MX2012004221A - Proceso para purificacion de adenovirus de cultivos de alta densidad celular. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona métodos para la purificación de adenovirus a gran escala a partir de suspensiones de alta densidad celular, usando fragmentación y/o precipitación de ADN de células huésped seguido de una etapa de clarificación con filtración de flujo tangencial.

Description

PROCESO PARA PURIFICACION DE ADENOVIRUS DE CULTIVOS DE ALTA DENSIDAD CELULAR CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con el campo de la producción de virus. Más particularmente, se relaciona con métodos mejorados para la purificación de partículas de adenovirus de una suspensión celular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los últimos desarrollos en el campo de la producción de vacunas han creado la necesidad de una manufacturación a gran escala. Son necesarios procesos grandes y de alto rendimiento para ayudar al mundo con cantidades suficientes de vacunas (recombinantes) para combatir las enfermedades infecciosas.

Las vacunas contra las enfermedades infecciosas pueden basarse en partículas de adenovirus recombinantes. Por esta razón, se están haciendo grandes esfuerzos en la optimización de los procesos de base celular para la producción de adenovirus. Las células están siendo cultivadas a densidades aumentadas y, subsecuentemente, infectadas para obtener rendimientos de virus totales superiores . Tales procesos de alta densidad celular se describen, por ejemplo, en WO 2010/060719 de Crucell Holland BV, y en Yuk et al. (2004) . Se describió ahí un proceso para la producción de grandes REF. : 228966 concentraciones de adenovirus recombinante . Este proceso optimizado depende de la capacidad de infectar cultivos a alta densidad celular (por ejemplo, mayor de 5x10s células/ml) con la conservación de una alta productividad de virus por célula. Asimismo, se ofrece un método para obtener una solución de virus cosechado con alta concentración viral en un biorreactor simple. Los rendimientos de las partículas virales (VP) típicas de estos procesos son de aproximadamente 1.5-2.5xl012 VP/mL.

Los procesos en donde se cultivan células a altas densidades son proclives a la acumulación de altas cantidades de residuos celulares y ADN de células huésped. Estos contaminantes tienen que desecharse adicionalmente del proceso de purificación, la cual es una operación problemática. Un método para desechar el ADN de la célula huésped de un cultivo celular cosechado se describió anteriormente en US7326555. El método consiste en precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped del cultivo celular. Un agente de precipitación selectivo podría unir específicamente al ADN de la célula huésped y dejar sin precipitar las partículas de adenovirus. Sin embargo, el método en esta referencia sólo tiene que describirse para los cultivos celulares con baja densidad celular, en donde el residuo celular y el ADN de la célula huésped están presentes en bajas cantidades.

Hasta ahora no se ha sabido que este proceso pudiera aplicarse en un medio de cultivo que contiene altas densidades celulares. Por el contrario, de la técnica previa puede inferirse una fuerte sugerencia de que un agente de precipitación, como se usó en tal método, no precipitaría selectivamente el ADN de la célula huésped del cultivo y precipitaría las partículas virales cuando se usa a altas concentraciones (Goerke et al. 2004) .

Las cosechas del cultivo celular que contiene el adenovirus en general, se procesan adicionalmente para obtener un adenovirus purificado. Una etapa de clarificación usando, por ejemplo, filtración profunda y/o filtración se flujo tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) se incluye usualmente en el proceso de purificación. El uso de TFF requiere una cosecha relativamente limpia, esto es, que contiene cantidades limitadas de residuo celular u otras impurezas, tales como, por ejemplo, ADN de célula huésped. Un exceso de estas impurezas podría bloquear posiblemente los filtros. Como consecuencia, la clarificación por TFF se usa comúnmente además del proceso de purificación, por ejemplo, como una tercera o cuarta etapa de proceso.

La separación del adenovirus de una suspensión celular que contiene adenovirus directamente después de la cosecha, usando filtración de flujo tangencial, se describió anteriormente, por ejemplo, en EP 1371723. Sin embargo, el adenovirus se creció en células adherentes, que permanecieron en el biorreactor después de la cosecha. Por lo tanto, la suspensión que contiene el virus que se procesó adicionalmente , contuvo muy bajas concentraciones de residuo celular y ADN de la célula huésped. WO 2006/052302 también describe el uso de TFF directamente después de la cosecha. Sin embargo, las densidades celulares de la cosecha que contiene el adenovirus usada en la presente, fueron mucho menores que 5xl06 células/mL. Como se describe en la presente, el uso de TFF en la etapa de clarificación directamente después de la cosecha, no es factible para los cultivos celulares que contienen densidades celulares altas.

Dado que los procesos de cultivo celular están siendo sobre-escalados y las células están siendo cultivadas a densidades aumentadas, hay una necesidad en la industria de procesos en la dirección 3' que permitan el tratamiento de suspensiones a alta densidad celular. En particular, esto aplica para el campo de la producción de adenovirus.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para purificar partículas de adenovirus de un lisado celular de una suspensión celular, en particular, de una suspensión de alta densidad celular.

Los intentos para purificar el adenovirus de una suspensión de alta densidad celular con los procesos existentes resultaron en una recuperación de virus muy baja, como se ejemplifica en la presente (ejemplo 1). En general, las concentraciones de impurezas en tal suspensión de alta densidad celular obtenida después de la cosecha fueron demasiado altas para permitir la purificación de adenovirus directa. El procesamiento en la dirección 3' de las suspensiones de alta densidad celular usando los procesos conocidos requeriría comúnmente una multitud de etapas. Una primera etapa de filtración consistiría de una filtración gruesa para remover los precipitados grandes y el residuo celular. Subsecuentemente, una o dos etapas de filtración selectiva serían requeridas para obtener una suspensión de adenovirus suficientemente purificada.

Se ha encontrado y descrito sorprendentemente en la presente que directamente subsecuente a la preparación de un lisado celular que contiene adenovirus, el uso consecutivo de la fragmentación y/o precipitación del ADN de la célula huésped seguido de una etapa de clarificación que comprende filtración de flujo tangencial (TFF) resultó en una suspensión de adenovirus altamente purificada.

Sorprendentemente, el lisado celular que contiene el adenovirus, grandes cantidades de residuo celular, ADN de la célula huésped y otras impurezas, podría procesarse eficientemente al adenovirus purificado con la presente invención. Asimismo, la presente invención proporciona un nuevo proceso apropiado para la remoción de ADN de célula huésped en los procesos de purificación de adenovirus a gran escala .

Con la incorporación de la fragmentación o precipitación del ADN en el proceso de purificación, una etapa de clarificación simple fue suficiente para purificar el adenovirus de una suspensión de alta densidad celular, usando TFF para la clarificación.

La invención proporciona un método para purificar partículas de adenovirus de una suspensión celular que tiene una densidad celular que oscila de 5xl06 a 150xl06 células por mi, en donde el método comprende: a) lisar las células dentro de la suspensión celular; b) fragmentar y/o precipitar el ADN de la célula huésped dentro de la suspensión celular y c) someter la suspensión celular obtenida en la etapa b) a una clarificación por filtración de flujo tangencial.

En algunas modalidades, el adenovirus se purifica de una suspensión celular que tiene una densidad celular que oscila de 5xl06 a 150xl06 células por mi, por ejemplo, 5xl06 a 50xl06 células por mi ó lOxlO6 a 30xl06 células por mi.

En otra modalidad, la precipitación en la etapa b) se realiza precipitando selectivamente el ADN de la célula huésped de las partículas de adenovirus mediante la adición de un agente de precipitación selectiva.

En una modalidad preferida, la filtración de flujo tangencial se realiza con una membrana que tiene un tamaño de poro que oscila de 0.1 a 0.65 µp?.

