EA008670B1 - Культуры e1-иммортализованных клеток и способы их культивирования с целью повышения выхода их продукции - Google Patents

Abstract

Изобретение предлагает способы культивирования клеток, происходящих из эмбриональных клеток-ретинобластов, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, предпочтительно клеток PER.C6™, для улучшения выхода продуктов таких клеток. Предлагаются стратегии питания таких клеток и культур при высоких плотностях, дающие высокий выход продуктов, таких как рекомбинантные антитела.

Description

Изобретение относится к области культивирования клеток. В частности, изобретение относится к области культивирования клеток, полученных из клеток, иммортализованных последовательностями Е1 аденовируса. Точнее, изобретение относится к культивированию таких клеток с целью получения высокого уровня биологических продуктов из таких клеток.

Уровень техники в области изобретения

Клеточная линия человека РЕВ.С6®, представленная клетками, депонированными в Европейской коллекции культур клеток животных (ЕСАСС) под № 96022940, получена из клеток сетчатки путем иммортализации с помощью генов Е1а и Е1Ь аденовируса (А65) и описана в патенте США 5994128. Помимо способности действовать как клетки с дефектом упаковки [нуклеотидных последовательностей] для аденовирусных векторов с делецией Е1 (патент США 5,994,128; νθ 01/005945) и в продуцировании других вирусов (νθ 01/38362), Е1-иммортализованные клетки, такие как клетки РЕР.С6. могут быть использованы для продуцирования рекомбинантных белков, таких как антитела (νθ 00/63403).

Х1е с1 а1. (2002) описали способ культивирования Е1-иммортализованных клеток в бессывороточной суспензии. Однако выход продуктов, достигнутый с использованием способов культивирования, описанных в данной области техники для Е1-иммортализованных клеток, может быть улучшен. Именно это является предметом данного изобретения - предложить новые способы увеличения выхода продуктов такого типа клеток.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1 - график, показывающий рост и продукцию антител клона РЕВ.С6 (клон 1), который выращивали во встряхиваемых колбах при двух исходных концентрациях клеток (0,3 и 1,0х10⁶ мл^-1). Левая вертикальная ось: число жизнеспособных клеток (Ν_ν). Правая вертикальная ось: концентрация антител (АЬ). Горизонтальная ось: время (часы).

Фиг. 2 - график, показывающий снижение клеточно-специфической утилизации глутамина при повышении числа жизнеспособных клеток продуцирующего антитела клона РЕВ.С6 (клон 1). Ν: число клеток.

Фиг. 3 - профили бэтч-культуры клона 1 РЕВ.С6. А: Метаболиты. О1с, глюкоза; Ьас, лактат; О1и, глутамин; ΝΗ₃, аммиак; Р, фосфат. В-Е: Аминокислоты (АА).

Фиг. 4 - График, показывающий эффект смеси питательных компонентов, содержащей глюкозу, глутамин, аминокислоты, фосфат, кальций и факторы роста, на клон 1 РЕВ.С6. А: число жизнеспособных клеток (Νν). В: концентрация антител (АЬ). Кружки - бэтч-культура. Квадраты - бэтч-культура с подпиткой.

Фиг. 5 - график, показывающий число жизнеспособных клеток (Ν_ν) и выход антител (АЬ) клонов РЕВ.С6, в случае когда культуральная среда заменялась один раз в день (2 независимых эксперимента для каждого клона). А: клон 1. В: клон 2.

Фиг. 6 - результат модифицированного питания (пример 4) клона 1. А: число жизнеспособных клеток (Ν_ν). В: концентрация антител (АЬ). Пустые кружки: бэтч-культура. Заполненные кружки: бэтчкультура с подпиткой.

Фиг. 7 - результат дальнейшего улучшения модифицированного питания с различными первой и последующими добавками (пример 4, табл. 2) для клона 1. А: число жизнеспособных клеток (Ν_ν). В: концентрация антител (АЬ). Кружки: бэтч-культура. Квадраты: бэтч-культура с подпиткой. Стрелки: последнее внесение питания.

Фиг. 8 - результат дальнейшего улучшения модифицированного питания с различными первой и последующими добавками (пример 4, табл. 2) для клона 2. Νν: число жизнеспособных клеток. АЬ: концентрация антител.

Фиг. 9 - уровень галактозилирования 1дО, полученный в соответствии со способами согласно изобретению.

Фиг. 10 - результат дальнейшего улучшения модифицированного питания с различными первой и последующими добавками (пример 4, табл. 2) для клона 3. Ν_ν: число жизнеспособных клеток. АЬ: концентрация антител.

Сущность изобретения

Один из аспектов данного изобретения состоит в том, что предлагается стратегия питания бэтчкультуры с подпиткой или перфузионной с подпиткой культуры клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1. В одном из вариантов реализации этого изобретения предложен способ культивирования таких клеток, причем указанные клетки способны к росту в суспензии, включающий в себя следующие стадии: определение, по меньшей мере один раз за время культивирования клеток, концентрации по меньшей мере одного компонента среды, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина, цистина, валина, лизина, треонина и глицина; добавление в среду компонентов в ходе культивирования клеток в момент истощения или до него по меньшей мере одного из компонентов, концентрация которого определялась на предыдущей стадии, причем добавляемые компоненты включают в себя по меньшей мере глюкозу, глутамин, фосфат, лейцин, серин, изолейцин, аргинин, метионин и цистин. Другие компоненты, которые могут быть также с пользой внесены в соответствии с данным изобретением, их количества, а также вре

- 1 008670 мя внесения компонентов предлагаются ниже, так же, как и в формуле изобретения.

Другой аспект данного изобретения состоит в том, что предлагается культура клеток, происходящих из клеток, иммортализованных последовательностями Е1 аденовируса, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 10х10⁶ клеток/мл. Предпочтительно, указанная культура содержит по меньшей мере 12х10⁶ клеток/мл, более предпочтительно - по меньшей мере 15х10⁶ клеток/мл. В определенных предпочтительных вариантах реализации культура в соответствии с данным изобретением содержит более чем 20х10⁶, 25х10⁶, 30х10⁶ или 40х10⁶ клеток/мл. Способы получения таких культур также предлагаются в данной заявке.

Еще один аспект состоит в том, что предлагается способ увеличения плотности клеток и выхода продукта культуры клеток, иммортализованных последовательностями Е1 аденовируса. В одном из вариантов его реализации предлагается способ культивирования таких клеток, отличающийся тем, что указанный способ содержит стадию субкультивирования указанных клеток при концентрации засева между 0,8х10⁶ и 2,0х10⁶ жизнеспособных клеток/мл, предпочтительно - между 0,9х10⁶ и 1,5х10⁶ жизнеспособных клеток/мл.

Предпочтительно, клетки, используемые в способах согласно изобретению, происходят из клеток сетчатки, более предпочтительно - из клеток эмбриональной сетчатки человека (НЕК.), такие клетки депонированы в ЕСАСС под № 96022940. В определенных вариантах реализации указанные клетки представляют собой клетки РЕК.С6.

В определенных вариантах реализации указанные клетки могут продуцировать рекомбинантные белки, предпочтительно антитела, с высоким выходом продуктов. В других вариантах реализации указанные клетки содержат рекомбинантные аденовирусные векторы, имеющие делецию в сегменте Е1, или другие вирусы, которые могут продуцироваться в указанных клетках с высоким выходом при использовании способов в соответствии с данным изобретением. В предпочтительных вариантах реализации клетки культивируют по меньшей мере часть времени в бессывороточной среде.

Подробное описание изобретения

Продуктивность какой-либо клеточной линии главным образом определяется тремя основными параметрами: специфической продуктивностью клеточной линии, достижимым максимумом концентрации клеток и возможной длительностью процесса продуцирования. Увеличение любой из этих переменных ведет к повышению конечной концентрации продукта и зависит в значительной степени от клеточной линии. В традиционной бэтч-культуре такие клеточные линии как СНО и 8Р2/0 могут достигать плотностей до 4х10⁶/мл. При бэтч-культивировании с подпиткой или при перфузии концентрация жизнеспособных клеток увеличивается, и типичные гибридомные клетки, такие как 8Р2/0, могут культивироваться при плотностях до 10х10⁶ клеток/мл, тогда как клетки СНО могут культивироваться при плотностях до 610х10⁶ клеток/мл. В изобретении описаны способы повышения плотности культуры жизнеспособных клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, предпочтительно происходящих из клеток эмбриональной сетчатки, для достижения плотностей клеток, превышающих известные ранее в данной области техники. Кроме того, способы согласно изобретению могут быть использованы для получения более высокого выхода продуктов культуры клеток согласно изобретению.

В данном изобретении раскрыт усовершенствованный способ того, как Е1-иммортализованные клетки, такие как клетки РЕК.С6, могут быть высокоэффективно использованы для получения высокого выхода моноклональных антител. Показано, что эти клетки культивируются при очень высоких концентрациях жизнеспособных клеток в способе традиционного бэтч-культивирования (до 14х10⁶ жизнеспособных клеток/мл).

Кроме того, Е1-иммортализованные клетки, такие как клетки РЕК.С6, в высокой степени пригодны для способа бэтч-культивирования с подпиткой, поскольку культура этих клеток, против ожиданий, потребляет лактат и аммиак и поддерживает жизнеспособность в течение длительного периода времени в условиях ограниченного питания. В данном изобретении предлагаются способы повышения выхода продуктов из указанных клеток за счет стратегии питания культуры.

Термин «стратегия питания» в данной заявке означает внесение определенных идентифицированных компонентов, включающих в себя, но не ограниченных такими питательными веществами, как сахара, аминокислоты и тому подобное, в культуральную среду. Идентифицированные компоненты предпочтительно добавляют в определенных количествах и в определенные моменты времени, когда они требуются для увеличения выхода продуктов из клеток, как это предлагается в данной заявке.

Е1-иммортализованные клетки, такие как клетки РЕК.С6, также хорошо подходят для перфузионного способа, поскольку для них можно поддерживать очень высокие концентрации жизнеспособных клеток (до 50х10⁶ клеток/мл с жизнеспособностью клеток по меньшей мере 85%) в течение длительного периода и с хорошей конечной концентрацией продукта.

Культуральные среды

Способы согласно изобретению в целом повышают выход продукта из клеток по сравнению с выходом, полученным в способах, описанных в данной области для клеток согласно изобретению. Предпочтительно бессывороточные культуральные среды используются по меньшей мере часть времени в способах согласно изобретению. Предпочтительно среда содержит только рекомбинантно полученные

- 2 008670 белки не животного происхождения. Такие культуральные среды коммерчески доступны из различных источников. В одном из вариантов реализации изобретения в способе бэтч-культивирования с подпиткой или перфузионного (с подпиткой) культивирования использовалась культуральная среда УРКО (1КН В1О8С1еисе8).

