KR20220143108A - 포유 동물 세포 배양 공정 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유 동물 세포에서 세포 배양 및 재조합 단백질 또는 재조합 바이러스 생산의 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 락테이트 및 고농도의 시스테인을 제공하는 신규한 공급 배지 및 상기 공급 배지를 사용하여 포유 동물 세포를 배양하거나 관심 대상 생성물, 예를 들어, 이종 단백질 또는 재조합 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 포유 동물 세포에서 세포 배양 및 재조합 단백질 또는 재조합 바이러스 생산의 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 락테이트 및 고농도의 시스테인을 제공하는 신규한 공급 배지 (feed medium) 및 상기 공급 배지를 사용하여 포유 동물 세포를 배양하거나 관심 대상 생성물, 예를 들어, 이종 단백질 또는 재조합 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다.
생물 제약 산업에서의 대부분의 재조합 치료학적 단백질은 정확한 단백질 폴딩 및 번역후 변형에 대한 능력으로 인해 포유 동물 세포 배양에 의해 생산된다. 포유 동물 배양 시스템 내에서, 중국 햄스터 난소 (Chinese hamster ovary: CHO) 세포는 산업적 생산 공정에서 선택되는 숙주이다. 이의 주요 장점은 사람과 유사한 번역후 변형 패턴이다. 또한, CHO 세포는 이미 안전한 숙주로 입증되었으며, 신규한 치료제 제조를 위해 승인될 가능성이 보다 높다. 고품질의 생성물을 생산하는 높은 생산성을 갖는 안정한 CHO 세포주의 개발이 지난 수년 동안 철저하게 이루어졌지만, 세포 배양 성능의 추가 개선이 지속적으로 필요하다. 그러나, HEK293, NS0 및 BHK21과 같은 다른 포유 동물 세포주도 또한 단백질 발현 또는 바이러스 생산을 위한 생물 제약 산업에서 사용될 수 있다.
공정 개발을 위한 주요 전략은 세포가 환경과 지속적으로 상호 작용하기 때문에 배지 설계이다. 성장, 생산성 및 생성물 품질은 사용되는 배지의 선택과 조성에 직접으로 영향을 받는다. 세포의 영양소 요구를 충족하고 억제 물질의 축적을 최소화하기 위한 세포 배양 배지의 최적화는 공정 성능에 큰 영향을 미친다.
배지 조성이 자세히 관찰되어야 할 뿐만 아니라 세포의 대사에 대한 보다 깊은 이해도 배지 개발과 관련하여 똑같이 중요하다. CHO 세포 및 기타 포유 동물 세포의 대사는 락테이트, 암모니아 및 기타 다양한 성장 억제 대사 산물과 같은 고농도의 세포독성 또는 억제 부산물을 초래하는 탄소 및 질소 공급원과 같은 기질의 비효율적으로 높은 흡수를 특징으로 한다. 세포독성 또는 억제 부산물은 배지가 교환되지 않아 세포독성 부산물이 시간 경과에 따라 축적되기 때문에 유가식 (fed-batch) 공정에서 특히 문제이다.
포유 동물 세포, 특히, CHO 세포의 이러한 부정적인 특성을 극복하는 것을 목표로, pH, 온도 또는 pCO2와 같은 공정 파라미터에 영향을 미치는 수많은 전략이 개발 및 적용되었다. 더욱이, 복잡한 공급 전략과 세포주 조작이 억제 화합물의 형성을 감소시키기 위해 적용된다.
최근에, 생물 약제 생산을 위한 포유 동물 세포에 의한 생물 공정은 주로 성장, 생산성 및 생성물 품질 향상에 중점을 두고 철저하게 개발되었다. 고 씨딩 세포 밀도 (Seeding Cell Density: SCD)의 사용에 의해, 세포의 비생산적인 성장기를 방지하여 개선된 공간-시간 수율을 초래한다. 그러나, 배지 설계를 조정하는 세포의 최적화된 영양 공급에 대한 요구는 고 씨딩 세포 밀도를 갖는 배양에서 훨씬 더 두드러지는데, 이는 이러한 배양이 특히 공정의 종료시에 생존력 저하를 초래할 수 있는 잠재적으로 억제성 또는 세포독성 대사 산물을 축적하는 경향이 있기 때문이다.
따라서, 포유 동물 세포 배양의 고 밀도 성장을 지원함과 동시에 높은 단백질 생산을 지원하는 안정한 배지의 추가 개발에 대한 요구가 여전히 증가하고 있다. 역사적으로, 동물 세포 배양을 위한 배지는 혈장, 혈청 또는 조직 추출물을 포함하였는데, 이는 이러한 복잡한 배지 성분의 높은 가변성과 빈약한 한정 및 고유한 바이러스 오염 위험으로 인해 불안정하고 매우 불규칙한 배양 공정을 초래한다. 그 이후로, 미리 한정된 화합물만을 포함하는 화학적으로 한정된 무혈청 배지의 사용이 증가하였으며, 오늘날 제약 산업의 표준이다.
세포 배양 배지는 대부분 탄수화물 또는 아미노산, 지질, 비타민, 미량 원소, 염, 성장 인자, 폴리아민과 같은 에너지원과 완충제, 계면 활성제 또는 소포제와 같은 비영양 성분으로 이루어진다. 유가식 배양에 사용되는 배지는 다음 2가지 하위 그룹으로 나누어질 수 있다: 공정 배지 (P-배지) 또는 기본 배지와 공급 배지 (F-배지). 기본 배지는 초기 농도의 모든 필수 성분을 포함하며 접종에 사용된다. 공급 배지는 주로 공정 동안 고농도의 영양소를 제공한다. 따라서, 세포 배양 배지는 많은 상이한 화합물의 복잡한 조성물이며, 성장, 생산성 또는 생성물 품질의 향상을 초래하는 화합물을 식별하는 것은 어렵다. 최근 배지 개발의 주요 과제 중 하나는 상이한 조건하에 배양된 상이한 세포주에 적용 가능한 배지의 실시이다. 배지는 사용된 세포주가 영양소 공급에 대한 유사한 요구 사항을 시사하는 공통 발현 벡터를 갖는 공통 숙주로부터 유래한다는 전제하에 사용된다. 이러한 접근법은 타임라인을 감소시켜 배지의 세포주 특이적 조정을 피함으로써 신속한 공정 개발을 가능하게 한다. 배지 설계는 또한 시판 중이거나 개발 중인 다양한 생물 약제를 고려할 때 배지 개발을 더욱 어렵게 하는 업스트림 제조에서 목적하는 분자의 주요 품질 속성에 큰 영향을 미친다. 배지 설계의 복잡성에 추가하여, 다양한 배지 기술은 배지 조성의 선택에 대한 다양한 요구를 시사한다. 최적화된 공급 전략 또는 공정 유형의 선택은 보충에 대한 다양한 요구, 예를 들어, 높은 생존 세포 밀도 (viable cell density: VCD)를 지원하는 관류를 초래한다. 따라서, 세포 배양 배지는 많은 상이한 화합물의 복잡한 조성물이며, 성장, 생산성 또는 생성물 품질의 향상을 초래하는 화합물을 식별하는 것은 어렵다.
시스테인은 포유 동물 세포 배양 배지의 일반 성분이다. 이는 필수 아미노산으로 간주되지 않지만, 그럼에도 불구하고 세포 배양 및 단백질 합성에 중요한 아미노산이다. 불충분한 시스테인 수준이 단백질 역가의 감소를 초래한다는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 특히, 공급물 중 Cys의 불충분한 수준은 세포에서 Cys 고갈을 초래할 수 있다. 이러한 고갈은 글루타티온 (GSH) 및 타우린과 같은 항산화제 분자에 부정적인 영향을 미쳐 여러 유해한 세포 효과와 함께 산화적 스트레스를 유발한다. 시스테인은 세포 배양 배지의 필수 성분인 것으로 공지되어 있지만, 보다 높은 농도의 Cys의 공급은 세포외 환경에서 부적절한 이황화 결합 쌍 형성과 증가된 단백질 응집을 초래할 수 있다 (문헌 [Ali A. S., et al., Biotechnol. J., 2019, 14: 1800352]).
다른 한편으로, 락테이트는 세포 성장과 생존력에 부정적인 영향을 미치는 원치 않는 부산물로서 공지되어 있다. 높은 수준의 락테이트는 세포 배양 공정에 분명히 부정적인 영향을 미치는 것으로 보고되며, 이는 배양 후기에 락테이트 축적을 감소시키고/시키거나 락테이트 소비를 유도하기 위해 시도되었다 (문헌 [Li J., et al., Biotechnol Bioeng, 2012, 109(5): p 1173-1186]). 따라서, 선행 기술에서 기재된 바와 같이, 포유 동물 세포 배양물에서의 락테이트 축적 또는 락테이트 생산은 아스파라긴과 산성 시스틴의 조합을 포함하는 배지에 의해 회피되었지만 (국제공개공보 WO 2006/026408, 예를 들어, 실시예 10, 도 42), 특히, 락테이트는 감소되지 않고 오히려 폐기물로 간주되며 이와 같이 세포 배양에 첨가 또는 공급되지 않는다. 리 등 (Li et al.)은 대체 피드백 pH 제어 전략으로 락테이트를 사용하고, 락테이트 소비 대사 상태하의 외인성 락테이트 공급이 공정 이점, 특히, 암모늄 수준 감소 및 CO2 수준 저하를 제공할 수 있다는 것을 최초로 관찰하였다. 암모니아는 아미노산 대사의 부산물이며, 세포 성장에 부정적인 영향을 미친다. 유럽 출원공개 EP 2135946 A1 및 문헌 [Kishishita et al., J. Biosci Bioeng. (2015), 120 (1), 78-84]은 락테이트를 포함하지 않는 배양 배지에 의한 세포 배양 공정을 개시하고 있지만, 이는 회피되거나 저농도로 유지되어야 하는 원치 않는 폐기물인 것으로 간주된다고 명시적으로 교시하고 있다 (유럽 출원 공개 EP 2135946 A1의 단락 [0046] 및 문헌 [Kishishita et al., p. 81, 좌측 컬럼, 2번째 단락, 1~3행] 참조).
문헌 [Ritacco F.V. et al, Biotechnol. Prog., 2018, 34(6): 1407-1426]은 CHO 세포 배양 배지 개발의 여러 접근법을 검토하고 있다. 이는 글루코오스 소비의 생성물인 락테이트가 포유 동물 세포 배양에서 세포 성장을 억제할 수 있다는 것을 1408 페이지와 1410 페이지에 걸쳐 있는 단락에서 개시하고 잇다. 각각의 분석에 따르면, 지수기의 CHO 세포는 산소 농도에 관계 없이 주로 호기성 해당 과정을 통해 에너지를 생성하고 락테이트를 생산하는 반면, 정지기의 세포는 주로 산화적 인산화를 수행하고 락테이트를 소비하는 것으로 나타났다. 그러나, 일반적으로 락테이트를 피해야 한다는 것이 본 개시 내용으로부터 도출될 수 있다. 또한, 증가된 아스파라긴 농도가 락테이트와 암모늄을 감소시키는데 유용할 수 있다고 말하지만 (1412 페이지, 좌측 컬럼, 4번째 단락, 18~20행), 이러한 맥락에서 시스테인의 역할은 논의되지 않는다.
이종 단백질 및 재조합 바이러스를 포함하는 고수율의 생물 약제를 높은 생성물 품질로 생산하기 위해 유가식 배양으로 포유 동물 세포를 배양하기 위한 추가의 개선된 방법에 대한 수요 증가의 관점에서, 개선된 세포 배양 배지 및 상기 세포 배양 배지를 사용하는 방법이 여전히 필요하다. 그러므로, 본 발명의 목적은 포유 동물 세포에서 관심 대상 생성물의 생산을 위한 개선된 유가식 방법을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 세포 배양 성능 및/또는 생성물 품질에 대한 락테이트와 시스테인의 놀라운 조합 효과에 관한 것이다.
하나의 양태에서, 다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 관심 대상 생성물을 생산하는 방법이 제공된다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제 (feed supplement)를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 관심 대상 생성물을 단리하는 단계. 바람직하게, 상기 공급 배지는 매일, 보다 바람직하게는 연속적으로 첨가된다. 상기 관심 대상 생성물은 바람직하게는 이종 단백질 또는 재조합 바이러스이고/이거나, 상기 기본 배지 및 공급 배지는 바람직하게는 무혈청이며 화학적으로 한정된다. 특정한 바람직한 실시 형태에서, 상기 락테이트/시스테인의 몰비는 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1이다.
상기 락테이트는 3 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 7 mmol/L/일 이상 또는 10 mmol/L/일 이상으로 첨가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트는 0.5 g/L 이상, 1 g/L 이상, 2 g/L 이상, 바람직하게는 2 내지 4 g/L로 유지된다.
상기 시스테인은 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물로서, 시스틴 또는 이의 염으로서, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 제공될 수 있다. 제공된 형태와 상관 없이, 상기 시스테인은 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상 또는 0.4 mM/일 이상으로 첨가될 수 있다.
특정 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성 (specific productivity)은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가한다. 대안으로 또는 추가로, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가한다. 바람직하게, 상기 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다. 대안으로 또는 추가로, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다.
상기 이종 단백질은 바람직하게는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 항체, 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체이다.
다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 포유 동물 세포를 배양하는 방법이 또한 제공된다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; 및 (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계.
또 다른 양태에서, (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키는 방법이 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다.
더 또 다른 양태에서, (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법이 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다.
더 또 다른 양태에서, (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 포유 동물 세포로부터 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 이종 단백질을 생산할 때 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하는 방법이 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 포유 동물 세포는 임의의 포유 동물 세포 또는 세포주일 수 있으며, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포이다.
본 발명에 따른 임의의 방법에 의해, 바람직하게는 본 출원에서 기재된 바와 같은 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키거나 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법에 의해 생산된 이종 단백질이 또한 제공된다. 상기 이종 단백질은 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 이종 단백질을 생산할 때 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하는 방법에 의해 생산될 수 있다.
더 또 다른 양태에서, 본 발명은 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도에 관한 것인데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 첨가한다.
유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도가 또한 제공되는데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 포함한다. 바람직하게, 상기 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다.
유가식 공정으로 생산된 이종 단백질의 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도가 또한 제공되는데, 여기서, 바람직하게는 상기 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 증가된 높은 만노오스 구조, 증가된 저분자량 종 및/또는 증가된 산성 종이다.
유가식 공정으로 이종 단백질 역가 및/또는 세포 비생산성을 증가시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도가 또한 제공된다. 바람직하게, 상기 유가식 공정은 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 포유 동물 세포는 바람직하게는 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포이다.
더 또 다른 양태에서, 락테이트 및 시스테인을 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mM/mM)로 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 공급 배지가 제공된다. 바람직하게, 상기 공급 배지는 별도의 첨가를 위한 하나 이상의 공급 보충제를 포함한다.
더 또 다른 양태에서, (a) 락테이트 및 임의로 시스테인을 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 농축된 공급 배지, 및 (b) 시스테인을 포함하는 농축된 공급 배지로부터 분리된 수성 보충제를 포함하는 키트가 제공되는데, 여기서, 상기 공급 배지 및 보충제는 세포 배양 시작 부피의 5% 미만, 바람직하게는 3.5% 미만의 매일 첨가에서 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인 몰비 (mM/mM) 및 0.225 mM/일 이상의 시스테인을 제공한다.
도 1: 3L 생물 반응기에서 10x10E06개 세포/ml의 씨드 농도를 사용하는 초고 씨딩 밀도 (ltra High Seeding Density: uHSD) 공정의 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 상대적 IgG 역가 (C) 및 락테이트 농도 (D). 락테이트 및/또는 시스테인의 볼루스 첨가의 존재 또는 부재하에 일반 uHSD를 사용하여 CHO 세포를 13~14일 동안 배양하였다. (C) y축의 IgG 농도는 최고 측정값 (100%)에 대한 역가로서 제공된다.
