CN110923280A - 河豚毒素制备及其纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种河豚毒素制备及其纯化方法。其中，所述方法包括：通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液；对所述发酵液进行固液分离处理；过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液；重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液；真空蒸发所述初浓缩液，获得终浓缩液；在真空环境下，干燥所述终浓缩液以获得所述河豚毒素。该制备方法的工艺简单，生产原料来源广泛，可以有效的解决传统河豚毒素生产方式所存在的原料来源不足、工艺复杂、成本高以及得率低等的问题。

Description

河豚毒素制备及其纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种河豚毒素制备及其纯化方法。

背景技术

河豚毒素(TTX)虽然是一种毒性很强的生物活性物质，但是其同时具有广泛的医用价值，如降血压、抗心律失常、缓解痉挛、镇痛、麻醉等多种疗效。特别值得指出的是，TTX在用于抑制癌症和解毒时，具有用量少、持效时间长且用后不成瘾的优点，有很大的潜在开发利用价值。

目前，国内外所用的TTX主要是从河豚鱼内脏中提取的，该方法步骤繁琐、得率低、产品纯度不高，而且要消耗大量的河豚鱼资源，破坏生态系统。

还有一些利用化学法人工合成的河豚毒素。但是由于化学法合成步骤较多、合成难度太大，目前尚无实际应用价值。

在实现本发明过程中，发明人发现相关技术存在以下问题：现有的河豚毒素制备方法由于成本较高，制备方式繁琐等因素，严重制约了河豚毒素的产量，使得河豚毒素在市场上供不应求，价格极高，影响了河豚毒素的推广应用和研究。

发明内容

针对上述技术问题，本发明实施例提供了一种河豚毒素制备及其纯化方法，以解决现有河豚毒素制备方法成本高、制备步骤繁琐，产量受限的问题。

本发明实施例的第一方面提供一种河豚毒素的制备方法。其中，所述制备方法包括：

通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液；对所述发酵液进行固液分离处理；过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液；重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液；真空蒸发所述初浓缩液，获得终浓缩液；在真空环境下，干燥所述终浓缩液以获得所述河豚毒素。

可选地，所述通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液包括：

将所述产河豚毒素菌种接种到种子培养基中，制备获得种子液；依次通过一级发酵罐、二级发酵罐和三级发酵罐分别进行第一级发酵、第二级发酵和第三级发酵；在第三级发酵完毕后，从所述三级发酵罐输出所述发酵液。

可选地，所述第一级发酵的时间为24-28小时，所述第二级发酵的时间为 28-32小时，所述第三级发酵的时间为36-40小时。

可选地，所述对所述发酵液进行固液分离处理，具体包括：将所述发酵液放入离心机中，以设定的离心力进行离心。

可选地，所述过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液，具体包括：依次使用微滤膜和超滤膜对所述上清液进行过滤，获得所述滤液。

可选地，所述微滤膜的孔径为0.1-0.2微米；所述超滤膜的截流分子量为 1000-2000。

可选地，所述重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液，具体包括：

S1、通过纳滤膜浓缩所述滤液；

S2、向所述浓缩后的滤液加入纯水进行稀释；

重复执行所述步骤S1和S2若干次，直至所述初浓缩液的导电率低于设定值。

可选地，重复执行3-5次所述步骤S1和步骤S2，直至所述初浓缩液的导电率低于10μS/cm。

可选地，所述纳滤膜的截留分子量为200-250；所述纯水的导电率低于 0.1μS/cm。

本发明实施例的第二方面提供了一种河豚毒素。其中，所述河豚毒素由如上所述的河豚毒素的制备方法制备获得。

本发明实施例提供的技术方案中，通过微生物发酵的方式产生和制备河豚毒素，可以大批量的生产河豚毒素。该制备方法的工艺简单，生产原料来源广泛，可以有效的解决传统河豚毒素生产方式所存在的原料来源不足、工艺复杂、成本高以及得率低等的问题。

附图说明

图1为本发明实施例的河豚毒素制备及纯化方法的一个实施例示意图；

图2为本发明另一实施例的河豚毒素制备及纯化方法的一个实施例流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本说明书中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是用于限制本发明。本说明书所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。

图1为本发明实施例提供的河豚毒素制备及纯化方法的示意图。该河豚毒素制备方法以微生物发酵法为基础，结合合理的纯化方式，可以大批量的制备或者生产河豚毒素，有利于克服现有河豚毒素生产过程中存在的多种问题。