Продукты

Способы согласно изобретению предпочтительно используются для получения продуктов в клетках согласно изобретению. Способы согласно изобретению могут быть использованы для увеличения продукции антител, а также и других белков (№0 00/63403). Для продукции белков клетки согласно изобретению содержат, соответственно, нуклеиновую кислоту, кодирующую указанные белки, в оперативной связи с элементами, способными к управлению экспрессией указанных белков. Кроме того, способы [согласно изобретению] могут быть использованы для увеличения продукции рекомбинантных аденовирусных векторов, имеющих делецию в сегменте Е1, в этом случае клетки используются как комплементарные клетки, которые, в свою очередь, известны специалистам в данной области по установленным методикам (например, патент США 5994128; №0 01/005945). Кроме того, способы согласно изобретению могут быть использованы для усовершенствования процессов распространения других (не принадлежащих к аденовирусам) вирусов в клетках (№0 01/38362). Следовательно, продуктами согласно изобретению могут быть рекомбинантные белки, такие как антитела, эритропоэтин и им подобное, также как и рекомбинантные аденовирусные векторы с делецией в сегменте Е1 или другие вирусы.

Клетки

Клетки согласно изобретению - это клетки, которые были иммортализованы аденовирусными последовательностями Е1, каковые клетки в данном документе упоминаются как Е1-иммортализованные клетки. Такие клетки экспрессируют по меньшей мере функциональную часть сегмента Е1А аденовируса и предпочтительно также по меньшей мере функциональную часть сегмента Е1В. Белок Е1А обладает трансформирующей активностью, тогда как белок Е1 В обладает анти-апоптозной активностью. Клетки согласно изобретению могут происходить от разных видов клеток, в том числе клеток легких, почечных клеток, амниоцитов, но предпочтительно происходят от клеток сетчатки. Они могут происходить от эмбриональных клеток сетчатки. Предпочтительными клетками согласно изобретению являются клетки человека. Способ иммортализации эмбриональных клеток сетчатки был описан в данной области (патент США 5994128). Соответственно, клетки сетчатки, которые были иммортализованы аденовирусными последовательностями Е1, могут быть получены этим способом. В определенных предпочтительных вариантах реализации клетки согласно изобретению происходят из Е1-иммортализованных клеток НЕК, таких как клетки РЕК.С6. Под клетками РЕК.С6, используемыми для данных целей, подразумеваются клетки ранних или поздних пассажей или происходящие от ранних или поздних пассажей клеток, депонированных в ЕСАСС под № 96022940. Кроме того, в указанных клетках может присутствовать также сегмент Е2А с мутацией 15125 (см., например, патент США 6395519). Клетка, происходящая от клеток РЕК.С6, может быть клеткой РЕК.С6, инфицированной рекомбинантным аденовирусом или другим вирусом, а также клеткой РЕК.С6, в которую введена рекомбинантная нуклеиновая кислота, например, содержащей экспрессирующую кассету, в которой нуклеиновая кислота, кодирующая представляющий интерес белок, оперативно связана с последовательностями, способными управлять ее экспрессией, такими как промотор и сигнал поли(А), причем предпочтительно, чтобы указанные клетки были из стабильного клона, который может быть выбран в соответствии со стандартными процедурами, известными специалистам в данной области. Культура такого клона способна к продуцированию белка, кодируемого указанной рекомбинантной нуклеиновой кислотой.

Компоненты питания

В одном из аспектов данного изобретения предложены способы культивирования клеток согласно изобретению, в которых, следуя стратегии питания культуры согласно изобретению, определенные аминокислоты добавляются в ходе культивирования с целью восполнения аминокислот, концентрация которых становится или может стать лимитирующей для оптимального процесса и выхода продукта. Термин «аминокислота» означает все встречающиеся в природе α-аминокислоты как в Ό-, так и в Ьстереоизомерных формах и их производные. Производное определяется как аминокислота, к которой присоединена другая молекула или атом. Производные включают в себя, например, [аминокислоты] с ацетилированной аминогруппой, аминированной карбоксильной группой или окисленными остатками серы двух молекул цистеина с образованием цистина. Далее, производные аминокислот могут включать в себя эфиры, соли, такие как хлориды, сульфаты и им подобное, а также гидраты. Специалисты в данной области понимают, что когда в данном изобретении упоминается аминокислота, могут быть использованы ее производные, которые также включены в объем данного изобретения. Другие компоненты, такие как сахара, факторы роста, витамины и т. д. также могут быть добавлены для усовершенствования способов согласно изобретению.

Стратегии питания

В одном из аспектов данного изобретения предложен способ получения продукта в клетках, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, в культуральной среде, в которой указанный продукт выбирают из группы, состоящей из рекомбинантных белков, вируса и рекомбиниантного адено

- 3 008670 вируса с делецией в сегменте Е1, отличающийся тем, что указанный способ включает в себя стадию, на которой в культуральную среду добавляют по меньшей мере лейцин, серин, изолейцин, аргинин, метионин и цистин. В одном из аспектов данного изобретения предложен способ культивирования клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1 и способных к росту в суспензии, включающий в себя стадии определения по меньшей мере один раз за время культивирования концентрации по меньшей мере одного из компонентов среды, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина, цистина, валина, лизина, треонина и глицина; добавления компонентов в среду в ходе культивирования клеток при истощении или до него по меньшей мере одного из компонентов, концентрация которого была определена на предшествующей стадии, причем добавляемые компоненты включают в себя по меньшей мере глюкозу, глутамин, фосфат, лейцин, серин, изолейцин, аргинин, метионин и цистин. Понятие истощение, используемое в данной заявке, определяется временем, за которое концентрация компонента снижается до 30% или менее от его исходной концентрации в культуральной среде. В этих аспектах определение концентрации по меньшей мере одного компонента среды, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина или цистина, предпочтительно по отношению к определению компонентов, выбранных из группы, состоящей только из валина, лизина, треонина и глицина. В определенных вариантах реализации на первой стадии определяют концентрации по меньшей мере двух компонентов по данному изобретения. В определенных вариантах реализации добавляемые компоненты дополнительно включают в себя одно или более веществ из валина, лизина, треонина, глицина, аспарагина, тирозина, гистидина, фенилаланина, триптофана, кальция, инсулиноподобных факторов роста (1СЕ) ЬопдКЗ 1СЕ-1 и Ьопд 1СЕ, а также инсулина. В специфическом варианте реализации компоненты добавляются в конечных концентрациях (в ммоль/л свежедобавляемого компонента на 10х10⁶ клеток/мл): 6,0 - для глюкозы, 2,60 при первом внесении и 1,75 при последующих - для глутамина, 0,70 - для фосфата, 0,66 - для лейцина, 1,10 при первом внесении и 0,55 при последующих - для серина, 0,50 - для изолейцина, 0,46 - для аргинина, 0,23 - для метионина и 0,25 -для цистина. В других вариантах реализации добавляют следующие компоненты в конечных концентрациях (в ммоль/л свежедобавляемого компонента на 10х10⁶ клеток/мл): 0,45 валин, 0,44 - лизин и 0,30 - треонин. В других вариантах реализации дополнительно добавляют следующие компоненты в конечных концентрациях (в ммоль/л свежедобавляемого компонента на 10х10⁶ клеток/мл): 0,10 - аспарагин, 0,13 - тирозин, 0,10 - гистидин, 0,02 - фенилаланин и 0,06 - триптофан. Кроме того, кальций может быть добавлен в конечной концентрации (в ммоль/л добавляемого компонента на 10x10⁶ клеток/мл) - 0,02.

Присутствие в среде факторов роста, таких как ЮЕ, эпидермального фактора роста (ЕСЕ) и инсулина или их производных также может быть полезно. Отклонения в количествах добавляемых компонентов могут составлять 33% или менее на компонент, предпочтительно 20% или менее, более предпочтительно - 10% или менее, а еще более предпочтительно 5% или менее. Количества даны в 10х10⁶ клеток/мл и линейно зависят от числа клеток/мл. В предпочтительных вариантах реализации указанные компоненты добавляют между 48 ч [культивирования] и моментом истощения по меньшей мере одного из компонентов среды, концентрацию которых определяли на предыдущей стадии. В определенных вариантах реализации указанные добавления проводят между 24 ч [культивирования] и периодом, непосредственно предшествующим истощению. В определенных аспектах изобретения предложен способ согласно изобретению, в котором указанные клетки экспрессируют рекомбинантный иммуноглобулин, секретируемый в культуральную среду до уровня по меньшей мере 500 мг на литр, предпочтительно по меньшей мере 700 мг/л, более предпочтительно по меньшей мере 850 мг/л, а еще более предпочтительно по меньшей мере 1000 мг/л, еще более предпочтительно по меньшей мере 1250 мг/л, еще более предпочтительно по меньшей мере 1500 мг/л, еще более предпочтительно по меньшей мере 1750 мг/л и еще более предпочтительно по меньшей мере 2000 мг/л. В целом добавление компонентов среды согласно изобретению, т.е., например, в способе бэтч-культивирования с подпиткой, приводит к повышению выхода производимого продукта по меньшей мере в 1,5 раз, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2,5 раз, а еще более предпочтительно приблизительно в 3 раза или даже больше по сравнению со способом, в котором компоненты не добавляют, т.е. в способе бэтчкультивирования.

В дополнение к использованию в способе бэтч-культивирования с подпиткой, стратегии питания согласно изобретению могут быть также эффективно использованы в оптимизации процесса бэтчкультивирования, как это изложено в примере 5.

