EA028875B1

EA028875B1 - Способ очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии

Info

Publication number: EA028875B1
Application number: EA201270557A
Authority: EA
Inventors: Вохт Марсел Лео Де; Марлус Венстра
Original assignee: Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В.
Priority date: 2009-10-15
Filing date: 2010-10-14
Publication date: 2018-01-31
Also published as: BR112012008507B1; AU2010305768B2; PL2488635T3; MX2012004221A; BR112012008507A2; HK1174949A1; WO2011045381A1; CN102575233A; JP2013507141A; EA201270557A1; KR101805938B1; BR112012008507B8; AU2010305768A1; CA2777116A1; US20120202268A1; ES2445713T3; CA2777116C; EP2488635B1; DK2488635T3; EP2488635A1

Abstract

Изобретение относится к способу очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии, включающему лизис клеток, избирательное осаждение их ДНК с помощью домифена бромида и осветление суспензии путем фильтрации в тангенциальном потоке.

Description

028875

Изобретение относится к области производства вирусов. В частности, оно относится к усовершенствованным способам очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии.

Уровень техники изобретения

Последние достижения в области производства вакцин создали потребность в крупномасштабном производстве. Необходимы надежные и высокопроизводительные способы для обеспечения мирового сообщества достаточным количеством (рекомбинантных) вакцин для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Вакцины против инфекционных заболеваний могут иметь в основе рекомбинантные аденовирусные частицы. В связи с этим, большие усилия направлены на оптимизацию способов производства аденовирусов на основе клеток. Клетки культивируют при все возрастающей плотности и затем инфицируют для получения более высокого общего выхода вируса. Такие способы, применяющиеся при высокой плотности клеток, описаны, например, в АО 2010/060719 на имя Сгисе11 Но11аий В.У., и в статье Уик с( а1. (2004). В этих документах описан способ производства рекомбинантного аденовируса в высоких концентрациях. Этот оптимизированный способ основан на возможности инфицировать культуры при высокой плотности клеток (например, выше чем 5х10⁶ клеток/мл) с сохранением высокой вирусной продуктивности на клетку. При этом предложен способ получения раствора собранного вируса с высокой вирусной концентрацией в одном ферментере. Типичные выходы вирусных частиц (в.ч.) (УР) при данном способе составляют примерно 1,5-2,5х10¹² в.ч./мл.

Отличительной особенностью способов, в которых клетки культивируют при высокой плотности, является накопление большого количества клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев. Эти загрязняющие компоненты затем должны быть удалены в процессе очистки, которая является трудоемкой процедурой. Способ удаления ДНК клеток-хозяев из собранной клеточной культуры раскрыт ранее в ИЗ 7326555. Способ состоит из избирательного осаждения ДНК клеток-хозяев из культуры клеток. Средство для избирательного осаждения может специфически связываться с ДНК клеток-хозяев и оставлять аденовирусные частицы неосажденными. Однако способ в данной ссылке описан только для клеточных культур с низкой плотностью клеток, в которых клеточный дебрис и ДНК клеток-хозяев присутствуют в небольших количествах.

До настоящего времени не было известно, что данный способ можно применять в случае культур с высокой плотностью клеток. Напротив, на основании предшествующего уровня техники можно сделать категоричный вывод о том, что осаждающее средство, используемое в указанном способе, не будет избирательно осаждать ДНК клеток-хозяев из культур, а будет осаждать вирусные частицы, если его использовать в высокой концентрации (Ооетке е( а1. 2004).

Как правило, содержащие аденовирус сборы клеточных культур далее подвергают обработке для получения очищенного аденовируса. Стадия осветления с использованием, например, глубинной фильтрации и/или фильтрации в тангенциальном потоке (ТРР) обычно включена в указанный способ очистки. Для применения ТРР необходим относительно чистый сбор, т.е. содержащий ограниченные количества клеточного дебриса или других примесей, таких как, например, ДНК клеток-хозяев. Есть вероятность, что избыток указанных примесей может засорять фильтры. В результате, осветление методом ТРР, как правило, применяют на более поздних стадиях процесса очистки, например, как третью или четвертую стадию в способе.

Отделение аденовируса от содержащей аденовирус клеточной суспензии непосредственно после сбора методом фильтрации в тангенциальном потоке ранее описано, например, в ЕР 1371723. Однако аденовирус выращивали на прикрепляющихся клетках, которые оставались в ферментере после сбора. Вследствие этого, подвергающаяся дальнейшей обработке содержащая вирус суспензия содержала низкие концентрации клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев. В АО 2006/052302 также описано применение ТРР непосредственно после сбора. Однако плотность клеток содержащего вирус сбора, используемого в том документе, была гораздо ниже чем 5х10⁶ клеток/мл. Как раскрыто в данном документе, применение ТРР на стадии осветления сразу после сбора не представляется возможным для клеточных культур с высокой плотностью клеток.

Поскольку масштабы процессов с использованием клеточных культур увеличиваются и клетки культивируют во все возрастающей плотности, в промышленности существует потребность в способах переработки, позволяющих обрабатывать суспензии с высокой плотностью клеток. В частности, это относится к области производства аденовирусов.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способам очистки аденовирусных частиц из лизата клеток из клеточной суспензии, в частности, из суспензии с высокой плотностью клеток.

Попытки очищать аденовирус из суспензии с высокой плотностью клеток существующими способами приводили к очень низким показателям извлечения вируса, как видно из примера данного документа (пример 1). Концентрации примесей в указанной суспензии с высокой плотностью клеток, полученной после сбора, как правило, были слишком высоки, чтобы можно было очищать вирус напрямую. Для последующей обработки суспензий с высокой плотностью клеток известными методами, как правило, тре- 1 028875

буется множество стадий. Первая стадия фильтрации будет состоять из грубой фильтрации для удаления крупных осадков и клеточного дебриса. Затем потребуется еще одна или две стадии избирательной фильтрации для получения достаточно очищенной суспензии аденовируса.

К своему удивлению, авторы изобретения обнаружили и раскрыли в данном документе, что сразу после получения клеточного лизата, содержащего аденовирус, последовательное применение фрагментации и/или осаждения ДНК клеток-хозяев с последующей стадией осветления, включающей фильтрацию в тангенциальном потоке (ТРР), приводит к получению высокоочищенной суспензии аденовируса.

Удивительно, но клеточный лизат, содержащий аденовирус, большие количества клеточного дебриса, ДНК клеток-хозяев и другие примеси, можно эффективно обрабатывать до получения очищенного аденовируса по настоящему изобретению. Таким образом, настоящее изобретение относится к новому способу, подходящему для удаления ДНК клеток-хозяев в крупномасштабных процессах очистки аденовируса.

С включением фрагментации или осаждения ДНК в способ очистки достаточно одной стадии осветления для очистки аденовируса из суспензии с высокой плотностью клеток, при использовании ТРР для осветления.

Изобретение относится к способу очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии с плотностью клеток в диапазоне от 5х 10⁶ до 150х 10⁶ клеток в 1 мл, включающему стадии а) лизиса клеток в указанной клеточной суспензии; Ь) избирательного осаждения ДНК клеток-хозяев в указанной клеточной суспензии путем добавления домифена бромида в концентрации от 1,2 до 5 мМ; с) осветления клеточной суспензии, полученной на стадии Ь), методом фильтрации в тангенциальном потоке для удаления осажденной ДНК клеток-хозяев и других примесей.

В некоторых вариантах осуществления указанный аденовирус очищают из клеточной суспензии, имеющей плотность клеток в диапазоне от 5х10⁶ до 150х10⁶ клеток в 1 мл, например от 5х10⁶ до 50х10⁶клеток в 1 мл или от 10х 10⁶ до 30х 10⁶ клеток в 1 мл.

В предпочтительном варианте осуществления фильтрацию в тангенциальном потоке проводят с использованием мембраны, имеющей размер пор от 0,1 до 0,65 мкм.

В других предпочтительных вариантах осуществления фильтрацию в тангенциальном потоке проводят с использованием полого волокна. В другом предпочтительном варианте осуществления указанную фильтрацию в тангенциальном потоке проводят с использованием системы АТР.