En otra modalidad preferida, la filtración de flujo tangencial se realiza con una fibra hueca. En aún otra modalidad preferida, la filtración de flujo tangencial se realiza con un sistema ATF .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Recuperación de adenovirus y ADN de célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno en suspensiones celulares a baja densidad (2.5xl06-3.5xl06 ve/mi) y alta (20xl06-30xl06 vc/ml) .

Figura 2. Recuperación de adenovirus y ADN de célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno en suspensiones celulares a baja densidad (2.5xl06-3.5xl06 vc/ml) y alta ( 18xl06-25xl06 vc/ml).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para purificar partículas de adenovirus de una suspensión a alta densidad celular. De acuerdo con la invención, las suspensiones a alta densidad celular se obtienen cultivando las células a altas densidades celulares. Por ejemplo, tal cultivo puede realizarse en una forma por lotes, alimentación por lotes o perfusión. Los métodos para cultivar las células a altas densidades celulares son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los métodos específicos para obtener los cultivos de alta densidad celular se describen en, por ejemplo, WO 2004/099396, WO 2005/095578, WO 2008/006494, WO 2010/060719.

De acuerdo con la presente invención, una suspensión a alta densidad celular contiene entre aproximadamente 5xl06 y 150xl06 células/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 8xl06 y 120xl06 células/mL, por ejemplo entre aproximadamente 12xl06 y lOOxlO6 células/mL, por ejemplo, entre aproximadamente 20xl06 y 80xl06 células/mL.

En una modalidad preferida de la presente invención, la densidad celular en la suspensión a alta densidad celular oscila entre aproximadamente lOxlO6 y 50xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 20xl06 células/mL, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 25xl06, por ejemplo, hasta aproximadamente 30xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 35xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 40xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente 45xl06 células/mL.

De acuerdo con la presente invención, los cultivos a alta densidad celular se infectan con partículas de adenovirus para permitir que los adenovirus se propaguen en el cultivo celular. Aquí, se obtienen suspensiones a alta densidad celular, las cuales contienen altas concentraciones de adenovirus, en un biorreactor simple. Los métodos para infectar los cultivos a alta densidad celular también son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los métodos específicos para obtener tales cultivos a alta densidad celular con alta concentración de virus se describen en, por ejemplo, EP0816818.9, Cortin et al. (2004) y Yuk et al. (2004). Estas referencias describen procesos para la producción de grandes cantidades de adenovirus recombinante . Estos procesos dependen de la capacidad de infectar los cultivos a alta densidad celular con conservación de una alta productividad de adenovirus por célula. Asimismo, ofrece un método para obtener una suspensión a alta densidad celular con altas concentraciones de adenovirus, en un biorreactor simple. Los rendimientos típicos de los procesos actuales, por ejemplo, para adenovirus recombinantes 35 (rAd35) son de aproximadamente 1.5-2.5xl012 VP/mL . Una vez que el adenovirus se ha propagado en el cultivo celular, matando la mayoría de las células, las partículas de adenovirus, de acuerdo con la presente invención, se purifican de la suspensión a alta densidad celular .

El método de la presente invención, en una primera etapa, incluye lisar las células contenidas en la suspensión a alta densidad celular. Las suspensiones a alta densidad celular lisadas, las cuales se infectaron con partículas de adenovirus, causan que se acumulen grandes cantidades de residuos celulares y ADN de célula huésped en la suspensión celular. Estas acumulaciones hacen problemático el procesamiento en la dirección 3' subsecuente de la suspensión celular.

La presente invención proporciona un método conveniente para purificar partículas de adenovirus del lisado celular de las suspensiones a alta densidad celular. Se precipitan selectivamente grandes cantidades de ADN de célula huésped de las partículas de adenovirus dentro de la suspensión a alta densidad celular, adicionando un agente de precipitación selectiva al lisado celular, de modo que por lo menos aproximadamente 80% de las moléculas de ADN de la célula huésped se precipitan de la suspensión de alta densidad celular que contiene las partículas de adenovirus. Como se describe en la presente, la etapa de precipitación permite la precipitación del ADN de la célula huésped contaminante, con por lo menos una reducción de 80% en el ADN de la célula huésped, de preferencia 90%> e incluso más preferentemente, como se ejemplifica en la presente, aproximadamente una reducción de 95% en el ADN de la célula huésped después de la clarificación con TFF.

Lisis La primera etapa del proceso incluye lisar las células dentro de la suspensión celular. Esta primera etapa, en donde se lisan las membranas celulares, permite la cosecha del adenovirus celular asociado (intracelular) y no asociado (extracelular) de la suspensión de alta densidad celular infectada. La lisis del detergente de la célula huésped, mientras que es el método preferido para lisar las células huésped que contienen virus, puede reemplazarse por métodos de lisis no mecánicos (tales como tratamiento enzimático) y/o métodos de corte mecánico (tales como ultrafiltración de fibra hueca) para liberar cantidades máximas de adenovirus. Los métodos que pueden usarse para la lisis celular activa son conocidos por la persona experimentada en la técnica, y por ejemplo, se han descrito en WO 98/22588, p. 28-35. Por ejemplo, los métodos útiles en este aspecto, son congelado-descongelado, corte sólido, lisis hipertónica e/o hipotónica, corte líquido, sonicación, extrusión a alta presión, lisis de detergente, combinaciones de los anteriores, y similares. En una modalidad de la invención, las células se lisan usando por lo menos un detergente. El uso de un detergente para la lisis tiene la ventaja de que es un método fácil, y éste es fácilmente escalable.

Los detergentes que pueden usarse, y la manera en que se emplean, en general son conocidos por la persona experimentada en la técnica. Por ejemplo, varios ejemplos se describen en WO 98/22588, p. 29-33. Los detergentes, como se usan en la presente, pueden incluir, pero^ no se limitan a detergentes aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos y no iónicos. Ejemplos de los detergentes son, por ejemplo, Tritón y/o Polisorbato-80. En una modalidad, el detergente usado es Tritón X-100. Además, puede adicionarse un solvente tal como TNBP al lisado o lisado clarificado, a baja concentración, para complementar estos detergentes en su capacidad para inactivar los virus envueltos. También, la autolisis de las células huéspedes infectadas por el adenovirus puede proporcionar una liberación sustancial del adenovirus intracelular, y puede usarse en los procesos de la invención. Por lo tanto, cualquier forma de la lisis de la célula huésped que es conocida en la técnica, puede usarse para liberar el virus intracelular en el medio de cultivo de la célula huésped, para la cosecha final por lo métodos descritos en la presente. Es claro para la persona experimentada en la técnica que podría variar la concentración óptima del detergente, por ejemplo, dentro del intervalo de aproximadamente 0.1%-1% (p/p) .

Fragmentación y precipitación selectiva Después de la lisis, el ADN de la célula huésped puede fragmentarse o precipitarse de la suspensión celular que contiene el virus.

En una modalidad preferida, el ADN de la célula huésped se precipita mediante la adición de una solución de agente de precipitación selectiva (SPA, por sus siglas en inglés) . Esta etapa permite la precipitación selectiva del ADN de la célula huésped, mientras que se dejan sin modificar las partículas de virus en la fase líquida. Como se ejemplifica en la presente, esta etapa de precipitación temprana resulta en aproximadamente por lo menos 90% de reducción en el ADN de la célula huésped después de la clarificación.

