KR20220077927A - 바이러스 벡터를 제조하는 방법 - Google Patents

바이러스 벡터를 제조하는 방법 Download PDF

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아밋 쿠마르 두타
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리플리겐 코포레이션
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Abstract

본 발명의 개시는 일반적으로 공정 여과 시스템, 보다 구체적으로 접선 유동 여과를 사용하는 시스템에 관한 것이다.

Description

바이러스 벡터를 제조하는 방법
우선권
본 출원은 모든 목적상 전체 내용이 본원에 참조로서 포함되는 2019년 12월 10일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/946,082호에 대한 35 USC § 119에 따른 우선권의 이익을 주장한다.
개시의 분야
본 발명의 개시는 일반적으로 공정 여과 시스템, 보다 구체적으로 접선 유동 여과를 사용하는 시스템에 관한 것이다.
여과는 전형적으로 유체 용액, 혼합물 또는 현탁액을 분리하고/하거나, 정화하고/하거나, 개질시키고/시키거나, 농축하기 위해 수행된다. 생명공학 및 약제학적 산업에서, 여과는 신약, 진단학 및 기타 생물학적 제품의 성공적인 생산, 처리 및 시험을 위해 필수적이다. 예를 들어, 동물 또는 미생물 세포 배양물을 사용하여 생물학적 제제를 제조하는 공정에서, 배양 배지로부터의 특정 성분의 정화, 선택적 제거 및 농축을 위해 또는 추가 처리 전에 배지를 개질시키기 위해 여과가 수행된다. 여과는 또한 높은 세포 농도에서 배양물을 관류 상태로 유지함으로써 생산성을 향상시키는 데 사용될 수 있다.
생물학적 제제 제조 공정은 상당한 공정 강화를 통해 발전하였다. 재조합 단백질, 바이러스-유사 입자(VLP), 유전자 요법 입자 및 백신을 생산하기 위한 진핵생물 및 미생물 세포 배양 둘 모두는 이제 100e6 세포/㎖ 이상을 달성할 수 있는 세포 성장 기술을 포함한다. 이는 대사성 폐기물을 제거하고 추가 영양소로 배양물을 보급하는 세포 보유 디바이스를 사용하여 달성된다. 세포 보유의 가장 일반적인 수단 중 하나는 교번 접선 유동(ATF)을 사용하여 중공 섬유 여과를 사용하여 생물반응기 배양물을 관류하는 것이다. 상업적 및 개발 규모 공정 둘 모두는 중공 섬유 필터를 통해 ATF를 수행하기 위해 다이어프램 펌프를 제어하는 디바이스를 사용한다(예를 들어, 미국 특허 번호 6,544,424호 참조).
바이러스 벡터의 하류 정제는 종종 배치(batch) 모드로 수행된다. 배치 모드 정제는 생산성 저하, 제품 품질 변동, 높은 장비 풋프린트(footprint) 및 높은 생산 비용을 발생시킬 수 있다. 바이러스 벡터의 다중컬럼 기반 연속 크로마토그래피 정제가 보고되었지만, 이러한 방법은 복잡한 밸브 전환 및 높은 공정 실패 가능성을 포함할 수 있다. 이들 다중-컬럼 기반 방법은 또한 종종 생산 비용을 증가시키는 고가의 수지를 필요로 한다.
침전 기반 정제는 크로마토그래피 정제보다 저렴하다. 상기 정제는 배치 모드에 대해 이전에 보고되었으며, 이는 이전에 언급된 모든 단점을 갖는다.
본 발명의 개시는 바이러스 벡터의 연속 하류 정제를 위한 침전의 용도를 설명한다. 상기 방법은 다중-컬럼 크로마토그래피 공정보다 더 강력하고 저렴하다.
다양한 양태에서, 본 발명의 개시는 일반적으로 바이러스 벡터의 제조 방법, 및 관련 디바이스 및 시스템에 관한 것이다. 본원에서 설명된 것들을 포함하는 본 발명의 개시에 따른 구현예는 특히 바이러스 벡터의 제조 및 정제에 사용되는 공정의 효과 및 효율성을 증가시킬 수 있다.