도 2: 250 ml 생물 반응기의 일반 공정에서 2개의 세포주에 대한 DoE 실험의 생존 세포 밀도, 생존력, 생성물 역가 및 락테이트 농도. (A, B, C 및 D) 세포주 A (CHO-K1; IgG1)의 세포 배양물을 0 g/L/일 나트륨 락테이트와 0 ml/l/일 시스틴 (0 Lac/0 시스틴; 대조군), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 0.84 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/0.84 시스틴), 및 17.2 g/L의 15 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (15 Lac/1.67 시스틴)과 함께 배양하였다. (A) 생존 세포 밀도 [10E06개 세포/ml], (B) 생존력 [%], (C) 최고 측정값 [%]에 대한 IgG 역가 및 (D) 락테이트 농도 [g/L]가 제공된다. (E, F 및 G) 세포주 B (CHO-K1; IgG4)의 세포 배양물을 17.2 g/L의 0 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/l/일의 제2 시스틴 공급 (0 Lac/1.67 시스틴), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/1.67 시스틴), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 0 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/0 시스틴), 및 17.2 g/L의 15 g/L/일 나트륨 락테이트와 0.84 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (15 Lac/0.84 시스틴)과 함께 배양하였다. (E) 생존 세포 밀도 [10E06개 세포/ml], (F) 생존력 [%], (G) 최고 측정값 [%]에 대한 IgG 역가 및 (H) 락테이트 농도 [g/L]가 제공된다.
도 3: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 수확 생존력 (R2: 0.95; Q2: 0.85). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다.
도 4: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 생성물 역가 (R2: 0.98; Q2: 0.96). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, y축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 높은 락테이트 및 높은 시스틴 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 5: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.98; Q2: 0.97). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 시스틴 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 6: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 수확 생존력 (R2: 0.95; Q2: 0.85). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다.
도 7: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 생성물 역가 (R2: 0.98; Q2: 0.96). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, y축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 높은 락테이트 및 높은 시스틴 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 8: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.98; Q2: 0.97). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 시스틴 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 9: 락테이트의 함수로서의 세포주 A (A) 및 세포주 B (B)에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.93; Q2: 0.77). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭한다. 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 10: 시스틴과 락테이트의 함수로서의 2개의 세포주에 대한 저분자량 종 (LMW). (A 및 B) 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 나타내는 x축 상에 ml/L/d로 표시된 시스틴 (A) 및 나트륨 락테이트의 첨가를 나타내는 x축 상에 g/L로 표시된 락테이트 (B) 함수로서의 세포주 A에 대한 저분자량 종 (Low Molecular Weight Species: LMWs). (C 및 D) 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 나타내는 x축 상에 ml/L/d로 표시된 시스틴 (C) 및 나트륨 락테이트의 첨가를 나타내는 x축 상에 g/L로 표시된 락테이트 (D) 함수로서의 세포주 A에 대한 저분자량 종 (LMWs). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다. y축의 정규화된 값 LMWs (%)는 DoE의 최고 값으로 정규화된다.
도 11: 세포주 C에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존력 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도시되어 있다. 2 ml/L/일의 추가 공급물 중의 14.37 g/L 시스틴 (w Cys), 또는 30 ml/L/일의 유리 공급 배지 (free feed medium)와 함께 30 g/L 락테이트 (w Lac), 또는 둘 다 (w Cys/Lac )를 세포 배양물에 첨가하였다. 공급 배지 (공급 1)만을 대조군 세포에 공급하였다.
도 12: 세포주 D에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 도면 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 13: 세포주 E에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 그림 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 14: 세포주 F에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 그림 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 15: uHSD 공정의 DoE 최적화에서 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 생성물 역가 (R2: 0.84; Q2: 0.77). 높은 락테이트 및 높은 시스테인 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 16: uHSD 공정의 DoE 최적화에서 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 생성물 역가 (R2: 0.84; Q2: 0.77). 높은 락테이트 및 높은 시스테인 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 17: 락테이트 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 수확 생존력 (R2: 0.94; Q2: 0.89). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 18: 락테이트 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 수확 생존력 (R2: 0.94; Q2: 0.89). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 19: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.99; Q2: 0.97). 시스테인 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 20: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.99; Q2: 0.97). 시스테인 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 21: 락테이트의 함수로서 세포주 A에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.71; Q2: 0.48). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 22: 락테이트의 함수로서 세포주 B에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.71; Q2: 0.48). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 2: 250 ml 생물 반응기의 일반 공정에서 2개의 세포주에 대한 DoE 실험의 생존 세포 밀도, 생존력, 생성물 역가 및 락테이트 농도. (A, B, C 및 D) 세포주 A (CHO-K1; IgG1)의 세포 배양물을 0 g/L/일 나트륨 락테이트와 0 ml/l/일 시스틴 (0 Lac/0 시스틴; 대조군), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 0.84 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/0.84 시스틴), 및 17.2 g/L의 15 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (15 Lac/1.67 시스틴)과 함께 배양하였다. (A) 생존 세포 밀도 [10E06개 세포/ml], (B) 생존력 [%], (C) 최고 측정값 [%]에 대한 IgG 역가 및 (D) 락테이트 농도 [g/L]가 제공된다. (E, F 및 G) 세포주 B (CHO-K1; IgG4)의 세포 배양물을 17.2 g/L의 0 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/l/일의 제2 시스틴 공급 (0 Lac/1.67 시스틴), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 1.67 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/1.67 시스틴), 17.2 g/L의 30 g/L/일 나트륨 락테이트와 0 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (30 Lac/0 시스틴), 및 17.2 g/L의 15 g/L/일 나트륨 락테이트와 0.84 ml/L/일의 제2 시스틴 공급 (15 Lac/0.84 시스틴)과 함께 배양하였다. (E) 생존 세포 밀도 [10E06개 세포/ml], (F) 생존력 [%], (G) 최고 측정값 [%]에 대한 IgG 역가 및 (H) 락테이트 농도 [g/L]가 제공된다.
도 3: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 수확 생존력 (R2: 0.95; Q2: 0.85). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다.
도 4: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 생성물 역가 (R2: 0.98; Q2: 0.96). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, y축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 높은 락테이트 및 높은 시스틴 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 5: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.98; Q2: 0.97). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 시스틴 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 6: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 수확 생존력 (R2: 0.95; Q2: 0.85). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다.
도 7: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 생성물 역가 (R2: 0.98; Q2: 0.96). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, y축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 높은 락테이트 및 높은 시스틴 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 8: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.98; Q2: 0.97). y축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭하며, x축의 단위 ml/L/d는 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 지칭한다. 시스틴 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 9: 락테이트의 함수로서의 세포주 A (A) 및 세포주 B (B)에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.93; Q2: 0.77). x축의 단위 g/L은 나트륨 락테이트의 첨가를 지칭한다. 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 10: 시스틴과 락테이트의 함수로서의 2개의 세포주에 대한 저분자량 종 (LMW). (A 및 B) 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 나타내는 x축 상에 ml/L/d로 표시된 시스틴 (A) 및 나트륨 락테이트의 첨가를 나타내는 x축 상에 g/L로 표시된 락테이트 (B) 함수로서의 세포주 A에 대한 저분자량 종 (Low Molecular Weight Species: LMWs). (C 및 D) 17.2 g/L 시스틴의 첨가를 나타내는 x축 상에 ml/L/d로 표시된 시스틴 (C) 및 나트륨 락테이트의 첨가를 나타내는 x축 상에 g/L로 표시된 락테이트 (D) 함수로서의 세포주 A에 대한 저분자량 종 (LMWs). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다. y축의 정규화된 값 LMWs (%)는 DoE의 최고 값으로 정규화된다.
도 11: 세포주 C에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존력 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도시되어 있다. 2 ml/L/일의 추가 공급물 중의 14.37 g/L 시스틴 (w Cys), 또는 30 ml/L/일의 유리 공급 배지 (free feed medium)와 함께 30 g/L 락테이트 (w Lac), 또는 둘 다 (w Cys/Lac )를 세포 배양물에 첨가하였다. 공급 배지 (공급 1)만을 대조군 세포에 공급하였다.
도 12: 세포주 D에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 도면 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 13: 세포주 E에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 그림 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 14: 세포주 F에 대한 생존 세포 밀도 (A), 생존율 (B), 락테이트 농도 (C) 및 상대적 IgG 역가 (D)가 도 11의 그림 범례에서 기재된 바와 같이 처리 후 도시되어 있다.
도 15: uHSD 공정의 DoE 최적화에서 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 생성물 역가 (R2: 0.84; Q2: 0.77). 높은 락테이트 및 높은 시스테인 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 16: uHSD 공정의 DoE 최적화에서 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 생성물 역가 (R2: 0.84; Q2: 0.77). 높은 락테이트 및 높은 시스테인 공급에서 최고 생성물 역가를 수득할 수 있다. 정규화된 역가의 값 (%)을 (DoE에 사용된 세포주 전체에 걸쳐) DoE의 최고 값으로 정규화한다.
도 17: 락테이트 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 수확 생존력 (R2: 0.94; Q2: 0.89). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 18: 락테이트 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 수확 생존력 (R2: 0.94; Q2: 0.89). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 19: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 A에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.99; Q2: 0.97). 시스테인 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 20: 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서의 세포주 B에 대한 산성 피크 변이체 (APG) (R2: 0.99; Q2: 0.97). 시스테인 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다.
도 21: 락테이트의 함수로서 세포주 A에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.71; Q2: 0.48). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
도 22: 락테이트의 함수로서 세포주 B에 대한 만노오스 5 구조 (Man5) (R2: 0.71; Q2: 0.48). 신뢰 구간 (95%)은 점선으로 표시되어 있다.
"~을 포함하는" 또는 "~으로 포함된"의 일반적인 실시형태는 "~로 이루어진"의 보다 구체적인 실시형태를 포괄한다. 또한, 단수 및 복수 형태는 제한적인 방식으로 사용되지 않는다. 본 출원에서 사용되는 단수형 "한", "하나" 및 "상기"는, 단수로만 나타내는 것으로 명백히 명시되지 않는다면, 단수와 복수 둘 다를 나타낸다.
"세포 재배" 또는 "세포 배양"이라는 용어는 모든 규모 (예를 들어, 마이크로 역가 플레이트부터 대규모 산업용 생물 반응기까지, 즉 1 mL 미만 규모 내지 > 10.000 L 규모)에서, 모든 상이한 공정 방식 (예를 들어, 회분식 (batch), 유가식, 관류, 연속 배양)에서, 모든 공정 제어 방식 (비제어, 완전 자동화, 및, 예를 들어, pH, 온도, 산소 함량의 제어를 갖는 제어 시스템)에서, 모든 종류의 발효 시스템 (예를 들어, 일회용 시스템, 스테인리스 스틸 시스템, 유리 제품 시스템)에서의 세포 배양 및 발효 공정을 포함한다. 본 발명에 따르면, 상기 세포 배양은 포유 동물 세포 배양이며 유가식 배양이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포 배양은 > 1 L, 바람직하게는 > 2 L, > 10 L, > 1,000 L, > 5000 L, 보다 바람직하게는 > 10,000L의 부피에서의 세포 배양이다.
본 출원에서 사용되는 "유가식"이라는 용어는 세포가 영양소를 함유하는 공급 배지를 연속적으로 또는 주기적으로 공급받는 세포 배양에 관한 것이다. 상기 공급은 0 일차에 세포 배양을 시작한 직후 또는 보다 전형적으로는 배양을 시작한 후 1, 2 또는 3일에 시작할 수 있다. 상기 공급은 매일, 2일 마다, 3일 마다 등과 같은 예정된 일정을 따를 수 있다. 대안으로, 상기 배양은 세포 성장, 영양소 또는 독성 부산물에 대해 모니터링될 수 있고, 공급은 이에 따라 조정될 수 있다. 일반적으로, 다음 파라미터는 종종 매일 측정되며, 생존 세포 농도, 생성물 농도 (역가) 및 여러 대사 산물, 예를 들어, 글루코오스, pH, 락테이트, 삼투질 농도 (염 함량 측정) 및 암모늄 (성장률에 부정적인 영향을 미치고 생존 바이오매스를 감소시키는 성장 억제제)를 포함한다. 회분식 배양 (공급 없는 배양)과 비교하여, 유가식 방식으로 보다 높은 생성물 역가를 수득할 수 있다. 전형적으로, 유가식 배양을 특정 시점에서 중단하고, 세포 및/또는 배지를 수확하고, 이종 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 관심 대상 생성물을 단리 및/또는 정제한다. 유가식 공정은 전형적으로 약 2~3주, 예를 들어, 약 10~24일, 약 12 내지 21일, 약 12 내지 18일, 바람직하게는 약 12 내지 16일 동안 유지된다. 특히, 이종 단백질의 생산을 위한 유가식 공정은 전형적으로 약 2~3주, 예를 들어, 약 10~24일, 약 12 내지 21일, 약 12 내지 18일, 바람직하게는 약 12 내지 16일 동안 유지된다.
재조합 바이러스 생산의 경우, 세포는 전형적으로 목적하는 세포 밀도로 재조합 바이러스에 의해 형질 도입된다. 공급은 0 일차에 세포 배양을 시작한 직후 또는 보다 전형적으로는 배양을 시작한 후 1, 2 또는 3일에 시작할 수 있으며, 여기서, 상기 세포는 세포 접종 시에, 또는 공급이 시작된 후일 수 있는, 목적하는 세포 밀도가 달성되는 특정 기간 후에, 예를 들어, 배양을 시작한 후 1~7 일차에, 바람직하게는 배양을 시작한 후 2~5 일차에, 보다 바람직하게는 배양을 시작한 후 3~5 일차에 목적하는 세포 밀도로 재조합 바이러스에 의해 형질 도입된다. 대안으로, 상기 세포는 재조합 바이러스를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 안정하게 형질 감염될 수 있거나, 상기 세포는 재조합 바이러스 또는 이의 조합을 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 일시적으로 형질 감염될 수 있다. 상기 포유 동물 세포의 바이러스 형질 도입과 마찬가지로, 일시적 형질 감염의 경우, 상기 세포는 세포 접종 시에, 또는 공급이 시작된 후일 수 있는, 목적하는 세포 밀도가 달성되는 특정 기간 후에, 예를 들어, 배양을 시작한 후 1~7 일차에, 바람직하게는 배양을 시작한 후 2~5 일차에, 보다 바람직하게는 배양을 시작한 후 3~5 일차에 목적하는 세포 밀도로 재조합 바이러스를 인코딩하는 하나 이상의 핵산에 의해 형질 감염될 수 있다.
정의에 의해, 숙주 세포 내로 도입된 모든 핵산, 서열 또는 유전자는, 도입된 서열이 숙주 세포의 내인성 핵산, 서열 또는 유전자와 동일하더라도, 숙주 세포와 관련하여 "이종 핵산", "이종 서열", "이종 유전자", "이종 RNA" 또는 "이식 유전자" 또는 "재조합 유전자"로 호칭된다. 따라서, "이종" 또는 "재조합" 단백질 또는 RNA는 이종 핵산, 서열 또는 유전자, 바람직하게는 DNA로부터 발현된 단백질 또는 RNA이다. 바람직한 실시 형태에서, 도입된 핵산, 서열 또는 유전자는 문제의 숙주 세포의 내인성 핵산 서열 또는 유전자와 동일하지 않다.
본 출원에서 사용되는 "인코딩하다" 및 "코딩하다"라는 용어는 중합체성 거대 분자의 정보가 제1 분자와 상이한 제2 분자의 생산을 지시하는데 사용되는 임의의 과정을 광범위하게 지칭한다. 제2 분자는 제1 분자의 화학적 성질과 상이한 화학 구조를 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 양태에서, "인코딩하다"라는 용어는 이중 가닥 DNA 분자의 하나의 가닥이 주형으로 사용되어 DNA 의존적 DNA 폴리머라아제에 의해 새로 합성된 상보적 자매 가닥을 인코딩하는 반보존적 DNA 복제 과정을 기술한다. 다른 양태에서, DNA 분자는 (예를 들어, DNA 의존적 RNA 폴리머라아제 효소를 사용하는 전사 과정에 의해) RNA 분자를 인코딩할 수 있다. 또한, RNA 분자는 번역 과정에서와 같이 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있다. 번역 과정을 기술하는데 사용될 때, "인코딩하다"라는 용어는 또한 아미노산을 인코딩하는 트리플렛 코돈까지 확장된다. 일부 양태에서, RNA 분자는, 예를 들어, RNA 의존적 DNA 폴리머라아제를 도입하는 역전사 과정에 의해 DNA 분자를 인코딩할 수 있다. 또 다른 양태에서, DNA 분자는 폴리펩타이드를 인코딩할 수 있는데, 여기서, 당해 경우에서 사용되는 "인코딩하다"는 전사 및 번역 과정 모두를 포함하는 것으로 이해된다.