Los SPAs que pueden ser útiles en la práctica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, copolímeros de amina, compuestos de amonio cuaternarios, y cualesquiera mezclas respectivas de los mismos. Más específicamente, las diferentes formas de polietileno (PEI) son muy eficientes en la neutralización de la carga iónica en exceso (impurezas de ADN) . Una lista de los posibles SPAs que puede usarse apropiadamente en la presente invención se proporciona en US7326555 (columna 12, líneas 56-67 y columna 13, líneas 1-28), incorporado en la presente por referencia. Los SPAs apropiados para el uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a las siguientes clases y ejemplos de productos comercialmente disponibles: sales de monoalquiltrimetilamonio (ejemplos de los productos comercialmente disponibles incluyen bromuro o cloruro de cetiltrimetilamonio como CTAB, bromuro o cloruro de tetradeciltrimetilamonio (TTA) , cloruro de alquiltrimetilamonio, cloruro de alquilariltrimetilamonio, bromuro o cloruro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de dodecildimetil-2-fenoxietilamonio, sal de bromuro o cloruro de hexadecilamina , sal de cloruro de dodecilamina y bromuro o cloruro de cetildimetiletilamonio) , sales de monoalquildimetilbencilamonio (ejemplos incluyen cloruros de alquildimetilbencilamonio y cloruro de bencetonio como BTC) , sales de dialquildimetilamonio (los productos comerciales incluyen bromuro de domifeno (DB) , haluros de didecildimetilamonio y cloruro o bromuro de octildodecildimetilamonio) , sales de amonio heteroaromáticas (los productos comerciales incluyen haluros de cetilpiridio (CPC o sal de bromuro y bromuro o cloruro de hexadecilpiridinio) , isómero cis de 1- [3 -cloroalil] -3 , 5 , 7-triaza-l-azoniaadamantano, bromuro de alquil-isoquinolinio y cloruro de alquildimetilnaftil-metil amonio (BTC 1110) . Las sales de amonio cuaternarias polisustituidas (los productos comercialmente disponibles incluyen, pero no se limitan a sacarinato de alquildimetilbencil amonio y ciclohexilsulfamato de alquildimetiletilbencil amonio) , sales de amonio bis-cuaternarias (ejemplos de los productos incluyen cloruro de 1, 10-bis (2-metil-4-aminoquinolinio-decano, cloruro de 1,6-bis { l-metil-3- (2 , 2 , 6-trimetil ciclohexil) -propildimetil amonio] cloruro de hexano o triclorobisonio, y bis-cuat referido como CDQ por Buckman Brochures) y sales de amonio cuaternario poliméricas (incluyedo poliionenos, tales como dicloruro de poli [oxietilen (dimetiliminio) etilen (dimetiliminio) etileno] , dicloruro de poli [N-3 -dimetilamonio) propil] - [3 -etilenoxietilendimetilamonio) propil] urea y cloruro de alfa-4-[1-tris (2-hidroxietil) amonio) . Como la persona experimentada entenderá a partir de US7326555, en donde varios de éstos se mostraron que trabajan, y en donde se mostró que la persona experimentada puede encontrar de manera rutinaria las concentraciones apropiadas para estos compuestos para precipitar selectivamente el ADN, éstos son ejemplos de SPAs, y se basan en la presente descripción y la descripción de la presente invención y es claro que éstos también serán convenientes en la presente invención.

En una modalidad preferida, los detergentes catiónicos se usan en la presente invención. En una modalidad aún más preferida, se usan en la presente invención las sales de dialquildimetilaminio, tales como bromuro de domifeno (DB, por sus siglas en inglés) . Aunque un gran número potencial de SPAs pueden usarse para la práctica de la presente invención, el bromuro de domifeno es de interés particular debido, principalmente, a su biodisponibilidad como una materia prima de grado GMP y su uso actual en otros productos destinados para el uso humano. Más específicamente, dado que el bromuro de domifeno se usa extensivamente como un ingrediente activo en los productos de higiene oral, así como cremas antibióticas típicas, esta molécula se produce en grandes cantidades y se libera bajo condiciones de cGMP.

Se determinó en la presente la concentración óptima de SPA que se usa en las suspensiones a alta densidad celular para precipitar el ADN de la célula huésped de la suspensión celular. Aunque se anticipó, con base en la técnica previa, que las partículas de adenovirus precipitarían inmediatamente cuando se colocaran en contacto con altas concentraciones de SPA, inesperadamente, las partículas de adenovirus permanecieron sin precipitar. De hecho, se mostró en la técnica previa, por ejemplo, en US7326555, que en suspensiones de baja densidad celular (hasta lxlO6 células/mL) , las partículas de adenovirus precipitan cuando se aumenta la concentración de detergente catiónico.

La suspensión como se produce lisando cultivos de alta densidad celular como se describe en la presente, contendrá cantidades ampliamente aumentadas del ADN de la célula huésped y otras impurezas y, por lo tanto, necesitará mayores cantidades de detergente catiónico (por ejemplo, aumento por un factor de 2.5). De esta manera, se espera con base a la extrapolación de los resultados a baja densidad celular, que este aumento en la concentración del detergente catiónico, conduciría a la precipitación de la totalidad de las partículas de adenovirus presentes en la suspensión.

Sin embargo, sorprendentemente, a altas concentraciones de SPA, fue aún posible la remoción selectiva del ADN de la célula huésped contaminante de una suspensión a alta densidad celular que contiene partículas de virus. En una modalidad preferida de la presente invención, el SPA, de preferencia DB, se adiciona a una concentración que oscila de 1.2 a 5 mM. En una modalidad aún más preferida, el SPA, de preferencia DB, se adiciona a una concentración que oscila de 1.3 a 2.2 mM, por ejemplo, 1.4 a 2 mM, por ejemplo, 1.4 a 1.8 mM, por ejemplo, 1.5 a 1.6 mM. Con base en la presente descripción, es claro que la persona experimentada en la técnica sabe cómo determinar los umbrales de concentración de SPA apropiados para una densidad celular dada en la cosecha.

La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 150xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.2 mM y 5 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 50xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 mM y 2.2 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una cosecha de suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus que comprende un densidad celular que oscila entre lOxlO5 y 30xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 y 2 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.9 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.8 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.4 y 1.7 mM, por ejemplo, entre aproximadamente 1.45 y 1.65 mM, por ejemplo, aproximadamente 1.5-1.55 mM.

Estará dentro del panorama de la persona experimentada probar los sustitutos potenciales para los SPAs descritos en la presente, para identificar un compuesto que precipita efectivamente las moléculas de ácidos nucleicos y otros residuos celulares de las partículas de adenovirus, como se ejemplifica en la presente, por el bromuro de domifeno (DB) . Por lo tanto, la presente invención se relaciona, en parte, con los métodos para purificar partículas de adenovirus de una suspensión a alta densidad celular. Tales métodos comprenden precipitar selectivamente las moléculas de ácido nucleico de célula huésped de las partículas de adenovirus dentro de la suspensión de alta densidad celular post-lisis, adicionando un agente de precipitación selectivo al medio de cultivo celular huésped post-lisis.

Aunque el método preferido para remover el ADN de la célula huésped de la suspensión celular es la precipitación selectiva, la invención no se limita a la misma. También se incluye en la presente invención cualquier otro método para remover el ADN de la célula huésped.

Por lo tanto, en una modalidad, el ADN de la célula huésped se fragmenta, esto es: se corta en piezas. De acuerdo con la presente invención, la fragmentación del ADN de la célula huésped después de la lisis, puede realizarse adicionando una nucleasa en la suspensión celular. Las nucleasas ejemplares apropiadas para el uso en la presente invención incluyen Benzonase®, Pulmozyme® o cualquier otra DNasa y/o RNasa usada comúnmente dentro de la técnica. En las modalidades preferidas de la invención,' la nucleasa es Benzonase®, la cual hidroliza típicamente los ácidos nucleicos hidrolizando los enlaces de fosfodiéster internos entre los nucleótidos específicos, por lo que se reduce la viscosidad del lisado celular. La Benzonase® puede obtenerse comercialmente , por ejemplo, de Merck KGaA (código W214950) .