如图1所示，所述制备及纯化方法包括如下步骤：

S100、通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液。

多级发酵系统可以由多个不同容积的发酵设备(如发酵罐)串接后形成，用于实现逐级扩大发酵，生产满足大量的发酵液。需要进行发酵的目标菌种可以在多级发酵系统中逐级扩大发酵规模从而制备得到所需要的发酵液。

在本实施例中，需要进行发酵的目标菌种为产河豚毒素菌种。该产河豚毒素菌种具体可以是通过基因工程等方式获得的，具有表达分泌河豚毒素能力的微生物。

具体可以根据实际情况的需要选择使用合适的产河豚毒素菌种，在此不作限定。现有也提出了许多可以分泌表达河豚毒素的微生物。通过多级发酵系统对这些微生物进行扩大培养，从而获得富含河豚毒素的发酵液。

在一些实施例中，所述多级发酵系统具体可以选用三级发酵系统，制备发酵液的过程具体包括如下步骤：

首先，将所述产河豚毒素菌种接种到种子培养基中，制备获得种子液。然后，依次通过一级发酵罐、二级发酵罐和三级发酵罐分别进行第一级发酵、第二级发酵和第三级发酵，逐级扩大发酵规模。最后，在第三级发酵完毕后，从所述三级发酵罐输出所述发酵液。

具体的，所述第一级发酵的时间为24-28小时，所述第二级发酵的时间为 28-32小时，所述第三级发酵的时间为36-40小时。通过对多级发酵时间的合理控制，可以达到最佳的发酵效果。

S200、对所述发酵液进行固液分离处理。

固液分离处理可以将发酵液中的微生物细胞与一些固体杂质去除。在采用分泌表达体系时，河豚毒素存在于发酵液固液分离后的上清液中。

具体可以通过离心的方式完成发酵液的固液分离处理，将发酵液输入到离心机中，以设定的离心力对发酵液进行离心后即可完成固液分离的处理，将发酵液分为上清和沉淀。

S300、过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液。

固液分离只是一个粗分离过程，只有重量显著较高的部分会积累在沉淀中。而上清液中还含有许多的杂质(如细胞碎片、颗粒物或者其他的大分子蛋白质)。由此，需要通过进一步的过来进行纯化。

在一些实施例中，可以依次使用微滤膜和超滤膜对所述上清液进行过滤，获得所述滤液。

其中，所述微滤膜的孔径可以控制在0.1-0.2微米；所述超滤膜的截流分子量为1000-2000。通过微滤膜可以过滤去除上清液中的细胞碎片和颗粒物。而截流分子量更小的超滤膜可以用于滤除上清液中的其他蛋白质等的大分子杂质。

S400、重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液。

河豚毒素在所述滤液中的丰度仍然是比较有限的，直接进行干燥或者提取处理会对设备造成较大的压力，而且滤液中存在各种盐或者电解质也会对最终的河豚毒素产品造成不利的影响。

由此，可以通过浓缩和稀释的方式，实现对滤液的浓缩和脱盐，以便于后续的进一步处理。浓缩和稀释的操作可以根据实际情况重复多次，直至达到所需要的设计目标。较佳的是，可以将重复次数控制在3-5次可以取得最佳的效果，更多的次数无法产生具有显著区别的脱盐效果，更少的次数无法达到正常的脱盐要求。

在一些实施例中，可以通过纳滤膜浓缩所述滤液，并且通过向所述浓缩后的滤液加入纯水进行稀释。浓缩和稀释停止重复执行的标准为初浓缩液的导电率。需要重复执行至初浓缩液的导电率低于设定值，以确定其符合脱盐的要求。

该设定值具体可以根据实际情况的需要而进行调整或者设置。在较佳实施例中，该设定值可以设置为10μS/cm，以表示初浓缩液的脱盐程度。

在本实施例中，可以理解的是，脱盐和浓缩的效果具体取决于所使用的纳滤膜和纯水。为了保证脱盐的效果，可以使用截流分子量为200-250的纳滤膜的同时，使用导电率低于0.1μS/cm的纯水。