"폴리펩타이드" 또는 "단백질"이란 용어는 상호 교환적으로 사용된다. 이들 용어는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 이들 용어는 또한 당화 (glycosylation), 무효소 당화 (glycation), 아세틸화, 인산화, 산화, 아미드화 또는 단백질 가공을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는 반응을 통해 번역후 변형된 단백질을 포함한다. 변형 및 변화, 예를 들어, 다른 단백질에 대한 융합, 아미노산 서열 치환, 결실 또는 삽입은 폴리펩타이드의 구조에서 이루어질 수 있는 반면, 분자는 이의 생물학적 기능 활성을 유지한다. 예를 들어, 특정 아미노산 서열 치환은 폴리펩타이드 또는 이의 원래의 핵산 인코딩 서열에서 이루어질 수 있으며, 유사하거나 변형된 특성을 갖는 단백질이 수득될 수 있다. 아미노산 변형물은, 예를 들어, 이의 원래의 핵산 서열 상에 부위 특이적 돌연변이유발 또는 중합효소 연쇄 반응 매개 돌연변이유발을 수행함으로써 제조될 수 있다. 따라서, "폴리펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 또한, 예를 들어, 면역글로불린 성분 (예를 들어, Fc 성분) 및 성장 인자 (예를 들어, 인터루킨), 항체 또는 임의의 항체로 유도된 분자 형식 또는 항체 단편으로 이루어진 융합 단백질을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "관심 대상 생성물"이라는 용어는 포유 동물 세포에서 생산된 임의의 생성물, 특히, 이종 단백질 및 재조합 바이러스를 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "세포 배양 배지"라는 용어는 바람직하게는 완충 배지에 비타민, 미량 원소, 염, 벌크 염, 아미노산, 지질, 탄수화물과 같은 필수 영양소 및 성분을 최소한으로 포함하는 포유 동물 세포를 배양하기 위한 배지이다. 전형적으로, 포유 동물 세포를 위한 세포 배양 배지는 대략 중성 pH, 예를 들어, 약 6.5 내지 약 7.5, 바람직하게는 약 6.8 내지 약 7.3, 보다 바람직하게는 약 7의 pH를 갖는다. 이러한 세포 배양 배지에 대한 비제한적인 예로는 햄 F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium: DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 변형 둘베코 배지 (Iscove´s Modified Dulbecco´s Medium: IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S (Invitrogen), 무혈청 CHO 배지 (Sigma), 무단백질 CHO 배지 (Sigma) 등과 같은 시판되는 배지 뿐만 아니라 다양한 공급원의 자체 제조 (proprietary) 배지가 포함된다. 상기 세포 배양 배지는 기본 세포 배양 배지일 수 있다. 상기 세포 배양 배지는 또한 공급 배지 및/또는 첨가제가 첨가된 기본 세포 배양 배지일 수 있다. 세포가 발효기 또는 생물 반응기에서 배양되는 경우, 상기 세포 배양 배지는 또는 발효 브로쓰로도 지칭될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "기본 배지" 또는 "기본 세포 배양 배지"라는 용어는 하기에서 정의된 바와 같은 포유 동물 세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지이다. 이는 세포가 세포 배양 실행의 시작부터 배양되는 배지를 지칭하며, 다양한 성분이 기본 배지에 첨가될 수 있지만 전형적으로 또 다른 배지에 대한 첨가제로서 사용되지 않는다. 상기 기본 배지는 임의로 추가의 첨가제 (또는 보충제) 및/또는 공급 배지가 배양, 즉, 세포 배양 배지를 생성하는 세포 배양 실행 동안 첨가될 수 있는 베이스의 역할을 한다. 상기 기본 세포 배양 배지는 세포 배양 과정의 초기부터 제공된다. 일반적으로, 상기 기본 세포 배양 배지는 탄소원, 아미노산, 비타민, 벌크 염 (예를 들어, 염화 나트륨 또는 염화 칼륨), 다양한 미량 원소 (예를 들어, 황산 망간), pH 완충액, 지질 및 글루코오스과 같은 영양소를 제공한다. 주요 벌크 염은 일반적으로 기본 배지에서만 제공되며, 약 280~350 mOsmo/kg의 세포 배양물의 최종 삼투질 농도를 초과하지 않도록 하여 세포 배양물이 합리적인 삼투압 스트레스에서 성장 및 증식할 수 있어야 한다.
본 출원에서 사용되는 "공급물" 또는 "공급 배지"라는 용어는 포유 동물 세포의 배양에서 공급물로 사용되는 영양소 농축물/농축 영양소 조성물에 관한 것이다. 따라서, 이는 세포 배양에 첨가되는 농축물로서 제공된다. 이는 세포 배양물의 희석을 최소화하기 위해 "농축 공급 배지"로서 제공되며, 전형적으로는 공급 배지는 용기에서 배양 시작 부피 (culture starting volume: CSV; 0 일차의 시작 부피를 의미함)를 기준으로 10~50 ml/L/일, 바람직하게는 15~45 ml/L/일, 보다 바람직하게는 20~40 ml/L/일, 보다 더 바람직하게는 30 ml/L/일로 제공된다. 이는 배양 시작 부피의 약 1~5%, 바람직하게는 약 1.5~4.5%, 보다 바람직하게는 약 2~4%, 보다 더 바람직하게는 약 3%의 매일 첨가에 상응한다. 고 밀도 씨딩 또는 초고 밀도 씨딩을 사용하는 배양의 경우, 10~50 ml/L/일, 15~45 ml/L/일 또는 25~45 ml/L/일과 같은 보다 높은 공급률이 유리할 수 있다. 이는 배양 시작 부피의 약 1~5%, 약 1.5~4.5% 또는 약 2.5~4.5%의 매일 첨가에 상응한다. 공급률은 공급 기간 전체에 걸친 평균 공급률로 이해되어야 한다. 공급 배지는 전형적으로 기본 세포 배양 배지의 모든 성분이 아닌 대부분의 성분의 보다 높은 농도를 갖는다. 일반적으로, 상기 공급 배지는 세포 배양 동안 소비되는 영양소, 예를 들어, 아미노산 및 탄수화물을 대체하는 반면, 염 및 완충액은 덜 중요하며 일반적으로 기본 배지와 함께 제공된다. 상기 공급 배지는 전형적으로 유가식 방식으로 (기본) 세포 배양 배지/발효 브로쓰에 첨가된다. 상기 기본 배지에 (반복적으로 또는 연속적으로) 첨가된 공급 배지는 세포 배양 배지를 생성한다. 상기 공급물은 연속 또는 볼루스 첨가와 같은 다양한 방식으로 또는 관류 관련 기술 (케모스타트 또는 하이브리드 관류 시스템)을 통해 첨가될 수 있다. 바람직하게, 상기 공급 배지는 매일 첨가되지만, 또한 1일 2회와 같이 보다 빈번하게, 또는 2일 마다와 같이 덜 빈번하게 첨가될 수 있다. 보다 바람직하게, 상기 공급 배지는 연속적으로 첨가된다. 영양소의 첨가는 일반적으로 배양 동안 (즉, 0 일차 후에) 수행된다. 기본 배지와 대조적으로, 상기 공급 배지는 전형적으로 주요 벌크 염 (예를 들어, NaCl, KCl, NaHCO3, MgSO4, Ca(NO3)2)과 같은 "고삼투압 활성 화합물"을 제외하고 기본 배지와 유사한 모든 성분을 제공하는 고농축 영양액 (예를 들어, > 6x)으로 이루어진다. 전형적으로, 벌크 염이 없거나 감소된 기본 배지의 6배 이상의 농축물은 화합물의 우수한 용해도와 충분히 낮은 삼투질 농도 (예를 들어, 270~1500 mOsmo/kg, 바람직하게는 310~800 mOsmo/kg)를 유지하여 세포 배양에서 삼투질 농도를 약 270~550 mOsmo/kg, 바람직하게는 약 280~450 mOsmo/kg, 보다 바람직하게는 약 280~350 mOsmo/kg으로 유지한다. 상기 공급 배지는 하나의 완전한 공급 배지로서 첨가될 수 있거나, 세포 배양물에 대한 개별적인 첨가를 위한 하나 이상의 공급 보충제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 공급 보충제의 사용은 규칙적인 공급 및 글루코오스 첨가를 위해 종종 수행되는 요구에 따른 공급과 같은 다양한 공급 일정으로 인해 필요할 수 있으므로, 전형적으로 적어도 별도의 공급물로서 또한 제공된다. 하나 이상의 공급 보충제의 사용은 또한 특정 화합물의 낮은 용해도, 특정 화합물의 다양한 pH에서의 용해도, 및/또는 고농도의 공급 배지에서의 화합물의 상호 작용으로 인해 필요할 수 있다. 상기 공급 배지는 바람직하게는 화학적으로 한정된다 (임의로 인슐린 또는 IGF와 같은 재조합 단백질을 포함함). 이는 세포를 포함하지 않거나, 배양 중인 세포와 접촉하지 않았거나, 세포 유래된 대사 폐기물을 포함하지 않는다. 따라서, 본 출원에서 사용되는 "공급 배지"라는 용어는 세포 배양물, 또는 세포 배양 중, 즉, 세포의 존재하의 배양 배지 (본 출원에서 세포 배양 배지로도 또한 지칭됨)로부터 유래된 사전 조건 배지를 제외한다.
본 출원에서 사용되는 "공급 보충제"라는 용어는 사용 전에 공급 배지에 첨가될 수 있거나 공급 배지와 별도로 기본 배지 및/또는 세포 배양 배지에 첨가될 수 있는 영양소 농축물에 관한 것이다. 따라서, 화합물은 공급 배지 또는 공급 보충제와 함께 제공될 수 있거나, 화합물은 공급 배지 및 공급 보충제와 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 시스테인은 공급 배지 및 공급 보충제와 함께 2가지 공급 전략으로 첨가될 수 있다. 공급 배지로서, "공급 보충제"는 세포 배양물의 희석을 피하기 위해 농축물로서 제공된다.
기본 배지와 공급 배지 둘 다인 세포 배양 배지는 바람직하게는 무혈청이며 화학적으로 한정된다. 상기 기본 배지 및/또는 공급 배지는 추가로 무단백일 수 있다. 본 출원에서 사용되는 "무혈청 배지"는 동물 기원의 혈청을 포함하지 않는 시험관내 세포 배양을 위한 세포 배양 배지를 지칭한다. 이는 혈청이 상기 동물로부터의 오염 물질, 예를 들어, 바이러스를 포함할 수 있으며 혈청이 불명확하고 회분식마다 다르기 때문에 바람직하다. 본 발명에 따른 기본 배지 및 공급 배지는 무혈청이다.
본 출원에서 사용되는 "화학적으로 한정된 배지"는 모든 성분이 공지되어 있는 시험관내 세포 배양에 적합한 세포 배양 배지를 지칭한다. 보다 구체적으로, 이는 동물 혈청 또는 식물, 효모 또는 동물 가수 분해물과 같은 임의의 보충제를 포함하지 않는다. 그러므로, 화학적으로 한정된 배지는 또한 무혈청이다. 본 발명에 따른 기본 배지 및 공급 배지는 바람직하게는 화학적으로 한정된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 기본 배지 및/또는 공급 배지는 무혈청이고 화학적으로 한정되고 임의로 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자 (insulin-like growth factor: IGF)와 같은 재조합 성장 인자를 포함한다. 본 출원에서 언급된 기본 배지 및/또는 공급 배지는 일단 세포 배양 배지를 제공하기 위한 세포 배양에서 배양될 포유 동물 세포에 의해 생산된 단백질을 제외하고는 추가의 단백질을 포함하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 "무단백 배지"는 단백질을 포함하지 않는 시험관내 세포 배양을 위한 세포 배양 배지 (일단 세포 배양에서 배양될 세포에 의해 생산된 단백질 제외)를 지칭하는데, 여기서, 단백질은 임의의 길이의 폴리펩타이드를 지칭하며, 단, 단일 아미노산, 디펩타이드 또는 트리펩타이드를 제외한다. 구체적으로, 인슐린 및 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)와 같은 성장 인자는 배지에 존재하지 않는다. 바람직하게, 본 발명에 따른 기본 배지 및 공급 배지는 화학적으로 한정되며 무단백이다.
본 출원에서 사용되는 "생존율"이라는 용어는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 자동화 현미경 세포 계수 (Innovatis AG, Bielefeld)를 기반으로 하는 Cedex 장치로 트립판 블루 배제에 의해 측정될 때 세포 배양에서의 생존 세포 %를 지칭한다. 그러나, 생 세포의 에너지 대사를 반영하데 사용되는 형광 측정 (예를 들어, 요오드화 프로피듐 기반), 열량 측정 또는 효소 방법, 예를 들어, LDH 락테이트 데하이드로게나아제 또는 특정 테트라졸륨 염, 예를 들어, 알라마르 블루, MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 또는 TTC (테트라졸륨 클로라이드)를 사용하는 방법과 같은 생존력의 측정을 위한 여러 다른 방법이 존재한다.
본 출원에서 사용되는 "생산하는" 또는 "고도로 생산하는", "생산", "생산 및/또는 분비", "생산하는", "생산 세포" 또는 "고수율로 생산하는"이라는 용어는 관심 대상 생성물, 예를 들어, 핵산에 의해 인코딩된 이종 단백질 또는 재조합 바이러스의 생산에 관한 것이다. "증가된 생산 및/또는 분비" 또는 "고수율 생산"은 이종 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 관심 대상 생성물의 발현에 관한 것이며, 이종 단백질의 맥락에서 세포 비생산성의 증가, 역가 증가, 세포 배양물의 전체 생산성 증가 또는 이들의 조합을 의미한다. 재조합 바이러스의 맥락에서, 이는 세포 특이적 및/또는 총 생산성 입자의 증가, 세포 특이적 및/또는 총 감염성 입자의 증가 또는 이들의 조합을 의미한다. 본 출원에서 사용되는 역가 증가는 동일한 부피에서의 농도 증가, 즉, 총 수율의 증가에 관한 것이며, 이종 단백질 뿐만 아니라 재조합 바이러스에 대해 사용될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "증진", "증진된", "증진되다", "증가" 또는 "증가된"이라는 용어는, 일반적으로 대조군 세포 배양과 비교하여 적어도 약 10% 만큼의 증가, 예를 들어, 포유 동물 세포 배양과 비교하여 적어도 약 20% 또는 적어도 약 30% 또는 적어도 약 40% 또는 적어도 약 50% 또는 적어도 약 75% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90% 또는 적어도 약 100% 또는 적어도 약 200% 또는 적어도 약 300% 만큼의 증가, 또는 10~300%의 임의의 정수 증가를 의미한다. 본 출원에서 사용되는 "대조군 세포 배양" 또는 "대조군 포유 동물 세포 배양"은 본 발명에 따른 동일한 방법을 사용하여 동일한 생성물을 생성하는 동일한 세포 (동일한 세포 클론)를 사용하는 세포 배양인데, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가한다.
관심 대상 생성물의 생산 방법
하나의 양태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 관심 대상 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 관심 대상 생성물을 단리하는 단계. 바람직하게, 상기 관심 대상 생성물은 이종 단백질 또는 재조합 바이러스, 보다 바람직하게는 이종 단백질이다.
