NL1005832C2 - Werkwijze voor de bereiding van CIS-(1S,2R)-aminoindanol. - Google Patents

Description

- 1 - PN 8985 WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN CIS-(IS.2RÏ-

AMINOINDANOL

5

De uitvinding betreft de enantioselectieve mineralisatie van cis-(lR,2S)-aminoindanol uit een racemisch mengsel van cis-l-amino-2-indanol, hetgeen 10 inhoudt dat cis-(lR,2S)-aminoindanol overwegend wordt gemetaboliseerd, waaarbij cis-(lS,2R)-aminoindanol achterblijft, door genoemd racemisch mengsel in contact te brengen met een micro-organisme of delen daarvan.

15 ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Cis-l-amino-2-indanol wordt bijvoorbeeld gebruikt in farmaceutische preparaten, in het bijzonder bij de bereiding van HIV-protease-inhibitoren die worden toegepast als farmaceutica ter bestrijding van 20 AIDS, zoals bijvoorbeeld beschreven door Thompson et al.in J. Med. 35, 1992.

Evenals bij andere chirale chemische producten, verschilt de biologische activiteit van farmaceutisch actieve bestanddelen als functie van de 25 stereochemie. Daarom is de stereochemie van de chirale tussenproducten die voor hun synthese worden gebruikt van belang. Bijgevolg heeft het (IS,2R)-enantiomeer van cis-l-amino-2-indanol de voorkeur voor de bereiding van de genoemde anti-AIDS-therapeutica.

30 Optisch actief cis-(lS,2R)-aminoindanol met een grote enantiomere overmaat (e.o.) kan worden verkregen door resolutie van het racemische mengsel van cis-l-amino-2-indanol. Als alternatief kan de chirale functie in een eerder stadium van de synthese worden 35 ingevoerd.

Stinson (Chem. & Eng. News, 6 (1994)) beschreef de bereiding van cis-(lS,2R)-aminoindanol via 10^5332 - 2 -

een asymmetrische epoxidatie van indeen onder toepassing van een optisch actieve mangaan-salen-katalysator. Het gevormde 1,2-epoxyindaan wordt omgezet in een Ritter reactie met behulp van bijvoorbeeld 5 acetonitril. Het resulterende oxazoline wordt daarna omgezet in het beoogde optisch actieve cis-l-amino-2-indanol. Een alternatieve route werd aangegeven door Van Eikeren (Chiral USA (1994); Chemspec, Manchester UK

(1994)), waarbij de Jacobson epoxidatie wordt gevolgd 10 door de omzetting van het resulterende 1,2-epoxyindaan in trans-l-(benzoylamino)-2-indanol. In twee volgende processtappen wordt het enantiomeer zuivere cis-1-amino-2-indanol bereid.

Een nadeel van beide processen is de 15 onvoldoende e.o. die rechtstreeks kan worden verkregen in de epoxidatiestap. Daardoor moeten verdere processtappen, zoals een extra, klassieke resolutie of één of meer kristallisaties, worden uitgevoerd om de benodigde enantiomere overmaat te bereiken.

20 Een derde proces, gekenmerkt door het voorkomen van optisch actief 1,2-epoxyindaan als product van een asymmetrische epoxidatie, wordt beschreven in 1990 (Tetrahedron Let. 31:7345). De gebruikte overeenkomstige katalysator maakt een hoge 25 enantiomere overmaat mogelijk waardoor verdere processtappen worden vermeden. Het resulterende epoxide kan rechtstreeks in bijvoorbeeld een Ritter reactie worden gebruikt onder behoud van de juiste chirale oriëntatie van het molecuul gedurende de omzetting in 30 cis-l-amino-2-indanol.

Een nadeel van deze procesbenadering is de slechte beschikbaarheid van de chirale katalysator, die moeilijk te bereiden is en in de handel niet verkrijgbaar is.