В другом предпочтительном варианте при осуществлении способа удаляется по меньшей мере 80% ДНК клеток-хозяев из клеточной суспензии аденовируса.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - график зависимости извлечения аденовируса и осаждения ДНК клеток-хозяев от концентрации домифена бромида в суспензиях с низкой (2,5х10⁶-3,5х10⁶ в.к./мл) и высокой (20х10⁶-30х10⁶в.к./мл) плотностью клеток.

Фиг. 2 - график зависимости извлечения аденовируса и осаждения ДНК клеток-хозяев от концентрации домифена бромида в суспензиях с низкой (2,5х10⁶-3,5х10⁶ в.к./мл) и высокой (18х10⁶-25х10⁶в.к./мл) плотностью клеток.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способам очистки аденовирусных частиц из суспензии с высокой плотностью клеток. По изобретению суспензии с высокой плотностью клеток получают, культивируя клетки до высокой плотности клеток. Такое культивирование можно, например, проводить в режиме периодического, периодического с добавлением субстрата или перфузионного культивирования. Способы культивирования клеток до высокой плотности клеток известны специалистам в данной области. Конкретные способы получения культур с высокой плотностью клеток раскрыты, например, в УО 2004/099396, УО 2005/095578, УО 2008/006494, УО 2010/060719.

По настоящему изобретению суспензия с высокой плотностью клеток содержит от примерно 5х10⁶до 150х10⁶ клеток/мл, например от примерно 8х10⁶ до 120х10⁶ клеток/мл, например от примерно 12х10⁶до 100х10⁶ клеток/мл, например от примерно 20х10⁶ до 80х10⁶ клеток/мл.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения плотность клеток в указанной суспензии с высокой плотностью клеток составляет от примерно 10х10⁶ до 50х10⁶ клеток/мл, например по меньшей мере примерно 15х10⁶ клеток/мл, например по меньшей мере примерно 20х10⁶ клеток/мл, например по меньшей мере примерно 25х10⁶, например вплоть до примерно 30х10⁶ клеток/мл, например вплоть до примерно 35х10⁶, например вплоть до примерно 40х10⁶, например вплоть до примерно 45х10⁶ клеток/мл.

По изобретению культуры с высокой плотностью клеток инфицируют аденовирусными частицами с тем, чтобы позволить указанному аденовирусу размножаться в клеточной суспензии. При этом получают суспензии с высокой плотностью клеток, содержащие аденовирус в высоких концентрациях, в одном ферментере. Способы инфицирования культур с высокой плотностью клеток также хорошо известны специалистам в данной области. Конкретные способы получения указанных культур с высокой плотностью клеток, имеющих высокую концентрацию вируса, раскрыты, например, в ЕР 08168181.9, Сотйи с1

- 2 028875

а1., 2004 и Уик с1 а1., 2004. В данных ссылках описаны способы получения больших количеств рекомбинантного аденовируса. Эти способы основаны на возможности инфицировать культуры при высокой плотности клеток с сохранением высокой вирусной продуктивности на клетку. При этом предложен способ получения суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей высокие концентрации аденовируса, в одном ферментере. Типичные выходы в современных способах, например, для рекомбинантного аденовируса 35 (тЛб35) составляют примерно 1,5-2,5х10¹² в.ч./мл. После того как аденовирус размножился в клеточной культуре, уничтожив большинство клеток, по настоящему изобретению аденовирусные частицы очищают из суспензии с высокой плотностью клеток.

Способ по настоящему изобретению в качестве первой стадии включает лизис клеток, содержащихся в суспензии с высокой плотностью клеток. Лизис в суспензиях с высокой плотностью клеток, инфицированных аденовирусными частицами, приводит к накоплению большого количества клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев в клеточной суспензии. Это накопление делает последующую обработку клеточной суспензии трудоемким процессом.

Настоящее изобретение относится к способу, подходящему для очистки аденовирусных частиц из клеточного лизата суспензий с высокой плотностью клеток. Большие количества ДНК клеток-хозяев можно избирательно отделять осаждением от аденовирусных частиц в суспензии с высокой плотностью клеток путем добавления избирательного осаждающего средства к клеточному лизату так, что по меньшей мере примерно 80% молекул ДНК клеток-хозяев осаждаются из суспензии с высокой плотностью клеток, содержащей аденовирусные частицы. Как описано в данном документе, стадия осаждения делает возможным осаждение загрязняющей ДНК клеток-хозяев с по меньшей мере 80% уменьшением количества ДНК клеток-хозяев, предпочтительно >90% и даже более предпочтительно, как приведено в качестве примера в данном документе, примерно 95% уменьшением количества ДНК клеток-хозяев после осветления методом ТРР.

Лизис.

Первая стадия способа включает лизис клеток в клеточной суспензии. Эта первая стадия, в которой лизируются клеточные мембраны, позволяет собирать как связанный с клетками (внутриклеточный), так и не связанный (внеклеточный) аденовирус из инфицированной суспензии с высокой плотностью клеток. Лизис клеток-хозяев при помощи детергента, будучи предпочтительным методом лизиса содержащих вирус клеток-хозяев, может быть заменен не механическими методами лизиса (например, обработкой ферментами) и/или механическими методами измельчения (например, ультрафильтрацией через полые волокна) для высвобождения максимальных количеств аденовируса. Методы, которые можно применять для активного лизиса клеток, известны специалистам в данной области и описаны, например, в \νϋ 98/22588, с. 28-35. Полезными с этой точки зрения методами являются, например, замораживаниеоттаивание, твердое измельчение, гипертонический и/или гипотонический лизис, жидкое измельчение, разрушение ультразвуком, экструзия высокого давления, лизис детергентом, сочетания перечисленного выше и тому подобное. В одном варианте осуществления клетки лизируют, используя по меньшей мере один детергент. Применение детергента для лизиса имеет то преимущество, что это легкий способ и его легко масштабировать.

Детергенты, которые можно использовать, и способы их применения, как правило, известны специалистам в данной области. Некоторые примеры обсуждаются, например, в νθ 98/22588, с. 29-33. Используемые по данному документу детергенты могут включать, но не ограничиваются ими, анионные, катионные, цвиттерионные и неионные детергенты. Примерами детергентов являются, например, Тритон и/или полисорбат-80. В одном варианте осуществления используемый детергент представляет собой Тритон Х-100. Кроме того, такой растворитель, как ΤΝΒΡ, можно добавлять к лизату или осветленному лизату в низкой концентрации для усиления способности детергентов инактивировать вирусы с оболочкой. Кроме того, автолиз инфицированных клеток-хозяев заключенным в них аденовирусом может способствовать значительному высвобождению внутриклеточного аденовируса и может быть использован в способах по изобретению. Вследствие этого, любой вид лизиса клеток-хозяев, известный в данной области, можно использовать для высвобождения внутриклеточного вируса в культуральную среду клетокхозяев для последующего сбора при помощи способов, раскрытых в данном документе. Для специалиста в данной области очевидно, что оптимальная концентрация детергента может варьироваться, например, в пределах диапазона примерно 0,1-1% (по весу).

Фрагментация и избирательное осаждение.

После лизиса ДНК клеток-хозяев можно фрагментировать или отделять осаждением от содержащей вирус клеточной суспензии.

В предпочтительном варианте осуществления ДНК клеток-хозяев осаждают добавлением раствора избирательного осаждающего средства (8ΡΆ). Эта стадия позволяет избирательно осаждать ДНК клетокхозяев, оставляя вирусные частицы нетронутыми в жидкой фазе. Как показано в данном документе, эта стадия осаждения на раннем этапе приводит по меньшей мере к примерно 90% снижению количества ДНК клеток-хозяев после осветления.