Перфузия

Альтернативным вариантом в другом аспекте данного изобретения может быть обмен культуральной среды. Показано, что могут быть достигнуты неожиданно высокие плотности клеток, когда это применяется к клеткам, происходящим из клеток сетчатки, иммортализованным аденовирусными последовательностями Е1. Обмен культуральной среды может выполняться любыми средствами, известными специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь этим, сбор клеток с помощью центрифугирования, фильтрования или подобным способом, после чего клетки ресуспендируют в свежей культуральной среде. В ином случае может быть использована перфузионная система, в которой культуральная

- 4 008670 среда либо непрерывно, либо периодически обменивается с использованием устройства клеточной сепарации, такого как центрифуга Сеп1п1ее11. или пропускания через картридж с системой полых волокон или подобного. Поэтому другой аспект данного изобретения состоит в том, что предлагается процесс культивирования клеток, происходящих из клеток эмбриональной сетчатки, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, отличающийся тем, что культуральная среда обменивается со скоростью 0,2-3, предпочтительно 0,5-3 объема культуры в день (24 ч). Культуры, полученные таким способом, предпочтительно имеют плотность жизнеспособных клеток выше, чем 20х10⁶ клеток/мл, более предпочтительно - выше, чем 30х10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах такие культуры имеют плотность клеток выше, чем 40х10⁶ клеток/мл. В некоторых вариантах такие культуры используют для получения рекомбинантных антител с выходом по меньшей мере 150 мг/л/день, предпочтительно по меньшей мере 200 мг/л/день, более предпочтительно по меньшей мере 300, 400 или 500 мг/л/день. Конечно, таким способом могут быть получены и другие продукты согласно изобретению. В данной заявке показано, что обмен одного полного объема культуральной среды каждый день поддерживает [плотность] по меньшей мере 30х10⁶ жизнеспособных клеток/мл с выходом антител более, чем 500 мг/л/день (до 750 мг/л/день) (фиг. 5). Одна полная замена среды в день соответствует скорости непрерывной перфузии 3 объема в день, что означает, что выход непрерывной перфузионной системы составляет приблизительно по меньшей мере 150-200 мг/л/день. Один из способов уменьшить такую скорость перфузии и, таким образом, повысить выход антител (путем уменьшения объема, в который секретируются антитела) является пополнение исходной культуральной среды существенными компонентами (известное как питательная перфузия). Эти компоненты для клонов, продуцирующих антитела Е1-иммортализованных клеток, таких как клетки РЕК..С6, определены в данной заявке (см. пример 2) и, следовательно, являются другим аспектом данного изобретения, в котором предложена такая перфузионная система с подпиткой, в которой используются стратегии питания в соответствии с данным изобретением. Обычным недостатком перфузионных процессов является накопление токсических метаболических побочных продуктов (таких как лактат и аммиак), что может приводить к снижению жизнеспособности клеток и выхода продуктов. Часто при высокой концентрации клеток и высокой скорости перфузии такие побочные продукты приходится удалять. Одним из преимуществ, показанных для клонов Е1-иммортализованных клеток, таких как клетки РЕК..С6, согласно изобретению, состоит в том, что они способны утилизировать лактат и аммиак таким образом, что концентрации этих веществ не становятся проблематичными (см. фиг. 3А). Поэтому возможно получение выхода антител в количестве по меньшей мере 500 мг/л/день путем обмена культуральной среды один или два раза в день. То же самое может быть достигнуто с использованием непрерывной перфузии, например, со скоростью 1 объем в день, в комбинации с добавлением в среду концентрата питательных веществ (питательная перфузия). Это может быть с выгодой совмещено со сливом клеток (удалением определенного процента клеточной популяции).

Культуры с высокими плотностями клеток предпочтительны для получения высокого выхода продуктов. Поэтому в другом аспекте данного изобретения предлагается культура клеток, происходящих от клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, причем указанные культуры содержат по меньшей мере 10х10⁶ клеток/мл. Жизнеспособность в культуре составляет по меньшей мере 80%. Предпочтительно жизнеспособность в культуре составляет по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%. Культуры согласно изобретению являются предпочтительно суспензионными, что означает, что клетки в указанных культурах находятся в культуральной среде в суспензии, например, во встряхиваемых колбах, роллерных бутылках, биореакторах, включая взбалтываемые емкости, реакторы с эрлифтом и им подобное. Стратегии, описанные в данной заявке, могут, однако, также использоваться для культур клеток в ферментере с системой полых волокон, как описано у Тапазе с1 а1. (1997), и адгезивных культур, таких как культуры клеток на микроносителях. В одном из вариантов реализации указанная культура содержит по меньшей мере 12х10⁶ клеток/мл. В данной заявке описано, что в традиционной бэтч-культуре может быть получено до 14х10⁶ клеток/мл.

Кроме того, было показано, что, используя перфузию среды, можно достичь даже большей плотности клеток до 50х10⁶ клеток/мл. Предшествующий уровень техники не давал никаких указаний на то, что достижимы такие неожиданно высокие плотности клеток. Таким образом, в других предпочтительных вариантах реализации данного изобретения предложена культура клеток, происходящих из Е1иммортализованных клеток, предпочтительно происходящих из клеток сетчатки, и указанная культура содержит по меньшей мере 15х10⁶ клеток/мл, предпочтительно по меньшей мере 20х10⁶ клеток/мл, более предпочтительно по меньшей мере 25х10⁶ клеток/мл. В специфических вариантах реализации указанная культура содержит по меньшей мере 30х10⁶ клеток/мл или даже по меньшей мере 40х10⁶ клеток/мл. Культуры с плотностью по меньшей мере 15х10⁶ клеток/мл согласно изобретению доступны с помощью процесса перфузии, что означает, что культуральная среда обменивается в ходе процесса культивирования. Культуры согласно изобретению имеют жизнеспособность клеток по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%. Указанные культуры являются суспензионными. Кроме того, указанные культуры содержат среду для выращивания клеток. Указанная среда для выращивания предпочтительно является бессывороточной. Клетки культуры могут содержать молекулы рекомбинантной нуклеиновой

- 5 008670 кислоты, кодирующие иммуноглобулины или их части или их производные в экспрессируемой форме. Такие клетки способны продуцировать иммуноглобулины с высоким выходом. В частности, в данной заявке показано, что культура клеток согласно изобретению, в которой среду меняют каждый день и в которой присутствует более чем 30х10⁶ клеток/мл, может дать выход рекомбинантных антител по меньшей мере 500 мг/л/день. Клетки в указанной культуре предпочтительно продуцируют по меньшей мере 10 пг белка/клетку/день.

Способы согласно изобретению, особенно связанные с продукцией рекомбинантного белка, могут быть также скомбинированы с другими мерами, описанными в данной области, что в некоторых случаях увеличивает выход продуктов. Поэтому в определенных вариантах реализации данного изобретения культуральную среду подвергают температурным сдвигам перед фазой продукции или во время нее, например, путем проведения процесса при более низкой температуре, например, между 30 и 35°С, в фазе продукции (см., например, патент США 6506598 и цитируемую в нем литературу, в которых описаны эффекты, оказываемые понижением температуры культуры клеток на некоторые параметры продукции рекомбинантного белка) или добавлением к культуре холодной культуральной среды (причем «холодная» означает, что ее температура ниже, чем температура, при которой культивируют клетки, предпочтительно холодная культуральная среда имеет температуру между 2 и 8°С), когда клетки субкультивируют или позднее во время процесса культивирования. В других вариантах реализации могут быть добавлены специфические факторы роста для улучшения процессов согласно изобретению, относящихся к выходу продуктов. В других вариантах реализации продукции белков способы согласно изобретению могут быть усовершенствованы путем добавления алкановых кислот или их солей, таких как бутират натрия, либо в течение всего культивирования, либо только в фазе продуцирования (см., например, патент США 6413746 и ссылки в нем, в которых описаны эффекты добавления бутирата на продукцию белков в клеточной культуре). В других вариантах реализации продукции белков культуральную среду подвергают сдвигам температуры или рН (\Ус1бстапп с1 а1., 1994, 8аиег с1 а1 2000).

Специалистам в данной области понятно, что некоторые аспекты и/или варианты реализации согласно изобретению можно комбинировать для получения процесса культивирования клеток, дающего особенно хороший выход продуктов. В качестве ограничивающего изобретение примера можно привести засев

Е1-иммортализованных клеток с плотностью около 0,8х10⁶-2,0х10⁶ клеток/мл и использование стратегии питания и/или обмена среды выращивания в ходе процесса культивирования для улучшения конечного выхода продуктов.

Ниже изобретение будет проиллюстрировано несколькими примерами, не означающими ограничения области данного изобретения.

Эксперименты

Способы и векторы для генетической инженерии клеток и/или клеточных линий для экспрессирования белка хорошо известны специалистам в данной области, например, различные технологии проиллюстрированы в Сиггеп! Рго1осо1з ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ли5иЬе1 е1 а1., ебз. (^11еу&8оп5, Ыете Уогк, 1988, и ежеквартальные обновления) и 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬогаЮгу Мапиа1 (Со1б 8рпп§ ЬаЬога!огу Ргезз. 1989). Основные и стандартные технологии клеточной культуры известны специалистам в данной области и описаны, например, у Κ.Ι. Ргезйпеу, СиЬиге оЕ ашта1 сеШ А тапиа1 оЕ Ьаыс 1есйшдие, Гоиг111 ебШоп (ХУПеу-Ызз 1пс., 2000, Ι8ΒΝ 0-471-34889-9). Если не указано иначе, в основном придерживались таких стандартных технологий.

Протоколы клеточной культуры

В примерах культивировали клетки РЕК.С6. Клетки, полученные из адгезивных культур в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (ЭМЕМ), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (РВ8, 1пуйгодеп), были перенесены непосредственно в бессывороточную среду. Кратко: субконфлюэнтные клетки в логарифмической фазе трипсинизировались, отмывались один раз бессывороточной средой и инокулировались непосредственно в 250-мл эрленмейеровские колбы с 0,2 мкм фильтром (Согшпд), содержащие 25 мл бессывороточной среды ЕхСе11-525 (ЕКН Вюзаепсез) при исходной концентрации клеток 0,3-0,5х10⁶ мл^-1, если не указано иначе. Культуры поддерживались в состоянии логарифмического роста путем пассажей каждые 2-3 дня. Колбы встряхивали на магнитной качалке (1пЕогз) при 100 об/мин в увлажняющем инкубаторе при 37°С и 5% СО₂. Культуры центрифугировали при 1000 об/мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в оставшейся среде.

Добавляли свежую холодную среду (4°С), и инокулировали новые колбы при подходящей концентрации клеток. После переноса в бессывороточную среду культуру пассировали в течение 2-4 недель для достижения полной адаптации, после чего создавали бессывороточный банк клеток. Все эксперименты начинали с использованием клеток из этого банка клеток.

