CN111172206B - 提高微生物转化生成乳糖酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌种子液接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20‑24h，然后添加促进培养基；继续发酵24‑36h，停止发酵，得到发酵液；步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10‑14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。本发明对废弃的湿菌体进行了二次利用，变废为宝，提高了乳糖酸的产率。

Description

提高微生物转化生成乳糖酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及提高微生物转化生成乳糖酸的方法。
背景技术
乳糖酸是一种重要的药物中间体，广泛已应用于医药制备技术领域。目前，合成乳糖酸的方法主要包括化学法、酶法以及生物法。市场应用的乳糖酸主要由化学法制得，高耗能且需要昂贵的金属催化剂。化学法所用到的化学试剂是一些有毒的且昂贵的试剂；在反应过程中还会有副产物产生；利用金属催化合成乳糖酸，金属催化剂容易钝化；化学法对pH和温度的稳定的要求相对严格，还容易产生大量的副产物，造成环境污染。酶法合成乳糖酸相对于化学法具产物相对单一、产物易于分离和条件温和等优点，但是用于生物催化的酶需要生产和进一步纯化，而这些步骤成本较高，费时费力。
乳糖酸的生物合成法是一种可行的方法，这种方法可以克服化学法和酶法合成乳糖酸的缺陷，绿色环保，而且能耗低，可持续发展性强。中国专利技术“CN101988046A”公开了一种利用荧光假单胞菌生产乳糖酸的方法，该方法以乳糖为转化底物，添加氮源和无机盐作为发酵培养基，在最优选的条件下，转化率可达到90%，但是该发酵过程时间较长，持续时间为120h，此外还需要添加其他碳源，增加了成本，提高了后续分离纯化的难度。中国专利技术“CN102703542A”和“CN102250986A”分别通过超声波和高压物理场技术对荧光假单胞菌进行刺激，对乳糖酸的转化率有一定的提升作用。文献“乳糖酸产生菌的发酵培养基优化，食品工业科技2014年” 以乳糖酸生产菌土生拉乌尔菌为实验菌株，在单因素实验的基础上进行优化培养基和培养条件，使得发酵液中乳糖酸的浓度和转化率大幅提高。
目前，生物转化合成乳糖酸的研究大多处于实验室阶段，为了使得微生物催化乳糖生产乳糖酸应用于工业生产中，以满足其日益增长的市场的需求，针对某一特定的产乳糖酸的微生物，我们需要解决以下几个问题：首先，需要尽可能高地提高底物乳糖的浓度，从而提高乳糖酸的产量；其次，通过提高乳糖酸的转化率来提高生产效率；最后，控制培养时间和成本，并且减轻后续分离纯化产品的难度。据此，申请人之前的专利技术“一种利用生物法合成乳糖酸的工艺”对荧光假单胞菌发酵培养条件进行了优化，通过添加促进培养基，提高了乳糖酸的生产速率和转化率。
发明内容
本发明旨在上述专利技术的基础上，继续对发酵条件进行优化，以进一步提高乳糖酸的产量。
本发明是通过如下技术方案来实现的。
提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，培养得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；
步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸。
优选地，所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1: 50-100的质量比混匀制得。
优选地，所述种子培养基为：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
优选地，所述发酵培养基为：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
优选地，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：2-3g：1L。
优选地，所述二次发酵培养基为：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
优选地，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da。
优选地，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为3-5:1。
更优选地，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：3g：1L。
更优选地，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为4:1。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明采用两次菌体培养方式，提高了发酵效率，实现了变废为宝。
第一次培养：
针对菌株转化生成乳糖酸的特点来进行优化发酵条件，缩短了发酵时间，提高了乳糖酸的生产效率。通过流加氨水控制pH为6.0左右，既有利于乳糖酸的转化作用，还能保证适合菌株增殖的酸碱度；维生素B3是多种酶类的重要辅助因子，添加适量的VB3有助于提高酶产量。
荧光假单胞菌发酵前期以菌株增殖为主，中后期产生相关代谢酶以及合成代谢产物为主，通过将相关糖类氧化酶分泌到胞外，将乳糖转化为乳糖酸；选择在发酵中期添加一定量的氯化钠，能够对菌株产生胁迫，造成酶合成机制的增强，还能够增加渗透压，提高细胞膜的通透性，有利于胞外酶的分泌；低添加量的木质素不会对菌株增殖活力产生负面影响，反而会提高乳糖酸的产量，可能是木质素能够诱导荧光假单胞菌氧化酶的表达，从而进一步提高了乳糖的转化率。
第二次培养为：
针对第一次发酵完成的发酵液进行过滤处理，以分离发酵清液用于后续提取乳糖酸，解除了乳糖酸的反馈抑制后，湿菌体仍然具备产酶和转化乳糖生成乳糖酸的能力；申请人继续往湿菌体中添加乳糖培养液，持续培养一段时间后，能产生一定量的乳糖酸；上述操作方式对废弃的湿菌体进行了二次利用，变废为宝，提高了工业附加值。
