NL8900420A - Werkwijze voor de fermentatieve oxydatie van reducerende disacchariden. - Google Patents

Description

Sw 33 Nw 2053

Werkwijze voor de fermentatieve oxydatie van reducerende disacchariden.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de fermentatieve oxydatie van reducerende disacchariden zoals maltose en lactose, waarbij gebruik gemaakt wordt van het microorganisme Pseudomonas cepacia. Door de oxydatie van deze disacchariden kunnen aldobionzuren zoals maltobionzuur of lactobionzuur of hun zouten vervaardigd worden.

In het Amerikaanse octrooischrift 3.899.604 wordt de toepassing van maltobionzuur als voedingszuur beschreven. Maltobionzuur heeft een mildzure smaak en verleent aan voedingsmiddelen waarin het is opgenomen tevens een bijdrage in de viscositeit. Verder kan maltobionzuur de natuurlijke geur en smaak van bepaalde voedingsmiddelen versterken (smaakverbeteraar) zoals is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.829.583.

In het Amerikaanse octrooischrift 3.862.005 is een werkwijze beschreven voor de fermentatieve oxydatie van disacchariden tot aldobionzuren met behulp van de microorganismen Pseudomonas graveolens of Pseudomonas fragi. De werkwijze wordt met name beschreven voor de omzetting van maltose in maltobionzuur. Deze werkwijze omvat o.a. de volgende 3 stappen, namelijk de groei van het microorganisme (groeifase), de afscheiding van de gegroeide cellen uit het groeimedium (afscheidingsstap) en de oxydatie van de disacchariden met behulp van in het celmateriaal aanwezige enzymen (productiefase). Een nadeel van deze werkwijze is de noodzaak om het celmateriaal uit het groeimedium af te scheiden alvorens de productief ase in een ander medium te kunnen starten. Dit is een gevolg van het feit dat genoemde microorganismen het disaccharide (bijvoorbeeld maltose) ook tijdens de groei- fase gebruiken als koolstof- en energiebron.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de fermentatieve productie van aldobionzuren zoals maltobionzuur of lactobionzuur met behulp van het micro-organisme Pseudomonas cepacia. Deze werkwijze bestaat in hoofdzaak uit 2 fasen, namelijk de groeifase en de productiefase. Het groeimedium bevat diverse voor de groei van het microorganisme noodzakelijke minerale stoffen en verder een koolstof- en energiebron (bijvoorbeeld gluco-* se) en een reducerend disaccharide (bijvoorbeeld maltose of lactose). In de groeifase wordt door omzetting van de glucose voornamelijk celmateriaal (biomassa) gevormd met daarin het enzym dehydrogenase, dat de aldobionzuurvor-ming katalyseert. De aanwezige disacchariden worden tijdens de groeifase niet gebruikt als koolstofbron. Deze di sacchariden induceren de dehydrogenase, waardoor in de groeifase al in beperkte mate aldobionzuurvorming plaatsvindt.

Nadat voldoende celmateriaal in de fermentor is gevormd tijdens de groeifase, kan in dezelfde fermentor de productiefase uitgevoerd worden zonder dat het celmateriaal eerst afgescheiden hoeft te worden. Daartoe wordt aan het fermentatiemedium een extra dosering disaccharide (bijvoorbeeld maltose of lactose) toegevoegd. Tevens wordt een extra hoeveelheid koolstofbron (bijvoorbeeld glucose en/of gistextract) aan het fermentatiemedium toegevoegd om te voorkomen dat in de fermentor tijdens de productiefase een sterke achteruitgang van de hoeveelheid actief celmateriaal optreedt. Tijdens de productiefase wordt het disaccharide nagenoeg uitsluitend omgezet in het corresponderende aldobionzuur of een zout daarvan.

Geschikte microorganismen die volgens de uitvinding toegepast kunnen worden zijn de stammen Pseudomonas cepacia CBS 659.88 en Pseudomonas cepacia CBS 658.88, beide op 26 oktober 1988 gedeponeerd bij het Centraalbureau voor Schimmelcultures te Baarn, Nederland.

