天冬酰胺脱酰胺和天冬氨酸异构化的蛋白质的制剂考虑(Formulation considerations for proteins susceptible toasparagine deamidation and aspartate isomerization).J Pharm Sci95:2321-2336.
Diepold K,Bomans K,Wiedmann M,Zimmermann B,Petzold A,Schlothauer T,Mueller R,Moritz B,Stracke JO,Molhoj M,Reusch D,Bulau P.2012.在升高的温度培养后通过LC-MS同时评估重组抗体中的Asp异构化和Asn脱酰胺(Simultaneous assessmentof Asp isomerization and Asn deamidation in recombinant antibodies by LC-MSfollowing incubation at elevated temperatures).PLoS One 7:e30295.
Dengl S,Wehmer M,Hesse F,Lipsmeier F,Popp O,Lang K.2013.在上游加工条件下单克隆抗体的聚集和化学修饰(Aggregation and chemical modification ofmonoclonal antibodies under upstream processing conditions).Pharm Res 30:1380-1399.
Li S,Schoneich C,Borchardt RT.1995.蛋白质医药品的化学不稳定性:氧化的机理和稳定化的策略(Chemical instability of protein pharmaceuticals:Mechanismsof oxidation and strategies for stabilization).Biotechnol Bioeng48:490-500.
Ji JA,Zhang B,Cheng W,Wang YJ.2009.模型蛋白质PTH中蛋氨酸、色氨酸和组氨酸氧化:机理和稳定性(Methionine,tryptophan,and histidine oxidation in a modelprotein,PTH:mechanisms and stabilization).J Pharm Sci98:4485-4500.
Hensel M,Steurer R,Fichtl J,Elger C,Wedekind F,Petzold A,SchlothauerT,Molhoj M,Reusch D,Bulau P.2011.使用叔丁基过氧化氢和定量LC-MS鉴定重组抗体中色氨酸氧化的潜在位点(Identification of potential sites for tryptophanoxidation in recombinant antibodies using tert-butylhydroperoxide andquantitative LC-MS).PLoS One 6:e17708.
Khetan A,Huang YM,Dolnikova J,Pederson NE,Wen D,Yusuf-Makagiansar H,Chen P,Ryll T.2010.使用CHO细胞在抗体产生期间控制丝氨酸对天冬酰胺的错误并入(Control of misincorporation of serine for asparagine during antibodyproduction using CHO cells).Biotechnol Bioeng107:116-123.
Wen D,Vecchi MM,Gu S,Su L,Dolnikova J,Huang YM,Foley SF,Garber E,Pederson N,Meier W.2009.在中国仓鼠卵巢细胞中表达的重组蛋白质中天冬酰胺位置处丝氨酸错误并入的发现和研究(Discovery and investigation of misincorporation ofserine at asparagine positions in recombinant proteins expressed in Chinesehamster ovary cells).J Biol Chem 284:32686-32694.
Feeney L,Carvalhal V,Yu XC,Chan B,Michels DA,Wang YJ,Shen A,Ressl J,Dusel B,Laird MW.2013.在产生重组单克隆抗体的CHO细胞系中消除酪氨酸序列变体(Eliminating tyrosine sequence variants in CHO cell lines producingrecombinant monoclonal antibodies).Biotechnol Bioeng110:1087-1097.
Bridges BA.2001.在细菌和其他细胞系统中的高突变(Hypermutation inbacteria and other cellular systems).Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci356:29-39.
Zeck A,,Regula JT,Larraillet V,Mautz B,Popp O,Gopfert U,Wiegeshoff F,Vollertsen UE,Gorr IHKoll H,Papadimitriou A.2012.重组蛋白质的低水平序列变体分析:一种优化的方法(Low level sequence variant analysis of recombinantproteins:an optimized approach).PLoS One 7:-e40328.
Jakubowski H.2001.氨酰基-tRNA合成酶的翻译准确性:牵涉到动脉粥样硬化(Translational accuracy of aminoacyl-tRNA synthetases:implications foratherosclerosis).J Nutr 131:2983S-2987S.
Gurer-Orhan H,Ercal N,Mare S,Pennathur S,Orhan H,Heinecke JW.2006.细胞蛋白质中游离间-酪氨酸的错误并入:氧化的氨基酸的潜在的细胞毒性机理(Misincorporation of free m-tyrosine into cellular proteins:a potentialcytotoxic mechanism for oxidized amino acids).Biochem J 395:277-284.
Hossler P,Khattak SF,Li ZJ.2009.在哺乳动物细胞培养中最优的和一贯的蛋白质糖基化(Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cellculture).Glycobiology 19:936-949.
Lee S,Park JR,Seo MS,Roh KH,Park SB,Hwang JW,Sun B,Seo K,Lee YS,KangSK,Jung JW,Kang KS.2009.组蛋白脱乙酰基酶抑制剂降低人间叶干细胞的增殖潜力和多世系分化能力(Histone deacetylase inhibitors decrease proliferation potentialand multilineage differentiation capability of human mesenchymal stem cells).Cell Prolif 42:711-720.
Murray-Beaulieu V,Hisiger S,Durand C,Perrier M,Jolicoeur M.2009.丁酸钠维持CHO细胞的代谢和t-PA生产性的能量状态(Na-butyrate sustains energeticstates of metabolism and t-PA productivity of CHO cells).J Biosci Bioeng 108:160-167.
Hendrick V,Winnepenninckx P,Abdelkafi C,Vandeputte O,Cherlet M,Marique T,Renemann G,Loa A,Kretzmer G,Werenne J.2001.丁酸和温度变换对重组的组织纤溶酶原激活物(t-PA)增加的生产性:细胞周期相分析(Increased productivity ofrecombinant tissular plasminogen activator(t-PA)by butyrate and shift oftemperature:a cell cycle phases analysis).Cytotechnology36:71-83.
Yoon SK,Choi SL,Song JY,Lee GM.2005.培养物的pH对在32.5和37.0摄氏度悬浮生长的中国仓鼠卵巢细胞产生促红细胞生成素的影响(Effect of culture pH onerythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspensionat 32.5and 37.0 degrees C).Biotechnol Bioeng 89:345-356.
Han YK,Koo TY,Lee GM.2009.通过升高重量摩尔渗透压浓度和降低培养温度增强CHO细胞的干扰素-β生产(Enhanced interferon-beta production by CHO cellsthrough elevated osmolality and reduced culture temperature).Biotechnol Prog25:1440-1447.