La concentración de nucleasa que es necesaria para la fragmentación adecuada depende de, es decir, la densidad de la célula huésped, la temperatura y el tiempo de reacción. La persona experimentada en la técnica sabe cómo determinar y optimizar la concentración requerida de nucleasa para una fragmentación exitosa del ADN de la célula huésped.

Clarificación El lisado celular tratado con SPA obtenido de las etapas previas, se clarifica subsecuentemente para remover el ADN de la célula huésped precipitado, residuos celulares y otras impurezas .

Los intentos para purificar directamente el adenovirus de una suspensión de alta densidad celular con un proceso de clarificación de una etapa, resultaron en una baja recuperación de virus, como se ejemplifica en la presente (ejemplo 1) . Las concentraciones de impurezas en tal suspensión de alta densidad celular obtenida después de la cosecha, en general, fueron demasiado altas para permitir la purificación directa del virus. Normalmente, las combinaciones de por lo menos dos filtros consecutivos, como se usan y recomiendan a menudo en la técnica, y como se ejemplifica en la presente, son necesarias para la clarificación apropiada.

Se ha encontrado y descrito sorprendentemente en la presente, que la combinación de la precipitación de ADN con una etapa de clarificación usando TFF, permite la purificación del virus de una suspensión de alta densidad celular con alta recuperación. Una sola etapa de filtración de flujo tangencial fue suficiente para remover el residuo celular y los precipitados de ácido nucleico de la suspensión que contiene virus. El ADN de la célula huésped se precipitó para más de 95% y la recuperación de virus fue mayor de 80%. Aquí, de acuerdo con la presente invención, es posible usar TFF como una etapa de clarificación simple. La suspensión que contiene virus, clarificada obtenida con el método de la presente invención, se reduce subsecuentemente en el ADN de la célula huésped y otras impurezas, comparado con el lisado original (obtenido en la etapa a) del presente método) .

De acuerdo con la presente invención, los filtros usados en una instalación de TFF son, por ejemplo, filtros de fibra hueca de GE Healthcare o JM separations; otras alternativas son filtros de pantalla plana de Millipore o Sartorius stedim biotech. En tal instalación de TFF, las partículas de virus se colectan en el permeado, mientras que el residuo celular, el ADN de la célula huésped precipitada y otras impurezas permanecen en el retenido. Se mostró en la presente que los filtros de fibra hueca fueron muy apropiados para el procesamiento de suspensiones de alta densidad celular. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención, la TFF se realiza con un filtro de fibra hueca.

De acuerdo con la presente invención, el tamaño de poro de tales filtros preferentemente oscila de 0.1 a 1 µt?. En una modalidad preferida de la presente invención, el tamaño de poro está oscilando de 0.2 a 0.65 µp\. Tales tamaños de poro permiten que las partículas de virus pasen de la membrana y que el residuo celular, el ADN de la célula huésped precipitada y otras impurezas sean retenidos por el filtro. Los módulos de filtrado se pre-humectan preferentemente con agua siguiendo las instrucciones del fabricante. El líquido está recirculando a través de los módulos usando una tubería y una bomba peristáltica.

En algunas modalidades de la presente invención, se usa TFF en la forma de filtración de flujo alternado (ATF) . La ATF es una forma de filtración de flujo tangencial y se encontró en la presente que la clarificación usando ATF fue particularmente muy adecuada para la recuperación de virus de las suspensiones con altas concentraciones de residuo celular, ADN de célula huésped y otras impurezas. El flujo tangencial puede obtenerse de acuerdo con los métodos conocidos por la persona experimentada en la técnica y como se describe, por ejemplo, en US 6,544,424. La ventaja de usar un sistema de ATF (por ejemplo, ATF System, Refine Technology, Co . , East Hanover, NJ) es que las corrientes de alimentación y retenido cambian las direcciones con cada ciclo de la bomba ATF (el ciclo consiste de un modo de presurización y escape) . Esto crea una acción de barrido de flujo inverso y una presión de trans-membrana que cambia continuamente (TMP, por sus siglas en inglés por sus siglas en inglés) a través de la membrana. Durante el escape se crea un vacío, durante el cual algún material se contra- inunda desde el lado del permeado hasta el lado del retenido, resultando en la limpieza de la membrana. El uso de la ATF resultará en menos obstrucción de la membrana, resultando en un campo de recuperación de virus superior. La persona experimentada en la técnica puede determinar la ATF óptima y las velocidades de flujo de permeado para el rendimiento máximo .

De acuerdo con la presente invención, los filtros usados en el sistema de ATF son, por ejemplo, filtros de fibra hueca de GE healthcare .

Una ventaja adicional de usar un sistema de ATF es que la instalación que se usa para la clarificación puede usarse antes para cultivar las células en el modo de perfusión. De hecho, un biorreactor conectado a un sistema de ATF puede usarse en primer lugar para cultivar las células a altas densidades celulares. Las densidades celulares muy altas de más de lOOxlO6 células viables/mL, pueden obtenerse con el uso de un sistema de perfusión de ATF, por ejemplo, con las células PER.C6 (ver, por ejemplo, Yallop et al., 2005 y O 2005/095578) . Una vez que las células han alcanzado una alta densidad celular, éstas pueden infectarse para obtener una suspensión celular que contiene virus altamente concentrada. El sistema de ATF que permanece conectado al biorreactor a través de todo el proceso podría usarse subsecuentemente para purificar el virus de la suspensión de alta densidad celular.

La combinación de la precipitación selectiva con clarificación por TFF remueve por lo menos 70%, de preferencia por lo menos 80% y aún más preferentemente por lo menos 90% del ADN de la célula huésped contenido en el lisado de alta densidad celular obtenido después de la cosecha.

Métodos de purificación adicionales En algunas modalidades, las partículas virales cosechadas se purifican adicionalmente . La purificación adicional del virus puede realizarse en varias etapas, que comprenden concentración, ultrafiltración, diafiltración o separación con cromatografía, como se describe en, por ejemplo, WO 2005080556, incorporada en la presente por referencia. También pueden usarse otras etapas, tales como, cromatografía de membrana de intercambio aniónico, filtración estéril, adsorción de fase inversa, cromatografía de hidroxiapatita . Por ejemplo, estas etapas se describen en US 7326555, incorporada en la presente por referencia en la presente. La persona experimentada en la técnica sabe cómo encontrar las condiciones óptimas para cada etapa de purificación. También WO 98/22588, incorporada en la presente por referencia, describe métodos para la producción y purificación de partículas virales.

En algunas modalidades de acuerdo con la invención, la suspensión de partícula de adenovirus clarificada puede tratarse por ultrafiltración. La ultrafiltración se usa para concentrar la suspensión de virus. La suspensión puede concentrarse de 5 a 20 veces y, posiblemente, puede tratarse con nucleasa (como se mencionó anteriormente) . Otro aspecto de la invención es la introducción subsecuente de un amortiguador de intercambio mediante diafiltración . La diafiltración, o intercambio de amortiguador, usando ultrafiltradores es una manera para la remoción e intercambio de sales, azúcares y similares. La persona experimentada en la técnica sabe bajo que condiciones el intercambio de amortiguador debería llevarse a cabo y que amortiguadores son apropiados para esta etapa.

La membrana de ultrafiltración particular seleccionada será de un tamaño suficientemente pequeño para retener las partículas de adenovirus, pero su icientemente grande para clarificar efectivamente las impurezas. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, pueden ser apropiados cortes de peso molecular nominal entre 10 y 1000 kDa. Se prefiere la ultrafiltración usando un modo de flujo tangencial. En este modo, la etapa puede controlarse ajustando un flujo transversal fijado con o sin contrapresión sobre el retorno retenido, ajustando una presión de transmembrana fijada o fijando el flujo transversal y el flujo de permeado.