De fermentatieomstandigheden kunnen binnen ruime grenzen variëren. De fermentatietemperatuur ligt bij voorkeur tussen 20 en 50°C. De pH van het fermenta-tiemedium ligt bij voorkeur tussen 5 en 8. Gedurende de fermentatie wordt de pH van het fermentatiemedium ongeveer neutraal gehouden bij voorkeur door toevoeging (titratie) van waterige alkalische oplossingen bijvoorbeeld van NaOH of KOH. Het fermentatiemedium wordt bij voorkeur geroerd en belucht. De om te zetten disacchariden kunnen in zuivere vorm toegevoegd worden. Men kan echter ook producten toepassen die rijk zijn aan het betreffende disaccharide zoals maltosestropen of zetmeelhydrolysaten die relatief veel maltose bevatten. De duur van de fermentatie is o.a. afhankelijk van de hoeveelheid gevormde biomassa/ de samenstelling van het fermentatiemedium en de fermentatieomstandigheden. De fermentatie kan worden beëindigd door verwijdering van het celmateriaal uit het fermentatiemedium bij voorbeeld door filtratie. De bereikte oxydatieren-dementen (mol verbruikte disaccharide berekend op mol geproduceerd aldobionzuur) kunnen tot circa 70 tot 95% bedragen. De uitvinding wordt toegelicht aan de hand van de volgende voorbeelden.

Voorbeeld 1

In een laboratoriumfermentor (inhoud 2 liter; merk Applikon) werd een groeimedium samengesteld dat bestond uit de volgende componenten:

Gedestilleerd water 700 ml (NH4)2SO4 2,8 g K2HPO4 0,98 g

MgSO4.7H20 0,14 g

Sporenoplossing 3,5 ml.

De sporenoplossing bevat de volgende componenten:

FeCl2.4H20 2 g/1 H3BO3 0,05 g/1

ZnCl2 0,05 g/1

CuCl2 0,03 g/1

MnCl2.4H20 0,5 g/1 (NH4)6MO7024-4H20 0,05 g/1

AlCls 0,5 g/1

CoCl2.6H20 0,05 g/1

NiCl2 0,05 g/1 I EDTA 0,5 g/1 HCl (geconcentreerd) 1 ml/1

Dit groeimedium werd gedurende 20 minuten bij 120°C gesteriliseerd. Daarna werden apart gesteriliseerde waterige oplossingen van 8 g glucose en 2 g maltose toegevoegd. Na af koelen tot de fermentatietemperatuur van 30°C, werd de pH van het medium met een waterige KOH-oplossing ingesteld op pH 7. Het geheel werd beent met 100 ml voorkweek van Pseudomonas capacia CBS 659.88, gekweekt in een Erlenmeyer op hetzelfde medium als de hoofdkweek. Tijdens de groeifase werd belucht met een debiet van 40 1/uur. Nadat in de groeifase voldoende celmateriaal was gevormd, werd in 3 gelijke porties in totaal 300 ml van een waterige maltose/glucose-oplossing (maltosegehalte 350 g/1? glucosegehalte 20 g/1) toegevoegd. Tijdens de productiefase werd de beluchting verhoogd tot 60 1/uur. Gedurende de gehele fermentatie werd getitreerd met een waterige oplossing van KOH om de pH van het medium op ongeveer 7 te houden. De fermentatie werd 48 uur na de toevoeging van de maltose/glucoseoplossing beëindigd. Op dat moment was ongeveer 95 gew.% van de toegevoegde maltose omgezet in maltobionzuur. Het celmateriaal werd door centrifugeren uit het reactiemengsel verwijderd. Aan het supernatant werden vervolgens 1 g/1 filtratiehulp-middel (Dicalite) en 4 g/1 actieve kool (Norit SX 2) toegevoegd. Na 1 uur conditionering bij 40°C werd het reac- tiemengsel gefiltreerd over een papierfilter. De heldere vloeistof werd door indampen (Rotavapor) ingedikt tot 70° Brix. Analyse met dunne-laag-chromatografie toonde aan dat het opgewerkte reactiemengsel alleen maltobion-zuur en maltose bevatte.