다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 포유 동물 세포를 배양하는 방법이 또한 제공된다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; 및 (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계. 임의로, 상기 관심 대상 생성물은 추가로 정제 또는 단리될 수 있다. 바람직하게, 상기 관심 대상 생성물은 이종 단백질 또는 재조합 바이러스, 보다 바람직하게는 이종 단백질이다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 공급 배지는 매일, 바람직하게는 유가식 공정의 공급 기간 동안 연속적으로 첨가된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 공급 배지는 0 내지 5 일차에 시작하여 첨가된다. 당해 분야의 통상의 기술자는 이것이 또한 씨드 밀도에 의존할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 정상적인 씨딩 밀도 (0.7 내지 1 x 106개 세포/ml)의 경우, 공급은 전형적으로 1~5 일차, 바람직하게는 2~3 일차에 시작된다. 공급은 전형적으로 유가식 공정의 종료 전 적어도 5일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 4일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 3일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 2일까지, 바람직하게는 상기 공정의 종료까지 계속된다. 보다 바람직하게, 공급은 2~3 일차에 시작되며, 유가식 공정의 종료 전 적어도 2일까지, 보다 바람직하게는 세포 유가식 공정의 종료까지 계속된다. 고 씨딩 밀도 (> 1 내지 4 x 106개 세포/ml)의 경우, 공급은 전형적으로 0~4 일차, 바람직하게는 0~2 일차에 시작된다. 공급은 전형적으로 유가식 공정의 종료 전 적어도 5일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 4일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 3일까지 계속되며, 상기 공정의 종료까지 계속될 수 있다. 바람직하게, 공급은 0~2 일차에 시작되며, 유가식 공정의 종료 전 적어도 4일 또는 3일까지 계속된다. 초고 씨딩 밀도 (> 4 내지 20 x 106개 세포/ml)의 경우, 공급은 전형적으로 0~3 일차, 바람직하게는 0~1 일차에 시작된다. 공급은 전형적으로 유가식 공정의 종료 전 적어도 5일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 4일까지, 유가식 공정의 종료 전 적어도 3일까지 계속되며, 상기 공정의 종료까지 계속될 수 있다. 바람직하게, 공급은 0 일차에 시작되며, 유가식 공정의 종료 전 적어도 4일 또는 3일까지 계속된다. 따라서, 공급 배지 첨가의 시작에 따라, 상기 방법은 단계 b) (포유 동물 세포를 접종하는 단계)와 단계 c) (공급 배지를 첨가하는 단계) 사이에 단계 bi)를 추가로 포함할 수 있는데, 여기서, 단계 bi)는 기본 배지에서 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 락테이트 또는 시스테인의 첨가를 한정하기 위해 본 출원에서 사용되는 단위 "mmol x L-1 x 일-1"은 또한 mmol/L/일 또는 mM/일로도 지칭될 수 있다. 이는, 상기 첨가가 볼루스 첨가인지 연속 첨가인지 여부에 관계 없이, 1일 당 제공되는 mmol/L를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 상기 세포는 바람직하게는 단계 (c)에서 및/또는 락테이트가 배양물에 첨가될 때 락테이트 소비 대사 상태에 있다.
본 출원에서 사용되는 "접종하는"이라는 용어는 포유 동물 세포주와 같은 포유 동물 세포의 샘플을 수집하고, 이를 성장에 필요한 영양소를 함유하는 배지 내로 배치하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 상기 포유 동물 세포는 성장 또는 생산을 위한 기본 배지 내로 배치된다. 이러한 단계는 또한 씨딩으로도 지칭될 수 있다. 상기 포유 동물 세포는 상이한 씨딩 밀도로 기본 배지 내로 접종될 수 있다. 본 출원에서 언급되는 "씨딩" 또는 "정상적인 씨딩"이라는 용어는 약 0.7 x 106개 세포/ml 내지 약 1 x 106개 세포/ml의 표준 씨딩 밀도를 지칭하고, "고 씨딩"이라는 용어는 1 x 106개 세포/ml 초과 내지 약 4 x 106개 세포/ml의 씨딩 밀도를 지칭하고, "초고 씨딩"이라는 용어는 4 x 106개 세포/ml 초과 내지 약 20 x 106개 세포/ml 또는 심지어 그 이상, 바람직하게는 약 6 x 106개 세포/ml 내지 약 15 x 106개 세포/ml, 보다 바람직하게는 8 x 106개 세포/ml 내지 약 12 x 106개 세포/ml의 씨딩 밀도를 지칭한다.
락테이트/시스테인의 몰비는 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1, 바람직하게는 약 15:1 내지 약 30:1일 수 있다.
하나의 실시 형태에서, 상기 락테이트는 3 mmol/L/일 이상, 3.8 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 바람직하게는 7 mmol/L/일 이상, 7.8 mmol/L/일 이상, 10 mmol/L/일 이상 또는 심지어 15 mmol/L/일 이상으로 첨가된다.
상기 세포 배양 배지 중의 락테이트는 0.5 g/L 이상, 1 g/L 이상, 바람직하게는 2 g/L 이상, 바람직하게는 2 내지 4 g/L, 보다 바람직하게는 2 내지 3 g/L로 유지된다. 상기 세포 배양 배지의 농도는 5 g/L (약 56 mM) 미만으로 유지되어야 하는데, 여기서, 락테이트는 독성이 된다. 따라서, 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트 농도는 약 1 g/L 내지 약 4.5 g/L (약 10 내지 50 mM), 약 2 g/L 내지 약 4 g/L (약 20~45 mM), 바람직하게는 약 2 g/L 내지 약 3 g/L (약 20~35 mM)로 유지된다. 상기 락테이트 (MW = 89.07 g/mol)는 이의 염, 에스테르 및/또는 수화물로서 및/또는 락트산, 바람직하게는 염, 예를 들어, 나트륨 락테이트 (MW = 112.06 g/mol)로서 제공될 수 있는데, 여기서, 1 g/L의 락테이트는 약 1.25 g/L의 나트륨 락테이트와 동일하다. 락테이트의 예시적인 에스테르는, 예를 들어, 에틸 락테이트 또는 부틸 락테이트이다. 락트산도 또한 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있다. 그러나, 이는 공급 배지의 pH에 영향을 미칠 수 있으므로, 바람직하게는 공급 배지의 성분에 첨가하거나 이와 혼합하기 전에 나트륨 락테이트를 제공하기 위해 NaOH로 적정된다. 락테이트 또는 락트산의 염, 에스테르 및/또는 수화물은 본 출원에서 제공된 락테이트 농도와 등몰 농도로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 배지 성분으로서 첨가된 락테이트를 함유하지 않는다. 그러나, 락테이트는 대사 산물로서 기본 배지에서의 배양 동안 생성될 수 있다. 상기 락테이트는 공급 배지에 대한 첨가 전에 나트륨 락테이트를 제공하기 위해 NaOH로 적정된 나트륨 락테이트 또는 락트산으로서 수득된다. 본 출원에서 사용되는 "락테이트"라는 용어는 L-락테이트를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 나트륨 락테이트 및 락트산은 나트륨 L-락테이트 및 L-락트산을 지칭한다.
상기 시스테인은 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물로서, 시스틴 또는 이의 염으로서, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 제공될 수 있다. 시스테인 염 및/또는 수화물, 또는 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드는 본 출원에 제공된 시스테인 농도와 등몰 농도로 제공된다. 본 출원에서 사용되는 "시스테인" 및 "시스틴"이라는 용어는 L-시스테인 및 L-시스틴을 지칭한다. 본 발명에 따르면, 상기 시스테인은 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는데, 여기서, 상기 시스테인은 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 첨가된다. 바람직하게, 상기 시스테인은 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.4 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mM/일 이상으로 첨가된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 시스테인은 약 0.225 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.25 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.3 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 또는 약 0.4 mM/일 내지 약 0.6 mM/일로 첨가된다.
이론에 구속시키고자 하는 것은 아니지만, 시스테인은 단백질 합성 및 글루타티온 (GSH) 생산에 사용된다. 글루타티온은 활성 산소종 (reactive oxygen species: ROS)의 제거에 의해 세포 산화 환원 균형을 유지하는 중요한 세포성 항산화제로서의 역할을 한다. ROS는 화학적으로 매우 반응성이며 산소 대사의 부산물이다. 산화적 스트레스 동안, ROS 수준은 상승하고 RNA와 단백질의 손상을 증진시킬 뿐만 아니라 세포 사멸을 촉진한다. 따라서, 시스테인의 첨가는 산화적 스트레스의 감소를 통해 산화 환원 균형을 유지할 수 있어 높은 생존력을 초래할 수 있다.
락테이트의 보다 높은 이용 가능성은 글루코오스 대신에 피루브산의 대체 공급원으로서 바람직한 락테이트 소비를 초래할 수 있다. 락테이트는 세포 배양의 초기 단계에서 많이 생산되며, 세포 배양, 특히, 고 밀도 또는 초고 밀도 세포 배양에서 락테이트 생산에서 락테이트 소비로의 대사 전환은 배양의 약 3 일차에 있다. 약 5 일차부터, 락테이트는 특히 고 밀도 또는 초고 밀도 세포 배양에서 보충 없이 제한될 수 있다. 높은 락테이트 소비는 보다 낮은 해당 작용 입력을 초래하여 보다 낮은 TCA 입력을 초래하는 것으로 믿어진다. 이는 보다 낮은 ROS 생성으로 전체 대사에 영향을 미친다. 락테이트와 시스테인의 조합은 동일한 이펙터를 부분적으로 표적화하기 때문에 유리할 수 있다. 시스테인은 감소된 ROS 수준으로 글루타티온 항산화 경로에 영향을 미치며, 락테이트는 대사를 하향 조절하여 ROS 생성을 하향 조절한다.
본 발명에 따른 방법은 세포를 배양하는 시험관내 방법이며, 이종 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 관심 대상 생성물의 높은 발현에 사용되는 포유 동물 세포주의 용도를 포함한다. 따라서, 하나의 실시 형태에서에서, 상기 포유 동물 세포는 포유 동물 세포주, 바람직하게는 불멸화 세포주이다. 포유 동물 세포 또는 포유 동물 세포주의 바람직한 예는 CHO 세포 (예를 들어, DG44 및 K1), NS0 세포, HEK293 세포 (예를 들어, HEK293 세포, HEK293F 및 HEK293T 세포) 및 BHK21 세포이다. 바람직하게, 상기 포유 동물 세포 또는 포유 동물 세포주는 현탁액에서의 성장에 적합하다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 포유 동물 세포 또는 포유 동물 세포주는 CHO 세포이다. 특정 실시 형태에서, 상기 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포이다.
본 출원에서 사용되는 "포유 동물 세포"라는 용어는 이종 단백질 또는 재조합 바이러스와 같은 관심 대상 생성물의 생산에 적합한 포유 동물 세포주를 지칭하며, "숙주 세포"로도 또한 지칭될 수 있다. 포유 동물 세포는 바람직하게는 형질전환 및/또는 불멸화 세포주이다. 이들은 세포 배양, 바람직하게는 무혈청 세포 배양에서 및/또는 바람직하게는 현탁 배양으로서 일련의 계대에 적합하며, 장기 구조의 일부인 일차 비형질 전환 세포 또는 세포들을 포함하지 않는다. 이종 단백질 생산을 위한 바람직한 포유 동물 세포는 설치류 세포, 예를 들어, 햄스터 세포, 특히, BHK21, BHK TK-, CHO, CHO-K1, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 또한 지칭됨), CHO-S 세포 및 CHO-DG44 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. CHO-DG44, CHO-K1 및 BHK21이 특히 바람직하며, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포가 보다 더 바람직하다. CHO-DG44 세포가 가장 바람직하다. 포유 동물 세포, 특히, CHO-DG44 및 CHO-K1 세포의 글루타민 신타아제 (glutamine synthetase: GS) 결핍 유도체도 또한 포함된다. 이들 세포는 이종 단백질을 안정하게 발현하는 클론의 GS 기반 선택 (예를 들어, 메티오닌 설폭시민 (MSX) 선택)에 특히 적합하다. 본 발명의 하나의 실시 형태에서, 상기 포유 동물 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 바람직하게는 CHO-DG44 세포, CHO-K1 세포, CHO DXB11 세포, CHO-S 세포, CHO GS 결핍 세포 또는 이들의 유도체이다.
재조합 바이러스 생산을 위한 바람직한 포유 동물 세포는 햄스터 또는 사람 세포, 예를 들어, 햄스터 세포, 특히, BHK21, BHK TK-, CHO (CHO-K1, CHO-DXB11 (CHO-DUKX 또는 DuxB11로도 또한 지칭됨), CHO-S 및 CHO-DG44 포함) 및 HEK293 세포, 또는 임의의 이러한 세포주의 유도체/자손이다. 보다 바람직하게, 상기 재조합 바이러스 생산을 위한 포유 동물 세포는 바람직하게는 무혈청 현탁 배양에 적합한 HEK293 세포 및 이의 유도체 (HEK293F 및 HEK293T 세포 포함)와 같은 사람 세포이다.
상기 포유 동물 세포는 치료학적 단백질, 바람직하게는 재조합 분비된 치료학적 단백질과 같은 이종 단백질을 인코딩하는 하나 이상의 발현 카세트(들)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 숙주 세포는 또한 쥐과 동물 골수종 세포, 예를 들어, NS0 및 Sp2/0 세포와 같은 쥐과동물 세포, 또는 이러한 세포주 중 임의의 세포주의 유도체/자손일 수 있다. 본 발명의 의미에 사용될 수 있는 포유 동물 세포의 비제한적인 예는 또한 표 1에 요약되어 있다. 그러나, 이들 세포의 유도체/자손, 사람, 마우스, 래트, 원숭이 및 설치류 세포주를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다른 포유 동물 세포도 또한 본 발명에서, 특히, 생물 약제학적 단백질의 생산을 위해 사용될 수 있다.
[표 1]
포유 동물 생산 세포주
무혈청 조건 하에, 및 임의로 어떠한 동물 기원의 단백질/펩타이드도 없는 배지 중에서 확립되고, 적응되고, 완전히 배양될 때, 포유 동물 세포가 가장 바람직하다. 햄 F12 (Sigma, Deisenhofen, Germany), RPMI-1640 (Sigma), 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; Sigma), 최소 필수 배지 (MEM; Sigma), 이스코브 변형 둘베코 배지 (IMDM; Sigma), CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA), CHO-S (Invitrogen), 무혈청 CHO 배지 (Sigma) 및 무단백질 CHO 배지 (Sigma)와 같은 시판되는 배지가 예시적인 적적한 영양액이다. 임의의 배지는 필요에 따라 다양한 화합물로 보충될 수 있으며, 이들 화합물의 비제한적인 예로는 재조합 호르몬 및/또는 기타 재조합 성장 인자 (예를들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자), 염 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘, 마그네슘, 포스페이트), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오사이드 (예를 들어, 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코오스 또는 기타 동등한 에너지원, 항생제 및 미량 원소가 있다. 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있는 임의의 기타 필요한 보충제도 또한 적절한 농도로 포함될 수 있다. 선택 가능한 유전자를 발현하는 유전자 변형된 세포의 성장 및 선택을 위해, 적절한 선택제가 배양 배지에 첨가된다.
본 출원에서 사용되는 "이종 단백질"이라는 용어는, 포유 동물 세포에 의해 자연적으로 발현되지 않고 재조합 기술을 사용하여 포유 동물 내로 도입된 임의의 단백질을 지칭한다. 바람직하게, 재조합 핵산은, 예를 들어, 형질 감염 또는 형질 도입에 의해 포유 동물 세포 내로 도입된다. 상기 핵산은 게놈 내로 안정하게 통합되거나 일시적으로 발현될 수 있다. 바람직하게, 상기 이종 단백질을 인코딩하는 핵산은 게놈 내로 안정하게 통합된다. 이종 단백질 발현을 위한 바람직한 포유 동물 세포주는 CHO-DG44 및 CHO-K1과 같은 CHO 세포이다.
상기 이종 단백질은 임의의 치료학적 관련 단백질일 수 있다. 치료학적 단백질에 대한 예로는 항체, 융합 단백질, 사이토카인 및 성장 인자가 있지만, 이들에에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에 따라 포유 동물 세포에서 생산된 이종 단백질로는 항체 또는 융합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 기타 이종 단백질로는, 예를 들어, 효소, 사이토카인, 림포카인, 유착 분자, 수용체 및 이의 유도체 또는 단편, 및 항진제 또는 길항제로서 역할을 하고/하거나 치료 또는 진단 용도를 가질 수 있는 임의의 다른 폴리펩타이드 및 스캐폴드일 수 있다.
