CN111166873B - 重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺、疫苗原液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺、疫苗原液及其制备方法，所述粗纯工艺包括以下步骤：取1体积份表达重组CA16疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎液，在搅拌条件下，加入终浓度为30g/L‑300g/L的硫酸氨溶液混合均匀；加入终浓度为2％‑10％的PEG6000溶液，搅拌均匀后，静置至沉淀沉降完全；吸取上清液，经超滤浓缩、清洗和过滤后，得到粗纯的重组CA16疫苗抗原。本发明实施例操作简便，澄清效果好，去杂质率高，可专一性去除杂质，而且具有较高的回收率，且工艺稳定性好，安全性高，密闭操作无污染等效果。
Description
技术领域
本发明涉及重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗制备技术，尤其涉及一种重组手足口病疫苗抗原的粗纯工艺、疫苗原液及其制备方法。
背景技术
手足口病(HFMD)是世界范围流行的儿童常见传染病。由多种人类肠道病毒(humanenterovirus，HEV)引起，现阶段主要以柯萨奇病毒A6型(CA6)、柯萨奇病毒A16型(CA16)、柯萨奇病毒A10型(CA10)、肠道病毒71型(EV71)等为主。其中，CA16是导致手足口病发生的最主要病毒之一，CA16疫苗的开发有利于预防手足口病。
重组汉逊酵母基因工程菌具有易培养、目的产物产量高、生产成本低、适合于工业化大生产等特点。
然而，发明人在实施本发明的过程中发现，利用重组汉逊酵母表达的重组CA16疫苗抗原虽然产量高、成本低，但由于酵母菌存在大量的异于人缘的杂质，目标蛋白的纯化是一个较大的难题，特别是在粗纯工艺阶段杂质较多。传统的离心、微滤、硫酸铵/PEG沉淀方法都存在不同的缺陷，离心工艺操作量大，微滤成本高且批处理量较小，而硫酸铵/PEG沉淀只能无差别沉淀，沉淀后去杂率和回收率均不理想。
发明内容
本发明所解决的技术问题是，提供一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺，该粗纯工艺操作简便，澄清效果好，去杂质率高，可专一性去除杂质，而且具有较高的回收率，且工艺稳定性好，安全性高，密闭操作无污染等效果。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺，包括以下步骤：
取1体积份表达重组CA16疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎液，在搅拌条件下，加入终浓度为30g/L-300g/L的硫酸氨溶液混合均匀；
加入终浓度为2％-10％的PEG6000溶液，搅拌均匀后，静置至沉淀沉降完全；
吸取上清液，经超滤浓缩、清洗和过滤后，得到粗纯的重组CA16疫苗抗原。
在一些可能的实施方式中，加入所述PEG6000溶液的终浓度为4％-8％。
在一些可能的实施方式中，加入所述PEG6000溶液的终浓度为5％-6％。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为60g/L-250g/L。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为90g/L-200g/L。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为120g/L-150g/L。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎液通过以下步骤制得：
将重组汉逊酵母基因工程菌工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌体后，经高压匀浆器破碎酵母菌，得到所述细胞破碎液。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原原液的制备方法，包括以下步骤：
将上述粗纯工艺得到的重组CA16疫苗抗原进行精纯后，用磷酸盐缓冲液稀释蛋白浓度，经除菌过滤，即制得所述重组CA16疫苗抗原原液。
在一些可能的实施方式中，所述精纯包括疏水层析、凝胶排阻层析。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原原液，采用上述抗原原液的制备方法制备。
本发明的有益效果是：
本发明的实施例通过先在细胞破碎液中加入硫酸铵溶液使蛋白发生聚集(未必发生聚沉)，然后控制加入PEG6000的终浓度大小来控制溶解的PEG6000交联的孔径(根据聚集颗粒的大小)来排阻聚集的杂质使之发生沉降，浓度越高交联孔径越小。可以通过调节聚集颗粒的种类和排阻孔径来高选择性的去除不同的杂质。从而达到了操作简便，澄清效果好，去杂质率高，可专一性去除杂质，而且具有较高的回收率，且工艺稳定性好，安全性高，密闭操作无污染等效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明提供的重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺一个实施例的纯化效果示意图。
图2是采用本发明的重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺一个实施例所得到的重组CA16疫苗抗原原液电泳图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
本发明实施例公开了一种重组汉逊酵母表达的重组CA16疫苗抗原的粗纯工艺，包括以下步骤：
取1体积份表达重组CA16疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎液，在搅拌条件下，加入终浓度为30g/L-300g/L的硫酸氨溶液混合均匀；
加入终浓度为2％-10％的PEG6000溶液，搅拌均匀后，静置至沉淀沉降完全；
吸取上清液，经超滤浓缩、清洗和过滤后，得到粗纯的重组CA16疫苗抗原。
在一些可能的实施方式中，加入所述PEG6000溶液的终浓度为4％-8％。
