CN108315375B - 一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物产品提取领域,特别涉及一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法。本方法以枯草芽孢杆菌¸巨大芽孢杆菌为原料,用去离子水重悬后破碎,加絮凝剂絮凝,过滤收集滤液;滤液经超滤膜脱除蛋白后,即得产品I;产品I在等电点附近经两步阳离子树脂分离,用纳滤膜脱盐后,即为产品Ⅱ;产品Ⅱ中滴加有机溶媒,低温结晶,晶体经低温干燥后,即得产品Ⅲ。本发明的有益效果是:本发明生产方法填补了国内生产技术空白;满足了工业生产及科研等不同层次的需要,生产成本得到有效控制;利用氧化型NADP+分子的两性特点,在等电点附近利用两种不同的阳离子树脂,对产品进行了精密提取分离。
Description
(一) 技术领域
本发明属于生物产品提取领域,特别涉及一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法。
(二) 背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,又称辅酶Ⅱ,分氧化型和还原型,一般简写为NADP+/NADPH,分子结构式见附图1。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是细胞内重要的辅酶,主要参与细胞合成代谢,如糖、脂、蛋白质三类物质代谢的绝大部分氧化还原反应,是微生物代谢网络中含量最丰富的氧化还原辅酶之一,在所有生物的新陈代谢中都发挥着重要的作用;其次,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸是细胞内抗氧化防御系统的重要组成成分,在细胞防御活性氧损伤方面起着重要的作用。
NADP+/NADPH在细胞中涉及的反应广泛,其浓度的改变不仅会影响产物形成,还会使代谢流发生广泛变化,在辅酶层面上调控碳代谢流的辅酶工程,定向改变和优化微生物细胞代谢功能及氧化还原酶催化的产物构成,从而实现代谢流最大化、快速化地导向目标代谢产物,目前代谢过程的研究已从酶的调控深入到辅酶的调控研究。其次,大部分药物及一些进入到人体中的有毒有害物质,许多是大分子有机物质,溶解性较低,一般需要在细胞色素P450加氧酶的参与下进行多步羟基化,增加物质的亲水性,以利于其分解代谢或排出体外,而细胞色素P450加氧酶的羟基化反应需要NADP+/NADPH的参与,因此辅酶Ⅱ在药物代谢模型的研究中具有重要作用。再次,酶催化不对称合成在手性药物和手性中间体生产中有着化学合成方法所无法比拟的优势,而几乎50%左右的反应涉及到辅酶的参与,由于酶发酵自身所产生的辅酶往往无法满足工业化生产对反应速率的要求,因此生产上大多数情况下需要添加辅酶。综上所述,辅酶Ⅱ在科研¸酶催化不对称合成¸医疗保健领域具有广泛的应用。
一直以来,科研及生产所需要的NADP+/NADPH都依赖进口,只是近年来国内才出现一家生产企业,但也具有外资背景。辅酶Ⅱ在生物中广泛存在,但含量极低,从生物中提取的辅酶Ⅱ以氧化型的形式存在,每公斤市场价格在数万元,工业化生产中使用氧化型产品,即NADP+,还原型的产品价格更加昂贵。关于NADP+/NADPH相关生产技术方面的文献报道,国内一直处于空白状态,仅发现一篇由中国科学院上海生化研究所等单位于1978年发表的有关辅酶Ⅰ(NAD+)提取方法的文献报道,该文献提供的辅酶Ⅰ提取工艺路线为:酵母细胞冷热破壁¸离心收集上清¸阴离子树脂除杂¸弱酸性阳离子树脂吸附¸解吸¸强酸性阳离子树脂除杂¸强碱性阴离子树脂吸附¸解吸¸活性炭吸附¸水/有机溶剂洗涤¸解吸¸结晶¸干燥,该工艺路线前后使用4步树脂处理和1步活性炭吸附解吸处理,工序十分繁杂,产品收率低,吸附¸解吸和再生所产生的废水将给环保带来极大的压力。
公开号为:104876993A¸名称为“一种氧化型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的纯化方法”的专利中仅提供了NADP+生产技术中纯化方法部分,而且采用的反相层析树脂价格昂贵,一般企业难以负担。
(三) 发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足,提供了一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法。
本发明是通过如下技术方案实现的:
一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法,包括以下步骤:
(1)将含有NADP+的微生物菌种扩大培养,得微生物培养液;
(2)微生物培养液离心分离,收集菌体,将收集的菌体通过2-4倍体积去离子水重悬,在30-100MPa压力下破碎,然后按50-300mg/L的比例向破碎液中加入壳聚糖,搅拌30-60分钟,静止絮凝30-60分钟,加4-10%硅藻土,过滤,收集滤液;
(3)步骤(2)得到的滤液经超滤膜脱除蛋白后,即得产品I;
(4)产品I中加入强酸性阳离子树脂,调节PH为2.8-3.0,搅拌0.5-4h,维持PH在2.8-3.0的范围内;
(5)将步骤(4)得到的混合物过滤,收集滤液,调整PH为1.5-2.0;然后加入弱酸性阳离子树脂,待吸附完毕后用2BV去离子水冲洗,采用0.1-0.5M的氢氧化钠进行解吸,根据检测指标截留中间解吸液;
(6)将步骤(5)得到的解吸液用纳滤膜脱盐浓缩后,即得产品Ⅱ;具体为:用300-500Da的纳滤膜对上述解吸液脱盐并浓缩,中间添加去离子水2-4次,每次0.3-2BV解吸液体积,浓缩结束得精制NADP+溶液,即本发明的产品Ⅱ。
(7)产品Ⅱ中滴加2-5BV的有机溶剂,控制在0.5-4h滴加完毕;然后控制温度-5-5℃结晶2-8h;经过过滤、收集晶体、低温干燥;其中结晶液过滤后,晶体冻干或≤50℃真空干燥,即为本发明的产品Ⅲ。
其中,所述含有NADP+的微生物包括:枯草芽孢杆菌¸巨大芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌¸巨大芽孢杆菌中含有葡萄糖脱氢酶基因,所述含有NADP+的微生物还包括具有NADP+依赖型葡萄糖脱氢酶基因片段的菌种。
NADP+在各类生物中普遍存在,生物新陈代谢所涉及的各种生物反应有将近40%以上的酶都需要辅酶的参与,枯草芽孢杆菌¸巨大芽孢杆菌中含有丰富的葡萄糖脱氢酶,是一种NADP+依赖型的氧化还原酶,其菌丝体中NADP+的含量也大大高于一般的微生物。现代研究表明,增加NADP+依赖型葡萄糖脱氢酶基因表达,可以增加生物葡萄糖脱氢酶的产生量,激发菌种自身NADP+合成酶的活性,并同步增加NADP+的含量;NADP+是NADP+依赖型葡萄糖脱氢酶的辅酶,是葡萄糖脱氢酶氧化还原催化反应功能的有机组成部分。
其中,步骤(3)中,脱除蛋白所使用的超滤膜孔径为3000-10000Da,脱除蛋白后得初制NADP+溶液,即本发明的产品I。
其中,步骤(4)中强酸性阳离子树脂为Na+型,步骤(5)中弱酸性阳离子树脂为H+型。
其中,步骤(6)中滤膜的孔径为300--500Da。
其中,步骤(7)中有机溶剂包括:丙酮¸乙醇¸甲醇¸异丙醇中的一种或几种的组合。
其中,所述产品I和所述产品Ⅱ为液态,所述产品Ⅲ为固态。
本发明根据工业生产及科研的实际需要,提供了产品I¸产品Ⅱ¸产品Ⅲ三种产品的生产方法。产品I生产工艺简单¸成本低廉,虽然产品纯度不高,但完全可以满足工业化生产的需要,尤其是自产自用的情况下具有无可比拟的价格优势;产品Ⅱ产品纯度较高,可以满足一般科研及生产的需求,使用方便,低温条件下可以储存,同目前市场上的产品相比,也具有较大的成本优势;产品Ⅲ是目前市场上的主流产品,纯度高,方便储藏运输及使用。
本发明的有益效果是:
(1)本发明提供了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸纯度不同的三种产品:产品I¸产品Ⅱ及产品Ⅲ的生产方法,填补了目前国内氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产技术空白。
(2)本发明提供了氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的三种产品生产方法,既满足工业生产及科研等不同层次的需要,又做到了产品使用成本的最低化,为工业化生产奠定了基础。
(3)本发明利用氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸为两性分子¸等电点在PH2.8左右的性质,利用两种不同性质的阳离子树脂对其进行了精密分离,工艺简单,分离纯度高。
(四) 说明书附图
图1 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的分子结构式。
(五) 具体实施方式
实施例1