일 양태에서, 바이러스 벡터의 제조 방법은 바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 중공 섬유 필터의 시스템을 통해 접선 유동 여과 장치의 공급 채널로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 용액은 바이러스 벡터를 침전시키기에 충분하지만 불순물을 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함할 수 있다. 중공 섬유 필터의 시스템으로부터 생성된 잔류액은 재용해될 수 있다. 바이러스 벡터는 접선 유동 여과 후에 투과액으로 통과할 수 있다.
본원에 또는 달리 설명된 다양한 구현예에서, 염은 인산칼슘일 수 있다. 재용해 단계는 EDTA 식염수를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 접선 유동 여과는 교번 접선 유동 여과 또는 접선 유동 심층 여과를 포함할 수 있다. 상기 방법은 용기를 통해 용액을 유동시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, (a) 용기는 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기는 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 한다.
일 양태에서, 바이러스 벡터를 정제하는 방법은 바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 접선 유동 여과 장치의 공급 채널로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 용액은 불순물을 침전시키기에 충분하지만 바이러스 벡터를 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함할 수 있다. 침전된 불순물은 투과액으로 통과하지 않을 수 있는 반면, 바이러스 벡터는 투과액으로 통과할 수 있다.
다양한 구현예에서, 잔류액은 폐기될 수 있다. 염은 4차 암모늄 화합물을 포함할 수 있다. 염은 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 포함할 수 있다. 상기 방법은 용기를 통해 용액을 유동시키는 것을 포함할 수 있으며, 여기서, (a) 용기는 용액에 염을 혼합할 수 있고, (b) 용기는 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 할 수 있다. 용기는 코일형 유동 반전 반응기 또는 교반 탱크 반응기일 수 있다. 접선 유동 여과 장치는 교번 접선 유동(ATF) 여과 또는 접선 유동 심층 여과 장치일 수 있다.
일 양태에서, 바이러스 벡터의 제조 방법은 바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 제1 잔류액 채널 및 제1 투과액 채널을 포함하는 제1 필터를 통해 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 잔류액은 제1 필터의 제1 잔류액 채널로부터 접선 유동 여과 필터의 제2 잔류액 채널로 유동될 수 있다. 잔류액은 제1 필터의 제1 잔류액 채널로부터 재용해될 수 있다. 용액은 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 불순물을 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 접선 유동 필터의 제2 투과액 채널로 통과한다.
다양한 구현예에서, 염은 인산칼슘일 수 있다. 재용해는 잔류액에 EDTA 식염수를 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 접선 유동 필터는 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 심층 필터를 포함할 수 있다. 용액은 용기를 통해 유동될 수 있으며, 여기서, (a) 용기는 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기는 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액은 용기로부터 제1 필터를 향해 유동된다. 제2 필터가 포함될 수 있다. 제2 필터는 제1 잔류액 채널과 유체 연통하는 제3 잔류액 채널을 포함할 수 있다. 제2 필터는 제1 잔류액 채널과 유체 연통하는 제3 투과액 채널을 포함할 수 있다. 제1 혼합기는 제1 잔류액 채널의 상류에 있을 수 있다. 제2 혼합기는 제3 잔류액 채널의 상류에 있을 수 있다. 완충액은 제2 혼합기로 유동될 수 있다. 제1 필터 및 제2 필터는 각각 편평-시트 카세트, 나선형 권취 섬유 필터 또는 중공 섬유 필터를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 바이러스 벡터를 농축하는 방법은 바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 잔류액은 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로부터 접선 유동 필터의 제2 잔류액 채널로 유동될 수 있다. 용액은 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 불순물을 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함할 수 있다. 실질적으로 침전된 불순물은 접선 유동 필터의 제2 잔류액 채널 내에 보유될 수 있다. 바이러스 벡터는 접선 유동 필터의 투과액 채널로 통과될 수 있다.