通过设置合适截流分子量的纳滤膜，可以有效的截止过滤滤液中溶解的电解质，使用非常低导电率的纯水可以避免在稀释过程中重新引入新的电解质。

S500、真空蒸发所述初浓缩液，获得终浓缩液。

初浓缩液可以进一步被送入真空蒸发设备，在真空环境下蒸发以获得河豚毒素浓度更高的终浓缩液。

S600、在真空环境下，干燥所述终浓缩液以获得所述河豚毒素。

对终浓缩液继续在真空环境下进行干燥即可获得最终所需要的河豚毒素成品。该河豚毒素成品以冻干粉的形式存在。

图2为本发明另一实施例提供的河豚毒素制备及纯化方法的示意图。该制备方法同样也基于微生物发酵来制备河豚毒素。如图2所示，该制备及纯化方法包括如下步骤：

S110、将产河豚毒素菌接种到摇瓶种子培养基，制备发酵种子液。

S120、将种子液接种到一级种子罐，发酵24-28小时。

S130、将一级种子罐内的发酵物移种到二级发酵罐中，发酵28-32小时。

S140、将所述二级发酵罐内的发酵物移种到三级发酵罐中，发酵36-40 小时，进一步的扩大培养发酵。

S200、使用离心机对三级发酵罐放罐后输出的发酵液进行离心，实现固液分离。

S310、取固液分离后的上清液，使用微滤膜进行预过滤。通过微滤膜的过滤可以滤除上清液中的细胞碎片和颗粒物等较大的杂质。

S320、使用超滤膜对所述预过滤后的滤液继续进行过滤。通过超滤膜可以进一步滤除滤液中，除河豚毒素外的其他蛋白质等大分子杂质。

S410、使用纳滤膜进一步浓缩所述滤液。

S420、向纳滤膜过滤后的滤液重新补充纯水至原有体积，对所述滤液进行稀释。

S430、重复执行步骤S410和S420多次，直至获得初浓缩液，达到脱盐和浓缩的效果。

S500、真空蒸发所述初浓缩液，获得终浓缩液。

S600、通过真空冷冻干燥机，干燥所述终浓缩液获得冻干粉。

本发明实施例提供的河豚毒素制备方法具有工艺简单、原料来源广泛等的优势，解决了传统工艺生产河豚毒素存在的原料来源不足、工艺复杂、成本高、得率低等的一系列问题和缺陷。

基于以上实施例揭露的河豚毒素制备方法，本发明还进一步的提供了一种河豚毒素产品。该河豚毒素产品以冻干粉的形式存在，通过如上所述的制备方法制备获得，具有生产成本低，纯度高的特点。

以下结合具体实例，详细描述利用微生物发酵法，制备河豚毒素的详细过程：

11)制备种子液：

使用的培养基配方为：蔗糖0.2％，酵母膏0.3％，蛋白胨0.5％，氯化钠 0.2％，磷酸二氢钾0.3％，pH6.5-7.0。

首先，按照上述的培养基配方，分别配制三瓶25ml/100ml(即100ml的三角瓶，装液量25ml)和三瓶250ml/1000ml(即1000ml的三角瓶，装液量250ml) 的培养基，在灭菌锅于121℃灭菌20min备用。

然后，分别从试管斜面种子各取一环种子接种到三个25ml/100ml三角瓶，置于摇床内26-30℃、转速150-200rpm，培养24-28h,作为一级种子。

最后，把三瓶一级种子分别接种到三个250ml/1000ml三角瓶，置于摇床内26-30℃、转速150-200rpm，培养24-28h，作为二级种子。

12)种子罐培养(即一级发酵罐)：

一级发酵罐的容积为25L。使用的培养基配方为：蔗糖0.5％，葡萄糖0.5％，酵母膏0.3％，硫酸铵0.3％，氯化钠0.5％，磷酸二氢钾0.5％，pH6.5-7.0。

将预先发酵好的三瓶二级种子液250ml/1000ml接种到25L发酵罐中，装料15L，空气流量8-10L/min、转速250-300rpm、pH6.5-7.0、温度27-29℃培养24-28h。

13)二级发酵罐培养:

二级发酵罐的容积规模为200L。使用的培养基配方为：蔗糖0.5％，葡萄糖0.8％，酵母膏0.3％，硫酸铵0.5％,氯化钠0.8％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.03％，pH6.5-7.0。