35 Bij een andere resolutiestrategie voor de bereiding van cis-(lS,2R)-aminoindanol waarin vroeg in de synthese optische activiteit wordt ingevoerd, wordt 1005832 - 3 - (IS,2R)-indaandiol als chiraal tussenproduct gebruikt. Dit diol kan uit indeen worden bereid in een biologische omzetting onder toepassing van micro-organismen. In WO-A-97/00966 wordt een dihydroxylering 5 van indeen beschreven door Pseudomonas putida Fl, hetgeen resulteert in de cis-(lS,2R)-verbinding met een enantiomere overmaat tot 90%.

Een nadeel van dit proces is de toch nog onvoldoende enantiomere overmaat, met als gevolg de 10 noodzaak verdere resolutiestappen in het proces te integreren. Verder resulteert deze biologische omzetting, behalve in het beoogde enantiomeer, in een mengsel van bijproducten zoals cis-(lR,2S)-indaandiol, 1-indanol, 1-indanon, en andere geoxideerde of 15 gehydroxyleerde indaanderivaten.

Het in een optische resolutie toe te passen racemisch cis-aminoindanol kan worden verkregen zoals beschreven in US-A-5.420.353, EP-A-480624 of WO-A-97/00237.

20 De optische resolutie van het racemische mengsel kan worden uitgevoerd door toevoeging van wijnsteenzuur zodat een diastereoisomeer-zuiver zout kan uitkristalliseren. Zoals beschreven in US-A-5420353 wordt cis-l-amino-2-indanol (100 g) opgelost in 25 methanol (1500 ml) gevolgd door de toevoeging van een oplossing van L-wijnsteenzuur (110 g) in methanol (1500 ml). Het mengsel werd verhit tot 60°C, daarna afgekoeld tot 20°C, gefiltreerd en gedroogd, hetgeen het zout van cis-(lS,2R)-aminoindanol en L-wijnsteenzuur (88 g) 30 opleverde.

Belangrijke nadelen van dit proces zijn het gebruik van organische oplosmiddelen en ten minste 1 equivalent splitsingsmiddel, dat na de reactie of moet worden afgevoerd of moet worden gerecycled. Bovendien 35 moet het proces geheel zonder water worden uitgevoerd en kunnen temperatuurschommelingen resulteren in de vorming van esters van wijnsteenzuur met het aanwezige 1005832 - 4 - oplosmiddel. Een ander nadeel van dit concept is de winning van het diastereoisomere zout als vaste stof, en de scheiding van het beoogde product van het gedurende de kristallisatie verkregen zout. Beiden 5 leiden tot een hogere kostprijs van het product, in vergelijking met processen waarin geen vaste stof gewonnen wordt.

Optisch actief 2-(4-hydroxyfenoxy)-propionzuur wordt ook gebruikt als een resolutiemiddel 10 bij de bereiding van cis-(lS,2R)-aminoindanol. Zoals beschreven in JP-A-07215922 kan een opbrengst van 95% worden verkregen bij een enantiomere overmaat van 97%.

Commerciële toepassing van dit proces wordt echter belemmerd door de kosten van 2-(4-15 hydroxyfenoxy)-propionzuur wanneer het wordt gebruikt als resolutiemiddel.

Bijgevolg worden de huidige processen voor de bereiding van optisch zuiver cis-(lS,2R)-aminoindanol gekenmerkt door lange reactietijden, hoge kosten voor 20 hulpmiddelen (oplosmiddelen en splitsingsmiddelen) en vaste-stof-verwerking. Bovendien zijn de processen in ecologisch opzicht minder aantrekkelijk.

De uitvinding beoogt het verschaffen van een eenvoudige werkwijze, waarbij optisch actief cis-1-25 amino-2-indanol met een hoge e.o. kan worden verkregen. Door enantioselectieve mineralisatie van cis-(lR,2S)-aminoindanol uit een racemisch mengsel van deze aminoalcohol, hetgeen inhoudt het in contact brengen van genoemd racemisch mengsel met een micro-organisme 30 of delen daarvan, wordt cis-(lR,2S)-aminoindanol overwegend gemetaboliseerd, waarbij cis-(lS,2R)-amino-indanol achterblijft, dat gemakkelijk, met een grote enantiomeer zuiverheid kan worden geëxtraheerd uit de waterfase. Verrassenderwijs is het mogelijk gebleken 35 met deze procesbenadering cis-(lS,2R)-aminoindanol met een grote enantiomere zuiverheid volgens een eenvoudige werkwijze te bereiden. Een verder voordeel van het 1005832 - 5 - mineralisatieproces is dat biomassa en kooldioxide de enige bijproducten van het resolutieproces zijn.

GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING 5

Micro-organismen zijn in staat verscheidene natuurlijke bronnen te benutten voor het verkrijgen van koolstof» stikstof en andere elementen voor hun groei en instandhouding. De substraten worden omgezet door de 10 metabolische activiteiten van de cellen die naast cellulaire tussenproducten, energie en kooldioxide voortbrengen. Dit oxidatieproces kan als mineralisatie worden aangeduid indien metabolische eindproducten zoals kooldioxide worden verkregen, die biologisch niet 15 verder kunnen worden geoxideerd. Mogelijke substraten voor dergelijke mineralisatieprocessen omvatten complexe substraten zoals proteïnehydrolysaten evenals bepaalde organische verbindingen zoals suikers of aminozuren, aromaten of heteroaromaten alsook andere in 20 de natuur voorkomende substraten.

Door microbiële screening uitgaande van water, slib en grondmonsters werden micro-organismen verkregen die verrassenderwijze in staat zijn te groeien met cis-l-amino-2-indanol als enige stik-25 stofbron. Bovendien is gebleken dat dit natuurlijke principe kan worden benut voor de synthese van optisch actief cis-(lS,2R)-aminoindanol onder toepassing van het racemische mengsel als substraat. Het ongewenste cis-(lR,2S)-aminoindanol wordt gemineraliseerd via het 30 metabolisme van de cel, resulterend in biomassa en kooldioxide, indien volledig wordt geoxideerd. Cis-(1S,2R)-amino-indanol blijft achter in een grote enantiomere overmaat, hoger dan 97%, in het bijzonder hoger dan 99%.

35 Voor de uitvoering van de beschreven werkwijze kan elk micro-organisme worden toegepast, dat wordt gekenmerkt door het overwegend metaboliseren van 1005832 - 6 - cis-(lR,2S)-aminoindanol wanneer het in contact wordt gebracht met een racemisch mengsel van l-amino-2-indanol. Bij voorkeur wordt gebruik gemaakt van organismen behorend tot de geslachten Klebsiella.

5 Pseudomonas en Aarobacterium. Meer in het bijzonder worden organismen toegepast geclassificeerd als Klebsiella oxvtoca, Pseudomonas putida. in het bijzonder Pseudomonas putida 0-15-4-2-2, en Aarobacterium radiobacter. die in staat zijn een 10 optische resolutie van cis-1,2-aminoindanol uit te voeren. Met name Klebsiella oxvtoca DSM 11495, en Aarobacterium radiobacter DSM 11479 bleken bijzonder goede resultaten te geven bij het uitvoeren van de asymmetrische scheiding van de twee enantiomeren van 15 cis-1,2-aminoindanol.

Het kweken van de organismen wordt in de praktijk vaak uitgevoerd bij een temperatuur tussen 20 en 50°C, bij voorkeur bij een temperatuur van 28 tot 30°C. De culturen worden vaak geïncubeerd bij een pH-20 waarde tussen 5 en 9, bij voorkeur bij een pH-waarde van 6,5 tot 7,5. De culturen worden belucht door het doorvoeren van een gas dat moleculaire zuurstof bevat ofwel door toevoeging van een andere gasvormige of vloeibare verbinding die door de organismen als 25 zuurstofbron kan worden gebruikt. Een alternatief is mechanisch roeren of schudden.