附图说明
图1：氯化钠对乳糖酸转化率的影响；
图2：氯化钠对乳糖酸生产速率的影响；
图3：木质素对乳糖酸转化率的影响；
图4：木质素对乳糖酸生产速率的影响；
图5：二次发酵时间和培养基对乳糖酸产量的影响。
具体实施方式
本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：
1）一次发酵：将荧光假单胞菌ATCC17400为试验菌株，活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cfu/ml的荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，30℃，通气量为0.4vvm，以100rpm的搅拌速度培养24h，然后添加促进培养基，促进培养基与发酵培养基的比例为：3g：1L；继续发酵30h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0。
种子培养基：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
发酵培养基：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
促进培养基：将木质素和氯化钠按照1: 100的质量比混匀制得。
2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜（截留分子量为1万Da）过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加占湿菌体4倍体积的二次发酵培养基，继续发酵培养12h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸；
二次发酵培养基：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
实施例2
提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：
1）一次发酵：将荧光假单胞菌ATCC17400为试验菌株，活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cfu/ml的荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，30℃，通气量为0.4vvm，以100rpm的搅拌速度培养24h，然后添加促进培养基，促进培养基与发酵培养基的比例为：2g：1L；继续发酵28h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.1。
种子培养基：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
发酵培养基：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
促进培养基：将木质素和氯化钠按照1:50的质量比混匀制得。
2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜（截留分子量为1万Da）过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加占湿菌体3倍体积的二次发酵培养基，继续发酵培养10h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸；
二次发酵培养基：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
实施例3
提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：
1）一次发酵：将荧光假单胞菌ATCC17386为试验菌株，活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cfu/ml的荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照8％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，30℃，通气量为0.4vvm，以100rpm的搅拌速度培养24h，然后添加促进培养基，促进培养基与发酵培养基的比例为：2.5g：1L；继续发酵28h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.2。
种子培养基：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
发酵培养基：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
促进培养基：将木质素和氯化钠按照1:70的质量比混匀制得。
2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜（截留分子量为2万Da）过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加占湿菌体4倍体积的二次发酵培养基，继续发酵培养13h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于后续分离提取乳糖酸；
二次发酵培养基：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
对比例1
提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其包括如下步骤：