在一些可能的实施方式中，加入所述PEG6000溶液的终浓度为5％-6％。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为60g/L-250g/L。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为90g/L-200g/L。
在一些可能的实施方式中，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为120g/L-150g/L。
在一些可能的实施方式中，所述细胞破碎液通过以下步骤制得：
将重组汉逊酵母基因工程菌工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌体后，经高压匀浆器破碎酵母菌，得到所述细胞破碎液。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的重组CA16疫苗抗原原液的制备方法，包括以下步骤：
将上述粗纯工艺得到的重组CA16疫苗抗原进行精纯后，用磷酸盐缓冲液稀释蛋白浓度，经除菌过滤，即制得所述重组CA16疫苗抗原原液。
在一些可能的实施方式中，所述精纯包括疏水层析法纯化、凝胶排阻层析法纯化。
相应地，本发明还公开了一种重组汉逊酵母表达的重组CA16疫苗抗原原液，采用上述抗原原液的制备方法制备。
与现有技术相比，本发明提供的一种澄清重组CA16疫苗抗原的方法至少具有下列优点：
1、批处理量大适用于工业化生产，将“细胞破碎液”加入罐中只需按发明要求加入对应溶液搅拌后静置沉降后，吸取上清液即可达到纯化分离的目的。
2、节约劳动力和时间，相比于硫酸铵沉淀工艺无需大规模的离心操作且所用时间一天内即可完成纯化操作。
3、节约成本，所用PEG6000和硫酸铵物料均低价易得、无毒、无害，且无需使用大量离心机节约设备成本。
4、澄清效果好，去杂质率高，可专一性去除杂质，而且具有较高的回收率，且工艺稳定性好，安全性高，密闭操作无污染；相比于现有技术的硫酸铵沉淀工艺需要将目标蛋白沉降为固体，本发明实施例的工艺过程中，目标蛋白始终处于液相中无相变过程，且纯化后的澄清度和杂蛋白去除率明显高于现有技术的硫酸铵沉淀工艺。
以本发明提供的上述粗纯工艺来澄清重组CA16疫苗抗原，其粗提纯的产品经过后续工艺的精提纯，能得到纯度99％以上的重组CA16疫苗抗原原液。
下列实施例旨在进一步举例更具体的描述说明本发明。
实施例1：PEG6000-硫酸铵体系澄清工艺
“发酵产物”的制备
将重组汉逊酵母基因工程菌工作种子批菌种经0.25L锥形瓶29-31℃摇瓶培养17-19小时、2L锥形瓶29-31℃摇瓶培养17-19小时、30L种子罐29-31℃发酵培养16-22小时、200L生产罐29-31℃发酵培养64-88小时，收获酵母菌体即得“发酵产物”。
“粗纯产物”的制备
取9份体积的“细胞破碎液”进行正交实验，边搅拌边加入硫酸铵液至终浓度为60g/L混合均匀，再加入PEG6000溶液至终浓度为4％搅拌均匀后静置，直至沉淀沉降完全后吸取上清液经超滤浓缩、清洗和过滤后即为“粗纯产物”。
实施例2
与实施例1的区别仅在于，边搅拌边加入硫酸铵液的终浓度为150g/L；加入PEG6000溶液的终浓度为6％。
实施例3
与实施例1的区别仅在于，边搅拌边加入硫酸铵液的终浓度为250g/L；加入PEG6000溶液的终浓度为8％。
试验结果如下：
表1：粗纯工艺蛋白去除率检测结果
表2：粗纯工艺抗原回收率检测结果
从表1和表2可以看出，PEG6000-硫酸铵体系的正交结果可以看出随着PEG6000和硫酸铵浓度增加杂蛋白去除率明显上升，最高达到97％。
从图1可以看出，PEG6000-硫酸铵体系澄清工艺纯化后的粗纯产物澄清透明，杂质明显较少。
实施例4：重组CA16疫苗抗原原液的制备
将150g/L硫酸铵和6％PEG6000所制备的粗纯产物，经疏水层析和分子筛层析后，用磷酸盐缓冲液稀释，除菌过滤后即为重组CA16疫苗抗原原液。
试验结果如下：
表3：重组CA16疫苗抗原原液检测结果
| 实验批号 | 抗原回收率(％) | HPLC纯度(％) |
| 190803 | 62 | 100 |
| 190804 | 58 | 100 |
| 190805 | 61 | 100 |
从所制备的重组CA16疫苗抗原原液检测结果和电泳图(参考图2)可以看出，所制备的原液回收率较高且纯度达到100％，达到预期目标，符合质量标准。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原的粗纯工艺，其特征在于，包括以下步骤：
取1体积份表达重组CA16疫苗抗原的重组汉逊酵母细胞破碎液，在搅拌条件下，加入硫酸氨溶液至其终浓度为60g/L-250g/L混合均匀，使蛋白发生聚集；
加入终浓度为4%-8%的PEG6000溶液，搅拌均匀后，静置至沉淀沉降完全；
吸取上清液，经超滤浓缩、清洗和过滤后，得到粗纯化的重组CA16疫苗抗原；
其中，所述细胞破碎液通过以下步骤制得：
将重组汉逊酵母基因工程菌工作种子批菌种经锥形瓶、种子罐、生产罐进行发酵培养，收获酵母菌体后，经高压匀浆器破碎酵母菌，得到所述细胞破碎液。
2.如权利要求1所述的工艺，其特征在于，加入所述PEG6000溶液的终浓度为5%-6%。
3.如权利要求1或2中任一项所述的工艺，其特征在于，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为90g/L-200g/L。
4.如权利要求1或2所述的工艺，其特征在于，加入所述硫酸铵溶液的终浓度为120g/L-150g/L。
5.一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原原液的制备方法，其特征在于，将包括如权利要求1-4中任一项所述的粗纯工艺得到的重组CA16疫苗抗原进行精纯后，用磷酸盐缓冲液稀释100～300ug/ml经除菌过滤后，即制得所述重组CA16疫苗抗原原液。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述精纯包括疏水层析和凝胶排阻层析。
7.一种重组汉逊酵母表达的手足口病疫苗抗原原液，其特征在于，采用如权利要求5或6所述的方法制备。
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