De acuerdo con la invención, una etapa posterior puede ser una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Durante esta etapa, las partículas de adenovirus se unen a un material cargado positivamente, por ejemplo, una membrana, un cartucho o columna. La elución subsecuente permite la separación de las partículas de virus de las impurezas y el ADN de la célula huésped restante.

Para la purificación de adenovirus con un absorbedor de membrana Mustang Q, la concentración de NaCl para la carga y lavado podría ser presumiblemente de 0.3 a 0.4 M a pH 7.5 y cambiaría de pH' s alternados. Más preferentemente, la concentración de NaCl es de 0.35 M. El pH de los amortiguadores necesita ser suficientemente alto para la unión del adenovirus (mayor de aproximadamente 6.5) . Además, el pH del sistema amortiguador también debería ser suficientemente bajo para evitar la inestabilidad viral. El pH máximo preciso que es usado dependerá del perfil de estabilidad específico del adenovirus y los componentes amortiguadores, y puede determinarse fácilmente por la persona experimentada en la técnica para tal aplicación particular. Como una guía y naturalmente no como una limitación, el pH podría oscilar potencialmente de aproximadamente 5-10.

Se prefiere altamente la presencia de 0.1% de PS-80 en los amortiguadores para lograr niveles bajos de ADN residual en el producto, debido a que atenúa la asociación de adenovirus/ADN y la agregación de adenovirus. Estará dentro del campo de la experimentación rutinaria para la persona experimentada en la técnica, establecer concentraciones de detergentes mayores o menores o detergentes alternativos que serían útiles para promover la disociación de las partículas de adenovirus de los otros adenovirus, así como diferentes contaminantes celulares . También está dentro de este mismo campo de concentración que la persona experimentada en la técnica puede elegir un detergente alternativo para el amortiguador del proceso. Ejemplos para tales detergentes alternativos pueden encontrarse en US 7326555. Los productos de cromatografía de membrana de intercambio aniónico, tales como los producidos por Pall (por ejemplo, la serie Mustang™) y Sartorius (por ejemplo, la serie Sartobind) son apropiados para la purificación viral de acuerdo con la presente invención. La patente US 6,485,958 y WO 05/080556 describen el uso de cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus recombinante .

La capacidad de unión para el virus en un absorbedor de membrana, tal como Mustang Q (Pall Corporation) es extremadamente alta, y en el orden de 7xl013 VP/ml. Otros absorbedores de membrana y resinas que son apropiados para la purificación de virus en este proceso incluyen, pero no se limitan de ninguna manera a Source 15Q y Source 30Q (GE life sciences) , Q-Sepharose XL (GE life sciences) , Fractogel TMAE (EM industries) , Sartobind Q (Sartorius) , Adsept Q (Natrix separations) , CIM QA (BIA separations) . La elución de adenovirus sería realizada preferentemente usando un amortiguador que contiene NaCl . La persona experimentada sabe cómo optimizar la concentración de NaCl.

En algunas modalidades, se prefiere usar por lo menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico, el adenovirus puede ser suficientemente puro. Sin embargo, en algunas modalidades, se realiza además una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño para aumentar la robustez del proceso. Esta etapa puede ser antes o después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Obviamente, también pueden combinarse convenientemente otras etapas de purificación con una etapa de cromatografía de intercambio aniónico. El uso de la cromatografía de intercambio aniónico para la purificación de adenovirus se ha descrito extensivamente, y, por lo tanto, este aspecto está bien dentro del alcance de la persona experimentada en la técnica. Se han empleado muchas matrices de cromatografía diferentes para la purificación de adenovirus y son apropiadas. La persona experimentada en la técnica puede encontrar fácilmente el material de intercambio aniónico óptimo para purificar tal adenovirus.

En cualquier modalidad particular de la presente invención, el producto de intercambio aniónico puede diafiltrarse en el amortiguador de formulación y filtrarse estéril. Alternativamente, una etapa de cromatografía adicional (por ejemplo, intercambio catiónico) puede agregarse ya sea antes o después de la diafiltración con el potencial para mejorar la solidez de impurezas y/o la clarificación del virus/prión.

Una etapa de ultrafiltración adicional también puede ser posible en esta etapa. La ultrafiltración de flujo tangencial es útil para remover la proteína residual y el ácido nucleico y para intercambiar el adenovirus en un amortiguador de formulación. La elección entre membranas de 300 kDa y 500 kDa se dictamina por los intercambios entre el rendimiento y la clarificación de la impureza mejorada. Otras configuraciones de membrana (tales como una fibra hueca) son sustitutos aceptables. La membrana de ultrafiltración seleccionada será de un tamaño suficientemente pequeño para mantener las partículas de adenovirus, pero suficientemente grande para clarificar efectivamente las impurezas. Dependiendo del fabricante y del tipo de membrana, pueden ser apropiados los cortes del peso molecular nominal entre 100 y 1000 kDa.

Puede incluirse en el proceso una etapa de filtración estéril, la cual es útil en la eliminación de la bio-carga. El producto puede filtrarse a través de una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) modificada de 0.22 micrómetros (por ejemplo, Millipore Millipak) .

Las etapas de procesamiento en la dirección 3', opcionales podrían adicionarse en el proceso. Por ejemplo, éstas podrían incluir una etapa de cromatografía de exclusión de tamaño, una etapa de adsorción de fase inversa y/o una etapa de cromatografía de hidroxiapatita . Más detalles en cada una de estas etapas pueden encontrarse en, por ejemplo, US 7326555, WO 03/097797, WO 02/44348.

La solicitud internacional WO 97/08298 describe la purificación de adenovirus usando algunas matrices cromatográficas para evitar el daño a los virus, incluyendo las etapas de intercambio aniónico y exclusión de tamaño.

Algunos métodos de ultrafiltración son muy apropiados para la purificación de adenovirus, como se describe en WO 2006/108707. Estas etapas pueden realizarse además de, o en lugar de, algunas etapas de purificación cromatográficas .

Escala de los sistemas de cultivo celular y sistemas de procesamiento en la dirección 3' Los procesos de la presente invención son escalables. Los cultivos celulares usados en la presente invención oscilan desde cultivos a pequeña escala (por ejemplo, corridas de 1-10 litros) hasta cultivos de media escala (por ejemplo, corridas de 20-1000 L) hasta preparaciones comerciales a gran escala, tales como corridas de producción de 1000 a 50,000 L. Las etapas de proceso iniciales (lisis, filtración profunda y ultrafiltración) se escalan con el volumen de cultivo, mientras que la cromatografía de intercambio aniónico y las etapas subsecuentes se escalan con la entrada de la partícula adenoviral . Por lo tanto, el tamaño de las etapas anteriores será basado en un estimado de productividad del biorreactor de por lo menos lxlO12 partículas de adenovirus por mL (vp/mL) . Por ejemplo, estos altos rendimientos de adenovirus pueden obtenerse infectando cultivos de alta densidad celular (como se describe, por ejemplo, en EP08168181.9 ) . La purificación adicional de estas suspensiones de alta densidad celular que contienen altas concentraciones de partículas de adenovirus, se hace posible con la presente invención. La posibilidad para procesar estas suspensiones, las cuales contienen altas cantidades de residuos celulares y ADN de la célula huésped, permiten la purificación de altas cantidades de partículas de adenovirus por volumen de suspensión. Es el mérito de esta invención proporcionar un método para procesar lotes de cultivo celular con altas densidades celulares, que contienen altas concentraciones de partículas de adenovirus y, de esta manera, permitiendo muy altos rendimientos de adenovirus por volumen procesado. El presente método, aunque es aplicable a cultivos celulares a gran escala, permitirán que las células sean cultivadas a una escala más pequeña, aún a densidades celulares mayores y incluso alcanzar altos rendimientos de adenovirus que además pueden procesarse eficientemente. Este método ofrece la posibilidad de procesar lotes de adenovirus altamente concentrados que tendrán un gran impacto sobre la industria de purificación de adenovirus total.

Adenovirus y células productoras La invención se relaciona con la purificación de adenovirus. Un adenovirus de acuerdo con esta invención puede ser cualquier adenovirus de tipo silvestre, modificado, mutado y/o un vector adenoviral recombinante . De interés específico en las aplicaciones de vacunación génica y/o la terapia génica es el uso de un adenovirus incompetente de replicación de primera o segunda generación, lisiado por El o además eliminaciones, incluyendo vectores de adenovirus "sin intestino" . El genoma del adenovirus en general se asocia con patologías benignas en los humanos. El genoma es susceptible a manipulación, dependiendo de la estrategia usada para construir el vector respectivo. Un virus de replicación incompetente, tal como un vector de adenovirus recombinante 35 (rAd35) ó 26 (rAd26) (como se ejemplifica en la presente) requiere una línea celular productora que complementa las eliminaciones.

Una célula productora (a menudo también llamada en la técnica y en la presente como "célula de empaque" o "célula de complemento" o "célula huésped") puede ser cualquier célula productora, en donde puede propagarse un adenovirus deseado. Por ejemplo, la propagación de los vectores de adenovirus recombinantes se realiza en las células productoras que complementan las deficiencias en el adenovirus. De preferencia, tales células productoras tienen en su genoma por lo menos una secuencia de adenovirus El, y por lo tanto, son capaces de complementar los adenovirus recombinantes con una eliminación en la región El. Además, el adenovirus puede tener una eliminación en la región E3 , la cual es prescindible del genoma Ad, y por esto tal eliminación no tiene que ser complementada. Puede usarse cualquier célula productora de complemento El, tal como las células de la retina humana inmortalizada por El, por ejemplo, células 91 1 o PER.C6 (ver la patente US 5,994,128), amniocitos El transformados (ver la patente EP 1230354) , células A549 transformadas El (ver, por ejemplo, WO 98/39411, patente US 5,891,690), GH329 :HeLa (Gao et al., 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, y similares. En algunas modalidades, las células productoras son, por ejemplo, células HEK293 o células PER.C6 o células 91 1 o IT293SF y similares. De preferencia, las células PER.C6 (depósito ECACC No. 96022940, depositado el 29 de febrero de 1996 y ECACC, CAMR, Portón Down, Salisbury SP4 0JG, Reino Unido; ver la patente US 5,994,128) o las células derivadas de las mismas se usan como células productoras.

El vector adenoviral de replicación deficiente puede generalizarse usando cualquier especie, cepa, subtipo o mezcla de especies, cepas o subtipos, de un adenovirus o un adenovirus quimérico como la fuente de ADN de vector (ver, por ejemplo, WO 96/26281, WO 00/03029), que, por ejemplo, puede proporcionar el vector adenoviral con la capacidad de infectar algunos tipos de células deseadas. En una modalidad preferida de la presente invención, se usa rAd35 o rAd26 como un adenovirus .

La persona experimentada en la técnica estará consciente de las posibilidades para propagar los vectores adenovirales de diferentes serotipos sobre las células huésped específicas, usando los métodos, tales como, por ejemplo, se describen en la patente US 6,492,169 o en WO 03/104467 y sus referencias. Por ejemplo, la propagación de rAd35 deficiente en El, las células productoras específicas que expresan E1B-55K de Ad35 pueden construirse, por ejemplo, con base en las células productoras existentes que expresan E1A y E1B de Ad5 , tales como las células PER.C6 o HEK293 (ver, por ejemplo, US 6,492,169) como se conoce por la persona experimentada. Alternativamente, y de preferencia, las líneas celulares complementarias existentes (Ad5-), tales como por ejemplo, PER.C6 o HEK293 pueden usarse sin modificación de las células para la propagación de rAd35 o rAd26 deficiente en El, por inclusión de la secuencia de codificación E4-orf6 de Ad5 en el vector rAd35 o rAd26, como se describe extensivamente en, por ejemplo, WO 03/104467, incorporado en la presente en su totalidad por referencia. De esta manera, la propagación de los vectores adenovirales de cualquier serotipo puede hacerse sobre las células productoras usando los medios y métodos bien conocidos por la persona experimentada en la técnica. Los vectores adenovirales, métodos para la construcción de los mismos y los métodos para propagarlos, son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en las Patentes U.S.

Nos. 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191 y 6,113,913 y Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication" , . S. Horwitz, "Adenoviruses" , capítulos 67 y 68, respectivamente, en Virology, B.N. Fields et al., eds . , 3ra. edición, Raven Press, Ltd., New York (1996) y otras referencias mencionadas en la presente.

La invención se explica adicionalmente en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención de ninguna manera. Sirven exclusivamente para clarificar la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: La clarificación del TFF directo no funciona para las cosechas de alta densidad celular Las células PER.C6 se crecieron en un biorreactor a 37°C y se infectaron con Ad35 en medio de cultivo libre de suero durante 3 días. Las células se cosecharon a una densidad celular entre 20 y 30xl06 células/ml y titulaciones del virus de 1 a 1.5xl012 VP/ml . Las virus se liberaron de las células con la adición de los detergentes no iónicos Tritón X-100 y Tween-80 a concentraciones finales de 0.1 y 0.05%, respectivamente. El tiempo de lisis fue entre 2 y 24 horas. Subsecuente a la lisis, la cosecha que contiene virus se clarificó por filtración de flujo tangencial (TFF) .

La clarificación se realizó usando un filtro de fibra hueca de 0.2 µ?? (GE Healthcare, modelo CFP-2 -E-4MA, 0.042 m2) o uno de 0.65 pm (GE Healthcare, modelo CFP-6-D-4MA, 0.046 m2) . Se concentró un litro de la cosecha lisada mediante un factor de por lo menos 3. Después de la clarificación, se realizó un lavado usando tres veces el volumen de retenido, en una operación de purgado y alimentación. Los experimentos de filtración se realizaron a un flujo de permeado que oscila entre 15 y 40 LMH. La recuperación del virus durante la etapa de filtración se determinó en la siguiente tabla.

Tabla 1 No hubo una recuperación del virus después de la clarificación. Esto fue bastante inesperado, dado que, por ejemplo, EP 1371723 y O2006/052302 describieron el uso de TFF para la clarificación de cultivos de adenovirus exitosamente. Aparentemente, las altas densidades celulares del presente proceso impiden esta etapa y hacen al TFF inapropiado para la clarificación directa.

Ejemplo 2: Precipitación selectiva de ADN de célula huésped en las suspensiones de alta densidad celular Se demostró la precipitación selectiva de ADN de células huésped en la técnica previa (Goerke et al., US 7326555) para densidades celulares de hasta lxlO6 células/mL. Se mostró en la presente que (a bajas densidades celulares) por lo menos 80% del ADN de la célula huésped se precipitó de la suspensión celular con una recuperación de 90% de las partículas de virus. Sin embargo, es desconocido completamente hasta ahora si tal precipitación selectiva sería factible a alta densidad celular, dado que tales suspensiones celulares contendrían cantidades mucho mayores del ADN de la célula huésped y residuo celular, y por lo tanto, sería esperado que serían requeridas cantidades mucho mayores de agente de precipitación de ADN, mientras que la extrapolación de los datos de la técnica anterior sugeriría que tales concentraciones mayores de agente de precipitación de ADN también precipitarían el adenovirus.