Биореакторы

Биореакторные культуры велись в 3-литровых реакторах с рабочим объемом 2 л (АррИкоп). Температура поддерживалась на уровне 37°С с помощью одеяла с электроподогревом. Концентрацию растворенного кислорода (6О₂) контролировали при 50% насыщении среды воздухом, регулируя состав подаваемого воздуха через свободное пространство над жидкостью и периодически распыляя его через мик

- 6 008670 ропоровый распылитель. Исходное значение рН культуры поддерживали на уровне 7,3, добавляя СО₂ через микропоровый распылитель. Нижний предел рН культуры был установлен на уровне 6,7, так что рН культуры позволяли постепенно снижаться (нижний предел не достигался). Культуру перемешивали двумя лопастными мешалками при 75 об/мин. Данные о процессе обрабатывались с помощью программного обеспечения ВюЕхрей (Аррйкоп).

Аналитические протоколы

Подсчет клеток и определение их жизнеспособности выполняли с помощью автоматического счетчика клеток СА8У (8сНагГе 8у51еш5). Концентрации глюкозы, лактата, аммиака и фосфата определяли с помощью анализатора Ек1асНет II (Кобак) в бесклеточном супернатанте культуры. Концентрации аминокислот определяли, используя модифицированный способ АссиТад НРЬС (хроматография высокого разрешения) (\Уа1ег5). описанный уап \¥апбе1еп апб Сойеп (1997). Аликвоты (200 мкл) отцентрифугированного супернатанта культуры хранили при -20°С в 1-мл криопробирках (Иа1депе) до момента использования. Образцы из каждого эксперимента одновременно анализировали для устранения экспериментальных отклонений. Осмоляльность измеряли с помощью осмометра, основанного на измерении понижения точки замерзания (Озтота! 030-б, Сопо!ес). Концентрацию антител определяли с помощью твердофазного иммуноферментного сэндвич-анализа (ЕЫ8А). Кратко, кассеты покрывали 2 мкг мл^-1 мышиного античеловеческого 1дС против каппа-легкой цепи (Рйаттшдеп) и инкубировали в течение ночи при 4°С. Конъюгированные с пероксидазой хрена (НИР) мышиные античеловеческие 1дС к тяжелой цепи (Рйатшшдеп; 1:500) использовали в качестве детектирующих антител в течение 1 ч при 37°С с офенилендиамином (ОРИ, 81дта) в качестве субстрата. Отмывку между стадиями инкубирования выполняли с помощью 0,05% Т\тееп 20 в фосфатном буфере (РВ8). Образцы разбавляли отмывочным буфером с добавлением 0,1% бычьего сывороточного альбумина (В8А). Количественную оценку проводили относительно эталона сравнения - бычьего 1дС1, с использованием калибровочного диапазона от 10 до 400 нг мл^-1. Образцы, очищенные белком А, подвергали качественному анализу с помощью изоэлектрофокусирования (1ЕЕ) и денатурирующего полиакриламидного гель-электрофореза (808-РАСЕ). Для анализа на гликаны Ν-связанные гликаны удаляли путем обработки образцов 1дС с помощью Ν-гликаназы (РАСазе Е) в 20 мМ фосфате натрия (рН 7.2) и анализировали с помощью масс-спектрометрии методом матричной лазерной десорбционной ионизации (МАЬО1-М8) на масс-спектрометре Аррйеб ВюзуЗетз Уоуадет ЭЕ Рго в режиме отражателя. Матрицей служила 2,5-дигидроксибензойная кислота (10 мг мл^-1) в смеси 50/50/0,1 ацетонитрил/вода/трифторуксусная кислота. Спектры были получены в позитивном ионном режиме, а гликаны детектировались как продукты соединения с натрием |М+№|+.

Расчет специфических для клеток темпов метаболизма

Специфические темпы утилизации метаболитов и продукции в бэтч-культуре и бэтч-культуре с подпиткой рассчитывали, используя логарифм среднего клеточной концентрации, как показано в следующем уравнении:

Яз = (С - С1) / (1₂ - 11) х [(Х2 - Х1) / 1п(Х2 - Х1)].

В этом уравнении

С - концентрация метаболита (мкмоль/л), ΐ- время(дни)и

X - концентрация жизнеспособных клеток.

Константы скорости спонтанной декомпозиции глутамина не включены, поскольку декомпозиция не была существенной в моменты времени, в которые рассчитывались скорости (данные не показаны). Коэффициенты выхода лактата, продуцированного из глюкозы (У_1ас/_д1с), аммиака, продуцированного из глутамина (У_атт/₆1_п) и аланина, продуцированного из глутамина (У_а1а/_д1п), рассчитывали из приведенных ниже уравнений и выражали в моль/моль:

У|асд|с = Ц| ас ^/ ч...

У_атт-д|п Цатт ^/ 9д|п ¥а1а-д|п = Ц_ак ^/ 9д|п

Примеры

Пример 1. Повышение максимального конечного выхода клеток в бэтч-культуре клеток РЕИ.С6.

Простейший процесс продукции - это бэтч-культура. Однако она ограничена по концентрации жизнеспособных клеток и, следовательно, достижимому выходу продуктов, в основном из-за ограничения питательных веществ. Представлен способ повышения максимальной конечной концентрации клеток в бэтч-культуре РЕИ.С6 или производных от РЕИ.С6 субклонов путем расчета специфичных для клеток скоростей утилизации ключевых питательных веществ при разных концентрациях клеток и путем запуска бэтч-культуры при концентрации клеток, когда достигается оптимальная утилизация питательных веществ по отношению к клеточному росту.

ДНК, кодирующая антиген-связывающий участок антитела, распознающего адгезивную молекулу эпителиальных клеток (ЕрСАМ), была сначала выделена из библиотеки фага зсЕу (НиИ е! а!, 1999). ДНК, кодирующая антиген-связывающий участок антитела, распознающего СО46, была выделена, как описано в \¥О 02/018948. Лидерная последовательность и константные участки типа 1дС1 вносились в основном, как описано у Вое1 е! ак, 2000. ДНК, кодирующая легкую и тяжелую цепи, клонирована в вектор экс

- 7 008670 прессии ροΌΝΆ3002 (Кео). Вектор экспрессии ρεΌΝΆ3002 (№о), который был описан в международной патентной заявке РС!ЖЬ02/00841, был депонирован 13 декабря 2001 г. в Европейской Коллекции Клеточных Культур (ЕСАСС) под номером 01121318. Результирующие векторы экспрессии, кодирующие 1дС1, который распознает ЕрСАМ или СЭ46, соответственно, регулируемые промотором СМУ, вводили в клетки РЕР.С6 в соответствии со стандартными способами.

В этих экспериментах использовали клоны, экспрессирующие рекомбинантные антитела, происходящие из родительской популяции клеточных линий РЕР.С6. Клон, экспрессирующий анти-ЕрСАМ, далее упоминается в данной заявке как клон 1, клон, экспрессирующий анти-СЭ46, далее упоминается как клон 2. Клетки содержали в среде ЕхСе11™ 525 (ЖН Вюзаепсез) (также возможно содержание клеток в среде СТМ-3 (81дта)), а производство партиями выполнялось в среде ЕхСе11™ УРРО (ГКН Вю8С1епсез, Са1. Νο. 14560). Для производства партиями клетки переносили непосредственно из ЕхСе11™ 525 в ЕхСе11™ УРРО.

На фиг. 1 показано, что максимальная конечная концентрация жизнеспособных клеток культуры, запущенной при [плотности] 1х10⁶ клеток мл^-1, достигала почти 14х10⁶ клеток мл^-1 через 6 дней (приблизительно в 3 раза выше, чем в бэтч-культурах СНО и 8р2/0), по сравнению с культурами, запущенными при плотности 0,3х10⁶ [клеток] мл^-1, которые достигали 10х10⁶ клеток мл^-1 через 9 дней. Разница в конечных титрах антител в обеих культурах очень невелика. Однако в культуре с исходной плотностью 1х10⁶ [клеток] мл^-1 уровень приблизительно в 600 мг л^-1 достигался через 6 дней, по сравнению с 9 днями в культуре с исходным уровнем 0,3х10⁶ мл^-1.

Более высокая концентрация клеток, наблюдавшаяся в культурах с исходным уровнем 1х10⁶ клеток мл^-1 по сравнению с исходным уровнем 0,3х10⁶ мл^-1, обусловлена более низким специфическим темпом утилизации питательных веществ при более высокой концентрации клеток. Показано, что уровень дыхания в гибридомных клетках снижается при повышении плотности клеток (\Уо111раг1 е! а1., 1990). Сходным образом, показано, что клеточно-специфический темп утилизации питательных веществ снижается с повышением концентрации клеток (Ройпет е! а1., 1994, Уа11ор апб 8уепбзеп, 2001). Теперь мы используем эту информацию в новых изобретательных подходах к формированию концепции повышения достижимых плотностей клеток в культуре.

Путем расчета клеточно-специфического темпа утилизации ключевых питательных веществ каждый день в бэтч-культуре и нанесения этих значений против концентрации клеток может быть получен график, показанный на фиг. 2 для глутамина. На фиг. 2 показана взаимосвязь между клеточноспецифическим темпом утилизации глутамина (Цоь) и концентрацией клеток. Из этого графика видно, что оптимальная концентрация клеток может быть выбрана на основе оптимального использования доступных питательных веществ. Например, культура с исходной концентрацией 0,3х10⁶ клеток мл^-1 достигнет приблизительно 0,5х10⁶ мл^-1 за 24 ч (среднее время удвоения популяции (рб!) этого клона составляет 32 ч). Значение Цоь при 0,5х10⁶ клеток мл^-1 составляет приблизительно 2,5 мкмоль 10⁶ клеток^-1 24 ч^-1. Общее потребление глутамина за эти 24 ч, следовательно, составляет приблизительно 1,25 мкмоль мл^-1 (0,5х2,5). Однако культура с исходной концентрацией 1х10⁶ клеток мл^-1 достигнет приблизительно 1,5х10⁶ [клеток] мл^-1 за 24 ч. Значение ц_о1п при этой концентрации клеток составляет приблизительно 0,7 5 мкмоль 10⁶ клеток^-1 24 ч^-1. Общее потребление глутамина, следовательно составляет приблизительно 1,125 мкмоль мл^-1. Две культуры, следовательно, используют приблизительно одинаковое количество глутамина в первые 24 ч.

Поэтому другой целью данного изобретения является обеспечение способа культивирования клеток, включающего в себя запуск культуры при концентрации клеток, когда специфический уровень утилизации питательных веществ близок к минимальному уровню плато. Он составляет около 0,8-2,0х10⁶ клеток/мл, предпочтительно 0,9-1,5х10⁶ клеток/мл для Е1-иммортализованных клеток сетчатки, в частности, клеток, происходящих из клеток РЕР.С6. Именно поэтому данное изобретение реализуется в субкультуре клеток с концентрацией засева 0,8-2,0х10⁶ клеток/мл, предпочтительно 0,9-1,5х10⁶ клеток/мл, более предпочтительно 0,95-1,25х10⁶ клеток/мл.