바람직한 이종 단백질은 항체 또는 이의 단편 또는 유도체, 또는 융합 단백질이다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 항체, 바람직하게는 단클론 항체의 생산에 유리하게 사용될 수 있다. 전형적으로, 항체는 단일 특이적이지만, 항체는 또한 다중 특이적일 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 단일 특이적 항체, 다중 특이적 항체 또는 이의 단편, 바람직하게는 항체 (단일 특이적), 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 이의 단편, 바람직하게는 이의 항원 결합 단편의 생산에 사용될 수 있다. 특별히 언급하지 않는다면, "항체"라는 용어는 단일 특이적 항체를 지칭한다. 본 발명의 범위내의 예시적인 항체로는 항-CD2, 항-CD3, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD30, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD44v6, 항-CD49d, 항-CD52, 항-EGFR1 (HER1), 항-EGFR2 (HER2), 항-GD3, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF 알파, 항-IL2, 항-IL-5R 또는 항-IgE 항체가 포함되지만 이들에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 항-CD20, 항-CD33, 항-CD37, 항-CD40, 항-CD44, 항-CD52, 항-HER2/neu (erbB2), 항-EGFR, 항-IGF, 항-VEGF, 항-TNF 알파, 항-IL2 및 항-IgE 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 출원에서 사용되는 "항체", "항체들" 또는 "면역글로불린(들)"이란 용어는, 분화된 B 림프구 (형질 세포)로부터 외래 물질 (= 항원)에 대한 숙주 유기체의 반응으로 자연적으로 형성되는 글로불린 중에서 선택된 단백질에 관한 것이다. 다양한 부류의 면역글로불린이 존재한다: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, IgY, IgW. 바람직하게, 상기 항체는 IgG 항체, 보다 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체이다. 면역글로불린 및 항체라는 용어는 본 출원에서 상호 교환적으로 사용된다. 항체로는 단클론, 단일 특이적 및 다중 특이적 (예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적) 항체, 단일 쇄 항체, 항체의 항원 결합 단편 (예를 들어, Fab 또는 F(ab')2 단편), 이황화 결합된 Fv 등이 포함된다. 항체는 임의의 종일 수 있으며, 키메라 및 사람화된 항체를 포함할 수 있다. "키메라" 항체는, 항체 도메인 또는 영역이 다른 종으로부터 유래하는 분자이다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 래트 또는 마우스 항체로부터 유래하고, 불변 영역은 사람 항체로부터 유래할 수 있다. "사람화된" 항체에서는 최소 서열만이 비-사람 종으로부터 유래한다. 종종 사람 항체의 CDR 아미노산 잔기만이 마우스, 래트, 토끼 또는 라마와 같은 비사람 종의 CDR 아미노산 잔기로 대체된다. 때로는 항원 결합 특이성 및 친화성에 영향을 미치는 몇 가지 중요한 골격 아미노산 잔기도 또한 비-사람 아미노산 잔기로 대체된다. 항체는 화학 합성을 통해, 재조합 또는 형질전환 수단을 통해, 세포 (예를 들어, 하이브리도마) 배양을 통해 또는 다른 수단에 의해 생산될 수 있다.
전형적으로, 항체는 중쇄 및 경쇄에 의해 각각 형성된 2쌍의 이종 이량체로 이루어진 사량체성 폴리펩타이드이다. 이종 이량체 뿐만 아니라 사량체성 폴리펩타이드 구조의 안정화는 쇄간 이황화 가교를 통해 일어난다. 각 쇄는 "면역글로불린 도메인" 또는 "면역글로불린 영역"이라 불리는 구조적 도메인으로 구성되며, 여기서, "도메인" 또는 "영역"이라는 용어는 상호 교환적으로 사용된다. 각 도메인은 약 70 내지 110개의 아미노산을 함유하며, 콤팩트한 3차원 구조를 형성한다. 중쇄와 경쇄 둘 다는 항원 인식 및 결합을 담당하는 덜 보존된 서열을 갖는 "가변 도메인" 또는 "가변 영역"을 N-말단에서 함유한다. 경쇄의 가변 영역은 또한 "VL"로서 지칭되고, 중쇄의 가변 영역은 "VH"로 지칭된다.
항원 결합 단편으로는, 예를 들어, "Fab 단편" (단편 항원 결합 = Fab)이 포함되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. Fab 단편은, 인접한 불변 영역에 의해 함께 유지되는 2개의 쇄의 가변 영역으로 이루어진다. 이들은 통상적인 항체로부터, 예를 들어, 파파인에 의한 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있지만, 유사하게는 Fab 단편은 또한 유전자 조작에 의해 생산될 수 있다. 추가의 항체 단편은, 펩신에 의한 단백질 가수분해 절단에 의해 제조될 수 있는 F(ab')2 단편을 포함한다.
유전자 조작 방법을 사용하여, 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL)의 가변 영역만으로 이루어진 단축 항체 단편을 생산하는 것이 가능하다. 이들은 Fv 단편 (단편 가변 = 가변 부분의 단편)으로서 지칭된다. 이들 Fv 단편은 불변 쇄의 시스테인에 의한 2개의 쇄의 공유 결합이 결여되어 있기 때문에, Fv 단편은 종종 안정화된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을, 예를 들어, 10개 내지 30개의 아미노산, 바람직하게는 15개의 아미노산의 단축 펩타이드 단편에 의해 연결하는 것이 유리하다. 이러한 방식으로, 펩타이드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL로 이루어진 단일 펩타이드 가닥이 수득된다. 이러한 종류의 항체 단백질은 단쇄-Fv (scFv)로서 공지되어 있다. scFv-항체 단백질의 예는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 따라서, 항체 단편 및 항원 결합 단편은 Fv 단편, 특히, scFv를 추가로 포함한다.
최근, scFv를 다량체성 유도체로서 제조하기 위한 다양한 전략이 개발되었다. 이것은 특히 개선된 약동학적 및 생체분포 특성뿐만 아니라 증가된 결합활성을 갖는 재조합 항체를 유도하기 위한 것이다. scFv의 다량체화를 달성하기 위해서, scFv는 다량체화 도메인을 갖는 융합 단백질로서 제조되었다. 다량체화 도메인은, 예를 들어, IgG의 CH3 영역 또는 코일형 코일 구조 (나선 구조), 예를 들어, 류신-지퍼 도메인일 수 있다. 그러나, scFv의 VH/VL 영역 사이의 상호 작용이 다량체화 (예를 들어, 디아바디, 트리아바디 및 펜타바디)에 사용되는 전략도 또한 있다. 디아바디는 통상의 기술자에게는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. scFv 분자에서의 링커를 5 내지 10개의 아미노산으로 단축하면, 쇄간 VH/VL-중첩이 일어나는 동종이량체가 형성된다. 디아바디는 이황화 브릿지의 도입에 의해 추가로 안정화될 수 있다. 디아바디-항체 단백질의 예는 선행 기술로부터 공지되어 있다.
미니바디는 통상의 기술자에게는 2가의 동종이량체성 scFv 유도체를 의미한다. 이것은, 면역글로불린, 바람직하게는 IgG, 가장 바람직하게는 IgG1의 CH3 영역을, 힌지 영역 (예를 들어, IgG1로부터도 또한) 및 링커 영역을 통해 scFv에 연결되는 이량체화 영역으로서 함유하는 융합 단백질로 이루어진다. 미니바디-항체 단백질의 예는 선행 기술로부터 공지되어 있다.
트리아바디는 통상의 기술자에게는 3가의 동종삼량체성 scFv 유도체를 의미한다. VH-VL이 링커 서열없이 직접 융합되는 ScFv 유도체는 삼량체의 형성을 유도한다.
통상의 기술자는 또한 2가, 3가 또는 4가 구조를 가지며 scFv로부터 유래한 소위 미니바디에 익숙할 것이다. 다량체화는 이량체성, 삼량체성 또는 사량체성 코일형 코일 구조에 의해 수행된다. 본 발명의 바람직한 실시 형태에서, 관심 대상 유전자는 상기에서 언급된 임의의 목적하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 단클론 항체, 이의 유도체 또는 단편에 대해 인코딩된다.
항체 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인으로 구성된 면역글로불린 단편은, 결정화 경향 (Fc = 결정화 가능한 단편) 때문에 "Fc 단편", "Fc 단편" 또는 "Fc"로 불린다. 이들은 통상적인 항체로부터, 예를 들어, 파파인 또는 펩신에 의한 프로테아제 분해에 의해 형성될 수 있을 뿐만 아니라, 유전자 조작에 의해 생산될 수도 있다. Fc 단편의 N-말단 부분은 힌지 영역의 아미노산이 여전히 얼마나 많이 존재하는지에 따라 달라질 수 있다.
항원 결합 단편 및 Fc 영역을 포함하는 항체는 또한 전장 항체로도 지칭될 수 있다. 전장 항체는 단일 특이적 및 다중 특이적 항체, 예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체일 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 치료학적 항체는 다중 특이적 항체, 특히, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체이다. 이중 특이적 항체는 전형적으로 하나의 분자에서 표적 세포 (예를 들어, 악성 B 세포) 및 이펙터 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포 또는 대식 세포)에 대한 항원 결합 특이성을 조합한다. 예시적인 이중 특이적 항체로는 디아바디, BiTE (Bi-specific T-cell Engager) 형식 및 DART (Dual-Affinity Re-Targeting) 형식이 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 디아바디 형식은 2개의 개별 폴리펩타이드 쇄 상에서 2개의 항원 결합 특이성의 중쇄 및 경쇄의 동족 가변 도메인을 분리하며, 여기서, 2개의 폴리펩타이드 쇄는 비공유적으로 결합되어 있다. DART 형식은 디아바디 형식을 기초로 하지만, C-말단 이황화 브릿지를 통해 추가의 안정화를 제공한다. 삼중 특이적 항체는 3개의 항원 결합 특이성을 조합하는 단클론 항체이다. 이들은 2개의 상이한 항체의 항원 인식 도메인을 하나의 이중 특이적 분자 내로 재구성하는 이중 특이적 항체 기술을 기반으로 구축될 수 있다. 예를 들어, 암 세포 상의 CD38과 T 세포 상의 CD3 및 CD28을 표적화하는 삼중 특이적 항체가 생성되었다. 다중 특이적 항체는 높은 생성물 품질로 생산하기가 특히 어렵다.
다른 바람직한 치료학적 단백질은 융합 단백질, 예를 들어, Fc-융합 단백질이다. 따라서, 본 발명은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 단백질 생산을 증가시키는 방법은 유리하게는 Fc-융합 단백질과 같은 융합 단백질의 생산에 사용될 수 있다.
융합 단백질의 이펙터 부분은 천연 또는 변형된 이종 단백질의 완전한 서열 또는 상기 서열의 임의의 부분일 수 있다. 면역글로불린 불변 도메인 서열은 임의의 면역글로불린 하위 유형, 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2 하위 유형, 또는 부류, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있다. 바람직하게, 이들은 사람 면역글로불린, 보다 바람직하게는 사람 IgG, 보다 더 바람직하게는 사람 IgG1 및 IgG2으로부터 유래된다. Fc-융합 단백질의 비제한적인 예로는 N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 커플링된 MCP1-Fc, ICAM-Fc, EPO-Fc 및 scFv 단편 등이 있다. Fc 융합 단백질은, N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인을, 예를 들어, 다른 면역글로불린 도메인, 효소적 활성 단백질 부분 또는 이펙터 도메인을 포함하는 또 다른 발현 작제물 내에 도입함으로써 유전자 공학적 접근법에 의해 작제될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 Fc-융합 단백질은, 예를 들어, N-연결된 당화 부위를 포함하는 중쇄 면역글로불린 불변 영역의 CH2 도메인에 연결된 단쇄 Fv 단편을 또한 포함한다.
추가의 양태에서, 본 발명의 방법을 사용하고 관심 대상 성성물을 단리 및/또는 정제하고 임의로 상기 관심 대상 성성물을 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 관심 대상 성성물을 생산하는 방법이 제공된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 관심 대상 생성물은 이종 단백질 또는 재조합 바이러스이다. 구체적으로, 본 발명의 방법을 사용하고 이종 단백질을 단리 및/또는 정제하고 임의로 상기 이종 단백질을 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 이종 단백질을 생산하는 방법이 제공된다. 대안으로, 본 발명의 방법을 사용하고 재조합 바이러스를 단리 및/또는 정제하고 임의로 상기 재조합 바이러스를 약제학적으로 허용되는 제형으로 제형화하는 단계를 임의로 추가로 포함하는, 예를 들어, 백신화 또는 유전자 요법을 위한 재조합 바이러스를 생산하는 방법이 제공된다.
상기 이종 단백질은 치료학적 단백질일 수 있으며, 특히, 상기 항체, 항체 단편, 항체 유도체 또는 Fc 융합 단백질은 바람직하게는 분비된 폴리펩타이드로서 배양 배지로부터 회수/단리된다. 이종 단백질의 실질적인 동종 제제를 수득하기 위해 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질로부터 치료학적 단백질을 정제할 필요가 있다. 제1 단계로서, 세포 및/또는 미립자 세포 잔해물을 배양 배지로부터 제거한다. 또한, 이종 단백질은, 예를 들어, 면역 친화성 또는 이온 교환 컬럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, Sephadex 크로마토그래피, 및 실리카 상에서 또는 DEAE와 같은 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 의해 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산의 오염물로부터 정제된다. 포유 동물 세포에 의해 발현된 이종 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 다중 특이적 항체, 예를 들어, 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체, 또는 이의 다중 특이적 항원 결합 단편, 또는 융합 단백질이다. 상기 항체 또는 다중 특이적 항체 (예를 들어, 이중 특이적 또는 삼중 특이적 항체)는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG4 항체일 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 관심 대상 생성물은 재조합 바이러스이다. 본 출원에서 사용되는 "재조합 바이러스"라는 용어는 유전자 요법 또는 입양 세포 전달을 위한 세포 변형에 특히 적합한 재조합 기술을 사용하여 생산된 임의의 바이러스를 지칭한다. 재조합 바이러스는 또한 변형된 단백질 및/또는 바이러스에 대해 이종인 단백질을 발현할 수 있다. 바람직한 재조합 바이러스로는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스 (adeno-associated virus: AAV), 단순 헤르페스 바이러스, 레오바이러스, 뉴캐슬병 바이러스, 홍역 바이러스, 백시니아 바이러스, 인플루언스 바이러스 (influence virus) 및 수포성 구내염 바이러스 (vesicular stomatitis virus: VSV)가 포함되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게, 상기 재조합 바이러스는 아데노 연관 바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스이다. 아데노 연관 바이러스 또는 수포성 구내염 바이러스의 생산을 위한 바람직한 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 이의 유도체이다. 재조합 바이러스 생산의 경우, 포유 동물 세포는 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 안정하게 및/또는 일시적으로 형질 감염될 수 있거나, 포유 동물 세포는 상기 바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하도록 형질 도입될 수 있다. 예를 들어, VSV는 무혈청 현탁 배양에서 HEK293 세포 또는 이의 유도체와 같은 포유 동물 세포의 형질 도입에 의해 생성될 수 있다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 관심 대상 생성물을 생산하는 방법에 관한 것이다: (a) 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 재조합 바이러스를의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 관심 대상 생성물을 단리하는 단계.
재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계인 단계 (a)는 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 도입하기 위해 상기 세포를 형질 도입 또는 형질 감염시키는 것을 포함하는데, 여기서, 상기 형질 감염은 일시적인 형질 감염, 안정한 형질 감염 또는 이의 조합일 수 있으며, 상기 형질 감염은 플라스미드와 같은 여러 핵산 분자의 공동 형질 감염을 포함할 수 있다. 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하는 안정하게 형질 감염된 세포의 경우, 상기 재조합 바이러스를 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포 (이종 단백질을 인코딩하는 안정하게 형질 감염된 포유 동물 세포의 경우)는 세포 배양물을 제공하기 위해 기본 배지에 접종되지만, 일시적인 형질 감염 또는 형질 도입은 세포 배양물을 제공하기 위해 기본 배지에 접종된 포유 동물 세포의 접종 후에 및 심지어 공급이 시작된 후에도 발생할 수 있다. 상기 포유 동물 세포는 재조합 바이러스를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자로 일시적으로 형질 감염되거나 목적하는 세포 밀도로 재조합 바이러스로 형질 도입될 수 있으며, 공급은 0 일차에 세포 배양을 시작한 직후에 또는 보다 전형적으로는 상기 배양을 시작한 후 1, 2 또는 3일에 시작할 수 있으며, 이는 포유 동물 세포를 형질 감염 또는 형질 도입하기 전 또는 후일 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 세포는 재조합 바이러스를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자에 의해 일시적으로 형질 감염되거나, 세포 접종 시에, 또는 공급이 시작된 후일 수 있는, 목적하는 세포 밀도가 달성되는 특정 기간 후에, 예를 들어, 배양을 시작한 후 1~7 일차에, 바람직하게는 배양을 시작한 후 2~5 일차에, 보다 바람직하게는 배양을 시작한 후 3~5 일차에 목적하는 세포 밀도로 재조합 바이러스에 의해 형질 감염된다. 바람직하게, HEK293 세포 또는 이의 유도체 (예를 들어, HEK293F 또는 HEK293T 세포)는 접종 및 임의로 공급 후에 재조합 바이러스 (예를 들어, VSV)로 형질 도입되어 재조합 바이러스 (예를 들어, VSV)를 인코딩하는 핵산을 포함하는 HEK293 세포 또는 이의 유도체를 제공한다. VSV와 같은 현탁액 무혈청 세포 배양으로 재조합 바이러스를 생산하는 방법은 그 자체로 당해 분야, 예를 들어, 문헌 [Elahi S.M. et al., Journal of Biotechnology (2019) 289:114-149]에 공지되어 있다.