Средства 8ΡΆ, которые могут быть полезны на практике настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, сополимеры аминов, четвертичные соединения аммония и любые соответствую- 3 028875

щие их смеси. Более конкретно, многие виды полиэтилена (ΡΕΙ) очень эффективны в нейтрализации избыточного анионного заряда (примеси ДНК). Список возможных δΡΑ, которые можно использовать соответствующим образом в настоящем изобретении, приведен в υδ 7326555 (колонка 12, строки 56-67 и колонка 13, строки 1-28), включенном в данный документ посредством ссылки. Соответствующие δΡΑ для применения по настоящему изобретению включают, но не ограничиваются ими, следующие классы и примеры коммерчески доступных продуктов: соли моноалкилтриметиламмония (примеры коммерчески доступных продуктов включают цетилтриметиламмония бромид или хлорид в виде СТАВ, тетрадецилтриметиламмония бромид или хлорид (ТТА), алкилтриметиламмония хлорид, алкиларилтриметиламмония хлорид, додецилтриметиламмония бромид или хлорид, додецилдиметил-2-феноксиэтиламмония бромид, гексадециламин: соль хлорид или бромид, додециламин или соль хлорид и цетилдиметилэтиламмония бромид или хлорид), соли моноалкилдиметилбензиламмония (примеры включают алкилдиметилбензиламмония хлориды и бензетония хлорид в виде ВТС), соли диалкилдиметиламмония (коммерческие продукты включают домифена бромид (ΌΒ), дидецилдиметиламмония галиды и октилдодецилдиметиламмония хлорид или бромид), гетероароматические соли аммония (коммерческие продукты включают цетилпиридиния галиды (СРС или соль бромид и гексадецилпиридиния бромид или хлорид), цис-изомер 1-[3-хлораллил]-3,5,7-триаза-1-азониаадамантана, алкилизохинолиния бромид и алкилдиметилнафтилметиламмония хлорид (ВТС 1110). Полизамещенные четвертичные соли аммония (коммерчески доступные продукты включают, но не ограничиваются ими, алкилдиметилбензиламмония сахаринат и алкилдиметилэтилбензиламмония циклогексилсульфамат), бис-четвертичные соли аммония (примеры продуктов включают 1,10-бис-(2-метил-4-аминохинолиния хлорид)декан, 1,6-бис-[1-метил-3-(2,2,6триметилциклогексил)пропилдиметиламмония хлорид]гексан или триклобизония хлорид, а также бискват, выпускаемый под названием СЭС компанией Висктап Вгоекигек), и полимерные четвертичные соли аммония (включают полиионены, такие как поли[оксиэтилен(диметилиминио)этилен(диметилиминио)этилена дихлорид], поли[Ы-3 диметиламмонио)пропил]-Н-[3-этиленоксиэтилендиметиламмонио)пропил]мочевины дихлорид и альфа4-[1-трис-(2-гидроксиэтил)аммония хлорид). Как специалист может понять из υδ7326555, в котором продемонстрировано действие некоторых из них, и в котором показано, что специалист может без труда определять соответствующие концентрации данных соединений для избирательного осаждения ДНК, эти соединения являются примерами δΡΑ и на основании описания указанного патента и описания настоящего изобретения очевидно, что они также подходят для настоящего изобретения.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют катионные детергенты. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения используют соли диалкилдиметиламмония, такие как домифена бромид (ΌΒ). Хотя большое количество потенциальных δΡΑ можно использовать на практике настоящего изобретения, дофимена бромид представляет особый интерес, в первую очередь благодаря своей доступности в качестве исходного материала СМРкатегории и использованию в настоящее время в других продуктах, предназначенных для использования применительно к человеку. Более конкретно, поскольку дофимена бромид широко используют в качестве активного ингредиента в средствах гигиены полости рта, а также в составе местных антибиотических кремов, эту молекулу производят в больших количествах и выпускают в контролируемых условиях, отвечающих требованиям сСМР.

Оптимальная концентрация δΡΑ, используемая в суспензиях с высокой плотностью клеток для отделения осаждением ДНК клеток-хозяев от клеточной суспензии, определена в данном документе. Хотя, исходя из предшествующего уровня техники, ожидалось, что аденовирусные частицы будут немедленно осаждаться при контакте с высокими концентрациями δΡΑ, совершенно непредвиденно аденовирусные частицы остались неосажденными. Действительно, в предшествующем уровне техники, например, в υδ 7326555, показано, что в суспензиях с низкой плотностью клеток (вплоть до 1х10⁶ клеток/мл), аденовирусные частицы осаждаются при возрастании концентрации катионного детергента.

Суспензия, получаемая путем лизиса культур с высокой плотностью клеток, описанная в данном документе, будет содержать значительно увеличенные количества ДНК клеток-хозяев и других примесей, и вследствие этого, будут необходимы повышенные количества катионного детергента (например, увеличенные в 2 раза). Таким образом, на основании экстраполяции результатов для низкой плотности клеток ожидалось, что это увеличение концентрации катионного детергента приведет к осаждению всех аденовирусных частиц, присутствующих в суспензии.

Тем не менее, удивительно, но при высоких концентрациях δΡΑ избирательное удаление загрязняющей ДНК клеток-хозяев из суспензии с высокой плотностью клеток, содержащей вирусные частицы, все еще было возможным. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения δΡΑ, предпочтительно ΌΒ, добавляют до концентрации, находящейся в диапазоне от 1,2 до 5 мМ. В еще более предпочтительном варианте осуществления δΡΑ, предпочтительно ΌΒ, добавляют до концентрации, находящейся в диапазоне от 1,3 до 2,2 мМ, например от 1,4 до 2 мМ, например от 1,4 до 1,8 мМ, например от 1,5 до 1,6 мМ. На основании настоящего раскрытия специалисту в данной области понятно, как определять соответствующие диапазоны концентраций δΡΑ для данной плотности клеток в момент сбора.

Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плот- 4 028875

ностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от 10х10⁶ до 150х10⁶ клеток/мл, находится в диапазоне примерно от 1,2 до 5 мМ. Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от 10х10⁶ до 50х10⁶ клеток/мл, находится в диапазоне примерно от 1,3 до 2,2 мМ. Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус собранной суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от 10х 10⁶ до 30х 10⁶ клеток/мл, находится в диапазоне примерно от 1,3 до 2 мМ, например, примерно от 1,4 до 1,9 мМ, например, примерно от 1,4 до 1,8 мМ, например, примерно от 1,4 до 1,7 мМ, например, примерно от 1,45 до 1,65 мМ, например, примерно 1,5-1,55 мМ.

Проверка потенциальных заменителей для 8РА, раскрытых в данном документе, с целью идентификации соединения, эффективно отделяющего осаждением молекулы нуклеиновой кислоты и другой клеточный дебрис от аденовирусных частиц, в качестве примера которого в данном документе приведен домифена бромид (ΌΒ). находится в пределах компетенции специалиста в данной области. Вследствие этого, настоящее изобретение частично относится к способам очистки аденовирусных частиц из суспензии с высокой плотностью клеток. Указанные способы включают избирательное отделение осаждением молекул нуклеиновой кислоты клеток-хозяев от аденовирусных частиц после лизиса в суспензии с высокой плотностью клеток путем добавления избирательного осаждающего средства после лизиса к культуральной среде клеток-хозяев.

Хотя предпочтительным способом удаления ДНК клеток-хозяев из клеточной суспензии является избирательное осаждение, изобретение этим не ограничивается. Любой другой способ удаления ДНК клеток-хозяев также включен в настоящее изобретение.

Вследствие этого, в одном варианте осуществления ДНК клеток-хозяев фрагментируют, то есть, разрезают на куски. По настоящему изобретению фрагментацию ДНК клеток-хозяев после лизиса можно осуществлять, добавляя нуклеазу в клеточную суспензию. Типичные нуклеазы, подходящие для использования по настоящему изобретению, включают бензоназу (Веп/опа^е®), пульмозим (Ри1то/уте®) или любую другую ДНКазу и/или РНКазу, обычно используемую в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения нуклеаза представляет собой бензоназу, которая быстро гидролизует нуклеиновые кислоты за счет гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между определенными нуклеотидами, тем самым уменьшая вязкость клеточного лизата. Бензоназу можно приобрести, например, у компании Мегск КОаА (код А214950).

Концентрация нуклеазы, необходимая для адекватной фрагментации, зависит, например, от плотности клеток-хозяев, температуры и времени реакции. Специалист в данной области знает, как определять и оптимизировать необходимую концентрацию нуклеазы для успешной фрагментации ДНК клетокхозяев.