Voorbeeld 2

In de laboratoriumfermentor van voorbeeld 1 werd 100 g maltose opgelost in 700 ml gedestilleerd water. Nadat de pH van de oplossing op 3 was ingesteld, werd het geheel gesteriliseerd gedurende 20 minuten bij 110°C. Vervolgens werd 500 ml van een gesteriliseerde waterige oplossing toegevoegd die de volgende groeicomponenten bevatte: (NH4)2SO4 4,2 g K2HP04 °'98 9 KH2PO4 °'56 9

MgS04.7Ha0 0,14 g

Sporenoplossing 3'5 ml

Gistextract g

Glucose 10,8 g

Vervolgens werd het medium afgekoeld tot 30°C en werd de pH met een waterige NaOH-oplossing ingesteld op 7. Daarna werd de fermentatie gestart door toevoeging van 100 ml entmateriaal van Pseudomonas cepacia CBS 658.88 afkomstig van een Erlenmeyer-voorkweek. Na 24 en 48 uur werden respectievelijk 200 ml en 100 ml van een waterige maltose/glucose-oplossing (maltosegehalte 600 g/1; glucosegehalte 30 g/1) toegevoegd. Gedurende de fermentatie werd getitreerd met NaOH-oplossing om de pH op ongeveer 7 te houden. Na 72 uur werd de fermentatie beëindigd. Het product werd verder opgewerkt zoals onder voorbeeld 1 is beschreven. De verkregen geconcentreerde oplossing bevatte 72% maltobionzuur (op d.s.).

Voorbeeld 3

In de laboratoriumfermentor van voorbeeld 1 werd het microorganisme Pseudomonas cepacia CBS 659.88 gekweekt. Het medium voor de groeifase had de volgende samenstelling: (NH4)2SO4 8,4 g/1 K2HP04 2 g/1 MgS04.7HiO 0,28 g/1 Gistextract 3 g/1 Sporenoplossing 7 ml/1

Aan 500 ml van dit gesteriliseerde medium werd IVO ml gesteriliseerde glucose-oplossing toegevoegd tot een glucoseconcentratie van 21,6 g/1. Vervolgens werd de fermentatietemperatuur ingesteld op 30°C. De pH van het medium werd met NaOH-oplossing ingesteld op 7. De fermentatie werd gestart door toevoegen van 100 ml entmate-riaal uit een Erlenmeyer met een voorkweek van Pseudomonas cepacia CBS 659.88. Nadat het microorganisme voldoende was gegroeid, werd 750 ml van een waterige lactose/glucose-oplossing (lactosegehalte 560 g/1; glucosegehalte 10 g/1) toegevoegd. Gedurende de fermentatie werd met NaOH-oplossing getitreerd om de pH van het medium op ongeveer 7 te houden. De fermentatie werd na 50 uur beëindigd. Het product werd opgewerkt zoals in voorbeeld 1 is beschreven. Het gehalte aan lactobionzuur (in de vorm van het Na-zout) in het eindproduct bedroeg 85 gew.% (op basis van de droge stof).

Claims (6)

1. Werkwijze voor de fermentatieve oxydatie van reducerende disacchariden tot aldobionzuren, met het kenmerk, dat men een fermentatiemedium, dat een reducerend disaccharide en groeicomponenten bevat, onder aerobe condities behandelt met celmateriaal verkregen door de groei van microorganismen die tot de soort Pseudomonas cepacia behoren.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het celmateriaal verkregen is door de groei van de stam Pseudomonas cepacia CBS 659.88.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het celmateriaal verkregen is door de groei van de stam Pseudomonas cepacia CBS 658.88.

4. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men maltobionzuren of zouten daarvan vervaardigt door de fermentatieve oxydatie van maltosebevattende substraten.

5. Werkwijze volgens conclusies 1-3, met het kenmerk, dat men lactobionzuur of zouten daarvan vervaardigt door de fermentatieve oxydatie van lactosebevattende substraten.

6. Aldobionzuren of hun zouten verkregen door toepassing van de wrkwijzen volgens conclusies 1-5.