Claims (10)

1.间-酪氨酸的用途，用于增加产生外源多肽的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的比生产率，其中添加间-酪氨酸以获得0.1mM至0.4mM的浓度。
2.根据权利要求1所述的用途，其中CHO细胞是CHO悬浮细胞。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述用途是在额外包含非限制性浓度的苯丙氨酸的培养基中，且间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25。
4.根据权利要求1所述的用途，其中多肽是免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。
5.在表达编码多肽的核酸的真核宿主细胞中产生外源多肽的方法，所述方法包括在包含间-酪氨酸的培养基中培养真核宿主细胞，其中添加间-酪氨酸以产生0.1mM至0.4mM的浓度。
6.根据权利要求5所述的方法，其中真核宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中多肽是免疫球蛋白或其变体或其片段或其融合物。
8.根据权利要求5所述的方法，其中培养基额外包含非限制性浓度的苯丙氨酸，其中间-酪氨酸/苯丙氨酸的摩尔比低于或等于1.25。
9.根据权利要求5至8中任一项所述的方法，其中在所述方法期间温度保持恒定。
10.用于增加产生外源多肽的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的比生产率的方法，其中培养基包含0.1mM至0.4mM间-酪氨酸。
CN201580042225.6A 2014-08-11 2015-07-31 用于增加真核细胞的比生产率的方法 Active CN106661557B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14180586 2014-08-11
EP14180586.1 2014-08-11
PCT/EP2015/067733 WO2016023775A1 (en) 2014-08-11 2015-07-31 Method for increasing the specific production rate of eukaryotic cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106661557A CN106661557A (zh) 2017-05-10
CN106661557B true CN106661557B (zh) 2022-01-18