Преимущество этого аспекта данного изобретения состоит в том, что число жизнеспособных клеток, которые могут быть получены, выше при более высокой плотности засева, и большее количество клеток достигается быстрее в ходе этого процесса. Этот аспект данного изобретения, следовательно, очень полезен для бэтч-культур, но может быть полезен и в бэтч-культурах с подпиткой или перфузионных культурах (с подпиткой), таких как в данном изобретении.

Пример 2. Стратегии питания для улучшения выхода антител в субклонах, происходящих из РЕР.С6.

Целью бэтч-культивирования с подпиткой является увеличение выхода продуктов путем повышения концентрации жизнеспособных клеток или продления периода продуцирования за счет введения концентратов питательных веществ для восполнения их потребления. Мы представляем здесь стратегию питания, улучшающую выход антител из субклонов, происходящих от клеток РЕР.С6. Стратегия питания может быть скомбинирована с более высокой исходной плотностью клеток для получения более высокой конечной плотности клеток в момент внесения питательных веществ и более короткого общего процесса продуцирования.

- 8 008670

Основной концентрат питательных веществ, содержащий глюкозу, фосфат, глутамин и 15 других аминокислот, готовили на основе профиля утилизации питательных веществ в шести дубликатных бэтчкультурах клона 1 во встряхиваемых колбах (см., например, фиг. 3). Сходные профили утилизации наблюдались и в случае клона 2, и поэтому ожидается, что стратегия питания, описанная ниже для клона 1, также улучшит выход и на других клонах, таким образом предлагая более общую стратегию для бэтчкультур с подпиткой или перфузионных культур с подпиткой Е1-иммортализованных клеток, предпочтительно клеток сетчатки, предпочтительно - клеток, происходящих из клеток РЕР.С6. Концентраты [питательных веществ] перечислены в табл.1. В необязательном порядке в питание могут быть добавлены кальций и три рекомбинантных фактора роста: ЬоидК.3 1СЕ-1, Ьоид ЕСЕ и инсулин. Добавление в этот период кальция и факторов роста существенно не влияли на полученные результаты. Оказалось, что глицин не является существенным для питания, и в последующих экспериментах его не добавляли. Инсулин приобретали у фирмы 81дша, ЬоидК.3 1СЕ-1 и Ьоид ЕСЕ приобретали у фирмы СгоРер. Все аминокислоты приобретали у фирмы 81дша. Время и частоту добавления питательных концентратов варьировали. Время первого добавления [питательных веществ] тестировали в 0-й, 1-й и 2-й дни до истощения питательных веществ. Глюкозу и фосфат использовали как индикаторы для начала питания. Серия добавлений болюсов проводилась каждые два дня на основе предсказанной концентрации жизнеспособных клеток. Обычно проводилось 6 подпиток. Концентрации добавляемых компонентов, показанные в табл. 1, не учитывают остатков компонентов в среде перед добавлением (т.е. концентрация компонента после добавления в культуральную среду будет выше, чем показанная в таблице, поскольку перед добавлением культуральная среда содержала некоторое количество этого компонента, так как добавление компонента согласно изобретению проводится до полного использования компонента клетками).

На фиг. 4 показан эффект питания смесью концентратов субклона РЕР.С6. экспрессирующего рекомбинантное антитело (клон 1). Начало питания на 3-й день (за два дня до истощения питательных веществ и продолжение питания каждые два дня после этого) приводит к конечному выходу антитела приблизительно 800 мг л^-1, т.е. увеличению приблизительно в 1,6 раз по сравнению с периодическим процессом, который дает 500 мг л^-1. Начало питания на 5-й день и продолжение каждые два дня после этого приводит к сходному увеличению конечной концентрации антитела.

Осмоляльность в бэтч-культурах (пример 1) снижалась с 280 до 240 мОсм кг^-1, тогда как в культурах с подпиткой она повышалась, со временем возрастая до 300-310 мОсм кг^-1.

Пример 3. Достижение числа жизнеспособных клеток, превышающего 30х10⁶ клеток на мл, и выхода антитела, превышающего 500 мг л^-1 день^-1.

Процессы с подпиткой могут приводить к возникновению токсических метаболитов, таких как лактат и аммиак, и повышению осмоляльности среды, которые в конце концов ограничивают концентрацию жизнеспособных клеток и длительность процесса, таким образом влияя на выход продукта. Возможной альтернативой процессу с подпиткой является перфузионный процесс, при котором высокая концентрация клеток может поддерживаться за счет постоянного обмена среды и слива клеток (удаления определенного процента клеточной популяции). Возможными недостатками такого процесса являются сравнительно низкая концентрация продукта вследствие потребности в больших объемах среды, часто встречающаяся сравнительно низкая жизнеспособность клеток и сравнительно высокая сложность управления такой системой. Поэтому выгодно пользоваться перфузионным процессом только при очень высокой концентрации жизнеспособных клеток и/или возможности поддерживать специфическую продуктивность.

Мы представляем здесь способ достижения концентрации жизнеспособных клеток, превышающей 30х10⁶ [клеток] мл^-1, и выхода антител, превышающего 600 мг л^-1 24 ч^-1, в культуре во встряхиваемых колбах с заменой одного объема среды в день.

Логарифмические культуры продуцирующих антитела клеток РЕК..С6, культивируемых во встряхиваемых колбах с ЕхСе11™ 525, переносили во встряхиваемые колбы, содержащие ЕхСе11™ УРРО, при исходном числе 1х10⁶ клеток/мл (другие исходные концентрации клеток дали сходные результаты). Замену среды с помощью центрифугирования (один объем в день) начинали на 3-й - 5-й день. Слива клеток не проводили. Образцы для анализа на метаболиты, для количественного определения антител и определения числа клеток отбирали каждый день и хранили при -20°С.

На фиг. 5 показано, что численность жизнеспособных клеток, достигающая 50х10⁶ мл^-1, и выход антител 500-750 мг л^-1 24 ч^-1 поддерживался в течение по меньшей мере 5 дней без слива клеток в двух независимых клонах, продуцирующих антитела.

Жизнеспособность клеток составляла около 80-90%. Такие высокие плотности клеток приблизительно в 3 раза выше, чем обычно достижимо с другими клеточными линиями, такими как СНО и 8р2/0, и поэтому клетки сетчатки, иммортализованные аденовирусными последовательностями Е1, такие как клетки РЕК..С6, являются хорошо подходящими для перфузионных процессов. Слив клеток может увеличить длительность процесса, и следовательно, оптимизированная система может включать в себя одну или более стадий сливов клеток.

До 50х10⁶ клеток на мл, с жизнеспособностью около 80-90%, могли поддерживаться в течение по меньшей мере 5 дней при одной полной замене среды каждые два дня. При такой стратегии многие пита

- 9 008670 тельные вещества исчерпывались на второй день. Поэтому среду предпочтительно сменять ежедневно. В перфузионном процессе это соответствует замене около 1-3 объемов/день. Это близко к обычному диапазону в стандартной перфузионной системе, где среда сменяется в темпе около 0,5-2 объемов/день. Несколько более высокие значения для клеток согласно изобретению связаны с очень высокими концентрациями клеток в перфузионной системе. При выбранной концентрации клеток, превышающей 30х10⁶ клеток/мл согласно изобретению, обмен среды должен составлять по меньшей мере 0,5 объема культуры в день, предпочтительно по меньшей мере 1 объем культуры в день. Невозможность обеспечить культуру питательными веществами (в данном случае через культуральную среду) в достаточных концентрациях ведет к гибели клеток. Ежедневный обмен среды приводит к повышению плотности жизнеспособных клеток (до 50х10⁶ клеток/мл при ежедневной замене среды против 10х10⁶ клеток/мл без ежедневной смены среды, см. фиг. 1 и 4) . Более того, при ежедневной смене среды клетки за один день дают выход продуктов, сходный с выходом продуктов, достигаемым в периодическом процессе за 8-13 дней.

Пример 4. Стратегии питания для дальнейшего улучшения выхода антител в субклонах, происходящих из РЕВ.С6.

Обеспечение сбалансированным питанием охватывает и такие компоненты как витамины, следовые элементы и липиды. Концентраты (10х или 50х, пригодны оба варианта) витаминов, неорганических солей, следовых элементов, факторов роста, липидов и растительных гидролизатов ЕхСе11 УРВО получали у фирмы 1ВН Вюзаепсез и добавляли вместе с основным питательным концентратом (минус кальций и факторы роста), описанным в примере 2. Концентраты ЕхСе11 УРВО добавляли до получения конечной концентрации 0,25Х.

На фиг. 6 показано воздействие такого модифицированного питания на рост (фиг. 6А) и выход антител (фиг. 6В) клона 1 во встряхиваемых колбах по сравнению с контрольной бэтч-культурой. Результаты были получены при начале питания на 3-й день (48 ч до истощения питательных веществ). Начало питания на 5-й день (день истощения питательных веществ) дало сходные результаты. Число жизнеспособных клеток поддерживалось существенно дольше, чем в бэтч-культуре, а выход антител повышался в 2,0 раза с 0,5 г л^-1 в процессе бэтч-культивирования до 1,0 г л^-1 в процессе бэтч-культивирования с подпиткой.

Анализ использованной среды из этих экспериментов по питанию показал изменения клеточноспецифических темпов утилизации некоторых аминокислот, вероятно вследствие добавления концентратов УРВО. Поэтому состав концентрата аминокислот, приведенный в примере 2, был модифицирован, как показано в табл. 2. Питание начинали за 48 ч до истощения питательных веществ и добавления делали каждые два дня. Обычно проводили 6 внесений питания. Опять-таки в концентрации добавляемых компонентов, представленных в таблице, не учтены остатки компонентов в использованной среде перед добавлением. При первом внесении питания использовали повышенные концентрации глутамина и серина по сравнению с последующими внесениями (см. табл. 2). Фосфат и глюкозу использовали как маркеры для определения момента начала питания. В этих экспериментах использовали клоны 1 и 2.