본 발명에 따른 방법의 특정한 다른 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 100% 초과까지 증가된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질이다.
추가의 별도 또는 추가의 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소될 수 있다. 높은 만노오스 구조는 만노오스 5, 만노오스 6, 만노오스 7, 만노오스 8 및/또는 만노오스 9 구조일 수 있다. 바람직하게, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 감소된 상대량은 상기 이종 단백질의 집단에서 만노오스 5 구조의 감소된 상대량이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체이다. 보다 바람직하게, 만노오스 5 구조를 갖는 (총) 항체의 집단의 상대량은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만이다. 본 출원에서 사용되는 "이종 단백질의 집단"이라는 용어는 동일한 핵산에 의해 인코딩된 샘플의 모든 이종 단백질을 지칭한다. 이종 단백질의 집단은, 예를 들어, 상기 집단에서 개별 이종 단백질의 글리코실화 또는 번역후 변형 또는 분해와 관련하여 불균일할 수 있다.
추가의 별도 또는 추가의 실시 형태에서, 상기 핵산은 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다. 상기 이종 단백질의 집단에서 산성 종의 상대량은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소될 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체, 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 (단일 특이적, 이중 특이적 또는 삼중 특이적) 또는 이의 항원 결합 단편이다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 실시 형태에서, 상기 핵산은 재조합 바이러스를 인코딩하고, 상기 바이러스 역가는 동일한 방법에 의해 생산된 바이러스 역가와 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 바이러스 역가는 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 100% 초과까지 증가된다.
본 발명에 따른 방법의 특정 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 무혈청 및 화학적으로 한정된 배지이며, 상기 공급 배지는 무혈청 및 화학적으로 한정된 배지이다. 또한, 상기 기본 배지 및 공급 배지는 무단백일 수 있다.
(a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키는 방법이 또한 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체 (여기서, 상기 항체는 단일 특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있음) 또는 이의 항원 결합 단편이다.
상기 이종 단백질의 집단에서 산성 종의 상대량은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소될 수 있다. 바람직하게, 상기 집단 중 이종 단백질의 50% 미만은 산성 종이고, 보다 바람직하게는 상기 집단 중 이종 단백질의 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 보다 더 바람직하게는 10% 미만은 산성 종이다.
본 출원에서 사용되는 "산성 종"이라는 용어는 이종 단백질, 특히, 번역후 변형에 의해 생성된 재조합 단클론 항체의 산성 전하 변이체를 지칭한다. 산성 종은 전형적으로 (WCX)-10과 같은 양이온 또는 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수집되며, LC-MS에 의해 특성화될 수 있다. 산성 전하 변이체는 메티오닌 산화, 아스파라긴 탈아미노화, 시스테이닐화, 당화, 환원된 이황화 결합을 포함하지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
(a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법이 또한 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체 (여기서, 상기 항체는 단일 특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있음) 또는 이의 항원 결합 단편이다. 본 발명에 따른 방법, 특히, 본 발명에 따른 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법 및 본 발명에 따른 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키는 방법에 의해 생산된 이종 단백질이 또한 본 발명에서 제공된다.
본 출원에서 사용되는 "높은 만노오스 구조"라는 용어는 비치환된 말단 만노오스 당을 함유하는 높은 만노오스 N-연결된 글리칸을 지칭한다. 이러한 글리칸은 전형적으로 키토비오스 (GlcNAc2) 코어에 부착된 5개 내지 9개의 만노오스 잔기를 포함하므로, 각각 만노오스 5 구조 (Man-5), 만노오스 6 구조 (Man-6), 만노오스 7 구조 (Man-7), 만노오스 8 구조 (Man-8) 및 만노오스 9 구조 (Man-9)로도 또한 지칭되는 MMan5GlcNAc2, Man6GlcNAc2, Man7GlcNAc2, Man8GlcNAc2 및 Man9GlcNAc2 글리칸을 포함한다. 높은 만노오스 구조는 이종 단백질의 짧은 반감기와 연관되며, 만노오스 5 구조는 높은 만노오스 구조를 대표하는 것으로 간주되고 전형적으로는 높은 만노오스 구조에 접근하도록 측정된다. 따라서, 상기 높은 만노오스 구조는 바람직하게는 만노오스 5 구조이다.
본 출원에서 사용되는 "관심 대상 생성물을 단리하는"이라는 용어는 포유 동물 세포로부터 관심 대상 생성물을 포함하는 세포 배양 배지를 단리하고/하거나, 상기 관심 대상 생성물을 포함하는 세포 배양 배지의 수확 후 상기 세포 배양 배지로부터 상기 관심 대상 생성물을 정제하고/하거나, 세포를 용해시키고 상기 포유 동물 세포 용해물로부터 상기 관심 대상 생성물을 정제하는 것을 포함한다. 마찬가지로, 본 출원에서 사용되는 "이종 단백질을 단리하는" 또는 "항체를 단리하는" 또는 "재조합 바이러스를 단리하는"이라는 용어는 포유 동물 세포로부터 이종 단백질 및/또는 항체 또는 재조합 바이러스를 포함하는 세포 배양 배지를 단리하고/하거나, 이종 단백질 및/또는 항체 또는 재조합 바이러스를 포함하는 세포 배양 배지의 수확 후 상기 세포 배양 배지로부터 상기 이종 단백질 및/또는 항체 또는 재조합 바이러스를 정제하고/하거나, 세포를 용해시키고 상기 포유 동물 세포 용해물로부터 상기 이종 단백질 및/또는 항체 또는 재조합 바이러스를 정제하는 것을 포함한다. 항체 또는 재조합 바이러스를 포함하는 이종 단백질을 정제하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
(a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 포유 동물 세포로부터 상기 이종 단백질을 포함하는 세포 배양 배지를 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 이종 단백질을 생산할 때 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하는 방법이 또한 제공되는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체 (단일 특이적, 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체 포함) 또는 이의 단편이다. 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 높거나 증가된 높은 만노오스 구조 (바람직하게는 높은 만노오스 5 구조), 높거나 증가된 저분자량 종 및/또는 높거나 증가된 산성 종일 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
공정 최적화는 특히 높은 씨드 생물 공정과 관련이 있다. 보다 높은 씨딩 밀도는 비생산적인 지수 증식기를 최소화하고, 비교적으로 짧고 높은 생산성 공정을 초래한다. CHO 세포는 유가식 공정에서 항체 또는 융합 단백질과 같은 이종 단백질의 생물 약제 생산에 가장 일반적으로 사용된다. 이러한 공정은 세포가 초기에 생물 반응기에 축적되는 비생산적이거나 덜 생산적인 성장기에 이어서 대부분의 생성물이 생성되는 정지기로 이루어진다. 상기 성장기의 길이는 공정 기간과 부피 생산성에 직접적인 영향을 미친다. N-1 씨드 트레인에서 관류 시스템의 사용에 의해, 이러한 성장기는 N-1 생물 반응기로 이동된다. 관류 방식은 허용 가능한 생존력으로 mL 당 최대 100x106개 세포의 높은 세포 밀도에 도달하기 위해 연속 배지 교환에 의해 폐기물 대사 산물의 연속 제거 및 영양소의 첨가를 가능하게 할 수 있다. N-1 단계에서 관류 공정의 적용을 통해, 높은 씨딩 밀도를 후속 N-단계 (즉, 유가식 공정)에서 달성할 수 있어 즉시 높은 생산성을 초래할 수 있다. uHSD (초고 씨드 밀도) 유가식 공정은 보다 단기간에 비슷한 생성물 품질로 동일한 양의 역가를 생성할 수 있어 제조 능력을 증가시킨다. 또한, 이는 보다 낮은 씨드 공정 보다 동일 기간에 보다 높은 양의 최종 생성물 역가를 생성할 수 있다. 따라서, 높은 씨딩 밀도 배양은 전반적인 생산성을 향상시키는데 유망하지만, 배지 최적화와 관련하여 특히 까다롭고 민감하다. 초고 씨딩 밀도 공정을 개선하기 위해, 본 발명자들은 시스테인 및/또는 락테이트가 배양 성능에 유리한 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. 놀랍게도, 이는 또한 정상적 씨딩 밀도를 사용하여 세포 배양을 향상시키는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따르면, 상기 시스테인은 0.225 mM/일 이상으로 첨가된다. 특히 고 밀도 씨딩 공정 또는 초고 밀도 씨딩 공정의 경우, 시스테인을 0.3 mM/일 이상, 0.4 mM/일 이상 또는 0.5 mM/일 이상으로 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 하나의 실시 형태에서, 상기 시스테인은 약 0.3 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 또는 약 0.4 mM/일 내지 약 0.6 mM/일로 첨가된다. 본 발명에 따른 증가 또는 감소는 방법 또는 배양과 비교하여 측정될 수 있는데, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 시스테인이 고 밀도 씨딩 공정 또는 초고 밀도 씨딩 공정에서 0.3 mM/일 이상으로 첨가되는 경우, 하나의 실시 형태에서, 증가 또는 감소는 방법 또는 배양과 비교하여 측정되는데, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.28 mM/일 이하로 첨가한다.
그러나, uHSD 공정은 종종 초기 생존력 저하를 특징으로 한다. 본 발명의 방법에 따른 락테이트 및 시스테인의 첨가는 이러한 문제를 극복한다. 따라서, 하나의 실시 형태에서, 상기 유가식 공정은 uHSD 유가식 공정이다.
세포 배양 성능을 개선하기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도
하나의 양태에서, 본 발명은 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도에 관한 것인데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 포함한다. 바람직하게, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 제공한다. 본 발명의 용도의 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체, 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체이다 (여기서, 상기 항체는 단일 특이적 및 다중 특이적일 수 있음).
본 발명은 또한 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조, 예를 들어, 만노오스 5 구조를 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도에 관한 것인데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 포함한다. 바람직하게, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 제공한다.
본 발명은 또한 이종 단백질의 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하기 위한 공급 배지에서의 용도에 관한 것인데, 여기서, 바람직하게는 상기 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 증가된 높은 만노오스 구조 (예를 들어, 만노오스 5 구조), 증가된 저분자량 종 및/또는 증가된 산성 종이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상, 예를 들어, 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상 또는 0.4 mM/일 이상으로 제공한다.
본 발명은 또한 유가식 공정으로 이종 단백질 역가 및/또는 세포 비생산성을 증가시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도에 관한 것이다. 유가식 공정으로 재조합 바이러스 생산을 증가시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도가 또한 제공된다.
본 발명의 용도의 하나의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체이다 (여기서, 상기 항체는 단일 특이적 및 다중 특이적일 수 있음). 본 발명에 따른 용도에 따른 유가식 공정은 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는데, 여기서, 상기 포유 동물 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같은 임의의 포유 동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포이다.
락테이트 또는 락테이트와 시스테인의 사용은 본 발명의 방법에 따른다. 따라서, 상기 락테이트와 시스테인은 약 8:1 내지 50:1, 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1, 보다 바람직하게는 약 15:1 내지 약 30:1, 보다 더 바람직하게는 약 15:1 내지 약 30:1의 락테이트/시스테인 몰비로 첨가되어야 한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 락테이트는 3 mmol/L/일 이상, 3.8 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 바람직하게는 7 mmol/L/일 이상, 7.8 mmol/L/일 이상, 10 mmol/L/일 이상 또는 심지어 15 mmol/L/일 이상으로 첨가된다. 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트는 0.5 g/L 이상, 1 g/L 이상, 바람직하게는 2 g/L 이상, 바람직하게는 2 내지 4 g/L, 보다 바람직하게는 약 2 내지 3 g/L로 유지될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트 농도는 약 1 g/L 내지 약 4.5 g/L (약 10 내지 50 mM), 약 2 g/L 내지 약 4 g/L (약 20~45 mM), 바람직하게는 약 2 g/L 내지 약 3 g/L (약 20~35 mM)로 유지된다. 상기 락테이트 (MW = 89.07 g/mol)는 이의 염 및/또는 수화물로서 및/또는 락트산으로서, 바람직하게는 나트륨 락테이트 (MW = 112.06 g/mol)로서 제공될 수 있는데, 여기서, 1 g/L의 락테이트는 약 1.25 g/L의 나트륨 락테이트와 동일하다. 락테이트 또는 락트산의 염 및/또는 수화물은 본 출원에서 제공된 락테이트 농도와 등몰 농도로 제공된다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 기본 배지는 배지 성분으로서 첨가된 락테이트를 함유하지 않는다. 그러나, 락테이트는 대사 산물로서 기본 배지에서의 배양 동안 생성될 수 있다.
상기 시스테인은 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물, 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 제공될 수 있다. 시스테인 염 및/또는 수화물, 또는 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드는 본 출원에 제공된 시스테인 농도와 등몰 농도로 제공된다. 본 발명에 따르면, 상기 시스테인은 0.225 mM/일 이상으로 첨가된다. 여기서, 상기 시스테인은 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 첨가된다. 바람직하게, 상기 시스테인은 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.4 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mM/일 이상으로 첨가된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 시스테인은 약 0.225 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.25 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.3 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 또는 약 0.4 mM/일 내지 약 0.6 mM/일로 첨가된다.
본 발명에 따른 용도의 특정 실시 형태에서, 상기 이종 단백질 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 100% 초과까지 증가된다.
또 다른 실시 형태에서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소될 수 있다. 감소된은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하는 것을 의미하는데, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 높은 만노오스 구조는 만노오스 5, 만노오스 6, 만노오스 7, 만노오스 8 및/또는 만노오스 9 구조일 수 있다. 바람직하게, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 감소된 상대량은 상기 이종 단백질의 집단에서 만노오스 5 구조의 감소된 상대량이다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체이며, 만노오스 5 구조를 갖는 (총) 항체의 집단의 상대량은 20% 미만, 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만 또는 심지어 2% 미만이다.
추가의 별도 또는 추가의 실시 형태에서, 상기 이종 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체, 또는 융합 단백질로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있고, 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 항체의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다. 상기 항체의 집단에서 산성 종의 상대량은 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60% 적어도 80% 또는 적어도 90%까지 감소될 수 있다. 바람직하게, 상기 이종 단백질은 항체이다 (여기서, 상기 항체는 단일 특이적 또는 다중 특이적 항체일 수 있음).
본 발명에 따른 용도의 또 다른 실시 형태에서, 재조합 바이러스가 생산되고, 상기 바이러스 역가는 동일한 방법에 의해 생산된 바이러스 역가와 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 공급 배지는 시스테인을 락테이트의 부재하에 0.225 mM/일 미만으로 첨가한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 바이러스 역가는 적어도 20%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 100% 초과까지 증가된다.
본 발명에 따른 용도는 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 높은 씨드 밀도 및 초고 씨드 밀도 (uHSD) 유가식 공정에서 사용될 수 있다.