Осветление.

Обработанный 8РА клеточный лизат, полученный на предыдущих стадиях, впоследствии осветляют для удаления осажденной ДНК клеток-хозяев, клеточного дебриса и других примесей.

Попытки напрямую очищать аденовирус из суспензии с высокой плотностью клеток одностадийным методом осветления приводили к очень низким показателям извлечения вируса, как видно из примера данного документа (пример 1). Концентрации примесей в указанной суспензии с высокой плотностью клеток, полученной после сбора, как правило, были слишком высоки, чтобы можно было очищать вирус напрямую. Как правило, для надлежащего осветления необходимы сочетания по меньшей мере двух последовательных фильтров, как часто используют и рекомендуют в данной области и как описано в примере в данном документе.

Авторы изобретения к своему удивлению обнаружили и раскрыли в данном документе, что объединение осаждения ДНК со стадией осветления методом ТРР позволяет проводить очистку вируса из суспензии с высокой плотностью клеток с высокими показателями извлечения. Одной стадии фильтрации в тангенциальном потоке было достаточно для удаления клеточного дебриса и осадков нуклеиновой кислоты из содержащей вирус суспензии. ДНК клеток-хозяев осаждалась на более чем 95%, и выход вируса был выше 80%. Таким образом, по настоящему изобретению можно использовать ТРР в качестве единственной стадии осветления. Осветленная содержащая вирус суспензия, полученная способом по настоящему изобретению, в значительной степени избавлена от ДНК клеток-хозяев и других примесей по сравнению с исходным лизатом (полученным на стадии а) настоящего способа).

По настоящему изобретению фильтры, используемые в установке ТРР, представляют собой, например, половолоконные фильтры от ОЕ НеаННсаге или ДМ Берагайопк; альтернативой им являются плоскомембранные фильтры от МПБроге или БаЛогшк δΚύίιη Вю1есН. В указанной установке ТРР вирусные частицы собираются в фильтрате, тогда как клеточный дебрис, осажденная ДНК клеток-хозяев и другие примеси остаются в ретентате. В данном документе продемонстрировано, что половолоконные фильтры очень подходят для обработки суспензий с высокой плотностью клеток. Вследствие этого, в предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения ТРР проводят с использованием половолоконного фильтра.

По настоящему изобретению размер пор указанных фильтров предпочтительно находится в диапа- 5 028875

зоне от 0,1 до 1 мкм. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения размер пор находится в диапазоне от 0,2 до 0,65 мкм. Указанные размеры пор позволяют вирусным частицам проходить через мембрану, а клеточный дебрис, осажденная ДНК клеток-хозяев и другие примеси задерживаются фильтром. Предпочтительно, фильтрующие модули предварительно смачивают водой в соответствии с инструкциями производителя. Жидкость рециркулирует через модули при помощи трубок и перистальтического насоса.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ТРР применяют в форме чередующейся тангенциальной фильтрации (АТР). АТР является разновидностью фильтрации в тангенциальном потоке и, как показано в данном документе, осветление методом АТР особенно хорошо подходит для извлечения вируса из суспензий с высокими концентрациями клеточного дебриса, ДНК клеток-хозяев и других примесей. Тангенциальный поток можно получать методами, известными специалистам в данной области и описанными, например, в И8 6544424. Преимущество использования системы АТР (например, АТР §у8кет, Кейпе Тескпо1оду, Со., Еакк Наиоует, N1) заключается в том, что подающий поток и поток ретентата меняют направления с каждым циклом насоса АТР (цикл состоит из режима давления и вытяжки). В результате возникает очищающее действие обратного потока и постоянно меняющееся трансмембранное давление (ТМР) через мембрану. В процессе вытяжки создается вакуум, во время чего некоторое количество материала переносится обратным потоком со стороны фильтрата на сторону ретентата, что приводит к очистке мембраны. Применение АТР способствует меньшему загрязнению мембраны, что приводит к более высоким показателям выхода для вируса. Специалист в данной области способен определять оптимальные параметры АТР и потока фильтрата для максимального выхода.

По настоящему изобретению фильтрами, используемыми в указанной системе АТР, являются, например, половолоконные фильтры от ОЕ НеаНйсате.

Дополнительным преимуществом использования системы АТР является то, что устройство, применяемое для осветления, можно использовать ранее для культивирования клеток в перфузионном режиме. Действительно, ферментер, соединенный с системой АТР, можно использовать в первую очередь для культивирования клеток до высокой клеточной плотности. Очень высокие плотности клеток, выше чем 100х10⁶ жизнеспособных клеток/мл, можно получать, используя перфузионную систему АТР, например, с клетками РЕК.С6 (см., например, Уа11ор е1 а1., 2005 и \УО 2005/095578). Когда клетки достигли высокой клеточной плотности, их можно инфицировать для получения высококонцентрированной содержащей вирус суспензии клеток. Систему АТР, которая остается соединенной с ферментером на протяжении всего процесса, в дальнейшем можно использовать для очистки вируса из указанной суспензии с высокой плотностью клеток.

Сочетание избирательного осаждения с осветлением методом ТРР позволяет удалять по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 80% и даже более предпочтительно по меньшей мере 90% ДНК клеток-хозяев, содержащейся в лизате с высокой плотностью клеток, полученном после сбора.

Методы дальнейшей очистки.

В некоторых вариантах осуществления собранные вирусные частицы дополнительно очищают. Дальнейшую очистку вируса можно проводить в несколько стадий, включающих концентрирование, ультрафильтрацию, диафильтрацию или разделение хроматографией, как описано, например, в \УО 2005080556, включенном в данный документ посредством ссылки. Можно также использовать другие стадии, такие как анионообменная мембранная хроматография, стерильная фильтрация, обращеннофазовая адсорбция, хроматография на гидроксиапатите. Эти стадии, например, описаны в И8 7326555, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Специалисту в данной области известно, как определять оптимальные условия для каждой стадии очистки. Также в \УО 98/22588, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки, описаны методы получения и очистки вирусных частиц.

В некоторых вариантах осуществления изобретения осветленную суспензию аденовирусных частиц можно подвергать ультрафильтрации. Ультрафильтрацию используют для концентрирования вирусной суспензии. Суспензию можно концентрировать в 5-20 раз и, возможно, обрабатывать нуклеазой (как упомянуто выше в данном документе). Другим аспектом изобретения является последующее введение обменного буфера с помощью диафильтрации. Диафильтрация или замена буфера с использованием ультрафильтров является способом удаления и замены солей, сахаров и т.п. Специалисту в данной области известно, при каких условиях должна происходить замена буфера и какие буферы подходят для этой стадии.

Конкретная выбранная мембрана для ультрафильтрации должна иметь размер пор достаточно маленький, чтобы удерживать аденовирусные частицы, но достаточно большой, чтобы эффективно очищать от примесей. В зависимости от производителя и типа мембраны подходящими могут быть номинальные пределы отсечения по молекулярной массе от 10 до 1000 кДа. Предпочтительной является ультрафильтрация с режимом тангенциального потока. В указанном режиме стадию можно контролировать, устанавливая фиксированный поперечный поток с противодавлением или без него на возврат ретентата, устанавливая фиксированное трансмембранное давление, либо фиксируя и поперечный поток и поток фильтрата.

- 6 028875

По изобретению следующей стадией может быть стадия анионообменной хроматографии. В процессе указанной стадии аденовирусные частицы связываются с положительно зараженным материалом, например, мембраной, картриджем или колонкой. Последующая элюция позволяет отделять вирусные частицы от примесей и остаточной ДНК клеток-хозяев.

Для очистки аденовируса при помощи мембранного абсорбента Ми81аи§ О концентрация ЫаС1 для нанесения и промывания предположительно может быть от 0,3 до 0,4 М при рН 7,5 и будет смещаться при изменении значения рН. Более предпочтительно, если концентрация ЫаС1 составляет 0,35 М. Величина рН буферов должна быть достаточно высокой, чтобы аденовирус связался (более чем примерно 6,5). Кроме того, величина рН буферной системы также должна быть достаточно низкой, чтобы избежать нестабильности вируса. Точный максимум рН, который можно использовать, будет зависеть от конкретного профиля стабильности аденовируса и от компонентов буфера, и его может легко определять специалист в данной области для конкретного применения. В качестве ориентира, но никоим образом не ограничения, величина рН потенциально может находиться в диапазоне примерно 5-10.