Эксперименты выполняли во встряхиваемых колбах и биореакторе. Эксперименты во встряхиваемых колбах выполнялись, как описано. Эксперименты в биореакторе запускали инокуляцией в 3литровый биореактор (Аррйкоп, рабочий объем 2 л) клеток из логарифмической предкультуры, выращенной во встряхиваемой колбе. Манипуляции с предкультурой и эксперименты в биореакторе выполняли в [среде] ЕхСе11 УРВО (1ВН Вюзаепсез). Индекс разведения для инокуляции в биореактор составлял по меньшей мере 1:6, а слив клеточной концентрации составлял около 0,3х10⁶ клеток/мл.

Результаты

На фиг. 7 показаны результаты модифицированного питания клона 1 в биореакторе по сравнению с контрольной бэтч-культурой. Максимальное число жизнеспособных клеток достигало 10-12х10⁶ мл^-1, а число жизнеспособных клеток поддерживалось между 8 и 10х10⁶ клеток мл^-1 до конца культивирования на 19-й день (фиг. 7А). Выход антител повышался в 3 раза - с 0,4 г л^-1 в способе бэтч-культивирования до

1,3 г л^-1 в способе бэтч-культивирования с подпиткой (фиг. 7В).

В этих бэтч-культурах с подпиткой осмоляльность и уровень аммиака достигали 430 мОсм кг^-1 и 16 ммоль л^-1, соответственно, т.е. уровней, которые, как сообщается, оказывают негативный эффект на производительность культуры и качество продукта. Следовательно, возможно, что снижение числа жизнеспособных клеток, наблюдающееся к концу процесса, по меньшей мере частично обусловлено этими факторами. На фиг. 8 показаны результаты стратегии питания клона 2 в 2-литровых биореакторах. Максимально достигнутое число жизнеспособных клеток составило 10-11х10⁶ мл^-1, а 7-9х10⁶ мл^-1 поддерживали до конца культивирования на 19-й день. Выход антител увеличился в 3 раза, с 0,5 г л^-1 до 1,5 г л^-1.

Процессы бэтч-культивирования и бэтч-культивирования с подпиткой с той же стратегией питания осуществляли также в случае третьего клона, экспрессирующего другое антитело, не связанное с указанным выше. Фиг. 10 показывает результаты стратегии питания в случае клона 3 во встряхиваемой колбе. Максимальное число жизнеспособных клеток достигало 14х10⁶ мл^-1, а 10-12х10⁶ мл^-1 поддерживали до конца культивирования на 17-й день. Выход антител повышался в 3 раза - с 0,7 г л^-1 до 2,1 г л^-1.

Стратегия питания, следовательно, улучшает выход [продукта] у различных клонов, каждый из которых экспрессирует различные антитела, что показывает, что процесс согласно изобретению применим

- 10 008670 в целом.

То есть, именно в этом аспекте данного изобретения предложен процесс, включающий в себя стратегию питания согласно изобретению, в котором выход продуцируемого белка повышается по меньшей мере в 1,5 раз, предпочтительно по меньшей мере в 2 раза, более предпочтительно по меньшей мере в 2,5 раза, а еще более предпочтительно по меньшей мере в 3 раза по сравнению с выходом периодического процесса.

Специфическая продуктивность (Даь) клеток, используемых в данном изобретении, составляла приблизительно 12-18 пг антител/клетку/день. В некоторых случаях С|_А:1 составляла около 10 пг антител/клетку/день, а в других случаях наблюдались значения приблизительно до 25 пг антител/клетку/день с использованием клеток и способов согласно изобретению. В бэтч-культурах этот показатель существенно снижается перед достижением максимального количества клеток, совпадая с истощением питательных веществ, происходящим приблизительно через 7 дней, тогда как в бэтч-культурах с подпиткой специфическая продуктивность удерживалась на этом уровне еще 2-3 дня после последней подпитки, т.е. процесс согласно изобретению продлевается приблизительно до 16-18 дней.

Качество продукта

В экспериментах, описанных выше, качество продукта проверялось различными способами, включая изоэлектрофокусирование, 8И8-РА6Е, МАЬИ1-ТОР масс-спектрометрию и высокощелочную ионообменную жидкостную хроматографию высокого разрешения с фазово-синхронизированным детектированием (НРАЕС-РАИ). Во всех случаях продуцируемые антитела в основном демонстрировали гликозилирование человеческого типа, а структурная целостность продуцируемого антитела была очень хорошей независимо от типа использованного процесса, и очень сходной с той, о которой сообщали 1оие5 с1 а1., 2003, когда и численность клеток, и выход продуктов были ниже. Следовательно, повышение выхода [продуктов] согласно изобретению достигается не ценой существенного снижения качества продукта.

Продуцируемый 1дС, очищенный белком А, из бэтч-культуры и из бэтч-культуры с подпиткой анализировали с помощью ΜΑΕΌΙ-Μ8. Материал, продуцируемый клетками РЕК..С6 в бэтч-культуре, демонстрирует профиль галактозилирования, сходный с таковым 1дС, очищенного из сыворотки человека, а гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы не идентифицированы в материале ни из бэтч-культуры, ни из бэтч-культуры с подпиткой. Средний процент гликанов, заканчивающихся 0, 1 и 2 галактозными остатками (С0:С1:С2), во всех протестированных бэтч-культурах составлял 29, 54 и 17%, соответственно. Это сравнимо с антителами, продуцированными СНО и гибридомой, которые часто в основном существуют в форме 60. Например, НПк е1 а1. (1999) сообщили о профиле галактозилирования (60:61:62) для антител, продуцированных в клетках N80 и СНО.

Антитела, продуцируемые в процессе бэтч-культивирования с подпиткой, демонстрируют пониженный уровень галактозилирования по сравнению с бэтч-культивированием (фиг. 9). Процент гликоформ 60 повышен с 29 до 49%, тогда как 61- и 62-гликоформ - снижен с 54% и 17% до 42% и 9%, соответственно. Это снижение галактозилирования происходит, возможно, вследствие высокой (до 16 мМ) концентрации аммиака при завершении процесса бэтч-культивирования с подпиткой. Однако уровень галактозилирования в антителах, продуцируемых клетками РЕК..С6 в процессе с подпиткой, выше, чем обычно наблюдаемый в бэтч-культуре, например, СНО (НПк е1 а1, 1999). Изоэлектрофокусирование (ΙΕΡ) и 8Ό8-ΡΑ6Ε показали отсутствие существенных различий между материалами, продуцированными в бэтч-культуре и бэтч-культуре с подпиткой (данные не показаны) и во всех случаях агрегация была ниже 3%.

Несмотря на сравнительно низкие значения У_атт/д1п, высокие концентрации жизнеспособных клеток приводят к накоплению глутамина в питательной среде, так что аммиак накапливается до уровня 16 ммоль л^-1. Несмотря на то, что это не приводит к падению концентрации жизнеспособных клеток, в бэтчкультурах, запущенных в присутствии ΝΗ₄Ο. показано, что концентрации последнего, превышающие 9 ммоль л^-1, негативно влияют на скорость роста культуры и максимальную концентрацию клеток. Кроме того, также это несколько влияет на гликозилирование (см. фиг. 9). Следовательно, уменьшение накопления аммиака может быть полезным, например, в соответствии со способом, описанным ниже.

До сих пор в описанном процессе уделялось внимание двум сферам - высокому уровню аммиака и осмоляльности. Большой вклад в повышение осмоляльности связан с концентратами УРК.0 (среда). Поэтому подход к уменьшению осмоляльности состоял в том, чтобы идентифицировать, какая группа компонентов среды (витамины, следовые элементы, неорганические соли, факторы роста и т.д.) важны для функционирования культуры, а какие можно удалить как несущественные. Это может быть полезно для процесса не только благодаря снижению осмоляльности питательной среды, но также и вследствие удаления потенциально вредоносных компонентов и возникающей возможности оптимизации внесения наиболее важных компонентов. Это может также снизить стоимость питательной среды. Уменьшение накопления аммиака может быть достигнуто путем более точного контроля добавления глутамина. Это может быть сделано на основе расчета специфического потребления и количества клеток, как описано выше. Это может быть достигнуто путем непрерывной закачки глутамина со скоростью, соответствующей концентрации жизнеспособных клеток и клеточно-специфическому темпу утилизации, так что остаточная концентрация глутамина в среде поддерживается на постоянно низком уровне, то есть между 0,2

- 11 008670 и 1,5 мМ, предпочтительно между 0,5 и 1,0 мМ. Другой подход, который может быть применим для клеток согласно изобретению, состоит в удалении глутамина из питательной среды, когда концентрация аммиака достигает определенного значения, например, в период одного или более введений питания, следующих за первым введением, так что клетки вынуждают к включению синтеза глутамина из аммиака и глютамата и глутамин-синтетазного пути. Этот подход в целом невозможен на таких типах клеток как ВНК и СНО, поскольку истощение глутамина часто приводит к быстрой и массовой гибели клеток, а перевод в безглутаминовые условия часто требует периода адаптации. Однако в бэтч-культурах клеток согласно изобретению концентрация жизнеспособных клеток продолжала возрастать в течение двух дней после истощения глутамина, а жизнеспособность культуры значительно не менялась, что предполагает значительный поток через путь глутаминсинтетазы, по меньшей мере достаточный для поддержания культуры.

Анализ использованной среды наиболее оптимизированной бэтч-культуры с подпиткой (примеры на фиг. 7, 8) показал, что в ходе процесса истощался только цистин. Поэтому дальнейшей модификацией аминокислотного питания согласно изобретению стало повышение концентрации цистина, например, до 0,3-0,35 ммоль/л или даже до 0,6 ммоль/л на каждые 10х10⁶ клеток/мл.

Пример 5. Улучшенный способ бэтч-культивирования (бэтч-культивирования с подпиткой).

Концентраты питательных веществ, разработанные для способа бэтч-культивирования с подпиткой могут также быть использованы для пополнения культуральной среды улучшенного способа бэтчкультивирования. Дополнение культуральной среды по меньшей мере одним внесением питания, подобно способу бэтч-культивирования с подпиткой, как было показано другими авторами, улучшает выход процесса бэтч-культивирования. Сходный подход пополнения культуральной среды концентратами питательных веществ может также быть использован для уменьшения числа внесений питательных веществ в процессе бэтч-культивирования с подпиткой, упрощая таким образом процесс, как показано другими авторами.