将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，30℃，通气量为0.3vvm，培养至浓度为109cfu/ml的荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养，30℃，通气量为0.4vvm，以100rpm的搅拌速度培养54h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0。
种子培养基：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
发酵培养基：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
实施例4
一次发酵中，促进培养基组分对乳糖酸生产速率和转化率的影响。
在对比例1的基础上，检测氯化钠添加时机和添加量对乳糖酸生产速率和转化率的影响。设定氯化钠的浓度梯度分别在发酵液中为0,0.5,1,2,3,4,5,6，单位是g/L，如图1-2所示，随着氯化钠浓度的增大，乳酸糖生产速率和转化率均随之提高，添加量为3g/L时，生产速率和转化率较不添加氯化钠的实验组提高了22.17%，继续增大氯化钠的浓度，生产速率和转化率反而有小幅下降，因此，选择3g/L的添加量最为合适。
在氯化钠添加量为3g/L的基础上，继续验证木质素对生产速率和转化率的影响，设定木质素的添加量在发酵液中分别为0,5,10,20,30,40,50,60，单位是mg/L，如图3-4所示，低浓度的木质素对乳糖酸生产速率和转化率影响不大，当木质素的添加量增大到20mg/L时，乳糖酸生产速率和转化率有明显的提升，继续增大木质素的添加量，乳糖酸生产速率和转化率继续增大，不过幅度放缓，当木质素的添加量达到40mg/L时，乳糖酸生产速率和转化率达到峰值，继续增大木质素的添加量，乳糖酸生产速率和转化率没有明显改变。申请人还对其他刺激物，例如壳聚糖、肉桂酸、甲醇、曲拉通X-100等进行了浓度梯度试验，发现其并不会给乳糖酸生产速率和转化率带来提升作用，甲醇和曲拉通X-100反而会降低乳糖酸生产速率和转化率，有可能是上述物质阻碍了细胞的产酶机制或者降低了酶活力，需要进一步的研究来阐明其具体机理。
实施例5
二次发酵对乳糖酸产量的影响。
在实施例4的基础上，进一步研究二次发酵对乳糖酸浓度的影响。二次发酵时间设定为2,4,6,8,10,12,14,16，单位为h；考虑到湿菌体浓度过大会造成后续无法分离发酵液，因此，添加二次发酵培养基的量分别设定为湿菌体体积的2倍（A组）、3倍（B组）、4倍（C组）、5倍（D组）、6倍（E组）、7倍（F组），共6个组。如图5所示，横向观察，随着二次发酵时间的增加，发酵液中乳糖酸浓度随之增加，在10-14小时，各组别均达到峰值，继续增大发酵时间，乳糖酸的浓度没有明显提升；纵向比较各组别的峰值，ABCD三个组别峰值较高，峰值最高的是A组，达到90g/L左右，其次为B组和C组，为85-90g/L之间，EF两个组乳糖酸浓度较低。综合上述试验结果，考虑到培养基成本、转化率以及乳糖酸的总产量等因素，选择二次发酵时间为10-12h，二次发酵培养基的添加量分别设定为湿菌体体积的3-4倍最为合适。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.提高微生物转化生成乳糖酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1）一次发酵：将荧光假单胞菌活化，然后接种到种子培养基上进行培养，得到荧光假单胞菌种子液，将荧光假单胞菌种子液按照5-10％的接种量接种于含有发酵培养基的发酵罐中进行发酵培养20-24h，然后添加促进培养基；继续发酵24-36h，停止发酵，得到发酵液；整个发酵过程中，通过流加氨水控制pH为6.0-6.2；
所述促进培养基的制备方法为：将木质素和氯化钠按照1: 50-100的质量比混匀制得；
所述促进培养基与发酵培养基的比例为：2-3g：1L；
步骤2）二次发酵：将一次发酵的发酵液进行陶瓷膜过滤，收集滤液和湿菌体，将湿菌体打回发酵罐，然后添加二次发酵培养基，继续发酵培养10-14h，停止发酵，将二次发酵液进行过滤，收集滤液；合并两次滤液用于分离提取乳糖酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子培养基为：按照重量百分比，5%乳糖、2%葡萄糖、1%蛋白胨、0.2%氯化钾、0.1%七水硫酸镁，余量为无菌水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：按照重量百分比，15%乳糖、2%玉米浆、1%甘油、0.5%磷酸氢二钾、0.2%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二次发酵培养基为：按照重量百分比，10%乳糖、0.5%玉米浆、0.3%磷酸氢二钾、0.1%七水硫酸镁、0.01%七水硫酸亚铁、0.001%VB3，余量为无菌水。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述陶瓷膜的截留分子量为1万Da。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为3-5:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促进培养基与发酵培养基的比例为：3g：1L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述二次发酵培养基和湿菌体的体积比为4:1。
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Potential use of ricotta cheese whey for the production of lactobionic acid by Pseudomonas taetrolens strains;Stefania De Giorgi等;《N Biotechnol》;第42卷;第71-76页 *
乳糖酸高产菌株的选育及发酵条件的初步研究;郑艳;《食品与发酵工业》(第8期);第39-41页 *

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