将种子罐种子液移种到200L发酵罐，装料120L，空气流量6-8m3/h，转速120-150rpm，温度27-29℃培养28-32h。

14)三级发酵罐发酵：

三级发酵罐的容积规模为2000L。使用的培养基配方为：蔗糖0.5％，葡萄糖1.0％，酵母膏0.4％，硫酸铵0.5％,氯化钠0.8％，磷酸氢二钾0.5％，硫酸镁0.05％，pH6.5-7.0。

将二级发酵罐的发酵液移种到三级发酵罐，装料1200L，空气流量30-40m 3/h，转速80-100rpm，温度27-29℃下，培养36-40h后放罐进行后续的分离提纯操作。

15)固液分离：

将发酵液调节pH为6.5-7.0，在离心机上离心，离心力8000-12000xg，温度控制为常温。通过离心分离出细胞与上清液并保留上清液。

16)微滤膜预过滤：

使用孔径为0.1-0.2μm微滤膜过滤，去除所述上清液中的残留细胞碎片、颗粒物等。

17)超滤膜过滤：

使用截留分子量为1000-2000的超滤膜继续过滤上清液中的蛋白质等大分子物质。

18)脱盐和初浓缩：

使用截留分子量为200-250的纳滤膜去除电解质等其他的小分子物质，并且对经过纳滤膜分离的透过液进行高效的脱水浓缩，浓缩5-10倍。然后，使用超纯水(EC＜0.1μS/cm)重新稀释至原体积。

反复进行浓缩和稀释的操作3-5次，直至浓缩液电导率＜10μS/cm为止。

19)精浓缩：

通过真空蒸发装置，在50-60℃下，对初浓缩液继续浓缩5-10倍，得到终浓缩液。

20)干燥：

通过真空冷冻干燥，将终浓缩液制成冻干粉。

21)层析纯化：

首先，将所述冻干粉以0.2％的醋酸溶解，10000rpm离心20min，保留上清液。然后，对上清液通过离子交换柱层析。其中，层析液为0.5％醋酸，分步收集，进一步通过生物检测法检测洗脱液毒性，并将含毒洗脱液合并。最后，将合并的含毒洗脱液真空冷冻干燥，获得最终的冻干粉作为最终产品。

22)计算产量：

在本具体实施例中，经过三级发酵获得的2000L发酵液最终可以制得冻干粉0.591g。对冻干粉通过高效液相色谱进行检测后确定，该冻干粉LD50 为5.46ug/kg，纯度达到98.6％。

本发明实施例提供的制备方法工艺简单，原料来源广泛，生产河豚毒素所需的费用相对于现有的生产方式明显降低，具有良好的应用前景。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及本发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种河豚毒素的制备及纯化方法，其特征在于，所述方法包括：

通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液；

对所述发酵液进行固液分离处理；

过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液；

重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液；

真空蒸发所述初浓缩液，获得终浓缩液；

在真空环境下，干燥所述终浓缩液以获得所述河豚毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过多级发酵系统，制备产河豚毒素菌种的发酵液包括：

将所述产河豚毒素菌种接种到种子培养基中，制备获得种子液；

依次通过一级发酵罐、二级发酵罐和三级发酵罐分别进行第一级发酵、第二级发酵和第三级发酵；

在第三级发酵完毕后，从所述三级发酵罐输出所述发酵液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第一级发酵的时间为24-28小时，所述第二级发酵的时间为28-32小时，所述第三级发酵的时间为36-40小时。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对所述发酵液进行固液分离处理，具体包括：

将所述发酵液放入离心机中，以设定的离心力进行离心。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过滤所述固液分离后获得的上清液，获得滤液，具体包括：

依次使用微滤膜和超滤膜对所述上清液进行过滤，获得所述滤液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微滤膜的孔径为0.1-0.2微米；所述超滤膜的截流分子量为1000-2000。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重复浓缩和稀释所述滤液若干次，获得脱盐后的初浓缩液，具体包括：

S1、通过纳滤膜浓缩所述滤液；

S2、向所述浓缩后的滤液加入纯水进行稀释；

重复执行所述步骤S1和S2若干次，直至所述初浓缩液的导电率低于设定值。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，重复执行3-5次所述步骤S1和步骤S2，直至所述初浓缩液的导电率低于10μS/cm。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纳滤膜的截留分子量为200-250；所述纯水的导电率低于0.1μS/cm。

10.一种河豚毒素，其特征在于，所述河豚毒素由如权利要求1-9任一项所述的河豚毒素的制备方法制备获得。

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