Наличие 0,1% ПС-80 в буферах является весьма предпочтительным для достижения низких уровней остаточной ДНК в продукте, поскольку он ослабляет ассоциацию аденовирус/ДНК и агрегацию аденовируса. Установление более высоких или более низких концентраций детергента или альтернативных детергентов, которые могут быть полезны для стимулирования диссоциации аденовирусных частиц от другого аденовируса, а также различных клеточных примесей, не будет выходить за рамки обычного экспериментирования у специалистов в данной области. Также, не выходя за рамки обычного экспериментирования, специалист в данной области может выбирать альтернативный детергент для буфера в данном способе. Примеры таких альтернативных детергентов можно найти в И8 7326555. Продукты для анионообменной мембранной хроматографии, такие как те, которые производят компании Ра11 (например, серии МиДапд™) и §айогш8 (например, серии ЗайоЫиб) являются подходящими для очистки вируса по настоящему изобретению. В патенте США 6485958 или АО 05/080556 описано применение анионообменной хроматографии для очистки рекомбинантного аденовируса.

Связывающая способность в отношении вируса мембранного абсорбента, такого как Ми81аи§ О (Ра11 Согрогабои), чрезвычайно высока, порядка 7х10¹³ в.ч./мл. Другие мембранные абсорбенты и смолы, подходящие для очистки аденовируса данным способом, включают, но никоим образом не ограничиваются ими, §оигее 150 и §оигее 300 (ОЕ ЬИс 8с1спсс5). 0-5>срНаго5С ХЬ (ОЕ ЫГс АспссЩ. Ргас!оде1 ТМАЕ (ЕМ бДийпсО, БайоЪшб О (Зайогшз), ЛАср! О (№-Ип.\ §срагабои8), С1М ОЛ (ΒΙΑ §срагабои8). Элюцию аденовируса предпочтительно проводят с использованием буфера, содержащего №С1. Квалифицированному специалисту известно, как оптимизировать концентрацию №С1.

В некоторых вариантах осуществления предпочтительно использовать по меньшей мере одну стадию анионообменной хроматографии. После стадии анионообменной хроматографии аденовирус может быть достаточно чистым. Однако в некоторых вариантах осуществления дополнительно проводят стадию гель-фильтрации для повышения надежности способа. Эту стадию можно проводить до или после стадии анионообменной хроматографии. Очевидно, что и другие стадии очистки также можно соответствующим образом комбинировать со стадией анионообменной хроматографии. Применение анионообменной хроматографии для очистки аденовируса подробно описано, и вследствие этого, данный аспект вполне по силам специалисту в данной области. Множество различных хроматографических матриц используются для очистки аденовируса и подходят для этого, и специалист в данной области может легко находить оптимальный анионообменный материал для очистки аденовируса.

В любом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения продукт после анионообменной хроматографии можно переводить диафильтрацией в буфер препарата и стерильно фильтровать. Альтернативно, можно добавлять дополнительную стадию хроматографии (например, катионообменной) либо до, либо после диафильтрации с потенциальной возможностью повышения надежности очистки от примесей и/или вирусов/прионов.

Дополнительная стадия ультрафильтрации также может быть возможной на данной стадии. Ультрафильтрация с тангенциальным потоком полезна для удаления остаточного белка и нуклеиновой кислоты и для перевода аденовируса в буфер препарата. Выбор между мембранами для 300 и 500 кДа продиктован поиском оптимального соотношения между выходом и более высокой степенью очистки от примесей. Другие конфигурации мембран (такие как полое волокно) являются приемлемыми заменителями. Выбранная мембрана для ультрафильтрации будет иметь размер пор достаточно маленький, чтобы удерживать аденовирусные частицы, но достаточно большой, чтобы эффективно очищать от примесей. В зависимости от производителя и типа мембраны подходящими могут быть номинальные пределы отсечения по молекулярной массе от 10 до 1000 кДа.

В способ можно включать стадию стерильной фильтрации, которая может помочь в избавлении от микрофлоры. Продукт можно фильтровать через модифицированную поливинилиденфторидную (РУОР) мембрану с размером пор 0,22 мкм (например, МППрогс, МППрак).

В способ можно добавлять необязательные последующие стадии обработки. Они могут, например, включать стадию гель-фильтрации, стадию обращенно-фазовой адсорбции и/или стадию хроматографии

- 7 028875

на гидроксиапатите. Более подробную информацию о каждой из этих стадий можно найти, например, в И8 7326555, АО 03/097797, АО 02/44348.

В международной патентной заявке АО 97/08298 описана очистка аденовирусов с использованием определенных хроматографических матриц для предотвращения повреждения вирусов, включающая стадии анионообменной и гель-хроматографии.

Некоторые методы ультрафильтрации также хорошо подходят для очистки аденовирусов, как описано в АО 2006/108707. Такие стадии можно выполнять в дополнение или вместо определенных хроматографических стадий очистки.

Масштаб систем культивирования клеток и системы последующей обработки.

Способы по настоящему изобретению являются масштабируемыми. Культуры клеток, используемые по настоящему изобретению, находятся в диапазоне от мелкомасштабных культур (например, культивирование в объеме 1-10 л) до среднемасштабных культур (например, культивирование в объеме 201000 л) и вплоть до крупномасштабного коммерческого производства, такого как производство в объеме от 1000 до 50000 л. Начальные стадии способа (лизис, глубинная фильтрация и ультрафильтрация) масштабируются в зависимости от объема культуры, тогда как анионообменная хроматография и последующие стадии масштабируются в зависимости от входящего количества аденовирусных частиц. Вследствие этого, масштаб более поздних стадий будет основан на оценке производительности ферментера, составляющей по меньшей мере 1х10¹² аденовирусных частиц на 1 мл (в.ч./мл). Такие высокие выходы аденовируса можно, например, получать, инфицируя культуры с высокой плотностью клеток (как описано, например, в ЕР08168181.9). Дальнейшая очистка таких суспензий с высокой плотностью клеток, содержащих аденовирусные частицы в высоких концентрациях, стала возможной благодаря настоящему изобретению. Возможность подвергать обработке такие суспензии, содержащие большие количества клеточного дебриса и ДНК клеток-хозяев, делает возможной очистку больших количеств аденовирусных частиц в расчете на объем суспензии. Заслугой данного изобретения является предложение способа обработки партий клеточных культур с высокой плотностью клеток, содержащих аденовирусные частицы в высоких концентрациях, и тем самым возможности получения очень высоких выходов в расчете на обрабатываемый объем. Настоящий способ, хотя и применимый к крупномасштабному культивированию клеток, позволяет культивировать клетки в меньшем масштабе также до высокой плотности клеток и попрежнему достигать высоких выходов аденовируса, который можно эффективно подвергать дальнейшей обработке. Данный способ обеспечивает возможность подвергать обработке партии высококонцентрированного аденовируса, что окажет большое влияние на всю индустрию очистки аденовирусов.

Аденовирус и клетки-продуценты.

Изобретение относится к очистке аденовируса. Аденовирус по данному изобретению может быть любым вирусом дикого типа, модифицированным, мутантным аденовирусом и/или рекомбинантным аденовирусным вектором. Особый интерес для применения з области генной вакцинации и/или генной терапии представляет использование неспособных к репликации аденовирусов 1-го или 2-го поколения с поврежденным Е1 или дополнительными делециями, включая "беспомощные" ("диДекк") аденовирусные векторы. Аденовирусный геном, как правило, связан с доброкачественными патологиями у человека. Геном поддается манипуляции в зависимости от стратегии, используемой для конструирования соответствующего вектора. Неспособному к репликации вирусу, такому как рекомбинантный аденовирусный вектор 35 (τΑά.35) или 26 (τΑά.26) (приведенный в качестве примера в данном документе), необходима линия клеток-продуцентов, которые компенсируют делеции.