다양한 구현예에서, 염은 인산칼슘일 수 있다. 잔류액은 EDTA 식염수를 잔류액에 첨가함으로써 제1 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로부터 재용해될 수 있다. 접선 유동 필터는 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 필터를 포함할 수 있다. 용액은 용기를 통해 유동될 수 있으며, 여기서, (a) 용기는 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기는 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액은 용기로부터 중공 섬유 필터를 향해 유동된다.
일 양태에서, 바이러스 벡터를 정제하는 방법은 바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 접선 유동 필터의 공급 채널로 유동시키는 것을 포함할 수 있다. 용액은 불순물을 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함할 수 있다. 실질적으로 침전된 불순물은 접선 유동 필터의 투과액으로 통과하지 않을 수 있다. 바이러스 벡터는 접선 유동 여과 장치의 투과액으로 통과할 수 있다.
다양한 구현예에서, 용액을 유동시키는 것은 컨테이너로부터 폐기물로 실질적으로 침전된 불순물을 포함할 수 있다. 염은 4차 암모늄 화합물을 포함할 수 있다. 염은 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 포함할 수 있다. 용액은 용기를 통해 유동될 수 있으며, 여기서, (a) 용기는 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기는 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액은 용기로부터 컨테이너로 유동된다. 용기는 코일형 유동 반전 반응기 또는 교반 탱크 반응기일 수 있다. 접선 유동 필터는 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 필터일 수 있다.
도 1은 본 발명의 개시의 구현예에 따른 바이러스 벡터를 정제하기 위한 시스템의 개략도이다.
도 2는 본 발명의 개시의 구현예에 따른 바이러스 벡터를 농축하기 위한 시스템의 개략도이다.
도 3은 본 발명의 개시의 구현예에 따른 바이러스 벡터를 연속 정제하고 불순물을 침전시키기 위한 시스템의 개략도이다.
개요
바이러스 벡터의 침전 기반 연속 정제에서, 반응기 및 여과 시스템이 사용된다. 반응기는 연속 교반 탱크 반응기(CSTR) 또는 코일형 코일 반응기(CCR)일 수 있다. 여과 시스템은 교번 접선 유동(ATF) 필터, 접선 유동 필터(TFF) 또는 접선 유동 심층 필터(TFDF)로서 작동될 수 있다. 상기 방법은 (i) 바이러스 벡터를 정제하거나, (ii) 바이러스 벡터를 농축하거나, (iii) 바이러스 벡터 공급물로부터 불순물을 제거하는 데 사용될 수 있다. 예시적 필터는, 예를 들어, TFF 또는 ATF 모드 중 하나 또는 둘 모두에서 작동되는 TFDF 작동에 대해 약 1 kda 내지 약 15 ㎛ 범위의 포어 크기 또는 TFDF 필터에 대해 더 큰 포어 크기를 갖는 중공 섬유 필터를 포함할 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에서, ATF 모드에서 작동하는 TFF는 필터를 따른 잔류액 채널 내의 유동 방향의 변화로 인해 (비-ATF에 비해) 더 적은 오염을 가질 수 있다. 이는 필터 성능을 증가시킬 수 있다. 본원에 설명된 다양한 구현예에서, TFDF는 더 빠른 유량을 허용할 수 있지만, 이는 TFF 또는 ATF보다 더 낮은 여과 용량을 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 용액이 혼합되고 생성된 물질은 중력, 유도 압력(예를 들어, 자기 부상, 연동 또는 다이어프램/피스톤 펌프) 또는 다른 힘을 통해 시스템을 통해 유동한다. 물질은 존재하는 생성물 또는 불순물의 침전 동역학에 의존하는 속도로 시스템을 통해 이동한다. 물질이 ATF, TFF, TFDF 등을 함유하는 여과 시스템에 도달하면, 압력 시스템이 여과 시스템을 통해 물질을 밀어낸다. 일부 구현예에서, 압력 시스템은 다이어프램 펌프를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 가능한 불순물은 숙주 세포 단백질 및 공급 배지에 사용되는 영양소로 구성될 수 있다.