개선된 세포 배양 성능을 위한 공급 배지
더 또 다른 양태에서, 본 발명은 락테이트 및 시스테인을 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mM/mM)로 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 공급 배지에 관한 것인데, 여기서, 상기 시스테인은 0.225 mM/일 이상으로 첨가된다. 바람직하게, 상기 공급 배지는 별도의 첨가를 위한 하나 이상의 공급 보충제를 포함한다. 특히, 상기 시스테인은 시스테인을 포함하는 공급 배지 및 시스테인을 포함하는 별도로 첨가되는 공급 보충제를 첨가하는 것과 같은 2가지 공급 전략으로 첨가될 수 있다. 락테이트는 바람직하게는 공급 배지와 함께 첨가되지만, 또한 공급 보충제에 별도로 첨가될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 상기 공급 배지 또는 공급 보충제는 화학적으로 한정된다 (임의로 인슐린 또는 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)와 같은 재조합 단백질을 포함함). 또한, 본 발명에 따른 공급 배지 또는 공급 보충제는 세포를 포함하지 않고 (즉, 세포를 포함하는 세포 배양물이 아님), 배양 중인 세포와 접촉하지 않고/않거나 (세포 배양물로부터 유래된 사전 조건 배지), 세포 유래된 대사 폐기물을 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 공급 배지는 본 출원에서 기재된 방법 및 용도에서 사용될 수 있으므로, 상기 방법에 대해 구체화되고 기재된 실시 형태는 마찬가지로 상기 공급 배지에 적용된다.
상기 공급 배지는 또한 키트에 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 (a) 락테이트 및 임의로 시스테인을 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 농축된 공급 배지, 및 (b) 시스테인을 포함하는 농축된 공급 배지로부터 분리된 수성 보충제를 포함하는 키트에 관한 것인데, 여기서, 상기 공급 배지 및 보충제는 세포 배양 시작 부피의 5% 미만, 바람직하게는 4% 미만, 보다 바람직하게는 3.5% 미만의 매일 첨가에서 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인 몰비 (mM/mM) 및 0.225 mM/일 이상의 시스테인을 제공한다. 본 발명에 따른 키트에 의해 제공되는 공급 배지는 본 출원에서 기재된 방법 및 용도에서 사용될 수 있으므로, 상기 방법에 대해 구체화되고 기재된 실시 형태는 마찬가지로 상기 키트에 적용된다.
특히, 상기 공급 배지 및 키트는 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는 유가식 공정에 특히 유용한데, 여기서, 상기 포유 동물 세포는 본 출원에서 기재된 바와 같은 임의의 포유 동물 세포일 수 있으며, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포는 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포이다.
상기 공급 배지는 본 발명의 방법에 따른 락테이트 및 시스테인을 제공하도록 조정된다. 따라서, 공급 배지 또는 상기 공급 배지를 제공하는 키트는 락테이트와 시스테인을 약 8:1 내지 50:1, 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1, 보다 바람직하게는 약 15:1 내지 약 30:1, 보다 더 바람직하게는 약 15:1 내지 약 25:1의 락테이트/시스테인 몰비로 제공하도록 조정된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 락테이트는 3 mmol/L/일 이상, 3.8 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 바람직하게는 7 mmol/L/일 이상, 7.8 mmol/L/일 이상, 10 mmol/L/일 이상 또는 심지어 15 mmol/L/일 이상으로 제공된다. 상기 락테이트 (MW = 89.07 g/mol)는 이의 염, 에스테르 및/또는 수화물 및/또는 락트산, 바람직하게는 염, 예를 들어, 나트륨 락테이트 (MW = 112.06 g/mol)로서 제공될 수 있는데, 여기서, 1 g/L의 락테이트는 약 1.25 g/L의 나트륨 락테이트와 동일하다. 락테이트 또는 락트산의 염 및/또는 수화물은 본 출원에서 제공된 락테이트 농도와 등몰 농도로 제공된다.
상기 시스테인은 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물, 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 본 발명에 따른 공급 배지 또는 키트에 제공될 수 있다. 시스테인 염 및/또는 수화물, 또는 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드는 본 출원에 제공된 시스테인 농도와 등몰 농도로 제공된다. 상기 공급 배지 또는 키트는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 기본 배지 또는 세포 배양 배지에 제공하도록 조정된다. 바람직하게, 상기 시스테인은 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.4 mM/일 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mM/일 이상으로 첨가된다. 하나의 실시 형태에서, 상기 시스테인은 약 0.225 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.25 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 약 0.3 mM/일 내지 약 0.6 mM/일, 또는 약 0.4 mM/일 내지 약 0.6 mM/일로 첨가된다.
본 발명에 따른 공급 배지 및 키트는 또한 본 출원에서 기재된 바와 같은 높은 씨드 밀도 및 초고 씨드 밀도 (uHSD) 유가식 공정에서 사용될 수 있다.
상기의 관점에서, 본 발명은 또한 하기 항목들을 포괄하는 것으로 인식될 것이다:
항목 1은 다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 관심 대상 생성물을 생산하는 방법을 제공한다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 관심 대상 생성물을 단리하는 단계.
항목 2는 상기 공급 배지가 매일, 바람직하게는 연속적으로 첨가되는, 항목 1에 따른 방법을 제공한다.
항목 3은 상기 락테이트/시스테인의 몰비가 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1인, 항목 1 또는 2에 따른 방법을 제공한다.
항목 4는 상기 락테이트가 3 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 7 mmol/L/일 이상 또는 10 mmol/L/일 이상으로 첨가되는, 항목 1 내지 3 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 5는 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트가 0.5 g/L 이상, 1 g/L 이상, 2 g/L 이상, 바람직하게는 2 내지 4 g/L로 유지되는, 항목 4에 따른 방법을 제공한다.
항목 6은 (a) 상기 시스테인이 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물, 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 제공되고/되거나; (b) 상기 시스테인이 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상 또는 0.4 mM/일 이상으로 첨가되는, 항목 1 내지 5 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 7은 상기 관심 대상 생성물이 이종 단백질 또는 재조합 바이러스인, 항목 1 내지 6 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 8은 상기 핵산이 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하는, 항목 1 내지 7 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 9는 상기 핵산이 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 높은 만노오스 구조가 만노오스 5 구조인, 항목 1 내지 8 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 10은 상기 핵산이 이종 단백질을 인코딩하고, 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가하는, 항목 1 내지 9 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 11은 상기 기본 배지 및 공급 배지가 무혈청이고 화학적으로 한정되는, 항목 1 내지 10 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 12는 상기 이종 단백질이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질인, 항목 1 내지 11 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 13은 상기 항체, 이중 특이적 항체 또는 삼중 특이적 항체가 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 항체인, 항목 12에 따른 방법을 제공한다.
항목 14는 다음 단계를 포함하는 유가식 공정으로 포유 동물 세포를 배양하는 방법을 제공한다: (a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; 및 (d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계.
항목 15는 (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 산성 종의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다.
항목 16은 (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다.
항목 17은 (a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계; (b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계; (c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; (d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 임의로, 상기 포유 동물 세포로부터 상기 이종 단백질을 단리하는 단계를 포함하는 유가식 공정으로 이종 단백질을 생산할 때 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하는 방법을 제공하는데, 여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지는 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가한다.
항목 18은 상기 포유 동물 세포가 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포가 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포인, 항목 1 내지 17 중 어느 한 항목에 따른 방법을 제공한다.
항목 19는 항목 15 내지 17 중 어느 한 항목에 따른 방법에 의해 생산된 이종 단백질을 제공한다.
항목 19는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도를 제공하는데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 첨가한다.
항목 21은 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도를 제공하는데, 여기서, 상기 공급 배지는 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 포함하고, 바람직하게는 높은 만노오스 구조는 만노오스 5 구조이다.
항목 22는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질의 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도를 제공하는데, 여기서, 바람직하게는 상기 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향은 증가된 높은 만노오스 구조, 증가된 저분자량 종 및/또는 증가된 산성 종이다.
항목 23은 유가식 공정으로 이종 단백질 역가 및/또는 세포 비생산성을 증가시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도를 제공한다.
항목 24는 상기 유가식 공정이 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 포유 동물 세포가 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포가 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포인, 항목 20 내지 23 중 어느 한 항목에 따른 용도를 제공한다.
항목 25는 락테이트 및 시스테인을 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mM/mM)로 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 공급 배지를 제공한다.
항목 26은 상기 공급 배지가 별도의 첨가를 위한 하나 이상의 공급 보충제를 포함하는, 항목 25의 공급 배지를 제공한다.
항목 27은 (a) 락테이트 및 임의로 시스테인을 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 농축된 공급 배지, 및 (b) 시스테인을 포함하는 농축된 공급 배지로부터 분리된 수성 보충제를 포함하는 키트를 제공하는데, 여기서, 상기 공급 배지 및 보충제는 세포 배양 시작 부피의 5% 미만, 바람직하게는 3.5% 미만의 매일 첨가에서 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인 몰비 (mM/mM) 및 0.225 mM/일 이상의 시스테인을 제공한다.
실시예
실시예 1: uHSD (초고 씨딩 밀도) 공정
단클론 IgG1 항체 (mAb)를 생산하는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포주 (세포주 A; CHO-K1 GS)를 유가식 방식으로 3 L 유리 생물 반응기 시스템에서 배양하였다. 관류 방식으로 2 L 일회용 생물 반응기 시스템에서 처리되는 N-1 단계까지 씨드 트레인 배양물을 진탕 플라스크에서 처리하였다. 0.4 g/L 시스테인 HCl H2O (2.3 mM 시스테인; MW 시스테인 HCl H2O = 173.63 g/mol), 0.028 g/L L-시스틴 2HCl (0.36 mM 시스테인; MW 시스틴 HCl = 157.62 mM) 및 락테이트 부재를 포함하는 자체 제조 기본 배지에서 씨딩 세포 밀도를 2.2 L의 시작 부피로 10x10E06개 세포/mL로 설정하였다. 유가식 배양을 13~14일 동안 수행하였다. 공급 배지 (1.21 g/L 시스테인 HCl H2O 포함; 0.0069 M 시스테인 및 락토오스 부재)를 0 일차부터 공정의 종료까지 (d0~d9: 45 ml/L/일; d9~d14: 25 ml/ L/일) 연속적으로 첨가하고, 글루코오스를 요구에 따라 공정에 첨가하여 ≥ 3 g/L 내지 5 g/L로 유지하였다. 나트륨 락테이트 및 추가의 시스테인 HCl H2O를 표 2에 나타낸 바와 같이 볼루스 첨가로 첨가하였다. 락테이트 농도가 3 g/L의 목표 농도 (스톡 용액 238.5 g/L, 2.68 mol/l)로 2 g/L 미만으로 하락한 경우, 락테이트를 3 일차부터 13 일차까지 볼루스 첨가에 의해 uHSD LAC 및 uHSD LAC/CYS 생물 공정에 첨가하였다. uHSD LAC/CYS 및 uHSD CYS 공정에 대한 시스테인 볼루스 첨가를 1 일차부터 5 일차까지 7 ml (스톡 용액 시스테인 HCl H2O: 30 g/L (20.69 g/L 시스테인; 0.17 mol/L)의 부피로 수행하였다. 배양 샘플을 24 시간 마다 채취하고, Cedex HiRes 분석기 (Roche, Germany)를 사용하여 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. Konelab Prime60i (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 글루코오스와 락테이트를 측정하였다. 항체 농도를 단백질-A HPLC 방법 (Thermo Scientific, USA)으로 측정하였다.
[표 2]
uHSD 공정으로 테스트된 실험 설정
생존 세포 밀도 (VCD), 생존력, 생성물 농도 및 락테이트 농도에 대한 락토오스, 시스테인, 또는 락토오스와 시스테인의 효과는 도 1a~1d에 도시되어 있다.
도 1a 및 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 락테이트와 시스테인 (uHSD LAC/CYS) 및 시스테인 단독 (uHSD CYS)의 공급은 추가의 락테이트 및 시스테인 공급 (uHSD) 없이 공급되고 락테이트 단독 (uHSD LAC)으로 공급된 세포와 비교하여 약 6 일차부터 시작하여 생존력 및 VCD를 개선하였다. 특히, 배양의 종료시에, 락테이트와 시스테인 (uHSD LAC/CYS)으로 공급된 세포의 생존력은 시스테인 단독 (uHSD CYS)으로 공급된 세포의 생존력 보다 훨씬 더 높은 것으로 보인다.
생산과 관련하여, 락테이트 공급 (uHSD LAC)은 배양 동안 IgG 역가에 긍정적인 영향을 미쳤지만, 이는 배양의 종료까지 지속될 수 없는 것으로 보인다. 추가의 cys 공급 (uHSD CYS)을 달성하는 세포 배양에서의 IgG 역가는 대조군 세포 배양 (uHSD)과 비슷하였다. 놀랍게도, 락테이트와 시스테인을 포함하는 세포 배양물 (uHSD LAC/CYS 세포)의 IgG 역가는 락테이트 또는 시스테인 단독에 의한 볼루스 공급과 비교하여 크게 증가하였다. 이는 주로 10 일차 후에 증가된 비생산성 (pg/세포/일)에 기인하였다 (데이터는 표시되지 않음).
도 1d에 도시된 바와 같이, 락테이트는 약 5 일차 내지 10 일차에 배양물에서 고갈되고, uHSD LAC/CYS 배양물에서 계속 2 g/L 초과이었다. 6 및 9 일차에 uHSD CYS 배양물 중의 락테이트 감소는 높은 세포 농도와 높은 비 락테이트 흡수율에 기인할 가능성이 높다.
전반적으로, 고 밀도 공급의 경우, 나트륨 락테이트와 시스테인의 볼루스 첨가를 포함하는 uHSD 공정은 개선된 생성물 역가 및 세포 생존율 프로파일을 초래하였다.
실시예 2: 규칙적인 유가식 공정에서의 DoE 최적화 연구
세포 배양에 대한 시스테인 및/또는 락테이트의 효과를 추가로 보다 자세히 분석하기 위해, 본 발명자들은 생물 반응기를 사용하는 제어된 조건하에 2개의 상이한 세포주를 사용하여 규칙적인 씨딩 밀도를 사용하여 규칙적인 유가식 공정을 수행하였다.
각각 IgG1 단클론 항체 (mAb)를 생산하는 2개의 CHO-K1 GS 세포주 (세포주 A 및 B)를 ambr 250 생물 반응기 시스템에서 배양하였다. 실험은 실험 설계 (Design of Experiment: DoE) 연구의 일부이었다. 씨드 트레인 배양물을 진탕 플라스크에서 처리하고, 씨딩 세포 밀도를 0.7x10E06개 세포/ml로 설정하였다. 유가식 배양을 14일 동안 수행하였다. uHSD 공정과 대조적으로, 생물 반응기에서 고농도의 반응성 화합물 시스테인을 감소시키고 규칙적으로 적용되는 공급물에 락테이트를 포함시키기 위해, 락테이트 및 시스틴의 연속 적용을 이러한 실험에서 적용하였다.
공급 배지 (1.1 g/L 시스테인 HCl H2O; 0.0063 M 시스테인 포함)를 2 일차부터 30 ml/L/일 (배양 시작 부피)로 공정의 종료까지 연속적으로 첨가하고, 요구에 따라 글루코오스를 공정에 첨가하였다. 배양 샘플을 24 시간 마다 채취하고, Cedex HiRes 분석기 (Roche, Germany)를 사용하여 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. Konelab Prime60i (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 글루코오스와 락테이트를 측정하였다. 항체 농도를 단백질-A HPLC 방법 (Thermo Scientific, USA)으로 측정하였다. UV 검출을 갖는 HPLC 시스템에 연결된 PrpPac WCX-10 분석용 컬럼을 사용하여 전하 변이체를 분석하였다. UV 검출을 갖는 HPLC 시스템에 연결된 BEH200 SEC 컬럼으로 크기 변이체를 분석하였다. LabChip GXII 및 HT Glycan Reagent Kit를 사용하여 N-글리칸 측정을 수행하였다.
다양한 농도의 시스테인 및 락테이트 공급의 상호 작용을 확인하기 위해, 실험 설계 (DoE) 연구를 수행하였다. DoE 연구는 여러 입력 인자의 변화를 허용하고 다양한 출력 파라미터에 대한 조합 및 단일 효과를 측정하는 데이터 수집 및 분석 도구이다. 따라서, 이러한 종류의 연구는 공정에서 동시에 여러 입력의 수준을 변경하여 공정에서 여러 인자의 상호 작용을 식별할 수 있다.