Family

ID=51298668

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580042225.6A Active CN106661557B (zh) 2014-08-11 2015-07-31 用于增加真核细胞的比生产率的方法

Country Status (11)

Country Link
US (3) US10336983B2 (zh)
EP (1) EP3180422B2 (zh)
JP (1) JP6697442B2 (zh)
KR (1) KR102467730B1 (zh)
CN (1) CN106661557B (zh)
BR (1) BR112016030659B1 (zh)
CA (1) CA2953450C (zh)
MX (1) MX2017000715A (zh)
RU (1) RU2725191C2 (zh)
SG (1) SG11201700908TA (zh)
WO (1) WO2016023775A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111233996A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 北京交通大学 一种将丁酸钠用于促进工程细胞株分泌表达rhIL-24的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101292036A (zh) * 2005-10-21 2008-10-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于重组表达多肽的方法
CN101688181A (zh) * 2007-06-29 2010-03-31 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Cho细胞

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY149138A (en) * 2001-08-04 2013-07-15 Samsung Electronics Co Ltd Method and apparatus for recording and reproducing video data, and information storage medium in which video data is recorded by the same
WO2008136398A1 (ja) * 2007-04-26 2008-11-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 高濃度アミノ酸含有培地を用いた細胞の培養方法
WO2009051109A1 (ja) * 2007-10-15 2009-04-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質を高生産する細胞の作製方法
WO2009054433A1 (ja) * 2007-10-24 2009-04-30 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 異種タンパク質製造のための細胞及びそれを用いた製造方法
US20110262965A1 (en) * 2010-04-23 2011-10-27 Life Technologies Corporation Cell culture medium comprising small peptides
PT3330370T (pt) * 2010-04-26 2021-05-11 Novartis Ag Processo para cultivo de células cho

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101292036A (zh) * 2005-10-21 2008-10-22 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于重组表达多肽的方法
CN101688181A (zh) * 2007-06-29 2010-03-31 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 Cho细胞

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Misincorporation of free m-tyrosine into cellular proteins:a potential cytotoxic mechanism for oxidized amino acid;HANDE GURER-ORHAN等;《Biochemical Journal》;20060415;第395卷(第2期);摘要、图1 *
Na-butyrate sustains energetic states of metabolism and t-PA productivity of CHO cells;MCMURRAY-BEAULIEU V等;《Journal of bioscience and bioengineering,elsevier,amsterdam》;20090801;第108卷(第2期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
US10336983B2 (en) 2019-07-02
RU2017105852A3 (zh) 2019-02-11
US20230081499A1 (en) 2023-03-16
WO2016023775A1 (en) 2016-02-18
SG11201700908TA (en) 2017-03-30
EP3180422A1 (en) 2017-06-21
CA2953450A1 (en) 2016-02-18
CA2953450C (en) 2023-01-10
KR102467730B1 (ko) 2022-11-15
MX2017000715A (es) 2017-04-27
EP3180422B1 (en) 2018-10-17
BR112016030659B1 (pt) 2023-04-11
JP6697442B2 (ja) 2020-05-20
US20200080048A1 (en) 2020-03-12
BR112016030659A2 (zh) 2017-08-22
CN106661557A (zh) 2017-05-10
RU2017105852A (ru) 2018-09-13
KR20170040250A (ko) 2017-04-12
US20170152473A1 (en) 2017-06-01
EP3180422B2 (en) 2021-11-17
JP2017523798A (ja) 2017-08-24
RU2725191C2 (ru) 2020-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230272336A1 (en) Cell culture method using amino acid-enriched medium
Jing et al. Identification of cell culture conditions to control protein aggregation of IgG fusion proteins expressed in Chinese hamster ovary cells
EP2139987B9 (en) Methods of protein production using anti-senescence compounds
US9802993B2 (en) Method for producing a cell for protein production by treating a cell overexpressing a taurine transporter with methotrexate
CN111201315A (zh) 灌注培养基
CN114616321A (zh) 细胞培养方法
US20230081499A1 (en) Method for increasing the specific production rate of eukaryotic cells
KR20220143108A (ko) 포유 동물 세포 배양 공정
AU2018348712B2 (en) Perfusion medium

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1237365

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant