JP4865539B2

JP4865539B2 - Ｅ１不死化細胞の培養物及び該培養物を培養して該培養物から得られる産物の収量を増加させる方法

Info

Publication number: JP4865539B2
Application number: JP2006505590A
Authority: JP
Inventors: アダムヤロップクリストファー
Original assignee: クルセルホランドベーヴェー
Priority date: 2003-05-09
Filing date: 2004-05-06
Publication date: 2012-02-01
Anticipated expiration: 2024-05-06
Also published as: US7291484B2; US20060121611A1; CN100383238C; EP1623023A1; DE602004017709D1; CN101328473A; US20070031932A1; EA008670B1; EP1623023B1; CA2520891A1; JP2006525800A; IL198861A; BRPI0409895B1; DK1623023T3; US8008043B2; US20100311160A1; CA2520891C; EA200501774A1; BRPI0409895B8; AU2004236440B2

Description

本発明は、細胞培養の分野に関する。詳細には、本発明は、アデノウイルス由来のE1配列によって不死化した細胞に由来する細胞を培養する分野に関する。より詳細には、本発明は、当該細胞を培養して当該細胞から高レベルの産物を得ることに関する。

No.96022940の下、ECACCに寄託されている細胞によって例示されるヒトPER.C6（登録商標）細胞株はアデノウイルス（Ad5）E1a及びE1b遺伝子で不死化することによって網膜細胞から得られ、特許文献１に開示されている。E1欠損アデノウイルスベクターのためのパッケージング細胞（特許文献１；特許文献２）、及び他のウイルスを製造するためのパッケージング細胞（特許文献３）として機能する能力に加えて、PER.C6細胞などのE1不死化細胞は、抗体などの組換えタンパク質を生産するために使用することができる（特許文献４）。
Xieら（2002）非特許文献１には、E1不死化細胞を無血清で懸濁培養する方法が開示されている。

米国特許第５，９９４，１２８号国際公開第０１／００５９４５号パンフレット国際公開第０１／３８３６２号パンフレット国際公開第００／６３４０３号パンフレット Xie L, Pilbrough W, Metallo C, Zhong T, Pikus L, Leung J, Auniμs, Zhou W (2002) Serum-free suspension cultivation of PER．C6(登録商標) cells and recombinant adenovirus production under different pH conditions. Biotechnol and Bioengin 80:569-579.

しかしながら、E1不死化細胞に関する技術分野において開示されている培養方法を使用して得られた産物の収量を向上させることができる。本発明の目的は、このタイプの細胞からの産物の収量を増加させる新規方法を提供することにある。

第１の態様において、本発明は、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞の流加（fed-batch culture）又は供給灌流培養（fed-perfusion culture）における供給計画を提供する。その一実施態様において、本発明は、当該細胞を培養する方法を提供し、前記細胞は懸濁液中で培養することが可能であり、該方法は、グルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン、シスチン、バリン、リジン、スレオニン及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の培地成分の濃度を、細胞を培養している間に少なくとも一度決定する工程と、細胞を培養している間、以前の工程で濃度を決定した少なくとも１種の成分が枯渇する際、又は枯渇する前に培地に成分を添加する工程とを有し、添加する工程において、添加される成分は、少なくともグルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン及びシスチンを含む。本発明に従って有利に添加することができる他の成分、成分の添加量、及び成分の添加時間を以下に、及び特許請求の範囲に記載する。

本発明の別の態様は、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞より得られた細胞培養物を提供することにあり、前記培養物は、少なくとも10x10⁶細胞／mlを含むことを特徴とする。好ましくは、前記培養物は少なくとも12x10⁶細胞／mlを含み、より好ましくは少なくとも15x10⁶細胞／mlを含む。特定の好ましい実施態様において、本発明に従う培養物は20x10⁶、25x10⁶、30x10⁶又は、40x10⁶細胞／ml以上を含む。ここでは、当該培養物を得る方法も提供される。

また、別の実施態様において、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞の細胞密度及び該細胞の培養物からの産物の収量を増加させる方法が提供される。この一実施態様において、当該細胞を培養する方法が提供され、前記方法は、0.8x10⁶〜2.0x10⁶生細胞／ml、好ましくは0.9x10⁶〜1.5x10⁶生細胞／mlの接種濃度で前記細胞を継代培養する工程を有することを特徴とする。

好ましくは、本発明の方法に使用する細胞は網膜細胞由来であり、より好ましくはヒト胚性網膜（HER）細胞由来であり、当該細胞は、ECACC 受託No.96022940の下寄託されている。特定の実施態様において、前記細胞はPER.C6細胞である。

特定の実施態様において、前記細胞は組換えタンパク質、好ましくは抗体を高収量で生産できる。他の実施態様において、前記細胞は、E1領域での欠損を有する組み換えアデノウイルスベクター、又は本発明に従う方法を用いて高収量で前記細胞において生産することができる他のウイルスを含む。好ましい実施態様において、前記細胞は少なくとも一部の時間、無血清培地内で培養する。

いずれの細胞株の生産性も、主に、３つの基本的なパラメーター、すなわち細胞株特有の生産性、達成可能であるピークの生細胞濃度、及び可能である生産プロセスの長さによって決まる。これらの変量のいずれかを増加せることによって、最終産物の濃度が増大し、当該変量のいずれかの増加は大体において細胞株に依存する。正統なバッチ培養（straight batch culture）において、CHO及びSP2/0などの細胞株は、4x10⁶/mlまでの細胞密度を達成することができる。流加（fed-batch）方法又は灌流（perfusion）方法において、生細胞濃度が増大し、典型的には、SP2/0などのハイブリドーマ細胞は、10x10⁶細胞/mlまで培養することができ、CHOは、6〜10x10⁶細胞/mlまで培養することができる。本発明では、好ましくは胚性網膜細胞由来の、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞の培養物の生細胞の密度を増加させて、先行技術において報告されたものを超える細胞密度を達成する方法について述べる。さらに、本発明に従う方法を使用して、本発明に従う細胞の培養物からより高い産物の収量を得ることができる。

本発明は、どのような方法でPER.C6細胞などのE1不死化細胞を高収量のモノクロナール抗体の生産のために有利に使用することができるのかという改良方法を明らかにする。これらの細胞を正統なバッチ方法において非常に高い生細胞濃度となるように（14x10⁶生細胞/mlまで）培養することを開示する。

さらに、PER.C6細胞などのE1不死化細胞は、これらの細胞の培養物が意外にも乳酸塩及びアンモニアを消費し、栄養を制限した条件下で長期間生存し続けることが可能であるので、流加方法に良く適合する。培養における供給計画によって前記細胞からの産物の収量を増加させる方法が提供される。

本明細書で使用する「供給計画」という用語は、ある種の特定された成分の培地への添加を意味し、該成分としては、特に制限されるものではないが、糖、アミノ酸などの栄養分が挙げられる。特定された成分は、好ましくは、本明細書に記載されているような、当該成分が細胞からの産物の収量を向上させるのに必要とされる場合に、ある特定の量で、特定の時間に添加される。

PER.C6細胞などのE1不死化細胞は、また、該細胞を非常に高い生細胞濃度（50x10⁶細胞/mlまで、生存率は少なくとも85％）で長期間維持することができ、最終産物の濃度が良好であるので、灌流（perfusion）方法に良く適合する。

培地
本発明の方法は、概して、本発明に従う細胞に関する技術分野において説明されている方法で得られる収量と比較して、細胞からの産物の収量を増加させるものである。好ましくは、無血清培地を本発明に従う方法における少なくとも一部の時間において使用する。好ましくは、培地は動物由来のものではなく遺伝子組み換えで生産されたタンパク質のみを含有する。そのような培地は種々の供給元から市販されている。本発明の一実施態様においては、VPRO培地（JRH Biosciences）を流加方法又は（供給）灌流方法に使用する。

産物
本発明の方法は、好ましくは、本発明の細胞において産物を生産するために使用される。本発明の方法は、抗体に加えて他のタンパク質（国際公開第００/６３４０３号パンフレット）の生産の改善に使用することができる。タンパク質の製造のために、本発明の細胞は、適度に前記タンパク質をコードする核酸を、実施可能であるように、前記タンパク質の発現を推進することが可能なエレメントと共に含む。さらに、該方法は、E1領域の欠損を有する組み換えアデノウイルスベクターの生産の改善のために使用することができ、その場合、確立された方法論（例えば、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、国際公開第０１／００５９４５号パンフレット）に従い、当業者に既知である補体細胞として細胞を使用する。また、本発明に従う方法を使用して、他の（アデノウイルスではない）ウイルスの細胞内での増殖方法（国際公開第０１/３８３６２号パンフレット）を改善することができる。従って、本発明に従う産物は抗体、エリスロポエチンなどの組換えタンパク質に加えて、E1領域の欠損を有する組み換えアデノウイルスベクター、又は他のウイルスであってもよい。

細胞
本発明に従う細胞は、アデノウイルス由来E1配列で不死化した細胞であり、該細胞は本明細書ではE1不死化細胞とも称される。当該細胞はアデノウイルスのE1A領域の少なくとも機能的な部分を発現し、好ましくは、E1B領域の少なくとも機能的な部分も発現する。E1Aタンパク質は形質転換活性を有し、E1Bタンパク質は抗アポトーシス活性を有する。本発明に従う細胞は、肺細胞、腎細胞、羊膜細胞を含むいずれの細胞由来であってもよいが、好ましくは網膜細胞由来である。本発明に従う細胞は胚性網膜細胞由来であってもよい。好ましくは、本発明に従う細胞はヒト細胞である。胚性網膜細胞の不死化方法は本技術分野において開示されている（米国特許第５，９９４，１２８号明細書）。従って、アデノウイルス由来E1配列で不死化した網膜細胞はその方法によって得ることができる。特定の好ましい実施態様において、本発明の細胞は、PER.C6細胞などのE1不死化HER細胞由来である。本願におけるPER.C6細胞とは、細胞の上流もしくは下流の継代由来の、又は細胞の上流もしくは下流の継代の子孫由来の細胞を意味し、ECACC No.96022940の下に寄託されている。さらに、ts125変異を有するE2A領域も前記細胞内に存在してもよい（米国特許第６，３９５，５１９号明細書参照）。PER.C6細胞由来の細胞は、組み換えアデノウイルス又はその他のウイルスに感染したPER.C6細胞であってもよく、組み換え核酸を導入したPER.C6細胞、例えば、所定のタンパク質をコードする核酸が、実施可能であるように、プロモーター及びポリＡシグナルなどのその発現を駆動することが可能な配列に連結されている発現カセットを含むPER.C6細胞であってもよく、好ましくは、前記細胞は、当業者に既知である標準な手法に従い選択することができる安定したクローン由来である。当該クローンの培養は、前記組み換え核酸によってコードされるタンパク質を生産することが可能である。

供給計画のための成分
一態様において、本発明は、本発明に従う細胞を培養する方法を提供し、該方法では、本発明に従う供給計画によって、特定のアミノ酸を培養プロセスの間に添加して、濃度が最適なプロセス及び産物の収量のために制限されたか、又は制限されることになるアミノ酸を補充する。アミノ酸は、総ての天然に生ずるＤ及びＬの両方の立体異性体のαアミノ酸およびそれらの誘導体を意味するものである。誘導体は、アミノ酸に付いた別の分子又は原子を有するアミノ酸として定義される。誘導体には、例えば、アミノ基のアセチル化、カルボキシル基のアミノ化、又はシスチンを形成する２個のシステインの硫黄残基の酸化が含まれる。さらに、アミノ酸誘導体には、エステル、塩化物、硫酸塩といった塩などに加えて水和物が含まれてもよい。当業者であれば、特定のアミノ酸が本明細書に記載されている場合、誘導体も使用してもよく、該誘導体も本発明の範囲内に含まれることが理解できる。糖、成長因子、ビタミンなどの他の成分も添加して、本発明に従う方法を改良してもよい。

供給計画
一態様において、本発明は、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞において産物を培地内で製造する方法を提供し、該方法において、前記産物は、組換えタンパク質、ウイルス、及びE1領域における欠損を有する組み換えアデノウイルスからなる群より選択され、前記方法は、少なくともロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン及びシスチンを培地に添加する工程を含むことを特徴とする。一態様において、本発明は、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞を培養する方法を提供し、前記細胞は懸濁して培養することが可能であるものであって、該方法は、細胞を培養している間に少なくとも一度、グルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン、シスチン、バリン、リジン、スレオニン及びグリシンからなる群から選択される少なくとも１種の培地成分の濃度を決定する工程と、細胞を培養している間に、濃度を前の工程で決定した少なくとも１種の成分が枯渇するとき又は枯渇する前に培地に成分を添加する工程とを含み、添加する工程において、添加される成分は、少なくともグルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン、シスチンを含む。本明細書で使用される「枯渇」とは、培地内の開始時の濃度の30％又はそれ未満の濃度を成分が有する時間として定義される。これらの態様において、グルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン、及びシスチンからなる群から選択される少なくとも１種の培地成分の濃度を決定することが、バリン、リジン、スレオニン及びグリシンからなる群から選択される成分のみ決定することよりも好ましい。特定の実施態様において、本発明に従う少なくとも２種の培地成分の濃度を最初の工程において決定する。特定の実施態様において、添加される成分は、さらに１種又は複数のバリン、リジン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、カルシウム、Long R3 IGF-1、Long EGFおよびインスリンを含む。特定の実施態様において、成分が、最終濃度で、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、グルコースでは6.0、グルタミンでは、最初の供給においては2.60、その後の供給においては1.75、リン酸塩では0.70、ロイシンでは0.66、セリンでは、最初の供給においては1.10、その後の供給においては0.55、イソロイシンでは0.50、アルギニンでは0.46、メチオニンでは0.23、及びシスチンでは0.25で添加される。更なる実施態様では、下記の成分が、最終濃度で、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、バリンでは0.45、リジンでは0.44、及びスレオニンでは0.30で、さらに添加される。更なる実施態様において、下記の成分が、最終濃度で、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、アスパラギンでは0.10、チロシンでは0.13、ヒスチジンでは0.10、フェニルアラニンでは0.02、及びトリプトファンでは0.06で、さらに添加される。さらに、カルシウムも、最終濃度で、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで0.02添加してもよい。IGF、EGF、及びインスリンなどの増殖因子、又はそれらの誘導体も培地中に入れるのに適している。上記成分の添加量は、33％又はそれ未満の、好ましくは20％又はそれ未満の、より好ましくは10％又はそれ未満の、さらにより好ましくは5％又はそれ未満の成分当たりの許容誤差を有してもよい。量は、10x10⁶細胞／ml当たりで示され、細胞／mlの数に直線的に依存する。好ましい実施態様において、前記成分は、48時間と、濃度が前の工程で決定された少なくとも１種の培地成分が枯渇する時との間に添加される。特定の実施態様において、前記添加は24時間とちょうど枯渇する前との間に行われる。特定の態様において、本発明は、本発明に従う方法を提供し、該方法において、前記細胞は、少なくとも500mg／リットル、好ましくは少なくとも700mg/l、より好ましくは少なくとも850mg/l、さらにより好ましくは少なくとも1000mg/l、さらにより好ましくは少なくとも1250mg/l、さらにより好ましくは少なくとも1500mg/lさらにより好ましくは少なくとも1750mg/l、さらにより好ましくは少なくとも2000mg/lのレベルになるように培地中に分泌される組み換えイムノグロブリンを発現する。概して、本発明に従う培地成分の添加によって、すなわち、例えば流加方法では、生産される産物の収量が、全く成分を添加しない方法、すなわちバッチ方法と比較して、少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも2.5倍、さらにより好ましくは約3倍又はそれよりはるかに高い量増加する。

流加方法での使用に加えて、本発明の供給計画は、また、実施例５に示すように、最適化されたバッチ方法においても好都合に使用することができる。

灌流
別の方法として、本発明の別の態様において、全培地を交換してもよい。アデノウイルスE1配列によって不死化した網膜細胞由来の細胞にこのことを適用した場合、予期しない高い生細胞密度を保持することができることが示される。培地交換を、当業者に既知のいずれの手段によって行ってもよく、該手段としては、特に制限されないが、遠心分離、濾過などによる細胞の収集後、細胞を新鮮な培地に再懸濁することが挙げられる。別の方法として、灌流システムを使用してもよく、該システムでは、セントリテック（centritech）遠心分離などの細胞分離装置を用いて、又はホロー・ファイバー・カートリッジ内を通過させることなどによって培地を連続的に又は断続的に交換する。従って、本発明の別の態様は、アデノウイルスE1配列によって不死化した胚性網膜細胞由来の細胞を培養する方法を提供することにあり、該方法は、培地を、１日（24時間）当たり0.2〜3、好ましくは0.5〜3の培養ボリュームの割合で交換することを特徴とする。本方法を用いて得られた培養物は、好ましくは20x10⁶細胞／ml以上、より好ましくは30x10⁶細胞／ml以上の生細胞密度を有する。特定の態様において、そのような培養物は40x10⁶細胞／ml以上の細胞密度を有する。特定の態様において、そのような培養物を用いて、組み換え抗体を、少なくとも150mg/l/日の収量で、好ましくは少なくとも200mg/l/日の収量で、より好ましくは少なくとも300、400、又は500mg/l/日の収量で製造する。当然、本発明に従う他の産物も当該方法によって製造できる。ここでは、毎日１回培地の全ボリュームを交換することによって、少なくとも30x10⁶生細胞／mlが支持され、抗体の収量が500mg/L/日以上（750mg/l/日まで）となることが示されている（図５）。毎日１回全部の培地を交換することは、１日当たり３ボリュームの連続した灌流の割合に相当し、連続灌流システムがおよそで少なくとも150〜200mg/L/日を生じることができることを意味する。この灌流の割合を減じ、それによって抗体の収量を増加させる（抗体が分泌される容積を減らすことによって）一の方法は、必須成分で新鮮な培地を補うことである（供給−灌流（fed-batch）として知られている）。PER.C6細胞などの抗体産生E1不死化細胞、クローンのためのこれらの成分は本明細書において特定され（実施例２参照）、それ故に本発明の別の態様は、そのような供給−灌流システムを提供することにあり、該システムにおいて、本発明に従う供給計画が使用される。供給−灌流方法の通常の不利益は毒性のある代謝副産物（乳酸塩及びアンモニアなど）が作られることであり、それによって、細胞の生存率及び産物の収量が低くなる。多くの場合、高い灌流割合での高い細胞濃度では、これらの副産物を除去する必要がある。本発明に従う、PER.C6細胞などのE1不死化細胞、クローンで実証された１の利益は、それらの細胞及びクローンが、濃度が問題とならないように乳酸塩及びアンモニアを利用することができることである（図３Ａ参照）。従って、１日に１回又は２回培地を交換することによって少なくとも500mg/l/日の抗体の収量を得ることができる。別の方法として、毎日例えば１ボリュームの連続灌流割合と、供給の濃縮物（feed concentrate）での培地の補充とを共に用いること（供給−灌流）によって、このことを達成することができる。これは、細胞のブリード（bleed）（細胞の集団の特定のパーセンテージを取り除くこと）と好都合に組み合わせることができる。

高い細胞密度を有する培養物は、高い産物の収量を得るのに好都合である。したがって、本発明の別の態様は、アデノウイルスE1配列によって不死化した細胞由来の細胞の培養物を提供することであり、前記培養物は少なくとも10x10⁶細胞/mlを含む。培養物内での生存率は少なくとも80％である。好ましくは、生存率は少なくとも90％であり、より好ましくは少なくとも95％である。本発明に従う培養物は好ましくは懸濁培養物であり、懸濁培養物とは、前記培養物内の細胞が、振盪フラスコ、ローラーボトル、及び攪拌タンク、エアリフト・リアクターなどを備えるバイオリアクターなどの中の培地内で懸濁している状態であることを意味する。しかしながら、本明細書に記載されている計画は、また、Tanaseら（1997）に記載されているものなどのホローファイバーリアクター内での細胞の培養に使用してもよく、マイクロキャリア上の細胞などの付着培養に使用してもよい。一実施態様において、前記培養物は少なくとも12x10⁶細胞／mlを含む。正統なバッチ培養によって14x10⁶細胞/mlまで得ることができることを本明細書にて明らかにする。

さらに、培地灌流によって、さらに高い細胞密度である50x10⁶細胞/mlまでの密度を達成することができる。先行技術には、そのような予想外の高い細胞密度を得ることができることを示唆するものがない。従って、他の好ましい実施態様において、本発明は、好ましくは網膜細胞由来のE1不死化細胞から得られる細胞の培養物を提供し、前記培養物は少なくとも15x10⁶細胞/ml、好ましくは少なくとも20x10⁶細胞/ml、より好ましくは少なくとも25x10⁶細胞/mlを含む。特定の実施態様において、前記培養物は少なくとも30x10⁶細胞/ml又は少なくとも40x10⁶細胞/mlも含む。本発明に従う少なくとも15x10⁶細胞/mlを有する培養物は灌流方法によって得ることができ、該灌流方法とは、培養プロセス中に培地を交換することを意味するものである。本発明に従う培養物は、少なくとも80％、好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、さらにより好ましくは少なくとも95％の生存率を有する。前記培養物は懸濁培養物である。前記培養物はさらに増殖培地（growth medium）を含む。前記増殖培地は好ましくは無血清である。培養物の細胞は、イムノグロブリンをコードする組み換え核酸分子、又はその一部もしくは誘導体を発現可能な形で含んでもよい。そのような細胞は、イムノグロブリンを高収量で生産することができる。特に、毎日培地を交換し、30x10⁶細胞/ml以上存在する本発明に従う細胞の培養物によって、少なくとも500mg/l/日の組み換え抗体の収量を得ることができる。前記培養物内の細胞は、好ましくは少なくとも10pg タンパク質／細胞／日を生産する。

本発明の方法、特に組換えタンパク質を生産する方法も、場合によっては産物の収量を向上させる技術に記載されている他の手段と組み合わせることができる。したがって、本発明の特定の実施態様において、生産段階の前又はその間に、例えば生産段階において、より低い温度、例えば30℃〜35℃の間でプロセスを行うことによって（組換えタンパク質の生産におけるいくつかのパラメーターに対する細胞培養温度の低下の効果について記載されている米国特許第６，５０６，５９８号及び該文献にて引用されている文献参照）、又は細胞を継代培養した際に、又は後の培養プロセスの間に冷却した培地を培養物に添加することによって（冷却したとは、細胞を培養する温度よりも低いことを意味し、好ましくは2℃〜8℃の温度を有する冷却した培地）、培地の温度を変動させる。他の実施態様において、特定の増殖因子を、産物の収量について本発明に従う方法を改良するために添加してもよい。タンパク質の生産についての他の実施態様において、本発明に従う方法を、カルボン酸又は酪酸ナトリウムなどのその塩を全培養段階の間に又は生産段階の間のみに添加することによって改良してもよい（細胞の培養におけるタンパク質の生産に対する酪酸塩の添加の影響について記載されている米国特許第６，４１３，７４６号及び該文献に引用されている参考文献参照）。タンパク質の生産についての他の実施態様において、培地の温度又はpHを変動させてもよい（Weidemannら1994、Sauerら2000）。

本発明に従ういくつかの態様及び／又は実施態様を組み合わせて産物の収量が特に良くなる細胞を培養する方法を提供することができることは当業者に明らかである。特に制限するものではないが、例えば、E1不死化細胞の培養物を約0.8x10⁶〜2.0x10⁶細胞／mlで蒔くことができ、培養プロセスの間、供給計画を使用するか、かつ／又は増殖培地を交換して最終産物の収量を向上させることができる。

以下、本発明をいくつかの実施例を用いて説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を何ら制限するものではない。

（実験）
細胞及び／又は細胞株を遺伝子組み換えして所定のタンパク質を発現する方法及びベクターは当業者に既知であり、例えば、種々の技術がCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubelら., eds.（Wiley & Sons, New York, 1988, 年４回更新）及びSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Cold Spring Laboratory Press, 1989）に示されている。一般的な及び標準の細胞培養技術は当業者に既知であり、例えば、R.I. Freshney, Culture of animal cells：A manual of basic technique, fourth edition（Wiley-Liss Inc., 2000, ISMN 0-471-34889-9）に記載されている。特に断りがない限り、そのような標準技術に従う。

（細胞培養プロトコール）
本実施例ではPER.C6細胞を培養した。10％FBS含有DMEM（Invitrogen）中の付着性培養物から直接移すことによって無血清培地に適応させた。簡潔に言うと、サブコンフルエントな状態の対数期の細胞をトリプシン処理し、無血清培地で1回洗浄し、25mlのExCell-525無血清培地（JRH Biosciences）を入れた0.2μフィルター（Corning）を備えた250mlのEnrlenmeyerフラスコに特に断りがなければ0.3〜0.5x10⁶ml^-1の開始細胞濃度で直接接種した。培養物をEnrlenmeyerフラスコ内で2〜3日ごとに継代することによって対数増殖期に維持した。フラスコを37℃、5％CO₂の加湿インキュベーター内にて磁気振盪機プラットフォーム（Infors）上で100rpmで振盪した。培養物を1000rpmで5分間遠心することによって継代した。上清を取り除き、ペレットを残存する培地に再懸濁した。新鮮な冷却した培地（4℃）を添加し、適当な細胞濃度で新しいフラスコに接種した。無血清培地に移した後、培養物を2〜4週間継代させて完全に適応させ、その後、無血清細胞バンクを構築した。総ての実験をこの細胞バンク由来の細胞を用いて開始した。

（バイオリアクター）
バイオリアクターでの培養を2Lの可動範囲を有する3Lの反応器（Applikon）内で行った。温度をヒート・ブランケットによって37℃に維持した。溶存酸素濃度（dO₂）を、50％の空気飽和で、注入ガス組成をヘッドスペースによって調整し、微小孔のスパージャーで断続的に散布することによって制御した。開始培養pHを微小孔のスパージャーでCO₂を添加することによって7.3に制御した。培養pHの下限を、培養pHを下方へ流れさせる（下限に達しない）ように6.7に設定した。培養物を2つのマリン・インペラーによって75rpmで攪拌した。プロセスデータをBioExpert software（Applikon）によって取得した。

（分析プロトコール）
細胞の数及び生存率の測定を、CASY自動細胞カウンター（Sharfe Systems）を用いて行った。グルコース、乳酸塩、アンモニア及びリン酸塩の濃度をEktachem IIアナライザー（Kodak）と細胞のない培養上清を用いて決定した。アミノ酸濃度を、Wandelen及びCohen（1997）に記載されている改変したAccuTag HPLC法（Waters）を用いて決定した。遠心した細胞上清の一定分量（200μl）を-20℃で1mlの凍結バイアル（Nalgen）内で必要となるまで保存した。各実験由来のサンプルを同時に分析して実験のバラツキを回避した。浸透圧を凝固点降下法の浸透圧計（Osmomat 030-d，Gonotec）で測定した。抗体濃度をサンドウィッチタイプELISAによって決定した。簡単に言うと、プレートを2μg ml^-1のカッパ軽鎖に対するマウス抗ヒトIgG（Pharmingen）で被覆し、一晩4℃でインキュベートした。重鎖に対するHRP抱合マウス抗ヒトIgG（Pharmingen；1：500）を検出抗体として1時間37℃で用い、OPD（Sigma）を基質として用いた。インキュベーション工程間の洗浄を0.05％Tween20のPBS溶液を用いて行った。サンプルを0.1％BSAを添加した洗浄バッファーで希釈した。定量を10〜400ng ml^-1の較正範囲を用いて、IgG1の参照標準と比較した。プロテインＡで精製した抗体サンプルの品質分析を等電点電気泳動法（IEF）と変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（SDS-PAGE）を用いて行った。グリカン分析では、N結合グリカンを、IgGサンプルの20mMリン酸ナトリウム溶液（pH7.2）内でのPNGase F処理によって除去し、Applied Biosystems Voyager DE ProマススペクトロメーターでのリフレクターモードのMALDI-MSで分析した。マトリックスはアセトニトリル／水／トリフルオロ酢酸が50/50/0.1である溶液中の２，５−ジヒドロキシ安息香酸（10mg ml^-1）であった。スペクトルをポジティブイオンモードで得、グリカンをナトリウム付加体（[M+Na]+）として検出した。

（細胞特有の代謝速度の計算）
バッチ培養及び流加培養における代謝産物の利用及び生産の細胞特有の速度を下記等式：
q_s = (C₂ - C₁) / (t₂ - t₁) x [(X₂ - X₁) / ln(X₂ - X₁)]に示す細胞濃度の対数平均値を使用して計算した。
この式において、Cは代謝産物の濃度（マイクロモル／l）、tは時間（日）、及びXは生存細胞濃度である。グルタミンの自然分解から成る速度定数は、分解が速度を計算する時点で重要でないため含めなかった（データ示さず）。グルコース当りの生産された乳酸塩の生産係数（Y_lac/glc）、グルタミン当りの生産されたアンモニアの生産係数（Y_amm/gln）、グルタミン当りの生産されたアラニンの生産係数（Y_ala/gln）を下記等式：
Y_lac/glc ＝ q_lac / q_glc
Y_amm/gln ＝ q_amm / q_gln
Y_ala/gln ＝ q_ala / q_gln
から計算し、モル／モルで表した。

（実施例１：PER.C6細胞のバッチ培養における最大最終細胞収量の増加）
最も簡単な生産方法はバッチ培養である。しかしながら、この培養は生存細胞濃度に制限され、それ故に多くは栄養物の制限により産物の収量が達成できる。異なる細胞濃度での鍵となる栄養物の利用の細胞特有の速度を計算し、細胞増殖に対して栄養物が最適に利用される細胞濃度でバッチ培養を開始することによって、PER.C6又はPER.C6由来サブクローンのバッチ培養の最大最終細胞濃度増加させる方法が示される。

最初に、上皮細胞接着分子（EpCAM）を認識する抗体の抗原結合領域をコードするDNAをscFvファージ・ディスプレイ・ライブラリー（Hulsら，1999）より単離した。CD46を認識する抗体の抗原結合領域をコードするDNAを国際公開第０２／０１８９４８号パンフレットに開示されている通りに単離した。IgG1タイプのリーダー配列及び定常領域を基本的にBoelら，2000に記載されている通りに付加した。次に、軽鎖及び重鎖をコードするDNAを発現ベクターpcDNA3002（Neo）にクローニングした。発現ベクターpcDNA3002（Neo）は、国際特許出願番号PCT/NL02/00841号に記載されており、2001年12月13日にEurope Collection of Cell Cultures（ECACC）にナンバー01121318の下で寄託された。EpCAM又はCD46を認識するIgG1をそれぞれコードし、CMVプロモーターによって制御されている生じた発現ベクターを標準の方法に従ってPER.C6細胞に導入した。

PER.C6細胞株の親の集団由来の組み換え抗体発現クローンを本実験で用いた。抗EpCAMを発現するクローンをここではクローン１と呼び、抗CD46を発現するクローンをここではクローン２と呼ぶ。
細胞をExCell（商標）525培地（JRH Biosciences）内で維持し（GTM-3培地（Sigma）内での細胞の維持も行った）、バッチ生産をExCell（商標）VPRO培地（JRH Biosciences，カタログ番号14560）内で実施した。バッチ生産のために細胞をExCell（商標）525からExCell（商標）VPROに直接移した。

図１は、0.3x10⁶細胞 ml^-1で開始した培養物が9日後に10x10⁶細胞 ml^-1に達したのと比較して、1x10⁶細胞 ml^-1で開始した培養物の最大最終生細胞濃度が6日後に約14x10⁶細胞 ml^-1に達した（CHO及びSp2/0のバッチ培養物より約3倍高い）ことを示す。両培養物の最終抗体力価の差異は非常に小さいものであった。しかしながら、0.3x10⁶細胞 ml^-1で開始した培養物では9日後に約600mg L^-1に達したのと比較して、1x10⁶細胞 ml^-1で開始した培養物においては6日後に約600mg L^-1に達した。

0.3x10⁶細胞 ml^-1と比較して1x10⁶細胞 ml^-1で開始した培養物においてより高い細胞濃度が見られたことは、より高い細胞濃度において栄養物の利用の細胞特有の速度がより低いことによるものである。ハイブリドーマ細胞の呼吸速度が細胞密度の増加によって減少することが示されている（Wohlpartら1990）。同様に、栄養物の利用の細胞特有の速度も細胞濃度の増加と共に減少することが示されている。（Portnerら1994，Yallop及びSvendsen 2001）。我々はこの情報を新規かつ独創的な方法に使用して、培養において達成できる細胞密度を増加させる概念を形成した。

バッチ培養において毎日鍵となる栄養物の利用の細胞特有の速度を計算し、これらの値を細胞濃度に対してプロットすることによって、グルタミンについて図２に示すようなグラフを得ることができる。図２は、グルタミンの利用の細胞特有の速度（q_Gln）と細胞濃度との間の関係を示す。このグラフから、最適な開始細胞濃度を利用可能な栄養物の最適な使用に基づいて選択することができる。例えば、0.3x10⁶細胞 ml^-1で開始する培養は24時間で約0.5x10⁶細胞 ml^-1に達する（このクローンの集団倍加時間（pdt）の平均は32時間である）。0.5x10⁶細胞 ml^-1でのq_Gln値は約2.5マイクロモル 10⁶細胞^-1 24時間^-1である。したがって、この24時間で消費されたグルタミンの総量は約1.25マイクロモル ml^-1（0.5x2.5）である。しかしながら、1x10⁶細胞 ml^-1で開始する培養は24時間で約1.5x10⁶ ml^-1に達する。この細胞濃度でのq_Gln値は約0.75マイクロモル 10⁶細胞^-1 24時間^-1である。したがって、消費されたグルタミンの総量は約1.125マイクロモル ml^-1である。それ故に、２つの培養は最初の24時間でほぼ同量のグルタミンを使用している。

したがって、本発明の別の目的は、特有の栄養物の利用のレベルが最小の停滞状態のレベルに近い細胞濃度で培養を開始することを有する、細胞を培養する方法を提供することにある。これは、E1不死化網膜細胞、特にPER.C6由来細胞では、約0.8〜2.0 x10⁶細胞/ml、好ましくは0.9〜1.5 x10⁶細胞/mlと同等である。それ故に、本発明の実施態様は、0.8〜2.0 x10⁶細胞/ml、好ましくは0.9〜1.5 x10⁶細胞/ml、より好ましくは0.95〜1.25 x10⁶細胞/mlの播種濃度で細胞を継代培養することである。

本発明の本態様の利点は、得られる生細胞の数がこのより高い播種密度においてより多くなり、プロセスの間においてより速くより多い細胞の数に達することである。したがって、本発明の態様はバッチ培養に非常に有用であるだけでなく、本発明のものなどの流加培養又は（供給）灌流培養に有利に使用することができる。

（実施例２：PER.C6由来サブクローンでの抗体収量を向上させる供給計画）
流加方法は、生細胞濃度を増加させることによって、又は栄養物の濃縮物を供給して消費されるその栄養物を補充することで生産期間を延ばすことによって産物の収量を増加させることを目的とするものである。ここでは、PER.C6由来サブクローンの抗体収量を向上させる供給計画を示す。供給計画は、栄養物の供給の開始において最終細胞密度がより高く、全体の生産プロセスがより短くなるように、より高い開始細胞密度と組み合わせることができる。

グルコース、リン酸塩、グルタミン及び15のその他のアミノ酸から成る基本の栄養物供給濃縮物を、振盪フラスコにおけるクローン１の6つの2連のバッチ培養物の栄養物利用プロファイル（例えば図３参照）に基づいて用意した。同様の利用プロファイルがクローン２において見られ、それ故にクローン１での下記の供給計画が他のクローンからの収量も向上させ、それによって、E1不死化細胞、好ましくは網膜細胞、好ましくはPER.C6細胞由来の細胞の流加培養又は供給灌流培養のためのより一般的な計画が得られることが期待される。濃縮物を表１に列記する。任意選択的に、カルシウムおよび３種の組み換え増殖因子、すなわちLongR3 IGF-1、Long EGF及びインスリンも供給物に添加した。この時点で、カルシウム及び増殖因子の添加は得られた結果に重大な影響を与えなかった。グリシンは供給に必須ではないようであり、もはや後の実験では添加しなかった。インスリンはSigmaから購入し、LongR3 IGF-1及びLong EGFはGroPepから購入した。総てのアミノ酸はSigmaから購入した。供給濃縮物の添加のタイミング及び頻度を変えた。最初の添加の時は栄養物の枯渇の0日前、1日前及び2日前に試した。グルコース及びリン酸塩を供給開始の指標として使用した。一連のボーラス添加を予測される生細胞濃度に基づいて2日毎に行った。通常、6供給を行った。表１に示す添加される成分の濃度は、添加前に費やされた培地内に残存する成分を考慮にいれなかった（すなわち、培地に添加した後の成分の濃度は、本発明に従う添加が細胞によって成分が完全に消耗される前に行われることから、培地添加前にこの成分のいくつかを依然として含むので、表に示される濃度より高い）。

図４は、組み換え抗体を発現するPER.C6（クローン１）のサブクローンに濃縮物の混合物を供給する効果を示す。３日目に供給を開始する（栄養物枯渇の２日前で、この後２日毎に続ける）ことによって、約800mg L^-1の最終の抗体収量が得られ、500mg L^-1が得られたバッチ方法より約1.6倍増加した。５日目に供給を開始し、この後２日毎に続けることによって、最終の抗体濃度が同様に増加した。

バッチ培養物（実施例１）における浸透圧は280から240mOsm Kg^-1まで減少したが、流加培養物において浸透圧は増加し、最終的には300〜310mOsm Kg^-1に上昇した。

（実施例３：30x10⁶細胞/mlを越える生細胞数と500mg L^-1 日^-1を越える抗体収量の達成）
流加プロセスを行った結果、乳酸塩及びアンモニアなどの毒性の代謝産物が蓄積され、培地の浸透圧が増加し、それによって、生細胞濃度及びプロセスの長さが最終的に制限され、したがって、産物の収量に影響を及ぼす可能性がある。流加方法を、連続的に培地を交換し、細胞を抜く（特定のパーセンテージの細胞集団を取り除く）ことによって高い細胞濃度を維持できる灌流方法に代えることができる。そのような方法での可能性のある欠点は必要とされる培地の容積が大きいことにより産物の濃度が比較的低いことと、細胞の生存率が比較的低いことがよくあることと、そのようなシステムを操作するのが比較的高度に複雑であることである。したがって、非常に高い生細胞濃度及び／又は特有の生産力を維持できる場合のみ、灌流方法を行うことは有利である。

ここに、一日当たり１培地ボリューム交換して振盪フラスコで培養したものにおいて、30x10⁶細胞 ml^-1を越える生細胞濃度と600mg L^-1 24時間^-1を越える抗体収量を達成したことを示す。

ExCell（商標）VPROを用いて振盪フラスコ内で培養した、抗体産生PER.C6細胞の対数増殖期の培養物を、ExCell（商標）VPROを入れた振盪フラスコに開始細胞数1x10⁶細胞/mlで（他の開始細胞濃度も同様の結果を与える）移した。遠心分離による培地交換（１日当たり１ボリューム）を３〜５日目に開始した。細胞を抜くことは全く行わなかった。代謝産物分析、抗体の定量及び細胞計数のサンプルを毎日採取し、-20℃で保存した。

図５は、２種の独立した抗体産生細胞クローンにおいて、50x10⁶ ml^-1までの生細胞数及び500〜750mg L^-1 24時間^-1の抗体収量を、細胞を抜かずに少なくとも５日間維持したことを示す。細胞の生存率は約80〜90％であった。これらの高い細胞密度は、CHO及びSp2/0のような他の細胞株で一般的に達成できるものより約３倍高く、それ故に、PER.C6細胞などのアデノウイルスE1配列によって不死化した網膜細胞は灌流方法に非常に適している。細胞を抜くことによって、プロセスの長さが向上し、したがって、最適化したシステムは、１又は複数の細胞を抜く工程を含んでもよい。

50x10⁶細胞／mlまでと約80〜90％の生存率は、２日毎に１回の完全な培地交換で少なくとも５日間維持することができる。この計画によって、栄養物の多くは2日目に消耗されるようになった。したがって、培地を毎日交換することが好ましい。灌流方法において、このことは、約１〜３ボリューム／日の交換に変えることができる。これは、培地を約0.5〜2ボリューム／日で交換する標準の灌流システムにおける典型的な範囲に近い。本発明に従う細胞での多少高い値は、灌流システムにおける本発明の細胞による非常に高い細胞濃度のためである。本発明に従って、30x10⁶細胞／ml以上の細胞濃度が好ましい場合、培地交換は少なくとも0.5培養ボリューム／日、好ましくは少なくとも1培養ボリューム／日であるべきである。充分な濃度での栄養物の供給（ここでは、培地を用いて）がないと、細胞が死滅する。毎日の培地交換によって、高い生細胞密度（毎日の培地交換がない場合10x10⁶細胞／mlに対し、毎日の培地交換が有る場合50x10⁶細胞／mlまで、図１及び図４参照）が得られる。さらに、毎日の培地交換によって、バッチ方法では8〜13日で達成されるのと同様の産物の収量が一日で前記細胞によって得られる。

（実施例４：PER.C6由来サブクローンの抗体収量をさらに向上させる供給計画）
バランスのとれた栄養物供給の準備はビタミン、微量元素及び脂質などの成分にまで及ぶ。ExCell VPRO、ビタミン、無機塩、微量元素、増殖因子、脂質及び植物の加水分解物の濃縮物（10x又は50x、両方行った）をJRH Bioscienceより得、実施例２に記載した基本の供給濃縮物（カルシウム及び増殖因子を抜いたもの）と共に添加した。ExCell VPRO濃縮物を添加して、最終濃度0.25Xを得た。

図６は、振盪フラスコ対バッチ・コントロールにおけるクローン１の増殖（図６Ａ）及び抗体収量（図６Ｂ）についてのこの改変した供給の結果を示す。３日目（栄養枯渇の４８時間前）に供給を開始することによって結果を得た。５日目（栄養枯渇の日）に開始すると同様の結果を得た。生細胞数を、バッチ・コントロールより大幅に長い間維持し、抗体収量がバッチでの0.5g L^-1から流加方法においては1.0g L^-1と2.0倍増加した。

これらの供給実験の消費培地分析によっていくつかのアミノ酸の利用の細胞特有の速度の変化を同定し、その変化はVPRO濃縮物の添加によるものであると思われた。したがって、実施例２に記載されているアミノ酸濃縮物を表２に示すように変更した。供給を栄養物枯渇の48時間前に開始し、２日毎に添加を行った。通常、６回供給を行った。かさねて、表に示す添加した成分の濃度は、添加前の消費培地中の残存成分を考慮に入れていない。

最初の供給添加において、後の供給と比較して増加させた濃度のグルタミン及びセリンを使用した（表２参照）。リン酸塩及びグルコースを、供給開始を決定する指標として使用した。クローン１及びクローン２を本実験に使用した。

振盪フラスコ及びバイオリアクターで実験を行った。振盪フラスコでの実験は記述されているように行った。バイオリアクターでの実験は、3Lのバイオリアクター（Applikon，2Lの可動範囲）に振盪フラスコで増殖した対数増殖期の前培養物由来細胞を接種することによって開始した。前培養及びバイオリアクターでの実験をExCell VPRO（JRH Biosciences）内で行った。バイオリアクターへの接種の分割の割合は少なくとも１：６であり、播種細胞濃度は約0.3x10⁶細胞/mlであった。

結果
図７は、バイオリアクター対バッチ・コントロールにおけるクローン１での供給変更の結果を示す。最大生細胞数は10〜12x10⁶ ml^-1に達し、生細胞数は、19日目に培養を終えるまで8〜10x10⁶細胞 ml^-1に維持された（図７Ａ）。抗体収量は、バッチでの0.4g L^-1から流加方法では1.3 g L^-1と3倍増加した（図７Ｂ）。

これらの供給培養において、浸透圧は430mOSm Kg^-1、アンモニアは16ミリモル L^-1に達し、培養の能力及び産物の質に負の影響を与えるとして報告されているレベルであった。したがって、プロセスの終わりに向けて見られた生細胞数の減少は、少なくとも一部はこれらの要因によるものであった可能性がある。

図８は、2Lのバイオリアクターでのクローン２における供給計画の結果を示す。最大生細胞数は10〜11x10⁶ ml^-1に達し、19日目に培養を終えるまで7〜9x10⁶ ml^-1が維持された。抗体収量は、0.5g L^-1から1.5 g L^-1へと3倍増加した。

別の、重ねて無関係の抗体を発現する第３のクローンの同様のバッチプロセスと流加培養プロセスを同様の供給計画で行った。図１０は、振盪フラスコでのこのクローン３における供給計画の結果を示す。最大生細胞数は14x10⁶ ml^-1に達し、17日目に培養を終えるまで10〜12x10⁶ ml^-1が維持された。抗体収量は、0.7g L^-1から2.1 g L^-1へと3倍増加した。

したがって、供給計画によって、異なる抗体をそれぞれ発現する異なるクローンにおいて収量が向上し、このことは、本発明に従う方法が一般的に適用可能であることを示す。

それ故に、本発明の態様は、本発明に従う供給計画を含む方法を提供することにあり、該方法では、生産されたタンパク質の収量が、バッチ方法における収量より少なくとも1.5倍、好ましくは少なくとも2倍、より好ましくは少なくとも2.5倍、さらにより好ましくは少なくとも3倍増加する。

本発明に使用する細胞特有の生産性（q_Ab）は約12〜18pg抗体／細胞／日であった。いくつかの事例では、q_Abは約10pg抗体／細胞／日であり、他の事例では、約25pg抗体／細胞／日までの値が本発明の細胞及び方法で見られた。バッチ培養において、最大細胞数に達する前にこの値が著しく減少し、このことは栄養物の枯渇と一致し、約７日後であった。一方で、流加培養においては、本発明の方法に従って、この特有の生産性は最終供給添加の２〜３日後までこのレベルで維持され、合計で約16〜18日となる。

（産物の質）
上記の実験において、産物の質を、等電点電気泳動法、SDS-PAGE、MALDI-TOF質量分析法及びHPAEC-PADを含む種々の方法によって検査した。総ての事例において、生産された抗体は基本的にはヒト型の糖鎖形成を示し、生産された抗体の構造の完全性は使用した方法に関係なく非常に良好であり、細胞数及び産物の収量が共により低い（Jonesら，2003）に報告されたものと非常に類似していた。したがって、本発明の方法によって得られる収量の増加は、産物の質の著しい低下を犠牲にしては得られるものではなかった。

バッチ培養及び流加培養より製造され、プロテインＡで精製したIgGをMALDI-MSによって分析した。バッチ培養よりPER.C6細胞によって製造された物質は、ヒト血清から精製されたIgGが示すものと類似したガラクトシル化のプロファイルを示し、バッチ又は流加のいずれによって製造された物質において混成構造又は高マンノース構造が全く同定されなかった。試験した総てのバッチ培養物由来の0、1及び2のガラクトース残基にて終わるグリカンの平均パーセンテージ（G0:G1:G2）は、それぞれ29、54及び17％であった。これは、多くの場合大部分がG0型であるCHO及びハイブリドーマで生産された抗体と比較することができる。例えば、Hillsら（1999）では、NSO細胞及びCHO細胞にて生産された抗体におけるガラクトシル化のプロファイル（G0:G1:G2）が報告されている。

流加方法で生産された抗体は、バッチと比較してガラクトシル化のレベルが減少していた（図９）。G0のグリコフォームのパーセンテージは29から49％に増加したが、G1のグリコフォームは54％から42％に、G2のグリコフォームは17％から9％に減少した。このガラクトシル化の減少は、おそらく、流加培養の終わりにアンモニア濃度が高い（最高16mMまで）ことによるものであった。しかしながら、PER.C6細胞での流加方法によって生産された抗体のガラクトシル化のレベルは、例えば（Hillsら1999）のCHOよりバッチで生産された抗体で通常見られたものより依然として高かった。等電点電気泳動法（IEF）およびSDS-PAGEによって、バッチ培養又は流加培養によって生産された物質間に大きな違いが示されず（データ示さず）、すべての事例において、凝集が3％以下であった。

Y_amm/glnが比較的低いのにもかかわらず、高い生細胞濃度によって、アンモニアが16ミリモル L^-1まで蓄積するように流加においてグルタミンを供給することになる。このことによって、生細胞濃度が減少しなかったが、NH₄Clの存在下で開始したバッチ培養が、9ミリモル L^-1を越える濃度によって、増殖速度および最大細胞濃度が悪影響を受けることを示した。さらに、糖鎖形成も多少影響を受けた（図９参照）。したがって、例えば、下記の方法に従ってアンモニアの蓄積を減少させることが有益である。

これまでに記載した方法において注目する２つの分野は高レベルのアンモニアと高レベルの浸透圧である。浸透圧の増加に大きく貢献しているものは、VRPO（培地）濃縮物によってもたらされるものである。したがって、この浸透圧を減少させるアプローチは、培地成分グループ（ビタミン、微量元素、無機塩、増殖因子など）のうちどれが培養能力にとって重要であるか同定し、重要でないものを除くことである。これは、供給の浸透圧を減らすことによってのみならず、有害である可能性のあるいかなる成分も除去し、最も重要な成分の添加の最適化を可能にすることによって方法の利益になる。供給のコストも減らせる。アンモニアの蓄積の減少は、グルタミンの添加をより厳密に制御することによって達成してもよい。このことは、上記した特定の消費及び細胞数の計算に基づいて行うことができる。このことは、培地中の残留グルタミン濃度を、0.2〜1.5mM、好ましくは0.5〜1.0mMなどの一定の低いレベルに維持するように、生細胞濃度及び細胞特有の利用の速度に適合させ、適切な割合でグルタミンを連続的にポンプで注入することによって達成することができる。本発明に従う細胞にとって可能な別のアプローチは、アンモニア濃度が特定のポイントに達した際、例えば、最初の供給の後の１又は複数の供給において、供給からグルタミンを除き、その結果、細胞がアンモニア及びグルタミン酸塩及びグルタミンシンテターゼ経路を用いるグルタミン合成に強制的に切り替えさせることである。このアプローチは、グルタミンの枯渇によって多くの場合急速かつ広範囲に及ぶ細胞死がもたらされ、グルタミンの無い条件への移動に適応期間が必要であるBHK及びCHOなどの細胞のタイプにとって一般的に可能であるものではない。しかしながら、本発明に従う細胞のバッチ培養において、生細胞濃度が、グルタミンが枯渇した後２日間増加し続け、培養の実行可能性が大きな影響を受けず、このことは、グルタミンシンテターゼ経路によって少なくとも培養を維持するのに充分な流れ（flux）があることを示唆している。

最も適した流加培養の消費培地分析（図７、図８の例）によって、プロセスの間にシスチンのみが枯渇したことが示された。したがって、本発明に従うアミノ酸の供給のさらなる改変は、シスチン濃度を、例えば10x10⁶細胞／mlごとに、0.3〜0.35ミリモル／lに又は最大0.6ミリモル／lまで増加させることである。

（実施例５：改良された（供給）バッチ方法）
流加方法のために開発した供給濃縮物も改良されたバッチ方法に使用する培地を補うために使用してもよい。流加方法由来の少なくとも１種の供給添加物で培地を補うことを、バッチの収量を向上させる他の手段で示した。供給濃縮物で培地を補う同様のアプローチも流加プロセスの間に供給添加物の数を減らし、それによってプロセスを簡略化するために使用してもよく、このことも他の手段によって示した。

本発明では、PER.C6細胞などのアデノウイルスE1配列によって不死化した細胞用の供給計画を明らかにした。ここでは、どの成分が流加方法において制限となるかが示され、流加方法において収量を向上させるために添加することができる成分の量及び成分同士の割合が明らかにされた。この情報を本実施例に用いて、改良されたバッチ方法を提供する。そのような培養は約10x10⁶細胞/mlを含むことが想定され、これは、本発明のバッチ培養及び流加培養で見られた細胞数前後である。流加実験では、６の供給物を添加し、表１又は表２に示す成分の濃縮物を用いた。供給の合計（すなわち、６の供給物を合わせたすべての合計）の10％〜60％の添加、好ましくは供給の合計の20％〜40％の添加によってバッチ方法が改良され、これは、栄養物が、培養の間に、後に消耗されるようになり、それ故に収量が、上記の培地に何も添加しない正統なバッチ方法と比較して生産力を延ばしたため上昇する。培地から栄養物が枯渇する前の任意の段階で成分を培地に直接添加することができるが、好ましくは培養の開始前に添加し、そのため、プロセス（改良されたバッチプロセス）の間に他の添加を全く行わず、それによって、プロセスが非常に簡単なものとなる。当然、このことを、プロセス（流加プロセス）の間に、後に特定の成分を余分に添加することと組み合わせてもよく、その場合、上記の流加方法においてのものよりも添加を減らしてプロセスを行う必要があり、それによって、より簡単な流加プロセスが得られる。したがって、本発明の別の実施態様は、アデノウイルスE1配列で不死化した細胞を培地で培養する、前記細胞において産物を生産する方法を提供することにあり、該方法は、下記の成分を下記の量で培地に添加することを特徴とし、グルコース（3.6〜21.6ミリモル／l、好ましくは7.2〜14.4ミリモル／l）、グルタミン（6.8〜40.9ミリモル／l、好ましくは13.6〜27.2ミリモル／l）、ロイシン（0.40〜2.4ミリモル／l、好ましくは0.79〜1.6ミリモル／l）、セリン（2.31〜13.9ミリモル／l、好ましくは4.62〜9.24ミリモル／l）、イソロイシン（0.3〜1.8ミリモル／l、好ましくは0.6〜1.2ミリモル／l）、アルギニン（0.28〜1.66ミリモル／l、好ましくは0.55〜1.10ミリモル／l）、メチオニン（0.14〜0.83ミリモル／l、好ましくは0.28〜0.55ミリモル／l）、シスチン（0.15〜0.9ミリモル／l、好ましくは0.3〜0.6ミリモル／l）、バリン（0.27〜1.62ミリモル／l、好ましくは0.54〜1.08ミリモル／l）、リジン（0.26〜1.58ミリモル／l、好ましくは0.53〜1.06ミリモル／l）、スレオニン（0.18〜1.08ミリモル／l、好ましくは0.36〜0.72ミリモル／l）、アスパラギン（0.06〜0.36ミリモル／l、好ましくは0.12〜0.24ミリモル／l）、チロシン（0.078〜0.47ミリモル／l、好ましくは0.16〜0.31ミリモル／l）、ヒスチジン（0.06〜0.36ミリモル／l、好ましくは0.12〜0.24ミリモル／l）、フェニルアラニン（0.012〜0.072ミリモル／l、好ましくは0.024〜0.048ミリモル／l）、トリプトファン（0.036〜0.22ミリモル／l、好ましくは0.072〜0.14ミリモル／l）及びリン酸塩（0.45〜2.7ミリモル／l、好ましくは0.9〜1.8ミリモル／l）である。括弧内の量は表２の6xの供給物の量の10％〜60％、好ましくは20％〜40％である。好ましくは、培地濃縮物（10x、50x、又は他の適切な濃縮物を使用することができる）も0.15x〜0.9x、好ましくは0.3x〜0.6xの最終濃度となるように添加する。好ましくは、これらの実施態様における培地はExCell VPRO培地である。0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5又は4の単一の供給の量（１の単一の供給は表１又は２に記載されている量である）を培地に添加し、本発明に従って、約10x10⁶細胞/mlで細胞を培養し、産物（例えば抗体）を製造する単純なバッチ方法をそのように補強した培地を用いて成分添加の最適な量を決定するために行う。最も高い産物の収量が得られる改良されたバッチ方法が、本発明に従う流加方法の供給の合計の約20％〜40％が培養前に、すなわち1〜2.5の単一の供給の間のある箇所において培地に与えられる場合に期待される。当然、一旦、添加成分の有益な範囲をこれらの実験によって確立すれば、量のより良い調整が可能である。当然、細胞数が異なる場合、成分の添加を再び調整することができる。例えば、細胞を5x10⁶細胞/mlの密度でのみ培養する場合、上記の量の半分のみの量の添加が必要であり、このことは当業者に明らかである。

（参考文献）

図１は、２種の異なる開始細胞濃度（0.3及び1.0x10⁶ml^-1）での振盪フラスコにおけるPER.C6クローン（クローン１）の増殖及び抗体生産を示すグラフである。左の縦軸：生細胞数（N_v）。右の縦軸：抗体（Ab）濃度。横軸：時間（時間）。図２は、抗体産生PER.C6クローン（クローン１）における生細胞数増加によるグルタミンの細胞特異的な利用の減少を示すグラフである。図３は、PER.C6細胞のバッチ培養のプロファイルを示す図である。A:代謝産物。Glc，グルコース；Lac，乳酸塩；Gln，グルタミン；NH₃，アンモニア；P，リン酸塩。B-E：アミノ酸（AA）。図４は、PER.C6クローン１に対する、グルコース、グルタミン、アミノ酸、リン酸塩、カルシウム及び増殖因子を含む供給成分混合物の効果を示すグラフである。A：生細胞数（N_v）。B：抗体（Ab）濃度。丸：バッチ。四角：流加。図５は、培地を１日当たり１回完全に交換したPER.C6クローンの生細胞数（N_v）及び抗体（Ab）収量を示すグラフである（それぞれ２つの独立した実験）。A:クローン１。B:クローン２。図６は、クローン１における改変した供給（実施例４）の結果を示す図である。A:生細胞数（N_v）。B：抗体（Ab）濃度。白丸：バッチ。黒丸：流加。図７は、クローン１における最初の供給添加と後の供給添加が異なる改変された供給の更なる改良（実施例４、表２）の結果を示す図である。A:生細胞数（N_v）。B：抗体（Ab）濃度。丸：バッチ。四角：流加。矢印：最後の供給。図８は、クローン２における最初の供給添加と後の供給添加が異なる改変された供給の更なる改良（実施例４、表２）の結果を示す図である。N_v:生細胞数。Ab：抗体濃度。図９は、本発明における方法に従って生産されたIgGのガラクトシル化のレベルを示す図である。図１０は、クローン３における最初の供給添加と後の供給添加が異なる改変された供給の更なる改良（実施例４、表２）の結果を示す図である。N_v:生細胞数。Ab：抗体濃度。

Claims

ECACC 受託No.96022940の下寄託されている細胞で表されるヒト胚性網膜細胞を培養して、前記細胞からの産物の収量を増加させる方法であって、前記細胞は懸濁して培養することが可能であり、該方法は、
ａ）グルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン、シスチン、バリン、リジン、スレオニン及びグリシンからなる群より選択される少なくとも１種の培地成分の濃度を、該細胞を培養している間に少なくとも一度決定する工程と、
ｂ）該細胞を培養している間、ａ）の工程で濃度を決定した少なくとも１種の成分が枯渇する際、又は枯渇する前に、培地に成分を添加する工程とを有し、添加する工程において、添加される成分は、少なくともグルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン及びシスチンを含む、前記細胞からの産物の収量を増加させる方法。
工程ａ）で濃度を決定する少なくとも１種の培地成分がグルコース、グルタミン、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン及びシスチンからなる群より選択される請求項１に記載の方法。
工程ａ）で前記培地成分の少なくとも２種の濃度を決定する請求項１又は２に記載の方法。
工程ｂ）で添加される成分が、さらにバリン、リジン、スレオニン、グリシン、アスパラギン、チロシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、リン酸塩、カルシウム、LongR3 IGF-1、Long EGF及びインスリンの１種又は複数を含む請求項１〜３項のいずれか１項に記載の方法。
工程ｂ）において成分を、最終濃度で、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、グルコースでは4.0〜8.0、ロイシンでは0.44〜0.88、セリンでは0.37〜1.47、イソロイシンでは0.33〜0.67、アルギニンでは0.31〜0.61、メチオニンでは0.15〜、0.31、及びシスチンでは0.1〜0.6で添加する請求項１〜４項のいずれか１項に記載の方法。
工程ｂ）において、グルタミンを、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加されるグルタミンの最終濃度が1.17〜3.47ミリモル/lとなるように添加する請求項５記載の方法。
工程ｂ）において成分を１回以上添加し、さらに最初の添加の結果、新たに添加されるグルタミンの最終濃度が後の添加の結果のものより高いことを特徴とする請求項６記載の方法。
培地中のグルタミンの残存濃度を0.2〜1.5mMに維持するように、さらにグルタミンを基本的に連続して添加する請求項５記載の方法。
培地中のグルタミンの残存濃度を0.5〜1.0mMに維持するように、さらにグルタミンを基本的に連続して添加する請求項８記載の方法。
工程ｂ）において、最終濃度が、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、バリンでは0.3〜0.6、リジンでは0.29〜0.59、スレオニンでは0.2〜0.4と成るように、さらに上記成分を添加する請求項５〜９項のいずれか１項に記載の方法。
工程ｂ）において、最終濃度が、10x10⁶細胞／ml当たりの新たに添加される成分のミリモル/lで、アスパラギンでは0.067〜0.13、チロシンでは0.087〜0.17、ヒスチジンでは0.067〜0.13、フェニルアラニンでは0.013〜0.027、及びトリプトファンでは0.04〜0.08となるように、さらに上記成分を添加する請求項１０記載の方法。
工程ｂ）における成分の添加を、48時間と、濃度を前の工程で決定した少なくとも１種の培地成分がちょうど枯渇する前との間に行う請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
前記工程を少なくとも１回繰り返す請求項１〜１２項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞を少なくとも9x10⁶／mlの細胞密度となるように増殖させる請求項１〜１３項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞は、回収される産物を生産する請求項１〜１４項のいずれか１項に記載の方法。
前記産物は組換えタンパク質である請求項１５記載の方法。
前記組換えタンパク質は、培地中に少なくとも500mg／リットルのレベルとなるように分泌されるイムノグロブリンである請求項１６記載の方法。
前記組換えタンパク質は、培地中に少なくとも1000mg／リットルのレベルとなるように分泌されるイムノグロブリンである請求項１７記載の方法。
前記細胞が培養の間懸濁した状態である請求項１〜１８項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞は培地中にあり、前記産物が、組換えタンパク質、ウイルス、及びE1領域における欠損を有する組み換えアデノウイルスからなる群より選択され、該方法は、少なくともグルタミン、グルコース、リン酸塩、ロイシン、セリン、イソロイシン、アルギニン、メチオニン及びシスチンを培地に添加することによって培地を補うことを特徴とする、請求項１〜１９項のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が、前記方法の少なくとも一部の時間において、少なくとも20x10⁶生細胞／mlの細胞濃度に達することをさらに特徴とする請求項２０記載の方法。
前記細胞が、前記方法の少なくとも一部の時間において、少なくとも30x10⁶生細胞／mlの細胞濃度に達することをさらに特徴とする請求項２１記載の方法。
下記成分：グルコース3.6〜21.6ミリモル／l、グルタミン6.8〜40.9ミリモル／l、ロイシン0.40〜2.4ミリモル／l、セリン2.31〜13.9ミリモル／l、イソロイシン0.3〜1.8ミリモル／l、アルギニン0.28〜1.66ミリモル／l、メチオニン0.14〜0.83ミリモル／l、シスチン0.15〜0.9ミリモル／l、バリン0.27〜1.62ミリモル／l、リジン0.26〜1.58ミリモル／l、スレオニン0.18〜1.08ミリモル／l、アスパラギン0.06〜0.36ミリモル／l、チロシン0.078〜0.47ミリモル／l、ヒスチジン0.06〜0.36ミリモル／l、フェニルアラニン0.012〜0.072ミリモル／l、トリプトファン0.036〜0.22ミリモル／l及びリン酸塩0.45〜2.7ミリモル／lを培地に添加することによって培地を補うことを特徴とする請求項１〜２２項のいずれか１項に記載の方法。
培地に添加される成分の量が、グルコース7.2〜14.4ミリモル／l、グルタミン13.6〜27.2ミリモル／l、ロイシン0.79〜1.6ミリモル／l、セリン4.62〜9.24ミリモル／l、イソロイシン0.6〜1.2ミリモル／l、アルギニン0.55〜1.10ミリモル／l、メチオニン0.28〜0.55ミリモル／l、シスチン0.3〜0.6ミリモル／l、バリン0.54〜1.08ミリモル／l、リジン0.53〜1.06ミリモル／l、スレオニン0.36〜0.72ミリモル／l、アスパラギン0.12〜0.24ミリモル／l、チロシン0.16〜0.31ミリモル／l、ヒスチジン0.12〜0.24ミリモル／l、フェニルアラニン0.024〜0.048ミリモル／l、トリプトファン0.072〜0.14ミリモル／l及びリン酸塩0.9〜1.8ミリモル／lである請求項２３記載の方法。
前記成分を、細胞を培養する前に培地に添加する請求項２３又は２４に記載の方法。