DoE 연구는 I-최적 설계를 기반으로 하며, 0 내지 1.67 ml/L/일 (즉, 0, 0.12 및 0.24 mM/일에 상응하는 0, 0.84 및 1.67 ml/L/일)의 공급 범위의 시스틴 (17.2 g/L 시스틴 (약 143 mM 시스테인에 상응함)을 갖는 제2 공급으로서)과 0 내지 30 g/L (즉, 0, 0.133 및 0.267 M에 상응하는 0, 15 또는 30 g/L, 및 0, 4 및 8 mM/일의 매일 첨가)의 스톡 용액의 나트륨 락테이트 (30 ml/L/일을 갖는 규칙적인 공급에 포함됨) 인자를 포함하였다. 시스테인을 공급 배지 (30 ml/L/일의 6.3 mM; 0.19 mM/일의 매일 첨가에 상응함)와 함께 첨가하였기 때문에, 0, 0.84 및 1.64로 언급된 샘플에서 시스테인의 총 매일 첨가량은 각각 0.19, 0.31 및 0.43 mM/일이다.
세포주 A에 대한 규칙적인 공정에서 VCD, 생존력, 생성물 역가 및 락테이트 농도에 대한 시스테인 및/또는 락테이트 공급의 효과는 도 2a~2d에서 도시되어 있으며, 세포주 B에 대한 경우는 도 2e~2h에서 도시되어 있다. 두 세포주 모두의 경우, 역가 (도 2c 및 2g) 및 세포 생존능 (도 2b 및 2f)에 대한 유리한 효과는 락테이트와 시스틴 공급에서 관찰되었다.
수확 생존력 및 수확시의 생성물 역가에 대한 락테이트와 시스틴 조합 공급의 긍정적인 효과는 DoE 등고선 플롯으로 제시되어 있다 (세포주 A: 도 3 및 4; 세포주 B: 도 6 및 7). 세포주 B를 사용하여 보다 높은 생성물 역가를 달성하였으며, 도 4 및 7에서의 생성물 역가를 실험에서, 즉, 세포주 B에 대해 최고 역가에 대해 정규화된 역가 [%]로서 제공하였다. 세포주 B에 대한 다양한 농도의 사용은 최고 생성물 역가가 높은 락테이트 및 높은 시스테인에서 수득될 수 있다는 것을 나타냈다. 유사한 결과는 세포주 A에 대해 나타났는데, 이는 또한 높은 락테이트 및 높은 시스테인이 수확 생존력 및 생성물 역가를 증가시킨다는 것을 입증한다.
공지된 항산화제로서의 시스테인은 또한 항체의 산성 전하 변이체를 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 그러므로, 산성 전하 변이체 (산성 피크 그룹 (acidic peak group: APG)), 저분자량 종 (LMWs) 및 높은 만노오스 종과 같은 생성물 품질 속성에 대한 락테이트와 시스테인 조합 공급의 효과를 측정하였다. 놀랍게도, APG, LMWs 및 높은 만노오스 구조에 대한 락테이트 공급의 긍정적인 효과는 도 5 및 8 (APG), 도 9 (높은 만노오스) 및 도 10 (LMW)s에서 알 수 있는 바와 같이 입증되었다.
도 5 및 8은 락테이트 및 시스틴 공급의 함수로서 각각 세포주 A 및 B에 대한 APG를 도시한 것이다. 도 5 및 8로부터 알 수 있는 바와 같이, 시스테인 공급으로 인한 APG의 증가를 추가의 락테이트 공급을 통해 크게 감소시킬 수 있다. 또한, 도 9a 및 9b로부터 알 수 있는 바와 같이, 항체의 만노오스 5 구조 (Man5)를 세포주 A 및 세포주 B에 의해 생산된 2개의 상이한 IgG1 항체에 대한 락테이트 농도 증가로 감소시킬 수 있다.. 마지막으로, 도 10은 시스테인 (도 10a 및 10c) 및 락테이트 (도 10b 및 10d) 농도의 함수로서 세포주 A 및 B에 대한 DoE의 최고 값 (세포주 B로 수득됨)으로 정규화된 LMWs를 도시한 것이다. 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 생산된 항체의 LMWs는 락테이트 또는 시스틴 공급의 증가에 따라 감소하였는데, 이는 높은 락테이트 및 높은 시스테인 농도 모두에 의해 감소된 LMWs의 상승 효과를 초래하였다.
실시예 3: 추가의 세포주에 의한 결과의 재현성
단클론 항체 (mAb)를 생산하는 CHO-DG44 GS 및 CHO-K1 GS 세포를 포함하는 4개의 추가 CHO 세포주를 ambr15 생물 반응기 시스템에서 배양하였다. 세포주 C 및 F는 각각 상이한 특이성을 갖는 IgG4 단클론 항체를 생산하며, 세포주 D 및 E는 각각 상이한 특이성을 갖는 IgG1 단클론 항체를 생산한다. 씨드 트레인 배양물을 진탕 플라스크에서 처리하고, 씨딩 세포 밀도를 0.7x10E06개 세포/ml로 설정하였다. 유가식 배양을 14일 동안 수행하였다. 공급 배지를 2 일차부터 공정의 종료까지 계속해서 첨가하고, 글루코오스를 실시예 2에서 기재된 바와 같이 요구에 따라 공정에 첨가하였다. 또한, 표 3에 나타낸 바와 같이, 시스테인 (1.1 g/L 시스테인 HCl H2O; 0.0063 M) 및 락테이트 (267 mM)를 포함하는 공급 배지, 또는 시스테인을 포함하지만 락테이트를 포함하지 않는 공급 배지 (배양 시작 부피의 30 ml/L/일로 규칙적인 연속 공급으로 첨가됨, 공급 1) 및/또는 제2 시스테인 공급 (공급 2)를 사용하는 가변 공급으로 공정을 수행하였다. 공급 배지에 대한 첨가 전에 나트륨 락테이트를 제공하기 위해 상기 락테이트를 NaOH로 적정된 나트륨 락테이트 또는 락트산으로서 수득하였다. 배양 샘플을 24 시간 마다 채취하고, Cedex HiRes 분석기 (Roche, Germany)를 사용하여 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. Konelab Prime60i (Thermo Scientific, USA) 또는 Biosen S-Line (EKF-diagnostics GmbH, UK)을 사용하여 글루코오스, 락테이트 및 항체 농도를 측정하였다.
[표 3]
재현성 실험을 위한 실험 설정
4개의 추가 CHO 세포주에 대한 실험은 공정 성능에 대한 락테이트와 시스틴 공급의 조합의 긍정적인 효과를 확인하였다. 4개의 세포주 모두에서 락테이트와 시스틴 공급의 조합으로 최고 세포 생존율 및 생성물 역가를 수득하였다 (도 11 내지 도 14 참조).
실시예 4: uHSD 공정의 DoE 최적화
IgG1 단클론 항체 (mAb)를 생산하는 2개의 CHO-K1 GS 세포주 A 및 B를 ambr 250 생물 반응기 시스템에서 배양하였다. 관류 방식으로 2 L 일회용 생물 반응기 시스템에서 처리되는 N-1 단계까지 씨드 트레인 배양물을 진탕 플라스크에서 처리하였다. 유가식 배양을 14일 동안 수행하였다. 공급 배지 (1.1 g/L 시스테인 HCl H2O (0.0063 M 시스테인) 및 0, 15 또는 30 g/L 나트륨 락테이트 (0, 0.133 또는 0.267 M 락테이트)를 포함함)를 0 일차부터 공정의 종료까지 연속적으로 첨가하였다. 씨딩 세포 밀도 (SCD)를 5 내지 10x10E06개 세포/ml로 설정하였다. 글루코오스를 요구에 따라 공정에 첨가하였다. 배양 샘플을 24 시간 마다 채취하고, Cedex HiRes 분석기 (Roche, Germany)를 사용하여 세포 계수 및 세포 생존율 측정을 수행하였다. Konelab Prime60i (Thermo Scientific, USA)를 사용하여 글루코오스와 락테이트를 측정하였다. 항체 농도를 단백질-A HPLC 방법 (Thermo Scientific, USA)으로 측정하였다.
실험 설계 (DoE) 연구는 0 내지 4.8 ml/L/일 (즉, 0, 0.12 및 0.24 mM/일에 상응하는 0, 2.4 및 4.8 ml/L/일)의 공급 범위의 시스틴 (5.98 g/L 시스틴 (약 49.83 mM에 상응함)을 갖는 제2 공급으로서)과 0 내지 30 g/L (즉, 0, 15 또는 30 g/L; 0, 0.133 및 0.267 M에 상응함, 및 45 ml/L/일의 5.98 및 11.96 mM/일 및 25 ml/L/일의 3.32 및 6.64 mM/일의 매일 첨가)의 나트륨 락테이트 (배양 시작 부피의 0 일차 내지 9 일차의 45 ml/L/일 및 9 일차 내지 14 일차의 25 ml/L/일을 갖는 규칙적인 공급에 포함됨) 인자를 포함하는 I-최적 설계를 기반으로 하였다. 시스테인을 또한 공급 배지 (45 ml/L/일의 6.3 mM; 0.28 mM/일 및 25 ml/L/일의 매일 첨가에 상응함, 0.16 mM/일의 매일 첨가에 상응하는)와 함께 첨가하였기 때문에, 제2 공급에 0, 2.4 및 4.8 ml/L/일을 첨가하는 샘플에서 시스테인의 총 매일 첨가량은 각각 45 ml/L/일의 매일 첨가시 0.28, 0.4 및 0.52 mM/일 및 25 ml/L/일 매일 첨가시 0.16, 0.28 및 0.4 mM/일이다.
[표 4]
실험 설정
생성물 역가에 대한 락테이트와 시스틴 조합 공급의 긍정적인 효과는 14 일차 수확시에 세포주 A에 대해 도 15에서, 세포주 B에 대해 도 16에서 DoE 등고선 플롯으로 제시되어 있다. 세포주 B를 사용하여 보다 높은 생성물 역가를 달성하였으며, 도 15 및 16에서의 생성물 역가를 실험에서, 즉, 세포주 B에 대해 최고 역가에 대해 정규화된 역가 [%]로서 제공하였다. 테스트된 두 세포주 모두에 대해 높은 락테이트 및 높은 시스테인 공급으로 최고 생성물 역가를 수득하였다.
락테이트 공급과 수확 생존력의 양의 상관 관계는 도 17 및 18에 추가로 제시되어 있다. 적합도 R2 및 예측도 Q2는 각 모델에 대해 제시되어 있다. 수확시 산성 전하 변이체 및 높은 만노오스와 같은 생성물 품질 속성에 대한 효과는 도 19 내지 도 22에 제시되어 있다. 높은 시스테인 공급으로 인한 산성 전하 변이체 (APG)의 증가가 추가의 락테이트 공급에 의해 크게 감소된 것으로 두 세포주 모두에 대해 나타났다.
Claims (18)
- 하기 단계를 포함하는 유가식 (fed-batch) 공정으로 관심 대상 생성물을 생산하는 방법:
a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 공급 보충제 (feed supplement)를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지 (feed medium)를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계;
d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및
e) 임의로, 상기 관심 대상 생성물을 단리하는 단계. - 제1항에 있어서, 상기 락테이트/시스테인의 몰비가 약 10:1 내지 50:1, 바람직하게는 약 10:1 내지 약 30:1인, 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서,
a) 상기 락테이트가 3 mmol/L/일 이상, 5 mmol/L/일 이상, 7 mmol/L/일 이상 또는 10 mmol/L/일 이상으로 첨가되고/되거나;
b) 상기 세포 배양 배지 중의 락테이트가 0.5 g/L 이상, 1 g/L 이상, 2 g/L 이상, 바람직하게는 2 내지 4 g/L로 유지되고/되거나;
c) 상기 시스테인이 시스테인 또는 이의 염 및/또는 수화물, 시스틴 또는 이의 염, 또는 시스테인을 포함하는 디펩타이드 또는 트리펩타이드로서 제공되고/되거나;
d) 상기 시스테인이 0.25 mM/일 이상, 0.3 mM/일 이상 또는 0.4 mM/일 이상으로 첨가되는, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 대상 생성물이 이종 단백질 또는 재조합 바이러스인, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산이 이종 단백질을 인코딩하고,
(a) 상기 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성 (specific productivity)이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 생성물 역가 및/또는 세포 비생산성과 비교하여 증가되고, 여기서, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고/하거나;
(b) 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 여기서, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 높은 만노오스 구조가 만노오스 5 구조이고/이거나;
(c) 상기 이종 단백질의 집단에서 (총) 산성 종의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가하는, 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기본 배지 및 공급 배지가 무혈청이고 화학적으로 한정되는, 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 단백질이 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 이중 특이적 항체, 삼중 특이적 항체 또는 융합 단백질인, 방법.
- 하기 단계를 포함하는 유가식 공정으로 포유 동물 세포를 배양하는 방법:
a) 관심 대상 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계; 및
d) 상기 관심 대상 생성물의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계. - a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계;
d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및
e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계
를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종을 감소시키는 방법으로서,
여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 산성 종의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가하는, 방법. - a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계;
d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및
e) 임의로, 상기 이종 단백질을 단리하는 단계
를 포함하는 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 높은 만노오스 구조를 감소시키는 방법으로서,
여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 높은 만노오스 구조의 상대량이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 시스테인을 0.19 mM/일 이하로 첨가하고, 바람직하게는 상기 높은 만노오스 구조가 만노오스 5 구조인, 방법. - a) 이종 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 포유 동물 세포를 제공하는 단계;
b) 상기 포유 동물 세포를 기본 배지에 접종하여 세포 배양물을 제공하는 단계;
c) 하나 이상의 공급 보충제를 상기 세포 배양물에 첨가하는 것을 포함하는 공급 배지를 첨가하되, 여기서, 상기 공급 배지가 세포 배양 배지를 생성하는 기본 배지 또는 생성된 세포 배양 배지에 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mmol x L-1 x 일-1/mmol x L-1 x 일-1)로 락테이트 및 시스테인을 첨가하고, 상기 시스테인이 0.225 mM/일 이상으로 첨가되는 단계;
d) 상기 이종 단백질의 발현을 가능하게 하는 조건하에 상기 세포 배양 배지에서 상기 포유 동물 세포를 배양하는 단계; 및
e) 임의로, 상기 포유 동물 세포로부터 상기 이종 단백질을 단리하는 단계
를 포함하는 유가식 공정으로 이종 단백질을 생산할 때 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하는 방법으로서,
여기서, 상기 이종 단백질의 집단에서 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향이 동일한 방법에 의해 생산된 이종 단백질의 집단과 비교하여 감소되고, 상기 공급 배지가 락테이트의 부재하에 동일한 농도의 시스테인을 첨가하는, 방법. - 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 이종 단백질.
- 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질에서 산성 종 및/또는 높은 만노오스 구조를 감소시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도로서, 여기서, 상기 공급 배지가 시스테인을 0.225 mM/일 이상으로 첨가하는, 용도.
- 유가식 공정으로 생산된 이종 단백질의 생성물 품질 특성에 대한 시스테인의 부정적인 영향을 방지하기 위한 공급 배지에서의 락테이트의 용도로서, 바람직하게는 상기 생성물 품질 특성에 대한 부정적인 영향이 증가된 높은 만노오스 구조, 증가된 저분자량 종 및/또는 증가된 산성 종인, 용도.
- 유가식 공정으로 이종 단백질 역가 및/또는 세포 비생산성을 증가시키기 위한 공급 배지에서의 락테이트 및 시스테인의 용도.
- 상기 유가식 공정이 포유 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 여기서, 상기 포유 동물 세포가 HEK293 세포 또는 CHO 세포, 또는 HEK293 세포 또는 CHO 세포 유도된 세포이고, 바람직하게는 상기 포유 동물 세포가 CHO 세포 또는 CHO 유도된 세포인, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법 또는 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항의 용도.
- 락테이트 및 시스테인을 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인의 몰비 (mM/mM)로 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 공급 배지로서, 바람직하게는 상기 공급 배지가 별도 추가를 위한 하나 이상의 공급 보충제를 포함하는, 공급 배지.
- (a) 락테이트 및 임의로 시스테인을 포함하는 포유 동물 세포 유가식 배양을 위한 농축된 공급 배지, 및
(b) 시스테인을 포함하는 농축된 공급 배지로부터 분리된 수성 보충제
를 포함하는 키트로서,
여기서, 상기 공급 배지 및 보충제가 세포 배양 시작 부피의 5% 미만, 바람직하게는 3.5% 미만의 매일 첨가에서 약 8:1 내지 약 50:1의 락테이트/시스테인 몰비 (mM/mM) 및 0.225 mM/일 이상의 시스테인을 제공하는, 키트.
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