Данное изобретение раскрывает стратегии питания клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, таких как клетки РЕК.С6. В данном изобретении показано, какие компоненты становятся лимитирующими в процессе бэтч-культивирования с подпиткой, а также определены количества и соотношение компонентов, которые могут быть добавлены для улучшения выхода продуктов в процессе бэтч-культивирования с подпиткой. Эта информация используется в данном примере для улучшения способа бэтч-культивирования. Предполагается, что такая культура содержит около 10х10⁶ клеток/мл, поскольку это близко к числу клеток, которое наблюдалось в бэтч-культуре и бэтч-культуре с подпиткой согласно изобретению. В экспериментах с бэтч-культурой с подпиткой питание добавляли 6 раз с концентрациями компонентов, приведенными в табл. 1 или 2. Добавление 10-60% от общего количества питательных веществ (т.е. всех питательных веществ за 6 введений питания), предпочтительно 2040% от общего количества, приводит к улучшению процесса бэтч-культивирования, поскольку питательные вещества исчерпываются в культуре позже, и поэтому возрастает выход, поскольку продуктивность продлевается по сравнению с обычным процессом бэтч-культивирования, описанным выше, когда никаких добавлений в культуральную среду не делалось. Компоненты могут быть добавлены непосредственно в культуральную среду на любой стадии до истощения питательных веществ в среде, однако добавление предпочтительно до начала культивирования, так чтобы никаких других добавлений в ходе процесса не делалось (улучшенный способ бэтч-культивирования), что делает процесс очень простым. Конечно, это может быть скомбинировано с дополнительными добавлениями определенных компонентов позднее в ходе процесса (процесс бэтч-культивирования с подпиткой), в каковом случае может быть сделано меньшее количество добавлений, чем необходимо сделать в процессе бэтч-культивирования, изложенном выше, что упрощает процесс бэтч-культивирования с подпиткой. Именно поэтому в другом варианте реализации данного изобретения предложен способ получения продукта в клетках, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, в котором указанные клетки культивируют в культуральной среде, отличающейся тем, что следующие компоненты добавляют в культуральную среду в следующих количествах: глюкоза (3,6-21,6 ммоль/л, предпочтительно 7,2-14,4 ммоль/л), глутамин (6,8-

40,9 ммоль/л, предпочтительно 13,6-27,2 ммоль/л), лейцин (0,40-2,4 ммоль/л, предпочтительно 0,79-1,6 ммоль/л), серин (2,31-13,9 ммоль/л, предпочтительно 4,62-9,24 ммоль/л), изолейцин (0,3-1,8 ммоль/л, предпочтительно 0,6-1,2 ммоль/л), аргинин (0,28-1,66 ммоль/л, предпочтительно 0,55-1,10 ммоль/л), метионин (0,14-0,83 ммоль/л, предпочтительно 0,28-0,55 ммоль/л), цистин (0,15-0,9 ммоль/л, предпочтительно 0,3-0,6 ммоль/л), валин (0,27-1,62 ммоль/л, предпочтительно 0,54-1,08 ммоль/л), лизин (0,26-1,58 ммоль/л, предпочтительно 0,53-1,06 ммоль/л), треонин (0,18-1,08 ммоль/л, предпочтительно 0,36-0,72 ммоль/л), аспарагин (0,06-0,36 ммоль/л, предпочтительно 0,12-0,24 ммоль/л), тирозин (0,078-0,47 ммоль/л, предпочтительно 0,16-0,31 ммоль/л), гистидин (0,06-0.36 ммоль/л, предпочтительно 0.12-0.24 ммоль/л), фенилаланин (0,012-0,072 ммоль/л, предпочтительно 0,024-0,048 ммоль/л), триптофан (0,0360,22 ммоль/л, предпочтительно 0,072-0,14 ммоль/л) и фосфат (0,45-2,7 ммоль/л, предпочтительно 0,9-1,8 ммоль/л). Количества в скобках составляют 10-60%, предпочтительно 20-40%, от общих количеств, вводимых за 6 подпиток и приведенных в табл. 2. Предпочтительно также добавлять концентрат культуральной среды (10х, 50х, могут быть использованы и другие подходящие концентраты) до конечной кон

- 12 008670 центрации в диапазоне 0,15х-0,9х, предпочтительно в диапазоне 0,3х-0,6х. Предпочтительной культуральной средой в этих вариантах реализации данного изобретения является среда ЕхСе11 УРКО. Чтобы определить оптимальное количество добавлений компонентов, добавляют питание в культуральную среду в количестве, составляющем 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5 или 4-е разовые дозы питания (разовая доза - это количества, приведенные в табл. 1 или 2), и осуществляют простой бэтч-процесс с улучшенной таким образом средой для культивирования клеток с концентрацией около 10х10⁶ клеток/мл и получения продукта (например, антител) согласно изобретению. Улучшенного процесса бэтч-культивирования, дающего наиболее высокий выход продуктов, можно ожидать, когда до начала культивирования в культуральную среду вводится около 20-40% общего объема питания процесса бэтч-культивирования с подпиткой согласно изобретению, т.е. около 1-2,5 объемов разового питания. Конечно, возможно более тонкое регулирование количеств питания, когда благоприятный диапазон количества добавляемых компонентов установлен этими экспериментами. Конечно, когда количества клеток различаются, добавление компонентов может быть опять-таки откорректировано в соответствии с их количеством. Например, если клетки культивируют при плотности всего в 5х10⁶ клеток/мл, потребуется добавление всего половины обычного количества питания, как это понятно специалистам в данной области.

Таблица 1:

Компоненты Конечная концентрация (после добавления) (на 10х10⁶ клеток/мл) (ммоль л^-1)

Глюкоза 6, 00

Глутамин

Лейцин

Серин Изолейцин

Аргинин Метионин

Цистин

Валин

Лизин

Треонин Глицин

Аспарагин Тирозин Гистидин Фенилаланин Триптофан

Фосфат

1,75

0, 60

0,55

0,45

0,42

0,23

0,14

0,45

0,40

0,33

0,33

0,15

0,14

0,11

0,10

0,02

0,70

Кальций

ЪопдВЗ 1СГ-1 Ьопд ЕСЕ

Инсулин

0,02* мкг/л* мкг/л* мкг/л* присутствие необязательно

Таблица 2. Компоненты

Конечная концентрация (после добавления) (на 10х106 клеток/мл) (ммоль л-1) Первое питание Последующие питания

- 13 008670

Глюкоза	6,00	6,00
Глутамин	2,60	1,75
Лейцин	0, 66	0,66
Серин	1,10	0,55
Изолейцин	0,50	0,50
Аргинин	0,46	0,46
Метионин	0,23	0,23
Цистин	0,25	0,23
Валин	0,45	0, 45
Лизин	0,44	0,44
Треонин	0,30	0,30
Аспарагин	0,10	0,10
Тирозин	0,13	0,13
Гистидин	0,10	0,10
Фенилаланин	0,02	0,02
Триптофан	0,06	0,06
Фосфат	0,75	0,75
10Х УРКО	0,25Х	0,25Х

Список литературы

Вое1 Е., Уег1аап 8., РорреЬег МЛ., Жз1егдаа1 Ν.Α., Уап 81гцр Ι.Α., Бод1епЬегд Т. (2000). Бипсйопа1 Ьитап топос1опа1 апйЬод1ез оЕ а11 1зо1урез сопз1гис1ед Егот рЬаде д1зр1ау ЬЬгагу-дегВед зтд1е-сЬат Εν апйЬоду Егадтеп1з. I. 1ттипо1. МеФодз, 239, 153-66.

Н111з Α.Ε., Ра1е1 Α.Κ., Воуд Ρ.Ν. апд 1атез Б.С. 1999. Соп1го1 оЕ ШегареиЕс апЬЬоду д1усозу1айоп. 1п: Α. Вегпагд, В. ОпЕЕйЬз, Ж Νοβ апд Ε. Жат (едз), Атта1 Се11 ТесЬпо1оду: Ргодис1з Егот Се11з, Се11з аз Ргодис1з, 255-257, К1имег Αсадет^с Ргезз, БогдгесЫ, ТЬе №1Ьег1апдз.

Ни1з Ο.Α., Неупеп Ι.Α.Ε.Μ., Сиото Μ.Ε., КотпдзЬегдег 1.С., Жедтап Б., Вое1 Ε., νап дег Уиигз1-де Упез Α-В, Боузоп 8.Α.Ι, Не1ЕпсЬ νап Вегде Непедоимеп О.Р., νап Меуег М., де КгшЕ I., Бод1епЬегд Т. (1999). Α гесотЬтап!, Еи11у Ьитап топос1опа1 апйЬоду мЬЬ апЫитог асИх-Лу сопз!гис1ед Егот рЬадед1зр1ауед апйЬоду Егадтеп1з. ΝΕ Вю1есЬпо1., 17, 276-281.

Допез Ό., Кгооз Ν., Αпета В., Уап Моп1Еог1 В., Уооуз Α., Уап Бег Кгаа1з 8., Уап Бег Не1т Ε., 8тЬз 8., 8сЬои1еп I., Вгоимег К., БадегмегЕ Ε., Уап Вегке1 Р., Орз1еЬеп Ό-Ι, Бод1епЬегд Т., Вой! Α. (2003) Н1дЬ1е\^;е1 ехргеззюп оЕ гесотЬтап! 1дО т 1Ье Ьитап се11 1те ΡΕВ.С6. Вю1есЬпо1. Ргод., 19: 163-168.

РоПпег В., ВоЬтапп Α., Бидетапп I. апд Магк1 Н. (1994). Εзΐ^таΐ^оп оЕ зрес1Е1с д1исозе ир!аке га!ез т сиЬигез оЕ ЬуЬпдота се11з. I. Вю1есЬпо1., 34: 237-246.

8аиег Р.Ж, Вигку Ι.Ε., Аеззоп М.С., 81егпагд Н.Б. апд С)и Б. (2000). Α Ь1дЬ у1е1дтд, депепс ргосезз Еед Ьа1сЬ се11 сиЬиге ргосезз Еог ргодисйоп оЕ гесотЬтап! апйЬод1ез. Вю1есЬпо1. Вюепд., 67: 585-597.

Тапазе Т., 1кеда Υ., 1мата К., НазЬ1то1о Α., Ка1аока Т., ТокизЫта Υ. апд КоЬауазЫ Т. 1997. Сотрапзоп оЕ т1сго-Е111га11оп Ьо11ом Е1Ьег ЬюгеасФгз Еог таттаЬап се11 сиЬиге. I. Еегт. 1оепд. 83: 499-501.

Х1е Б., РЬЬгоидЬ Ж, Ме1а11о С, 2Ьопд Т., Р1киз Б., Беипд I., Αип^тз, 2Ьои Ж (2002) 8егит-Егее зизрепзюп сиЙВайоп оЕ ΡΕВ.С6® се11з апд гесотЬтап! адепоν^^из ргодисЬоп ипдег д1ЕЕегеп! рН сопдйюпз. Вю1есЬпо1. апд Вюепдт., 80: 569-579.

Ж1детапп В., Бидм1д Α. апд КгеЕгтег О. (1994). Бом 1етрега1иге сиЙВайоп - Α з!ер 1омагдз ргосезз орЬт1заЬоп. Су1о1есЬпо1оду, 15: 111-116.

АоЛраП Ό., Кпмап Ό. апд Оатег I. (1990). ΕЕЕесΐз оЕ се11 депзЬу апд д1исозе апд цкПатте 1еуе!з оп 1Ье гезрпайоп га!ез оЕ ЬуЬпдота се11з. Вю1есЬпо1. Вюепд., 36: 630-635.

Υа11ор ΟΑ. апд 8νепдзеп I. (2001). ТЬе еЕЕес!з оЕ О418 оп 1Ье дгом1Ь апд те1аЬоЬзт оЕ гесотЬтап! таттаЬап се11 1тез. Су1о1есЬпо1оду, 35: 101-114.

Claims (41)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ культивирования клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, причем указанные клетки способны к росту в суспензии, включающий в себя следующие стадии:

   а) определение по меньшей мере один раз в ходе культивирования клеток концентрации по меньшей мере одного из компонентов среды, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина, цистина, валина, лизина, треонина и глицина,

   б) добавление компонентов к среде в ходе культивирования клеток во время или до истощения по меньшей мере одного из компонентов, концентрацию которого определяли на стадии а), причем добавленные компоненты включают в себя, по меньшей мере, глюкозу, глутамин, фосфат, лейцин, серин, изолейцин, аргинин, метионин и цистин.
2. 2. Способ по п.1, в котором по меньшей мере один компонент среды, концентрацию которого определяли на стадии а), выбран из группы, состоящей из глюкозы, глутамина, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина и цистина.

   - 14 008670
3. 3. Способ по п.1 или 2, в котором на стадии а) концентрации определяли по меньшей мере у двух из указанных компонентов среды.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, в котором компоненты, добавленные на стадии б), дополнительно включают в себя одно или более веществ, выбранных из валина, лизина, треонина, глицина, аспарагина, тирозина, гистидина, фенилаланина, триптофана, фосфата, кальция, ЬоидКЗ ЮР-1, Ьоид ЕСЕ и инсулина.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором компоненты на стадии б) добавляют в конечной концентрации в ммоль/л свежедобавленного компонента на 10х10⁶ клеток/мл в диапазонах между 4,0 и 8,0 для глюкозы, 0,44 и 0,88 для лейцина, 0,37 и 1,47 для серина, 0,33 и 0,67 для изолейцина, 0,31 и 0,61 для аргинина, 0,15 и 0,31 для метионина и 0,1 и 0,6 для цистина.
6. 6. Способ по п.5, в котором на стадии б) глутамин дополнительно добавляли до конечной концентрации 1,17 и 3,47 ммоль/л свежедобавленного глутамина на 10х10⁶ клеток/мл.
7. 7. Способ по п.6, в котором компоненты на стадии б) добавляли более чем один раз, дополнительно отличающийся тем, что в результате первого добавления конечная концентрация свежедобавленного глутамина выше, чем в результате последующего добавления.
8. 8. Способ по п.5, в котором дополнительно добавляют глутамин, по существу, непрерывно, так что остаточная концентрация глутамина в среде поддерживается между 0,2 и 1,5 мМ, предпочтительно между 0,5 и 1,0 мМ.
9. 9. Способ по любому из пп.5-8, в котором на стадии б) дополнительно добавляют следующие компоненты до конечной концентрации в ммоль/л свежедобавленного компонента в расчете на 10х10⁶ клеток/мл в диапазоне между 0,3 и 0,6 для валина, 0,29 и 0,59 - для лизина, 0,2 и 0,4 - для треонина.
10. 10. Способ по п.9, в котором на стадии б) дополнительно добавляют следующие компоненты до конечной концентраций в ммоль/л свежедобавленного компонента на 10х10⁶ клеток/мл: между 0,067 и 0,13

    - аспарагина, 0,087 и 0,17 - тирозина, 0,067 и 0,13 - гистидина, 0,013 и 0,027 - фенилаланина и 0,04 и 0,08

    - триптофана.
11. 11. Способ по любому из пп.1-10, в котором добавление компонентов на стадии б) производят между 48 ч культивирования и непосредственно перед истощением по меньшей мере одного из компонентов среды, концентрацию которого определяли на предшествующей стадии.
12. 12. Способ по любому из пп.1-11, в котором указанные стадии повторяли по меньшей мере один раз.
13. 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором указанные клетки происходят из клеток сетчатки.
14. 14. Способ по п.13, в котором указанные клетки происходят из эмбриональных клеток сетчатки человека, представленных клетками, депонированными в ЕСАСС под № 96022940.
15. 15. Способ по любому из пп.1-14, в котором клетки выращивают при плотности клеток по меньшей мере 9х10⁶ клеток/мл.
16. 16. Способ по любому из пп.1-15, в котором клетки продуцируют продукт, который затем собирают.
17. 17. Способ по п.16, в котором указанный продукт представляет собой рекомбинантный белок.
18. 18. Способ по п.17, в котором указанный рекомбинантный белок является иммуноглобулином, который секретируется в культуральную среду до уровня по меньшей мере 500 мг/л.
19. 19. Способ по п.18, в котором указанный рекомбинантный белок является иммуноглобулином, который секретируется в культуральную среду до уровня по меньшей мере 1000 мг/л.
20. 20. Способ по любому из предшествующих пунктов, где клетки в период культивирования находятся в суспензии.
21. 21. Способ получения продукта в клетках, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, в котором указанные клетки находятся в культуральной среде, а указанный продукт выбран из группы, состоящей из рекомбинантного белка, вируса и рекомбинантного аденовируса с делецией в сегменте Е1, отличающийся тем, что культуральную среду дополняют внесением в культуральную среду, по меньшей мере, глутамина, глюкозы, фосфата, лейцина, серина, изолейцина, аргинина, метионина и цистина.
22. 22. Способ по п.21, дополнительно отличающийся тем, что концентрация указанных клеток достигает по меньшей мере 20х10⁶, предпочтительно по меньшей мере 30х10⁶ жизнеспособных клеток/мл в течение по меньшей мере части периода указанного процесса.
23. 23. Способ получения продукта в клетках, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, в котором указанные клетки культивируют в культуральной среде, отличающийся тем, что культуральную среду дополняют путем добавления следующих компонентов на 1 л культуральной среды: 3,6-21,6 ммоль глюкозы, 6,8-40,9 ммоль глутамина, 0,40-2,4 ммоль лейцина, 2,31-13,9 ммоль серина, 0,3-1,8 ммоль изолейцина, 0,28-1,66 ммоль аргинина, 0,14-0,83 ммоль метионина, 0,15-0,9 ммоль цистина, 0,27-1,62 ммоль валина, 0,26-1,58 ммоль лизина, 0,18-1,08 ммоль треонина, 0,06-0,36 ммоль аспарагина, 0,078-0,47 ммоль тирозина, 0,06-0,36 ммоль гистидина, 0,012-0,072 ммоль фенилаланина, 0,036-0,22 ммоль триптофана и 0,45-2,7 ммоль фосфата.
24. 24. Способ по п.23, в котором количества компонентов, добавляемых на литр культуральной среды,

    - 15 008670 составляют 7,2-14,4 ммоль глюкозы, 13,6-27,2 ммоль глутамина, 0,79-1,6 ммоль лейцина, 4,62-9,24 ммоль серина, 0,6-1,2 ммоль изолейцина, 0,55-1,10 ммоль аргинина, 0,28-0,55 ммоль метионина, 0,3-0,6 ммоль цистина, 0,54-1,08 ммоль валина, 0,53-1,06 ммоль лизина, 0,36-0,72 ммоль треонина, 0,12-0,24 ммоль аспарагина, 0,16-0,31 ммоль тирозина, 0,12-0,24 ммоль гистидина, 0,024-0,048 ммоль фенилаланина, 0,0720,14 ммоль триптофана и 0,9-1,8 ммоль фосфата.
25. 25. Способ по п.23 или 24, в котором дополнительные концентраты культуральной среды добавляют в конечной концентрации 0,15х-0,9х, предпочтительно 0,3х-0,6х.
26. 26. Способ по любому из пп.23-25, в котором указанные компоненты добавляют в культуральную среду до начала культивирования клеток.
27. 27. Культура клеток, иммортализованных аденовирусными последовательностями Е1, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 10х10⁶ клеток/мл.
28. 28. Культура клеток по п.27, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 12х10⁶ клеток/мл.
29. 29. Культура клеток по п.28, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 15х10⁶ клеток/мл.
30. 30. Культура клеток по п.29, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 20х10⁶ клеток/мл.
31. 31. Культура клеток по п.30, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 30х10⁶ клеток/мл.
32. 32. Культура клеток по п.31, отличающаяся тем, что указанная культура содержит по меньшей мере 40х10⁶ клеток/мл.
33. 33. Культура клеток по любому из пп.27-32, в которой по меньшей мере 80% клеток жизнеспособ ны.
34. 34. Культура клеток по любому из пп.27-33, в которой культуральная среда сменяется со скоростью около 0,2-3 объемов культуры/день.
35. 35. Культура клеток по любому из пп.27-34, в которой клетки в указанной культуре экспрессируют рекомбинантный белок.
36. 36. Культура клеток по п.35, в которой указанные клетки продуцируют по меньшей мере 10 пг белка/клетку/день.
37. 37. Культура клеток по п.27, которая представляет собой бэтч-культуру, клетки которой экспрессируют рекомбинантный иммуноглобулин с выходом по меньшей мере 500 мг/л.
38. 38. Культура клеток по п.37, в которой указанный выход составляет по меньшей мере 700 мг/мл.
39. 39. Культура клеток по п.35 или п.36, которая представляет собой перфузионную культуру или перфузионную культуру с подпиткой и в которой указанный рекомбинантный белок является иммуноглобулином, который экспрессируется с выходом по меньшей мере 150 мг/л/день.
40. 40. Культура клеток по любому из пп.27-39, в которой указанные клетки происходят от эмбриональных клеток сетчатки человека, представленных клетками, депонированными в ЕСАСС под № 96022940.
41. 41. Культура клеток по любому из пп.27-40, причем указанная культура является суспензионной культурой.