(1)以巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌经扩繁,以5%的接种量接入30L经121℃灭菌20分钟的TB培养基中,全程用氨水控制PH7.0;初始转速300转/分钟,中后期600转/分钟;初始流量1:0.6,中后期1:1.2 ;罐压0.05MPa;溶氧反弹后,开始流加80%浓度的甘油溶液,速率165ml/h;OD600 ≥ 60 时,温度由37℃降温至30℃,培养周期42h。放罐OD600 =98,放罐体积34.2L 。
(2)HPLC检测发酵液NADP+含量为 256mg/L。
(3)发酵液离心,8000转/分钟,收集菌体6.82kg。
(4)菌体用24L去离子水重悬,60MPa压力下均质破碎两次。
(5)破碎液加壳聚糖6.4g,搅拌30分钟,静止40分钟;加入硅藻土1600g,板框过滤,顶洗,收集滤液30.4L。
(6)用8000Da的超滤膜进行蛋白脱除,后期分3次加去离子水10L,收集透过液34.5L,即得产品I。HPLC检测NADP+钠盐含量为 243mg/L,收率95.7%。
实施例2
(1)实例1中的产品I用300-600Da纳滤膜浓缩至1.46L。
(2)浓缩液中加入强酸性阳离子树脂50g,树脂为Na+型,用盐酸调PH2.8-3.0,搅拌0.5-4h,并随时调节PH,使之保持在2.8-3.0范围内。
(3)过滤,收集滤液1.42L,用盐酸下调PH至1.5.0-2.0,上弱酸性阳离子树脂柱Φ35*350,树脂装量150ml,树脂预先转型为H+型,上样流速2BV/h;上柱完毕,用2BV去离子水冲洗。
(4)用0.2M的氢氧化钠溶液解吸,根据检测指标截留中间解吸液345ml。
(5)解吸液用盐酸调PH6.5,用300-500Da的纳滤膜对上述解吸液脱盐并浓缩,中间添加去离子水3次,每次300ml,最后得浓缩液95ml,即本发明的产品Ⅱ。HPLC检测NADP+钠盐含量为 81.5g/L,收率92.4%
实施例3
(1)向实施例2步骤(5)中的产品Ⅱ中滴加300ml丙酮,用时0.5h。
(2)滴加完毕,-5--5℃温度下结晶6h。
(3)用布氏漏斗真空抽滤,50ml丙酮顶洗,收集固体。
(4)固体≤50℃真空干燥4h,得固体6.86g,即产品Ⅲ。HPLC检测NADP+钠盐含量99.4% 。收率88.6% 。
上面以举例方式对本发明进行了说明,但本发明不限于上述具体实施例,凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法,包括以下步骤:
(1)将含有NADP+的微生物菌种扩大培养,得微生物培养液;
(2)微生物培养液离心分离,收集菌体,将收集的菌体通过2-4倍体积去离子水重悬,在30-100MPa压力下破碎,然后按50-300mg/L的比例向破碎液中加入壳聚糖,搅拌30-60分钟,静止絮凝30-60分钟,加4-10%硅藻土,过滤,收集滤液;
(3)步骤(2)得到的滤液经超滤膜脱除蛋白后,即得产品I;
(4)产品I中加入强酸性阳离子树脂,调节pH 为2.8-3.0,搅拌0.5-4h,维持PH在2.8-3.0的范围内;
(5)将步骤(4)得到的混合物过滤,收集滤液,调整pH 为1.5-2.0;然后加入弱酸性阳离子树脂,待吸附完毕后用去离子水冲洗,采用0.1-0.5M的氢氧化钠进行解吸;
(6)将步骤(5)得到的解吸液用纳滤膜脱盐浓缩后,即得产品Ⅱ;
(7)产品Ⅱ中滴加相对于产品Ⅱ2-5BV体积的有机溶剂,控制在0.5-4h滴加完毕;然后控制温度-5-5℃结晶2-8h;经过过滤、收集晶体、低温干燥,即得产品Ⅲ;
步骤(3)中,脱除蛋白所使用的超滤膜孔径为3000-10000Da;
步骤(4)中强酸性阳离子树脂为Na+型,步骤(5)中弱酸性阳离子树脂为H+型;
步骤(6)中滤膜的孔径为300--500Da。
2.根据权利要求1所述的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法,其特征在于:所述含有NADP+的微生物包括:枯草芽孢杆菌¸巨大芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法,其特征在于:步骤(7)中有机溶剂包括:丙酮¸乙醇¸甲醇¸异丙醇中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求1所述的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的生产方法,其特征在于:所述产品I和所述产品Ⅱ为液态,所述产品Ⅲ为固态。
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