Клетка-продуцент (иногда также называемая в данной области или в данном документе "упаковывающей клеткой" или "дополняющей клеткой" или "клеткой-хозяином") может быть любой клеткойпродуцентом, в которой нужный аденовирус может размножаться. Например, размножение рекомбинантных аденовирусных векторов осуществляют в клетках-продуцентах, компенсирующих недостатки аденовируса. Такие клетки-продуценты предпочтительно имеют в своем геноме, по меньшей мере, аденовирусную последовательность Е1, и благодаря этому способны дополнять рекомбинантные аденовирусы с делецией в области Е1. Дополнительно аденовирус может иметь делецию в области Е3, которая является необязательной в геноме Ад (Αά), и, следовательно, такую делецию нет необходимости компенсировать. Можно использовать любую компенсирующую Е1 клетку-продуцента, например, клетки сетчатки человека, иммортализованные за счет Е1, например, клетки 911 или РЕИ.С6 (см. патент США 5994128), Е1-трансформированные амниоциты (см. ЕР патент 1230354), Е1-трансформированные клетки А549 (см., например, АО 98/39411, патент США 5891690), ОН329:НеЬа (Оао е! а1., 2000, Нитап Оеие Тйетару 11: 213-219), 293 и т.п. В некоторых вариантах осуществления клетки-продуценты представляют собой, например, клетки НЕК293 или клетки РЕР.С6. или клетки 911, или клетки 1Т2938Е. и тому подобное. Предпочтительно в качестве клеток-продуцентов используют клетки РЕИ.С6 (ЕСАСС депозит № 96022940, депонированы 29 февраля 1996 г. в ЕСАСС, САМИ, Ройои Ио^и, ЗаПкЬигу 8Р40Ю, ИиНеД К1идДот; см. патент США 5994128), или производные от них клетки.

Неспособный к репликации аденовирусный вектор можно получать с использованием любого вида, штамма, подтипа или смеси видов, штаммов или подтипов аденовируса, либо химерного аденовируса в качестве источника векторной ДНК (см., например, АО 96/26281, АО 00/03029), которая, например,

- 8 028875

может обеспечивать аденовирусный вектор способностью инфицировать клетки определенных нужных типов. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в качестве аденовируса используют гАб35 или гАб26.

Специалисту в данной области известно, каким образом осуществлять размножение аденовирусных векторов различных серотипов на определенных клетках-хозяевах при помощи методов, таких как, например, те, которые описаны в патенте США 6492169 или в νθ 03/104467, а также в приведенных там ссылках. Например, для размножения Е1-дефицитного гАб35 можно конструировать определенные клетки-продуценты, экспрессирующие Е1В-55К вируса Аб35, например, на основе существующих клетокпродуцентов, экспрессирующих Е1А и Е1В вируса Аб5, таких как клетки РЕК.С6 или НЕК293 (см., например, И8 6492169), как известно специалисту в данной области. Альтернативно и предпочтительно, существующие дополняющие (А65-) линии клеток, такие как, например, РЕР.С6 или НЕК293, можно использовать без модификации клеток для размножения Е1-дефицитного гАб35 или гАб26 за счет включения последовательности, кодирующей Е4-от£6 из Аб5, в вектор гАб35 или гАб26, как подробно описано, например, в νθ 03/104467, полное содержание которого включено в данный документ посредством ссылки. Таким образом, размножение аденовирусных векторов любого серотипа можно осуществлять в клетках-продуцентах, применяя средства и способы, хорошо известные специалистам в данной области. Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в данной области и описаны, например, в патентах США № 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913, а также в книге Тйошак 8йеик, "Абеиоушбае аиб 1йе1т КерНеаНои", Μ. δ. Ногой/, "Абеиоуиикек", главы 67 и 68, соответственно, в книге У1то1о§у, под редакцией В. N. Ие1б8 е! а1., 3-е изд., Кауеи Рте88, Ыб., №\ν Уогк (1996), и в других ссылках, приведенных в этом документе.

Изобретение дополнительно поясняется на следующих примерах. Примеры никоим образом не ограничивают изобретение. Они служат лишь для разъяснения изобретения.

Примеры

Пример 1. Прямое осветление методом ТЕР не работает в случае сборов с высокой плотностью клеток.

Клетки РЕК.С6 выращивали в ферментере при 37°С и инфицировали Аб35 в бессывороточной культуральной среде в течение 3 дней. Клетки собирали при плотности клеток 20-30х10⁶ клеток/мл и титрах вируса 1-1,5х10¹² в.ч./мл. Вирусы высвобождали из клеток добавлением неионных детергентов Тритон Х-100 и Твин-80 до конечной концентрации, соответственно, 0,1 и 0,05%. Время лизиса составляло от 2 до 24 ч. После лизиса содержащий вирус сбор осветляли фильтрацией в тангенциальном потоке (ТРР).

Осветление проводили с использованием либо 0,2-мкм (ОЕ НеаИйсате, модель СРР-2-Е-4МА, 0,042 м²), либо 0,65-мкм (ОЕ НеаИйсате, модель СЕР-6-Э-4МА, 0,046 м²) половолоконного фильтра. 1 л лизированного сбора концентрировали по меньшей мере в 3 раза. После осветления проводили вытяжку, используя троекратный объем ретентата в режиме дренирования и подпитки. Эксперименты по фильтрованию проводили при потоке фильтрата в диапазоне от 15 до 40 л/м²/ч. Извлечение вируса в процессе стадии осветления показано в следующей таблице.

Таблица 1

Эксп.	Параметры процесса	Параметры результативности
#	Размер пор (мкм)	Плотность клеток (χΙΟ⁴ клеток/ мл)	Титр вируса (хЮ¹¹ В.Ч./ мл)	Осажденная ДНК к-х (%)	ДНК к-х (нг/л х!0" в.ч.)	Извлечение вируса при осаждении (%)	Извлечение вируса при осветлении (%)	Общее извлечение вируса (%)
1	0,2	29,2	11,4	НС проводилось	не проводилось	ие проводилось	0	0
2	0,65	20,1	15	не проводилось	не проводилось	не проводилось	0	0

После осветления не удавалось извлечь вирус. Это было несколько неожиданно, так как, например, в ЕР 1371723 и νθ 2006/052302 описано успешное применение ТЕР для осветления сборов аденовируса. Очевидно, высокая плотность клеток в данном способе является препятствием на этой стадии и делает метод ТЕЕ непригодным для прямого осветления.

Пример 2. Избирательное осаждение ДНК клеток-хозяев в суспензиях с высокой плотностью клеток.

Избирательное осаждение ДНК клеток-хозяев продемонстрировано на предшествующем уровне техники (Ооегке е! а1. (2005), υδ7326555) для плотности клеток вплоть до 1х10⁶ клеток/мл. В этих доку- 9 028875

ментах показано, что (при низких плотностях клеток) по меньшей мере 80% ДНК клеток-хозяев отделялось осаждением от клеточной суспензии с извлечением 90% вирусных частиц. Однако до настоящего времени совершенно не было известно, осуществимо ли такое избирательное осаждение при высокой плотности клеток, поскольку такие клеточные суспензии содержали бы гораздо большие количества ДНК клеток-хозяев и клеточного дебриса, и вследствие этого, можно было бы ожидать, что потребуются гораздо большие количества осаждающего ДНК средства, в то время как экстраполяция данных из предшествующего уровня техники позволяет предположить, что такие высокие концентрации осаждающего ДНК средства будут также осаждать и аденовирус.

Для того чтобы изучить возможность осаждения ДНК при высоких плотностях клеток, осаждение ДНК клеток-хозяев тестировали в мелкомасштабных пробирках, содержащих клетки с плотностью вплоть до 30х10⁶ клеток/мл. Мелкомасштабную модель с пробирками использовали в качестве инструмента быстрого скрининга для проверки того, происходит ли по-прежнему избирательное осаждение ДНК при высоких плотностях клеток.

