CN113121629A - 一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，包括依次进行的预处理、超滤澄清除杂、纳滤浓缩脱盐、树脂柱吸附洗脱、纳滤浓缩、脱盐脱色和结晶干燥步骤。本发明通过多道膜处理与多级树脂柱吸附相配合，通过不同阶段膜分子截留量的不同选择，保证了过滤效果，在多级树脂柱吸附后再次纳滤浓缩，大大减少了后续脱盐脱色和醇沉过程各物质的用量，更为安全环保；本发明各步骤的相互配合使得最终得到的烟酰胺单核苷酸纯度大于或等于99.7％。
Description
技术领域
本发明涉及核苷酸提取方法，特别涉及一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，NMN)，是一种自然存在的生物活性核苷酸，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的关键前体之一，具有抗氧化、减少氧化应激的作用，可以减缓生物体的生理衰退，增强能量代谢，延长寿命，在保健领域具有广阔的前景。
目前生产烟酰胺单核苷酸主流的方法大体可以分为化学合成法、生物酶催化法、发酵法三类。其中，化学合成法是以烟酰胺核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到，纯度差，而且使用了大量的有机溶剂，对环境破坏严重；生物酶催化法因不含有机溶剂残留，也不存在手性问题，且制备的NMN与机体内的同型，因而是一种较为绿色环保的制备方法。但是目前，生物催化法一般是以烟酰胺和磷酸核糖基焦磷酸为底物，在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成NMN。由于NMN中磷酸根主要来源于ATP或PRPP等能量物质，这2种前体的市场价格较高，也导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展；发酵法以微生物直接发酵，反应条件温和、对环境污染较小、原材料受限小，因而在国内外越来越受到关注。
发酵法生产烟酰胺单核苷酸，需要进行提取纯化，目前现有的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的工艺存在获得的产品纯度低(约为40％-60)的技术问题，亟待解决。
发明内容
本发明的目的是提供一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法。
本发明要解决的是现有技术中存在的提取获得的产品纯度低的技术问题。
为实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：
一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、预处理：将含有烟酰胺单核苷酸的发酵液进行预处理，去除大颗粒悬浮物，得到预处理滤液；
S2、超滤澄清除杂：将所述预处理滤液通过超滤系统进行澄清除杂，得超滤滤液；
S3、纳滤浓缩脱盐：将所述超滤滤液通过第一纳滤系统进行浓缩，加水顶洗去除一价离子，得纳滤滤液；
S4、树脂柱吸附洗脱：将所述纳滤滤液依次通过第一树脂柱和第二树脂柱进行吸附后洗脱，收集洗脱液；
S5、纳滤浓缩：将所述洗脱液通过第二纳滤系统进行浓缩，得纳滤浓缩液；
S6、脱盐脱色：利用电渗析对所述纳滤浓缩液进行脱盐后，再通过活性炭进行脱色，得脱色液；
S7、结晶干燥：将所述脱色液进行醇沉后，离心，烘干，即得。
进一步地，步骤S2中，所述超滤系统的超滤膜截留分子量为10000-30000道尔顿，所述超滤滤液中，烟酰胺单核苷酸的含量为5-6g/L。
进一步地，步骤S3中，所述第一纳滤系统的纳滤膜截留分子量为150-300道尔顿。
进一步地，步骤S3中，所述第一纳滤系统的操作压力为20-25bar。
进一步地，步骤S4中，所述洗脱液中，烟酰胺单核苷酸的含量为15-25g/L。
进一步地，步骤S5中，所述纳滤浓缩液中，烟酰胺单核苷酸的含量为160-220g/L。
进一步地，步骤S6中，通过电渗析脱盐后的纳滤浓缩液电导率小于1000us/cm。
进一步地，步骤S1中，所述预处理包括絮凝、离心、板框、陶瓷膜中的一种或几种联用。
进一步地，经步骤S7得到的烟酰胺单核苷酸纯度大于或等于99.7％。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法通过多道膜处理与多级树脂柱吸附相配合，通过不同阶段膜分子截留量的不同选择，保证了过滤效果，在多级树脂柱吸附后再次纳滤浓缩，大大减少了后续脱盐脱色和醇沉过程各物质的用量，更为安全环保；本发明各步骤的相互配合使得最终得到的烟酰胺单核苷酸纯度大于或等于99.7％。
附图说明
图1：本发明提供的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的工艺流程图。
具体实施方式
现有技术中存在的提取获得的产品纯度低的技术问题。所以本发明提出新的方案，为更加清楚的表示，下面结合附图对本发明做详细的说明。所述实施例的示例在旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
参照图1所示，本实施例公开了一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其包括以下步骤：
S1、预处理：将含有烟酰胺单核苷酸的发酵液进行预处理，去除大颗粒悬浮物，得到预处理滤液；
由于发酵液中含有菌丝体和悬浮固体等杂质，通过预处理去除大颗粒悬浮物有利于后续处理，节约后续精细处理成本，该预处理可以是絮凝，也可以是离心，也可以是板框过滤或陶瓷膜过滤，或者是这些方式中的几种联用，例如发酵液先通过絮凝，然后通过板框过滤；本步骤中，发酵液中烟酰胺单核苷酸的含量为20g/L。
S2、超滤澄清除杂：将步骤S1得到的预处理滤液通过超滤系统进行澄清除杂，得超滤滤液；