De reactie van het micro-organisme met het substraat cis-l-amino-2-indanol kan in een batch- of fedbatch-proces ofwel op continue wijze worden 30 uitgevoerd. Bij het batchproces worden alle substraten bij het begin van de reactie in het reactiemengsel gebracht. In tegenstelling hiermee worden in het fedbatch-proces de substraten gedeeltelijk toegevoegd gedurende het lopende proces. Bij een continu proces 35 kunnen het racemische cis-l-amino-2-indanol en de andere componenten van het medium afzonderlijk worden toegevoegd om de productvorming los te koppelen van de 1005832 - 7 - verblijftijd. De concentraties van zowel het substraat als het product kunnen zodanig zijn dat zij in opgeloste vorm in het reactiemengsel aanwezig zijn. De concentraties kunnen ook zo hoog gekozen worden dat een 5 deel van het substraat en/of product in vaste vorm voorkomt. In het laatste geval hebben we te maken met slurry-mineralisatie. Eenstapsprocessen (synthese in één pot) worden gekenmerkt door de resolutie van cis- 1,2-amino-indanol tegelijkertijd met de groei van de 10 cellen. Bij tweestapsprocessen worden de micro- organismen vooraf gekweekt en de biomassa, of delen daarvan, wordt, na afscheiding, in contact gebracht met het substraat cis-l-amino-2-indanol. Deze benadering maakt tevens kruisvoeding mogelijk, dat wil zeggen de 15 toevoeging van specifieke componenten van het medium, om de omzetting van amino-indanol in de tweede processtap verder te verbeteren, zoals bekend is in de techniek. Bekende voorbeelden van dergelijke componenten van het medium zijn α-oxoglutaraat en 20 Triton X100.

Voor het kweken van de micro-organismen kunnen verscheidene mengsels van verbindingen worden gebruikt, die in de gebruikte samenstelling de groei van de cellen onder de in het voorgaande beschreven 25 omstandigheden mogelijk maken. Al naar gelang de procesbenadering kan als koolstofbron gebruik worden gemaakt van koolhydraten, zoals glucose of sucrose, of organische zuren, zoals azijnzuur, melkzuur, barnsteenzuur of zouten daarvan, of cis-l,2-amino-30 indanol. Organische stikstofbevattende verbindingen, zoals gistextract, casaminozuren, pepton, mais-weekvloeistof, of anorganische stikstofbevattende chemicaliën, zoals ammoniumsulfaat of ammoniumfosfaat, of cis-1,2-amino-indanol kunnen worden toegepast als 35 stikstofbron. Indien nodig worden vitaminen en spoorhoeveelheden organische of anorganische zouten aan het medium toegevoegd.

1005832 - 8 -

Behalve volledige mineralisatie kunnen in de werkwijze volgens de uitvinding ook specifieke metabolische tussenproducten van de biologische afbraak van cis-(lR,2S)-aminoindanol worden verkregen. Deze 5 tussenproducten kunnen desgewenst worden gerecycleerd en worden hergebruikt voor de synthese van racemisch cis-l-amino-2-indanol. Voor een dergelijke onvolledige mineralisatie kan de biokatalysator in verschillende vormen worden toegepast. Naast levensvatbare cellen 10 kunnen de cellen volgens chemische of fysische methoden worden behandeld om hun membranen te perforeren teneinde transport door de membranen te optimaliseren. Voorts kunnen extracten van de cellen worden toegepast evenals gezuiverde enzympreparaten of elk deel van de 15 cellen, die de voor de stereospecifieke afbraak van cis-(lR,2S)-aminoindanol verantwoordelijke activiteiten bevatten.