특정 구현예에서, 시스템은 반응기, 예를 들어, 코일형 코일 반응기, 즉, 코일형 유동 반전 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기를 함유한다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 코일형 유동 반전 반응기가 방사형 혼합을 향상시켜 좁은 체류 시간 분포를 생성하는 작용을 하는 것으로 생각된다. 코일형 코일 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기의 사용은 침전 동역학에 좌우될 수 있다. 일부 구현예에서, 혼합된 물질은 불순물을 제거하기 위해 일련의 정적 혼합기 및 중공 섬유 필터로 유동할 것이다. 막 포어 크기는 다양할 수 있으며, 시스템에 존재하는 바이러스 벡터 및 침전물의 크기에 좌우될 수 있다. 물질이 일련의 정적 혼합기 및 중공 섬유 필터를 통해 유동하는 동안 폐기물이 시스템에서 제거되고 완충액이 추가된다. 상기 시스템의 생성된 잔류액은 침전물을 함유하며, 이는 여과 시스템을 통해 유동하기 전에 재용해된다. 여과 시스템의 일부는 ATF, TFF 또는 TFDF 작업을 포함할 수 있고, 중공 섬유, 편평 시트 카세트 필터 또는 나선형 권취 섬유 필터를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 시스템은 반응기, 예를 들어, 코일형 코일 반응기, 즉, 코일형 유동 반전 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기를 함유한다. 바이러스 벡터는 상기 반응기에서 침전되고, 생성된 혼합물은 중공 섬유 필터를 통해 유동하였다. 생성된 잔류액은 침전물을 함유하고, 여과 시스템을 통해 유동되도록 재용해될 수 있다. 여과 시스템의 일부는 ATF, TFF 또는 TFDF 작업을 포함할 수 있고, 중공 섬유, 편평 시트 카세트 필터 또는 나선형 권취 섬유 필터를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 시스템은 반응기, 예를 들어, 코일형 코일 반응기, 즉, 코일형 유동 반전 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기를 함유한다. 불순물을 함유하는 용액은 상기 반응기에서 혼합되어 불순물을 침전시킨다. 생성된 혼합물은 시스템으로부터 제거된 침전된 불순물을 가지며, 생성된 용액은 여과 시스템을 통해 유동하였다. 여과 시스템의 일부는 ATF, TFF 또는 TFDF 작업을 포함할 수 있고, 중공 섬유, 편평 시트 카세트 필터 또는 나선형 권취 섬유 필터를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 시스템은 단백질, 나노입자 및 바이러스(예를 들어, AAV, 렌티바이러스; 바이러스-유사 입자, 미세입자, 미세담체, 미세구, 나노입자 등)에 사용된다.
특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 침전된다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 바이러스 벡터를 침전시키는 것은 여과를 통해 용액으로부터 바이러스 벡터를 제거하는 것을 허용하는 것으로 생각되며, 침전된 바이러스 벡터는 잔류액 내에 존재한다. 상기 방법은 바이러스 벡터의 정제, 바이러스 벡터의 농축 또는 유사한 공정에 사용된다.
일부 구현예에서, 불순물은 침전된다. 이후, 침전된 불순물은 혼합물로부터 제거되고, 생성된 용액은 여과 시스템을 통해 유동하였다.
일부 구현예에서, 불순한 바이러스 벡터는 생물반응기, 특히 코일형 코일 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기 내에서 침전제(즉, 인산칼슘, 황산암모늄)와 혼합된다. 침전제는 특히 바이러스 벡터를 침전시킨다. 용액은 일련의 정적 혼합기 및 중공 섬유 필터를 통해 유동된다. 임의의 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 시리즈는 바이러스 벡터의 침전 및 시스템으로부터 상기 바이러스 벡터의 제거 둘 모두를 증가시키기 위해 사용된다. 침전물을 함유하는 잔류액은 필터로부터 수집되고, 바이러스 벡터를 재용해시키기 위해 용액(즉, 0.1 M EDTA 식염수)이 첨가된다. 재용해된 용액은 순수한 바이러스 벡터를 생성하기 위해 여과된다.
일부 구현예에서, 희석된 바이러스 벡터는 반응기, 특히 코일형 코일 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기 내에서 침전제(즉, 인산칼슘)와 혼합된다. 침전제는 특히 바이러스 벡터를 침전시킨다. 용액은 중공 섬유 필터를 통해 유동된다. 생성된 잔류액은 침전된 바이러스 벡터를 함유하고, 생성된 투과액은 폐기물로서 제거된다. 침전물은 재용해되고, 여과되어, 농축된 바이러스 벡터를 생성한다.
특정 구현예에서, 불순한 바이러스 벡터는 반응기, 특히 코일형 코일 반응기 또는 연속 교반 탱크 반응기 내에서 침전제(즉, 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드(CTAB), 도미펜 브로마이드 등)와 혼합된다. 침전제는 특히 용액 내의 불순물을 침전시킨다. 혼합 후, 불순물은 혼합물로부터 제거되고, 여기서 바이러스 벡터를 함유하는 용액은 여과되어 정제된 생성물을 생성한다.
특정 구현예에서, 미량의 불순물을 제거하기 위해 추가 하류 처리가 필요할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포 배양액은 설명된 시스템에서 사용하기 전에 정화되어야 한다. 연속 정화 시스템에 연결된 경우, 상류 생물반응기는 설명된 시스템에 직접 통합될 수 있다.
도 1은 바이러스 벡터를 제조하고 정제하기 위한 예시적 시스템을 예시한다. 시스템(100)은 반응기(106), 예를 들어, 코일형 코일 반응기를 포함하며, 이는 제1 및 제2 혼합기(108, 109) 및 제1 및 제2 중공 섬유 필터(110, 111)의 시스템에 연결된다(예를 들어, 중공 섬유 및 혼합기의 직렬 조합은 ATF 또는 TFF에서 작동될 수 있는 "스테이지"로 지칭될 수 있다). 2개의 스테이지가 예시되지만, 임의의 수의 스테이지(예를 들어, 0개, 1개, 2개, 3개, 4개, 10개 등)가 사용될 수 있다. 사용될 스테이지의 수는 수율 요구사항에 좌우될 것이다. 스테이지 수의 증가는 생성물 수율을 증가시키지만, 이는 또한 시스템 비용을 증가시킨다. 불순한 바이러스 벡터(102) 및 염(104)(예를 들어, 인산칼슘, 황산암모늄, 또 다른 침전제 등)이 반응기(106)에 첨가되어 시스템(100)을 통해 유동하기 위한 용액을 형성하고/하거나 이에 혼합된다. 용액은 반응기(106)로부터 제1 중공 섬유 필터(110)의 상류에 위치한 제1 혼합기(108)로 유동할 수 있다. 제1 혼합기(108)는 용액을 하류 투과액과 혼합하도록 구성된다(하기 논의되는 바와 같음). 제1 혼합기(108)의 생성물은 제1 중공 섬유 필터(110) 내로 유동할 수 있다. 제1 중공 섬유(110)는 일부 불순물을 제1 투과액 채널(116)을 통해 폐기물로 여과시킨다. 제1 중공 섬유 필터(110)의 제1 잔류액 채널은 제2 중공 섬유 필터(111)의 상류에 위치된 제2 혼합기(109)와 유체 연통한다. 제2 혼합기(109)는 제2 혼합기(109)에 첨가되는 바이러스 벡터를 침전시키는 것을 돕기 위해 제1 잔류액 채널로부터의 잔류액을 완충액(118)과 혼합하도록 구성된다. 제2 혼합기(109)의 생성물은 제2 중공 섬유 필터(111) 내로 유동할 수 있다. 제2 중공 섬유 필터(111)는 제2 투과액 채널(117)을 통해 일부 불순물(예를 들어, 바람직하지 않은 종) 및 침전되지 않은 바이러스 벡터를 여과시키며, 이는 상기 언급된 바와 같이 추가 처리를 위해 제1 혼합기(108)로 유동할 수 있다. 다양한 구현예에서, 필터의 포어 크기는 침전물 및 생성물의 입자 크기에 좌우될 수 있다. 입구 공급 유량에 대한 완충액 유량의 비율은 원하는 생성물 수율에 좌우될 수 있다. 입구 공급 유량에 대한 완충액 유량의 비율을 증가시키는 것은 생성물 수율을 증가시킬 수 있지만, 추가 완충액을 필요로 할 수 있고, 생성물을 희석시킬 수 있다. 제2 중공 섬유 필터(111)의 제2 잔류액 채널은 제2 잔류액 채널의 생성물이 컨테이너(112) 내로 유동할 수 있도록 컨테이너(112)와 유체 연통한다. 침전된 바이러스 벡터를 함유하는 컨테이너(112)는 식염수(120)(예를 들어, 약 0.1 M EDTA 식염수 등)를 첨가함으로써 용액으로 실질적으로 재용해될 수 있다. 컨테이너(112) 내의 재용해된 용액은 제3 필터(114)(예를 들어, ATF, TFF, TFDF 작동의 필터)를 통해 유동할 수 있다. 제3 필터(114)는 제3 투과액 채널(122)을 통해 실질적으로 정제된 바이러스 벡터를 여과시킨다.
도 2는 바이러스 벡터를 농축하기 위한 예시적 시스템을 예시한다. 시스템(200)은 반응기(206), 예를 들어, 중공 섬유 필터(208)에 연결되는 코일형 코일 반응기를 포함한다. 하나의 중공 섬유 필터(208)가 예시되어 있지만, 임의의 수의 필터(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 10개 등)가 사용될 수 있다. 희석된 바이러스 벡터(202) 및 염(204)(예를 들어, 인산칼슘, 황산암모늄, 또 다른 침전제 등)이 반응기(206)에 첨가되어 시스템(200)을 통해 유동하기 위한 용액을 형성하고/하거나 이에 혼합된다. 용액은 반응기(206)로부터 중공 섬유 필터(208)로 유동할 수 있다. 중공 섬유 필터(208)는 투과액 채널(214)을 통해 일부 불순물 및 침전되지 않은 바이러스 벡터(예를 들어, 바람직하지 않은 종)를 여과시키며, 이는 폐기물로 유동할 수 있다. 중공 섬유 필터(208)의 제1 잔류액 채널은 실질적으로 침전된 바이러스 벡터가 제1 잔류액 채널로부터 컨테이너(210)로 유동할 수 있도록 컨테이너(210)와 유체 연통한다. 침전된 바이러스 벡터를 함유하는 컨테이너(210)는 식염수(220)(예를 들어, 약 0.1 M EDTA 식염수 등)를 첨가함으로써 용액으로 재용해될 수 있다. 컨테이너(210) 내의 재용해된 용액은 접선 필터(212)(예를 들어, ATF 모드, TFF 모드, TFDF 모드 등에서 작동됨)를 통해 유동할 수 있다. 접선 필터(212)는 제2 투과액 채널(222)을 통해 실질적으로 농축된 바이러스 벡터를 여과시킨다. 접선 필터(212)는 접선 필터(212)의 잔류액이 컨테이너(210)와 접선 필터(212) 사이의 유동을 왕복할 수 있기 때문에 컨테이너(210)에 추가 유체를 첨가하지 않고 제2 투과액 채널(222)을 통해 농축된 바이러스 벡터를 생성하도록 연속적으로 작동할 수 있다. 이러한 방식으로, 접선 필터(212)는 추가 처리 단계 및/또는 장비 없이 제2 투과액 채널(222)로부터 생성된 농축된 바이러스 벡터를 계속 증폭할 수 있다.
도 3은 용액 내의 불순물을 침전시키고 용액의 바이러스 벡터를 정제하기 위한 예시적 시스템을 예시한다. 시스템(300)은 반응기(306), 예를 들어, 코일형 코일 반응기를 포함한다. 중공 섬유 필터(본원에 설명된 바와 같음)가 예시되지 않았지만, 임의의 수(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 8개, 10개, 15개, 20개, 50개, 100개 등)의 필터가 반응기(306)와 함께 인-라인(in-line)으로 사용될 수 있다. 불순한 바이러스 벡터(302)(예를 들어, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터) 및 염(304)(예를 들어, CTAB, 도미펜 브로마이드, 또 다른 침전제 등)이 반응기(306)에 첨가되어 시스템(300)을 통해 유동시키기 위한 용액을 형성하고/하거나 이에 혼합된다. 용액의 불순물(예를 들어, 바람직하지 않은 물질)은 반응기(306) 내에서 실질적으로 침전되고, 혼합된 용액은 반응기(306)로부터 컨테이너(308)로 유동할 수 있다. 침전된 불순물을 함유하는 컨테이너(308)는 접선 필터(310)(예를 들어, ATF, TFF, TFDF 등)를 통해 유동할 수 있다. 접선 필터(310)는 투과액 채널(322)을 통해 실질적으로 정제된 바이러스 벡터를 여과시킨다. 침전된 불순물은 접선 필터(310)의 잔류액 채널 내에 보유되고, 유지되거나, 컨테이너(308)로 반환된다. 컨테이너(308)는 컨테이너(308)로부터 침전된 불순물을 수용(예를 들어, "블리드(bleed)")하기 위한 폐기물 채널(324)을 포함한다. 폐기물 채널(324)은 펌프, 중력, 계량 밸브, 시차 밸브(timed valve), 수동 밸브, 개방 유동 경로, 제한된 유동 경로, 필터, 이들의 조합 등을 사용하여 유동될 수 있다. 접선 필터(310)는 접선 필터(310)의 잔류액이 컨테이너(308)와 접선 필터(310) 사이의 유동을 왕복할 수 있기 때문에 투과액 채널(322)을 통해 정제된 바이러스 벡터를 생성하도록 연속적으로 작동할 수 있다. 침전된 불순물이 반응기(306)로부터 컨테이너(308)로 유동할 때, 침전된 불순물은 컨테이너(308)로부터 폐기물 채널(324)로 추가로 유동된다. 따라서, 필터(310)가 과중되지 않고, 여과할 유체가 부족하지 않고, 실질적으로 일관된 질량 유량을 유지하도록 실질적으로 일정한 부피의 유체가 컨테이너(308)에 유지될 수 있다. 반응기(306)로부터 컨테이너(308)로의 유량, 침전된 불순물의 폐기물 채널(324)로의 유량, 및 컨테이너(308)로부터 필터(310)의 잔류액으로의 유체의 유량의 비율은 투과액 채널(322)을 통해 정제된 바이러스 벡터를 생성하는 시스템(300)의 연속 작동이 추가 처리 단계 및/또는 장비 없이 유지되도록 배열될 수 있다.
결론
상기 개시는 본 발명의 개시에 따른 여과 시스템의 여러 예시적인 구현예를 제시하였다. 이들 구현예는 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 개시의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 상기 설명된 시스템 및 방법에 대해 다양한 첨가 또는 변형이 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다. 추가로, 전술한 개시는 주로 교번 접선 유동 여과 시스템 및 이들의 적용에 초점을 맞추었지만, 본 발명의 개시의 원리는 중공 섬유 TFF 및 TFDF 및 기타 여과 시스템을 포함하는 다른 시스템에 적용될 수 있음이 당업자에 의해 인식될 것이다.

Claims (20)

  1. 바이러스 벡터의 제조 방법으로서,
    바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 제1 잔류액 채널 및 제1 투과액 채널을 포함하는 제1 필터를 통해 유동시키는 단계;
    잔류액을 제1 필터의 제1 잔류액 채널로부터 접선 유동 여과 필터의 제2 잔류액 채널로 유동시키는 단계; 및
    제1 필터의 제1 잔류액 채널로부터 잔류액을 재용해시키는 단계를 포함하며,
    용액이 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 불순물을 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함하고,
    바이러스 벡터가 접선 유동 필터의 제2 투과액 채널로 통과하는,
    방법.
  2. 제1항에 있어서, 염이 인산칼슘인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 재용해가 잔류액에 EDTA 식염수를 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 접선 유동 필터가 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 심층 필터를 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 용기를 통해 용액을 유동시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 (a) 용기가 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기가 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액이 용기로부터 제1 필터를 향해 유동되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 제2 필터를 추가로 포함하며, 제2 필터가 제1 잔류액 채널과 유체 연통하는 제3 잔류액 채널을 포함하고, 제2 필터가 제1 잔류액 채널과 유체 연통하는 제3 투과액 채널을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 제1 잔류액 채널의 상류에 있는 제1 혼합기 및 제3 잔류액 채널의 상류에 있는 제2 혼합기를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서, 제1 필터 및 제2 필터 각각이 편평-시트 카세트, 나선형 권취 섬유 필터 또는 중공 섬유 필터를 포함하는, 방법.
  9. 바이러스 벡터를 농축하는 방법으로서,
    바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로 유동시키는 단계; 및
    잔류액을 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로부터 접선 유동 필터의 제2 잔류액 채널로 유동시키는 단계를 포함하며,
    용액이 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 불순물을 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함하고,
    실질적으로 침전된 불순물이 접선 유동 필터의 제2 잔류액 채널 내에 보유되고;
    바이러스 벡터가 접선 유동 필터의 투과액 채널로 통과하는,
    방법.
  10. 제9항에 있어서, 염이 인산칼슘인, 방법.
  11. 제9항에 있어서, EDTA 식염수를 잔류액에 첨가함으로써 제1 중공 섬유 필터의 제1 잔류액 채널로부터 잔류액을 재용해시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제9항에 있어서, 접선 유동 필터가 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 필터를 포함하는, 방법.
  13. 제9항에 있어서, 용기를 통해 용액을 유동시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 (a) 용기가 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기가 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액이 용기로부터 중공 섬유 필터를 향해 유동되는, 방법.
  14. 바이러스 벡터를 정제하는 방법으로서,
    바이러스 벡터 및 불순물을 포함하는 용액을 접선 유동 필터의 공급 채널로 유동시키는 단계를 포함하며,
    용액이 불순물을 실질적으로 침전시키기에 충분하지만 바이러스 벡터를 실질적으로 침전시키기에는 충분하지 않은 양의 염을 포함하고;
    실질적으로 침전된 불순물이 접선 유동 필터의 투과액으로 통과하지 않고,
    바이러스 벡터가 접선 유동 여과 장치의 투과액으로 통과하는,
    방법.
  15. 제14항에 있어서, 컨테이너로부터 폐기물로 실질적으로 침전된 불순물을 포함하는 용액을 유동시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  16. 제14항에 있어서, 염이 4차 암모늄 화합물을 포함하는, 방법.
  17. 제14항에 있어서, 염이 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 포함하는, 방법.
  18. 제14항에 있어서, 용기를 통해 용액을 유동시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 (a) 용기가 용액에 염을 혼합하고, (b) 용기가 체류 시간의 좁은 분포를 특징으로 하고, (c) 용액이 용기로부터 컨테이너로 유동되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 용기가 코일형 유동 반전 반응기 또는 교반 탱크 반응기인, 방법.
  20. 제14항에 있어서, 접선 유동 필터가 교번 접선 유동(ATF) 필터 또는 접선 유동 필터인, 방법.
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