Para explorar la posibilidad de la precipitación del ADN a altas densidades celulares, la precipitación del ADN de la célula huésped se probó en tubos de prueba a pequeña escala, que contienen densidades celulares de hasta 30x10s células/mL. El modelo del tubo de prueba a pequeña escala se usó como una herramienta de selección rápida para probar si la precipitación de ADN selectiva se presenta aún a altas densidades celulares.

Las células PER.C6 se crecieron en un biorreactor y se infectaron con el adenovirus 35 (Ad35) y se crecieron a 37°C en medio de cultivo libre de suero durante 3 días. Las células se cosecharon a una densidad celular entre 2 y 30xl06 células/mL y titulaciones de virus que oscilan de 8xl010 a 1.5xl012 VP/mL. La lisis celular se realizó durante un periodo de 2 a 24 horas (hrs) , adicionando los detergentes no iónicos Tritón X-100 y Tween-80 a concentraciones finales de 0.1% y 0.05%, respectivamente. El aumento en las concentraciones de bromuro de domifeno (DB) en NaCl 40 mM, se adicionaron a 3.5 mL de cosecha lisada, seguido de la formación del vórtice inmediata durante 1 minuto. El material precipitado se removió con filtros de jeringa de fluoruro de polivinilideno (PVDF) 0.45 µp?. Los filtrados se analizaron para Ad35 y las concentraciones de ADN de la célula huésped, usando una prueba HPLC-AEX y Q-PCR, respectivamente.

La Figura 1 muestra la recuperación del virus y el ADN de la célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno. Las curvas representadas en triángulos se obtienen de las cosechas de los cultivos celulares que tienen densidades celulares que oscilan entre 2.5xl06 y 3.5xl06 células/mL. Las curvas representadas en círculos se obtienen de cosechas de cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 20x10s y 30xl06 células/mL. La C* (concentración de bromuro de domifeno que muestra una recuperación de virus de 90%) a densidades celulares baja y alta y el porcentaje relacionado del ADN de la célula huésped precipitada, se resaltan en las gráficas .

La concentración de DB que se requiere para precipitar más de 90% del ADN de la célula huésped a densidades celulares que oscilan entre 20xl06 y 30xl06 células/mL, se aumenta por un factor de por lo menos 2.5 veces comparado con la concentración de DB requerida a densidades celulares que son 10 veces menores. Sorprendentemente, el aumento de la concentración de DB no precipitó las partículas de virus, como se esperaría de la extrapolación de las curvas obtenidas a una densidad celular menor.

El experimento se repitió con los cosechas del cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 18xl06 y 25xl06 células/mL. La Figura 2 muestra la recuperación del virus y el ADN de la célula huésped precipitado, graficado contra la concentración de bromuro de domifeno. Las curvas representadas en triángulos se obtienen de las cosechas del cultivo celular, que tienen densidades celulares que oscilan entre 2.5xl06 y 3.5xl06 células/mL. Las curvas representadas en círculos se obtienen de las cosechas del cultivo celular que tienen densidades celulares que oscilan entre 18xl06 y 25xl06 células/mL. La C* (concentración de bromuro de domifeno que da una recuperación de virus de 90%) a densidades celulares baja y alta y el porcentaje relacionado del ADN de la célula huésped precipitado se resaltan en las gráficas.

Como puede observarse de las gráficas en las Figuras 1 y 2, la concentración de DB que da 90% de recuperación de virus (C*) para las suspensiones de alta densidad celular pueden diferir ligeramente entre los experimentos individuales, y esto es parte de la variación normal. Sin embargo, las gráficas demuestran consistentemente que una precipitación selectiva de ADN es posible también a altas densidades celulares, y que la concentración apropiada de SPA (aquí DB) es significativamente mayor que para los cultivos de baja densidad celular, pero mucho menor que la que se esperaría con base en la extrapolación. De esta manera, la persona experimentada reconocerá que hay un intervalo en lugar de un punto fijado de concentraciones apropiadas para el agente de precipitación selectivo, y con base en la descripción de la presente, pueden tener el intervalo apropiado. Por ejemplo, las concentraciones apropiadas de DB para el tratamiento de una cosecha de suspensión de alta densidad celular que contiene un adenovirus, comprende una densidad celular que oscila entre un intervalo de aproximadamente 10x10s y 30xl06 células/mL, entre aproximadamente 1.3 y 2 mM.

Con base en estos resultados, la persona experimentada en la técnica estará consciente ahora que la precipitación del ADN puede extrapolarse a las suspensiones que contienen adenovirus, que contienen incluso mayores densidades celulares, por ejemplo, de aproximadamente 40xl06 células/mL, por ejemplo, de aproximadamente 50xl06 células/mL, por ejemplo, hasta aproximadamente lOOxlO6 células/mL, por ejemplo, aproximadamente 150xl06 células/mL, y que los adenovirus de tales suspensiones de alta densidad celular pueden purificarse con el proceso de la presente invención.

De esta manera, es posible, de acuerdo con la presente invención, usar la precipitación selectiva de ADN en la purificación de partículas de adenovirus de las suspensiones de alta densidad celular.

Ejemplo 3: Precipitación selectiva de ADN de células huésped en suspensiones de alta densidad celular a gran escala La precipitación de ADN se probó a escalas que oscilan entre 0.5 L y 20 L. Las concentraciones de DB usadas para la precipitación de ADN se basaron en los resultados experimentales previos (Figura 2) . Se usó aproximadamente 80% de la concentración C* como se determinó en el modelo del tubo de prueba a pequeña escala.

En el modo de perfusión, la perfusión que se realizó con un sistema ATF, se inició 4 días post-inoculación a una densidad celular de aproximadamente 2.5xl06 células totales/mL. Después de 14 días de perfusión, la suspensión celular se diluyó con medio libre de suero fresco en el biorreactor a una densidad celular de aproximadamente 13xl06 células/mL. Subsecuentemente, el biorreactor se infectó con el virus Ad35. El sistema ATF se inició 5 horas post-infección a una velocidad de refresco media de 2 volúmenes de recipiente por día. Después de 3 días (post-infección) las células se cosecharon. La densidad celular en la cosecha (CDAH, por sus siglas en inglés) se proporciona en la Tabla 2.

Subsecuente a la cosecha, las células se lisaron durante un periodo de 2 a 24 horas, adicionando el detergente no iónico Tritón X-100 y Tween-80 a concentraciones finales de 0.1 y 0.05%, respectivamente. Posteriormente, se adicionó bromuro de domifeno a la cosecha lisada a concentraciones finales de 0.72 y 1.52 mM en NaCl 40 mM. El lisado precipitado se clarificó usando dos filtros de profundidad cargada, con tamaños de poro estimados entre -10 - ~ -5 µp? (Millistak + CE20) y -1 - ~ -0.2 µp (Cuno Zeta plus 50 CP), respectivamente. El primer filtro se usó para remover grandes residuos e impurezas celulares. Después de la pre-filtración, el segundo filtró se usó para remover las impurezas restantes y el ADN precipitado de la suspensión que contiene el virus. La clarificación se realizó a un flujo constante de 100 LMH (litros por metro cuadrado por hora) hasta que la presión alcanzó 5 psi (34.4 kPa) La Tabla 2 muestra los parámetros de proceso y los resultados del proceso de purificación. La lisis, precipitación de ADN (ADN ptt) y la clarificación se realizaron usando 8 diferentes cosechas, que difirieron en volumen, densidad celular en la cosecha (CDAH) y titulación viral. Las cosechas se tomaron de biorreactores de 2 L ó 10 L. De determinaron el porcentaje de ADN de la célula huésped precipitada (HC-ADN) y la recuperación del virus durante la etapa de precipitación.