Dankzij de afwezigheid van structureel verwante verbindingen in het geval van volledige 20 mineralisatie, is de verdere verwerking van cis- (1S,2R)-aminoindanol eenvoudig en kan deze verwerking worden uitgevoerd onder gebruikmaking van standaardmethoden, zonder echter daartoe beperkt te zijn. Om cis-(lS,2R)-aminoindanol te isoleren uit de waterige 25 reactie-oplossing kan de biokatalysator worden afgescheiden door centrifugeren, filtreren of volgens een willekeurige andere geschikte scheidingsmethode. Daarna wordt bijvoorbeeld het product geëxtraheerd in een organisch oplosmiddel, bijvoorbeeld tolueen of 30 dichloormethaan, onder geschikte omstandigheden. De extractie wordt bij voorkeur bij een temperatuur tussen 40 en 90°C uitgevoerd. In geval van slurry mineralisatie kan een pH-shift naar lagere pH-waarden, bijvoorbeeld naar een pH-waarde kleiner dan 3, worden 35 uitgevoerd om alle vaste cis-l-amino-2-indanol op te lossen, waarna de biomassa kan worden afgescheiden. Vervolgens kan cis-(lS,2R)-aminoindanol -als de vrije 1005832 - 9 - verbinding beoogd wordt na pH-shift naar basisch milieu- via kristallisatie worden geïsoleerd uit de waterfase of, na pH-shift naar basisch milieu en extractie, uit een organisch oplosmiddel.

5 Kwantificering van de enantiomere overmaat van het door mineralisatie van cis-(lR,2S)-aminoindanol verkregen cis-(lS,2R)-aminoindanol kan worden uitgevoerd door HPLC (kolom: Nucleosil* 120-5 C18, 25,4 mm; buffer: KH2P04 (3,5 g.l-1), Na2HP04 (5,8 g.l'1), pH 10 7, temperatuur: 40°C, pre-kolomderivatisering met A 30 mM o-ftaalaldehyde in methanol/water (1:1), B 30 mM L-NAC in methanol/water (1:1)).

VOORBEELD I

15 Voor de selectie van een biokatalysator die in staat is cis-(lR,2S)-aminoindanol enantioselectief te verbruiken, werden 40 verschillende natuurlijke monsters van afvalwater, afvalwaterslib en grond (gedeeltelijk verontreinigd) gebruikt als 20 uitgangsmateriaal. Deze monsters werden geïncubeerd in complexmedium alsook in mineraalmedium. Het complex-medium bestond uit gistextract (10,0 g.l-1), pepton (10,0 g.l-1) en NaCl (5,0 g.l-1). Het mineraalmedium bevatte MgS04.7H20 (0,3 g.l-1), KH2P04 (3,0 g.l-1), K2HP04 25 (12,0 g.l-1), NaCl (0,1 g.l-1), (NH4)2S04 (5,0 g.l-1),

CaCl2.2H20 (15,0 mg.l-1) en FeS04.7H20 (0,75 g.l-1). Verdere mineralen werden toegevoegd als stamoplossing (1 ml.I"1) bevattend A12(S04)3.18H20 (2,0 g.l-1),

CoS04.6H20 (0,7 g.l-1), CuS04.5H20 (2,5 g.l-1), H3B03 (0,5 30 g.l-1), MnCl2.4H20) (20,0 g.l-1), Na2Mo04.2H20 (3,0 g.l- 1), NiS04.3H20 (2,0 g.l-1) en ZnS04.7H20 (15,0 g.l"1). Het medium werd gédurende 15 min bij 121°C behandeld in een autoclaaf. Een oplossing van thiamine-HCl werd aan het steriele medium toegevoegd (5,0 mg.l-1) nadat het was 35 gemicrofiltreerd. Cis-(lR,2S)-aminoindanol (2 g.l-1) werd toegevoegd als enige stikstofbron alvorens het medium te steriliseren; als koolstofbron gebruikte 1005832 - 10 - glucose (5 g.l-1) werd als steriele oplossing toegevoegd. Het kweken werd uitgevoerd bij 28, 37 en 52°C. Organismen die in staat waren te groeien in mine-raalmedium onder het verbruiken van cis-(lR,2S)-amino-5 indanol als enige stikstofbron, werden gekweekt in vergelijkingsproeven onder toepassing van cis-(lR,2S)-aminoindanol, cis-(lS,2R)-aminoindanol alsook het racemaat als stikstofbron.

Bovendien zetten andere micro-organismen, in 10 het bijzonder Klebsiella oxvtoca DSM 11495 en

Aorobacterium radiobacter DSM 11479 selectief het cis-(IR,2S)-enantiomeer om, dat wil zeggen dat zij groeiden op dit enantiomeer en het racemaat, maar dat zij geen of slechts een zeer trage groei vertoonden op 15 cis-(lS,2R)-aminoindanol (figuur 1 en 2).