由于经过步骤S1预处理后的料液仍呈一定的浑浊状态且存在发酵带来的大分子杂质，所以如果将预处理滤液直接送入纳滤系统容易造成纳滤系统的流道堵塞，本实施例采用膜截留分子量为10000-30000(优选为20000)道尔顿的超滤系统先对所述预处理滤液进行澄清除杂，最后得到的超滤滤液，电导率约为20000us/cm，烟酰胺单核苷酸的含量为5-6g/L；
S3、纳滤浓缩脱盐：将步骤S2得到的超滤滤液通过第一纳滤系统进行浓缩，加水顶洗除去一价离子，得纳滤滤液；
第一纳滤系统用于对所述超滤滤液进行浓缩脱盐，该第一纳滤系统将超滤浓缩液浓缩约10倍，减少料液体积，并通过顶水将一价离子去除。所述第一纳滤系统的膜组件可以是卷式膜，材质为聚酰胺；纳滤膜的截留分子量150-300道尔顿，对NMN的截留率＞99％，脱盐率约50％，该第一纳滤系统操作压力20-25bar；
S4、树脂柱吸附洗脱：将所述纳滤滤液依次通过第一树脂柱和第二树脂柱进行吸附后洗脱，收集洗脱液；所述洗脱液电导率40000us/cm，烟酰胺单核苷酸的含量约为20g/L；
S5、纳滤浓缩：将所述洗脱液通过第二纳滤系统进行浓缩，第二纳滤系统将步骤S4中的洗脱液浓缩约10倍，减少溶液的体积90％，至溶液中烟酰胺单核苷酸的含量为200g/L以上。这样可以大大减少后续醇沉溶剂用量以及脱色过程中活性炭的用量，经第二纳滤系统处理得到纳滤浓缩液。
S6、脱盐脱色：利用电渗析(ED)对步骤S5中的纳滤浓缩液进行脱盐后，再通过活性炭进行脱色，得脱色液；
S7、结晶干燥：将所述脱色液进行醇沉后，离心，烘干，即得纯度大于或等于99.7％德烟酰胺单核苷酸。用于醇沉的溶剂可以是甲醇或乙醇等溶剂。乙醇与脱色液的体积比例为1:1。本发明各步骤的相互配合使得最终得到的烟酰胺单核苷酸纯度大于或等于99.7％。
所述步骤S6和S7也可以替换成以下步骤：
将步骤S5得到的纳滤浓缩液直接进行第一次醇沉(乙醇与纳滤浓缩液的体积比例为1:1)，离心，烘干；再次溶解后进行第二次醇沉，离心，烘干，通过两次醇沉与前述步骤配合亦可实现最终得到的烟酰胺单核苷酸纯度达到99.7％及以上。
以上实施例仅用以解释说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管上述实施例对本发明进行了具体的说明，相关技术人员应当理解，依然可对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改和等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围之中。
Claims (9)
1.一种从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、预处理：将含有烟酰胺单核苷酸的发酵液进行预处理，去除大颗粒悬浮物，得到预处理滤液；
S2、超滤澄清除杂：将所述预处理滤液通过超滤系统进行澄清除杂，得超滤滤液；
S3、纳滤浓缩脱盐：将所述超滤滤液通过第一纳滤系统进行浓缩，加水顶洗去除一价离子，得纳滤滤液；
S4、树脂柱吸附洗脱：将所述纳滤滤液依次通过第一树脂柱和第二树脂柱进行吸附后洗脱，收集洗脱液；
S5、纳滤浓缩：将所述洗脱液通过第二纳滤系统进行浓缩，得纳滤浓缩液；
S6、脱盐脱色：利用电渗析对所述纳滤浓缩液进行脱盐后，再通过活性炭进行脱色，得脱色液；
S7、结晶干燥：将所述脱色液进行醇沉后，离心，烘干，即得。
2.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S2中，所述超滤系统的超滤膜截留分子量为10000-30000道尔顿，所述超滤滤液中，烟酰胺单核苷酸的含量为5-6g/L。
3.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S3中，所述第一纳滤系统的纳滤膜截留分子量为150-300道尔顿。
4.根据权利要求1或3所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S3中，所述第一纳滤系统的操作压力为20-25bar。
5.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S4中，所述洗脱液中，烟酰胺单核苷酸的含量为15-25g/L。
6.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S5中，所述纳滤浓缩液中，烟酰胺单核苷酸的含量为160-220g/L。
7.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S6中，通过电渗析脱盐后的纳滤浓缩液电导率小于1000us/cm。
8.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：步骤S1中，所述预处理包括絮凝、离心、板框、陶瓷膜中的一种或几种联用。
9.根据权利要求1所述的从发酵液中提取烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：经步骤S7得到的烟酰胺单核苷酸纯度大于或等于99.7％。
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Denomination of invention: A method for extracting nicotinamide mononucleotides from fermentation broth Effective date of registration: 20231208 Granted publication date: 20230721 Pledgee: Bank of China Limited Xiamen hi tech Park sub branch Pledgor: QINHAO MEMBRANE TECHNOLOGY(XIAMEN)CO., Ltd. Registration number: Y2023980070301 |
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