Tabla 2 Se concluye que la precipitación de ADN selectiva es posible a alta densidad celular. De hecho, aunque se aumentó la concentración · de DB (con un factor de 2) , las partículas de virus permanecieron sin precipitar (ver la recuperación mayor de 70%) y la reducción de HC-ADN fue mayor de 98%.

Este proceso ofrece un método para desechar el ADN de la célula huésped de la cosecha de cultivos de alta densidad celular sin comprometer la recuperación del virus. Asimismo, permite el procesamiento de grandes volúmenes de suspensiones de alta densidad celular, la cual es necesaria en los procesos industriales.

Debe observarse que por razones prácticas, una concentración de DB simple (1.52 mM) se ha usado para la precipitación selectiva de ADN en los experimentos 4-8. Estos experimentos muestran que las suspensiones que contienen adenovirus que tienen un amplio intervalo (9. lxl06-25.8xl06 vc/ml) de las densidades celulares pueden tratarse con DB 1.52 mM. Esto es consistente con la noción anterior de que la relación entre las concentraciones apropiadas del agente de precipitación selectiva y la densidad celular no está muy fijada, pero en vez de esto proporciona una variación, de modo que es apropiado un intervalo de concentraciones del agente de precipitación para una densidad celular dada.

La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una suspensión de alta densidad celular que contiene el adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre lOxlO6 y 50xl06 células/mL, oscila entre aproximadamente 1.3 mM y 2.2 mM. La concentración apropiada de DB para el tratamiento de una cosecha dé suspensión de alta densidad celular que contiene el adenovirus, que comprende una densidad celular que oscila entre 10x10s y 30xl06 células/mL oscila entre aproximadamente 1.3 y 2 mM.

Se observa que para algunos experimentos a altas densidades celulares (experimentos # 6 y 7) , se observaron la recuperación del virus reducida y la capacidad de filtrado durante la segunda titulación, comparado con las cosechas de baja densidad celular. Además, el uso de dos filtros consecutivos distintos hace al proceso de una labor intensiva y costosa.

Ejemplo 4: Clarificación de etapa simple de las preparaciones de adenovirus de alta densidad celular por precipitación de ADN de célula huésped selectiva seguido por TFF Se crecieron células PER.C6 en un biorreactor de perfusión y se infectaron con Ad35 y se crecieron a 36°C en un medio de cultivo libre de suero durante 3 días. Las células se cosecharon a una densidad celular entre 20 y 30xl06 células/mL y las titulaciones del virus de 1 a 1.5xl012 VP/ml. Los virus se liberaron de las células mediante la adición de los detergentes no iónicos Tritón X-100 y Tween-80 hasta las concentraciones finales de 0.1 y 0.05%, respectivamente. El tiempo de lisis fue entre 2 y 24 horas. Subsecuente a la lisis celular, se realizó una etapa de precipitación de ADN seguido por clarificación.

La precipitación de ADN se realizó usando 0.063% a 0.077% de bromuro de domifeno (DB) en NaCl 40 mM. La precipitación de ADN se realizó durante 3 horas con un tiempo de adición de 2 horas de DB a una velocidad de agitación de 0.17 a 1.52 m/s'1. La clarificación se realizó usando filtración de flujo tangencial con un filtro de fibra hueca de 0.65 pm (GE Healthcare, modelo CFP-6-D-4MA, 0.046 m2) . Un litro de la cosecha lisada y precipitada de ADN se concentró mediante por lo menos un factor de 3. Después de la clarificación, se realizó un lavado usando tres veces el volumen de retenido, en una operación de purgado y alimentación. Los experimentos de filtración se realizaron a un intervalo de flujo de permeado entre 15 y 40 LMH. La lisis seguido de la precipitación y clarificación de ADN se realizaron usando 3 cosechas diferentes. El porcentaje de ADN de la célula huésped precipitada, la concentración de ADN de la célula huésped por lxlO11 partículas de virus y la recuperación del virus después de la precipitación y clarificación selectiva se determinaron en la Tabla 3.

Tabla 3 Similar al ejemplo anterior, se mostró inesperadamente en la presente que la precipitación selectiva de ADN fue posible a alta densidad celular. De hecho, aunque se aumentó la concentración de DB, las partículas de virus permanecieron sin precipitar (ver la recuperación mayor de 80%) y la reducción de HC-ADN fue mayor de 99%.

A pesar del fracaso en el ejemplo 1, se muestra en este ejemplo que la filtración de flujo tangencial, cuando se usa en combinación con la precipitación de HC-ADN selectiva permitió que se clarificaran suspensiones de alta densidad celular .

El uso de la filtración de flujo tangencial, en lugar de un grupo de dos filtros profundos distintos (como se ejemplificó anteriormente) ofrece la posibilidad de procesar una suspensión de alta densidad celular a una suspensión de adenovirus clarificada en una sola etapa de filtración.

La combinación de la precipitación de HC-ADN selectiva con el uso de filtración de flujo tangencial permite la remoción del ADN de la célula huésped de la cosecha de la suspensión de alta densidad celular, e inesperadamente, lo hace sin comprometer la recuperación de adenovirus. De hecho, la recuperación de adenovirus global usando este proceso puede aún ser mayor usando los procesos clásicos de clarificación de dos etapas, usando filtros profundos. Además, hace del proceso de purificación una labor menos intensiva y costosa, comparado con el proceso con los filtros profundos. Asimismo, permite el procesamiento de grandes volúmenes de suspensiones de alta densidad celular, que es necesario en los procesos industriales.

Referencias Cortin V, Thibault J, Jacob D, Garaier A. High-Titer Adenovirus Vector Productioni in 293S Cell Perfusión Culture. Biotechnol. Prog. 2004.

Goerke A, To B, Lee A, Sagar S, Konz K. Development of a Novel Adenovirus Purification Process Utilizing Selective Precipitation of Cellular DNA. Biotechnology and bioengineering, Vol . 91, No. 1, 5 de julio de 2005.

Yuk IHY, Olsen MM, Geyer S, Forestell SP. Perfusión Cultures of Human Tumor Cells: A Scalable Production Platform for Oncolytic Adenoviral Vectors . Biotechnol. Bioengin. 86: 637-641 (2004) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (9)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Método para purificar partículas de adenovirus de una suspensión celular que tiene una densidad celular que oscila de 5xl06 a 150xl06 células por mL, caracterizado porque comprende las etapas de : a) lisar las células dentro de la suspensión celular; b) precipitar selectivamente el ADN de la célula huésped dentro de la suspensión celular mediante la adición de un agente de precipitación selectiva a la suspensión celular, en donde el agente de precipitación selectiva se selecciona del grupo que consiste de compuestos de amonio cuaternario, copolímeros de amina y mezclas de los mismos; o fragmentar el ADN de la célula huésped dentro de la suspensión celular adicionando una nucleasa; c) someter la suspensión celular obtenida de la etapa b) a una clarificación por filtración de flujo tangencial, para obtener una suspensión de adenovirus purificada.

2. Método para purificar partículas de adenovirus de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la precipitación en la etapa b) se realiza precipitando selectivamente ADN de la célula huésped de las partículas de virus mediante la adición de un agente de precipitación selectiva.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el agente de precipitación selectiva es bromuro de domifeno (DB) .

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la concentración de bromuro de domifeno (DB) oscila de 1.2 a 5 mM.

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la densidad celular oscila de aproximadamente lOxlO6 a 30xl06 células por mL y la concentración de bromuro de domifeno (DB) oscila de 1.3 a 2 mM.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque la filtración de flujo tangencial se realiza con una membrana que tiene un tamaño de poro que oscila de 0.1 a 0.65 µp?.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la filtración de flujo tangencial se realiza con una fibra hueca.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la filtración de flujo tangencial se realiza con un sistema ATF.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque por lo menos 80% del ADN de la célula huésped se ha removido en la suspensión de adenovirus purificada.