Клетки РЕК..С6 выращивали в ферментере, инфицировали аденовирусом 35 (Л635) и выращивали при 37°С в бессывороточной культуральной среде в течение 3 дней. Клетки собирали при плотности клеток 2-30х10⁶ клеток/мл и титрах вируса в диапазоне от 8х10¹⁰ до 1,5х10¹² в.ч./мл. Лизис клеток проводили на протяжении периода времени от 2 до 24 ч путем добавления неионных детергентов Тритон Х-100 и Твин-80 до конечных концентраций 0,1 и 0,05% соответственно. Домифена бромид (ΌΒ) в возрастающих концентрациях в 40 мМ ЫаС1 добавляли к 3,5 мл лизированного сбора, а затем немедленно перемешивали на вортексе в течение 1 мин. Осажденный материал удаляли при помощи 0,45-мкм поливинилиденфторидных (РУЭР) шприцевых фильтров. Фильтраты анализировали на Л635 и концентрации ДНК клеток-хозяев методами ВЭЖХ-АОХ (НРЬС-ЛЕХ) и количественной ПЦР (О-РСР) соответственно.

На фиг. 1 представлен график зависимости извлечения вируса и количества осажденной ДНК клеток-хозяев от концентрации домифена бромида. Кривые, обозначенные треугольниками, получены от сборов клеточных культур с плотностями клеток, находящимися в диапазоне от 2,5х10⁶ до 3,5х10⁶ клеток/мл. Кривые, обозначенные кружками, получены от сборов клеточных культур с плотностями клеток, находящимися в диапазоне от 20х10⁶ до 30х10⁶ клеток/мл. Значение С* (концентрация домифена бромида, приводящая к извлечению 90% вируса) при низких и высоких плотностях клеток, а также соответствующее процентное выражение осажденной ДНК клеток-хозяев отмечены на графиках.

Концентрация ΌΒ, необходимая для осаждения более 90% ДНК клеток-хозяев при плотностях клеток в диапазоне от 20х10⁶ до 30х10⁶ клеток/мл, возрастала по меньшей мере в 2,5 раза по сравнению с концентрацией ΌΒ, необходимой при плотностях клеток в 10 раз меньших. Удивительно, но увеличенная концентрация ΌΒ не вызывала осаждение вирусных частиц, как можно было ожидать от экстраполяции кривых, полученных при низкой плотности клеток.

Эксперимент повторяли со сборами клеточных культур, имеющими плотности клеток в диапазоне от 18х10⁶ до 25х10⁶ клеток/мл. На фиг. 2 представлен график зависимости извлечения вируса и количества осажденной ДНК клеток-хозяев от концентрации домифена бромида. Кривые, обозначенные треугольниками, получены от сборов клеточных культур с плотностями клеток, находящимися в диапазоне от 2,5х10⁶ до 3,5х10⁶ клеток/мл. Кривые, обозначенные кружками, получены от сборов клеточных культур с плотностями клеток, находящимися в диапазоне от 18х10⁶ до 25х10⁶ клеток/мл. Значение С* (концентрация домифена бромида, приводящая к извлечению 90% вируса) при низких и высоких плотностях клеток, а также соответствующее процентное выражение осажденной ДНК клеток-хозяев отмечены на графиках.

Как можно заметить из графиков на фиг. 1 и 2, концентрация ΌΒ, приводящая к извлечению 90% вируса (С*), в случае суспензий с высокой плотностью клеток может немного различаться в отдельных экспериментах, и это является частью нормальной вариации. Тем не менее, графики неизменно демонстрируют, что избирательное осаждение ДНК возможно и при высоких плотностях клеток, и что подходящая концентрация §РЛ (здесь ΌΒ) значительно выше, чем в случае культур с низкой плотностью клеток, но гораздо ниже, чем можно было ожидать на основании экстраполяции. Таким образом, квалифицированный специалист признает, что существует скорее диапазон, чем фиксированное значение подходящих концентраций для избирательного осаждающего средства, и на основании раскрытия в данном документе сможет установить подходящий диапазон. Например, соответствующие концентрации ΌΒ для обработки содержащей аденовирус собранной суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от примерно 10х10⁶ до 30х10⁶ клеток/мл, находится в диапазоне от примерно 1,3 до 2 мМ.

На основании данных результатов специалист в данной области теперь будет знать, что осаждение ДНК можно экстраполировать на содержащие аденовирус суспензии, имеющие даже более высокие плотности клеток, например, примерно 40х10⁶ клеток/мл, например, примерно 50х10⁶ клеток/мл, например, вплоть до примерно 100х10⁶ клеток/мл, например, вплоть до примерно 150х10⁶ клеток/мл, и что аденовирус из таких суспензий с высокой плотностью клеток можно очищать способом по настоящему изобретению.

- 10 028875

Таким образом, по настоящему изобретению можно применять избирательное осаждение ДНК при очистке аденовирусных частиц из суспензий с высокой плотностью клеток.

Пример 3. Избирательное осаждение ДНК клеток-хозяев в суспензиях с высокой плотностью клеток в большем масштабе.

Осаждение ДНК тестировали в масштабах от 0,5 до 20 л. Концентрации ΌΒ, используемые для осаждения ДНК, выбирали на основании результатов предыдущих экспериментов (фиг. 2). Использовали примерно 80% от концентрации С*, определенной в мелкомасштабной модели с пробирками.

В перфузионном режиме перфузию, которую проводили с использованием системы АТР, начинали через 4 дня после инокуляции при плотности клеток примерно 2,5х10⁶ всех клеток/мл. Через 14 дней перфузии клеточную суспензию разводили свежей бессывороточной средой в ферментере до плотности клеток примерно 13х10⁶ клеток/мл. Затем ферментер инфицировали вирусом АЙ35. Систему АТР запускали через 5 ч после инфицирования при скорости обновления среды 2 объема сосуда в сутки. Через 3 дня (после инфицирования) клетки собирали. Плотность клеток в момент сбора (СЭАН) приведена в табл. 2.

После сбора клетки лизировали в течение периода времени от 2 до 24 ч добавлением неионных детергентов Тритон Х-100 и Твин-80 до конечных концентраций, соответственно, 0,1 и 0,05%. Домифена бромид добавляли к лизированному сбору до конечных концентраций 0,72 и 1,52 мМ в 40 мМ ΝαίΤ Осажденный лизат осветляли, используя два последовательно нагружаемых глубинных фильтра с разными размерами пор. Предполагаемые размеры пор обоих фильтров находились в диапазоне от ~10-~5 мкм (МШМак + СЕ20) и ~1—0,2 мкм (Сипо ΖοΙα плюс 50СР) соответственно. Первый фильтр использовали для удаления крупного клеточного дебриса и примесей. После указанной предварительной фильтрации использовали второй фильтр для удаления оставшихся примесей и осажденной ДНК из содержащей вирус суспензии. Осветление проводили при постоянном потоке 100 л/м²/ч пока давление не достигало 5 фунтов/кв.дюйм (0,3515 кг/см²).

В таблице 2 представлены параметры процесса и результаты процесса очистки. Лизис, осаждение ДНК (осажд. ДНК) и осветление проводили, используя 8 различных сборов, различающихся по объему, плотности клеток в момент сбора (СИАН) и титру вируса. Сборы брали из 2-л или 10-л ферментеров. Определяли процент осажденной ДНК клеток-хозяев (ДНК к-х) и извлечение вируса в стадии осаждения.

Таблица 2

Эксп.	Параметры процесса	Результаты
Осажд. ДНК	Осветление
#	СИАН(х10⁶ клеток/мл)	Титр вируса (хЮ¹¹ В.Ч./МЛ)	ИВ (мМ)	Извлечение на стадии (%)	Извлечение на стадии (%)	Уменьшение ДНК к-х (%)
1	1,36	2,13		92	86	99,6
2	2,47	2,24		91	86	99,9

3	2,37	1,85		90	90	99,2
4	9,1	6,7	1,52	69	97	99,9
5	18,6	8,9	88	98	99,8
6	20,1	15	90	82	98,3
7	16,7	11	99	71	99,9
8	25,8	15,9	104	92	99,8

Сделан вывод о том, что избирательное осаждение ДНК клеток-хозяев возможно при высокой плотности клеток. Действительно, хотя концентрация ΌΒ была увеличена (в 2 раза), вирусные частицы оставались неосажденными (обратите внимание, что извлечение выше 70%) и количество ДНК клетокхозяев сокращалось более чем на 98%.

В данном процессе предложен способ удаления ДНК клеток-хозяев из сбора культур с высокой плотностью клеток без ущерба для извлечения вируса. При этом он позволяет обрабатывать большие объемы суспензий с высокой плотностью клеток, что необходимо в промышленных процессах.

Следует отметить, что по практическим соображениям одну концентрацию ΌΒ (1,52 мМ) использовали для избирательного осаждения ДНК в экспериментах 4-8. Указанные эксперименты продемонстрировали, что содержащие аденовирус суспензии с широким диапазоном (9,1 х 10⁶-25, 8х10⁶ в.ч./мл) плотности клеток можно обрабатывать 1,52 мМ ΌΒ. Это согласуется с отмеченным выше фактом, что отношение между подходящими концентрациями избирательного осаждающего средства и плотностью клеток не является фиксированным, но допускает вариации так, что диапазон концентраций осаждающего средства подходит для данной плотности клеток.

Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от 10х10⁶ до 50х10⁶ клеток/мл, находится в диапазоне от примерно 1,3 до 2,2 мМ. Подходящая концентрация ΌΒ для обработки содержащей аденовирус суспензии с высокой плотностью клеток, имеющей плотность клеток в диапазоне от 10х10⁶ до 30х10⁶клеток/мл, находится в диапазоне от примерно 1,3 до 2 мМ.

Следует отметить, что для некоторых экспериментов при высоких плотностях клеток (эксперимен- 11 028875

ты № 6 и 7), наблюдали пониженные показатели извлечения вируса и емкости фильтра на 2-ом фильтре, по сравнению со сборами с низкой плотностью клеток. Кроме того, использование двух последовательных различных фильтров делает процесс трудоемким и дорогостоящим.

Пример 4. Осветление в одну стадию препаратов аденовируса с высокой плотностью клеток путем избирательного осаждения ДНК клеток-хозяев с последующей ТРР.

Клетки РЕК.С6 выращивали в перфузионном ферментере, инфицировали Л435 и выращивали при 36°С в бессывороточной культуральной среде в течение 3 дней. Клетки собирали при плотности клеток 20-30χ10⁶ клеток/мл и титрах вируса 1-1,5χ10¹² в.ч./мл. Вирусы высвобождали из клеток добавлением неионных детергентов Тритон Х-100 и Твин-80 до конечной концентрации, соответственно, 0,1 и 0,05%. Время лизиса составляло от 2 до 24 ч. После лизиса клеток проводили стадию осаждения ДНК с последующим осветлением.

Осаждение ДНК проводили, используя 0,063-0,077% домифена бромид (ΌΒ) в 40 мМ ЫаС1. Осаждение ДНК проводили в течение 3 ч со временем добавления ΌΒ 2 ч при скорости перемешивания 0,171,52 м/с. Осветление проводили методом фильтрации в тангенциальном потоке, используя 0,65-мкм (ОЕ НеаНЪсаге, модель СРР-6-О-4МЛ, 0,046 м²) половолоконный фильтр. Один литр сбора после лизиса и осаждения ДНК концентрировали по меньшей мере в 3 раза. После осветления проводили вытяжку, используя троекратный объем ретентата в режиме дренирования и подпитки. Эксперименты по фильтрованию проводили при потоке фильтрата в диапазоне от 15 до 40 л/м²/ч. Лизис с последующим осаждением ДНК и осветлением проводили, используя 3 различных сбора. Количество осажденной ДНК клетокхозяев в процентном выражении, концентрация ДНК клеток-хозяев в расчете на 1 χ 10¹¹ вирусных частиц и показатели извлечения вируса после избирательного осаждения и осветления представлены в табл. 3.

Таблица 3

Эксп,	Параметры процесса	Параметры результативности
#	Плотность клеток (х10^б клеток/мл)	Титр вируса (х10^]\| в.ч,/мл)	Осажденная ДНК к-х (%)	ДНК к-х (нг/л хЮ" в.ч.)	Извлечение вируса при осаждении (%)	Извлечение вируса при осветлении (%)	Общее извлечение вируса (%)
1	20,1	14,1	100	8,6	88	99	87
2	17,9	17,4	99,9	6,9	110	74	81,4
3	23,5	15,3	99,9	23,8	100	81,2	81,2

Как и в предыдущем примере, было неожиданно продемонстрировано, что избирательное осаждение ДНК возможно при высокой плотности клеток. Действительно, хотя концентрация ΌΒ была увеличена, вирусные частицы оставались неосажденными (обратите внимание, что извлечение выше 80%) и количество ДНК клеток-хозяев сокращалось более чем на 99%.

Несмотря на неудачу в примере 1, в данном примере показано, что метод фильтрации в тангенциальном потоке при использовании в сочетании с избирательным осаждением ДНК клеток-хозяев позволял осветлять суспензии с высокой плотностью клеток.

Применение фильтрации в тангенциальном потоке вместо набора из двух различных глубинных фильтров (как показано в примере ранее) делает возможной переработку суспензии с высокой плотностью клеток в осветленную аденовирусную суспензию за одну стадию фильтрации.

Сочетание избирательного осаждения ДНК клеток-хозяев с применением фильтрации в тангенциальном потоке позволяет удалять ДНК клеток-хозяев из сбора суспензии с высокой плотностью клеток, и неожиданно делает это без ущерба для извлечения аденовируса. Действительно, общее извлечение вируса при применении данного способа может даже быть выше, чем при использовании классических двухстадийных способов осветления и фильтрации с использованием глубинных фильтров. Кроме того, это делает способ очистки менее трудоемким и дорогостоящим по сравнению со способом с использованием глубинных фильтров. При этом он позволяет обрабатывать большие объемы суспензий с высокой плотностью клеток, что необходимо в промышленных процессах.

- 12 028875

Литература

СогРхп V., ТЫЪаи1Ъ Л., ЛасоЬ и., Сатхег А. НхдЬ-ТхСег АЦепспххгиз УесЬог РгоЦисЬхоп ίη 2933 Се11 Рег£изхоп Си1£иге. Вхо£есЬпо1. Ргод. 2004.

Соегке А., То В., Ьее А., Задаг 5., Κοηζ К. ΠβνβΙοριηθηΡ о£ а Νονεί Айепо'ххгиз Ригх£хса(:хоп Ргосезз Ц£х1хгхпд Зе1ес£хуе РгесхрхСаРхоп о£ Се11и1аг ΌΗΑ. Вхо£есЬпо1оду апД Ьхоепдхпеегхпд, νοί. 91, Но. 1, Ди1у 5, 2005.

Уик Ι.Η.Υ., 01зеп М.М., Сеуег 3., РогезРеИ З.Р. Рег£изхоп Си1£игез о£ Нитап Титог Се11з: А Зса1аЫе РгоДисРхоп Р1а££огт £ог ОпсоТуЬхс АДепоухга1 Уессогз. вхоСесЬпо1. Вхоепдхп. 86: 637641 (2004).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ очистки аденовирусных частиц из клеточной суспензии с плотностью клеток от 5х10⁶ до 150х 10⁶ клеток в 1 мл, включающий стадии:

a) лизис клеток в указанной клеточной суспензии;

b) избирательное осаждение ДНК клеток-хозяев в указанной клеточной суспензии путем добавления домифена бромида в концентрации от 1,2 до 5 мМ и

c) осветление клеточной суспензии, полученной на стадии Ь), методом фильтрации в тангенциальном потоке для удаления осажденной ДНК клеток-хозяев и других примесей.
2. Способ по п.1, в котором плотность клеток составляет от примерно 10х10⁶ до 30х10⁶ клеток в 1 мл и концентрация домифена бромида составляет от 1,3 до 2 мМ.
3. Способ по п.1 или 2, в котором указанную фильтрацию в тангенциальном потоке проводят, используя мембрану с диаметром пор от 0,1 до 0,65 мкм.
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором указанную фильтрацию в тангенциальном потоке проводят с использованием волокна.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором указанную фильтрацию в тангенциальном потоке проводят с использованием системы АТЕ.
6. Способ по любому из пп.1-5, в котором по меньшей мере 80% ДНК клеток-хозяев удаляется из клеточной суспензии.