Klebsiella oxvtoca DSM 11495 en Aorobacter ium radiobacter DSM 11479 zijn gedeponeerd bij de Duitse collectie voor micro-organismen en celculturen (DSMZ), onder nummer DSM 11495 respectievelijk DSM 11479.

20

VOORBEELD II

Klebsiella oxvtoca DSM 11495 werd gekweekt in een mineraalmedium als beschreven in Voorbeeld I. De incubatie van het organisme werd uitgevoerd in schud-25 kolven (volume 1000 ml, werkvolume 100 ml) bij 28°C op een roterende schudmachine (150 omw./min). Monsters (5 ml) werden regelmatig genomen voor de meting van de optische dichtheid (OD 600 nm) van de cultuur, alsook de concentratie van beide cis-enantiomeren.

30 Laatstgenoemde werden gebruikt voor de berekening van de enantiomere overmaat in de overeenkomstige omzettingen.

De overeenkomstige resultaten (figuur 3) wijzen uit dat door de toepassing van Klebsiella 35 oxvtoca DSM 11495 bij het mineralisatieproces een enantiomeerovermaat groter dan 98,5% kan worden bereikt bij een omzetting van 57%.

1005832 - 11 -

VOORBEELD III

In een schudkolf van 5 1 (werkvolume 2 1) werd Klebsiella oxvtoca DSM 11495 gedurende 67 h gekweekt zoals bovenstaand beschreven in een 5 mineraalmedium (zie voorbeeld I) bevattend cis-aminoindanol (2 g.l-1) en glucose (30 g.l-1). Na beëindiging van de incubatie werd de biomassa gesedimenteerd door centrifugeren. De bovenste laag werd verzameld en het volume ervan werd verminderd tot 10 235 ml bij 60°C in een vacuumverdamper. Daarna werd de productoplossing ingesteld op pH 13 door toevoeging van 200 ml 2,5 M NaOH. Na tweemaal extraheren met 200 ml dichloormethaan werd de organische fase gedroogd op natriumsulfaat en verdampt bij 50°C, hetgeen 15 resulteerde in 1,4 g van een witte stof. Deze stof werd geanalyseerd met TLC en NMR en geïdentificeerd als cis-(lS,2R)-amino-indanol met een enantiomere overmaat van 98%.

20 VOORBEELD IV

Om de tweestapswerkwijze te demonstreren werd in een schudkolf van 5 1 (werkvolume 21) Klebsiella oxvtoca DSM 11495 gedurende 67 h gekweekt zoals in het voorgaande beschreven in een mineraalmedium (zie 25 voorbeeld I), bevattend racemisch cis-1,2-aminoindanol (2 g.l-1) en glucose (30 g.l-1). Na beëindiging van de incubatie werd de biomassa gesedimenteerd door centrifugeren en tweemaal uitgewassen met fosfaatbuffer (50 mM, pH 7). De cellen werden verzameld en bewaard in 30 100 ml buffer.

In parallelproeven werd 20 ml celsuspensie geïncubeerd met 0,04 g racemisch cis-aminoindanol, waarbij Triton X100 en/of α-oxoglutaraat als hulpmiddelen werden toegevoegd in het reactievat.

35 1005832 - 12 - celsuspensie amino- α-oxoglu- Triton indanol taraat X100 [ml] [g] [g] [ml] A 20 ml buffer 0,04 0,04 0,04 B 20 ml 0,04 C 20 ml 0,04 0,04 5 D 20 ml 0,04 0,04 0,04

Na 0, 1,5, 4, 20 en 28 uur werden monsters genomen en geanalyseerd op de concentratie van beide enantiomeren 10 van cis-aminoindanol. De resultaten werden gebruikt voor de berekening van de enantiomere overmaat als maatstaf voor de samenstelling van het reactiemengsel.

Zoals weergegeven in figuur 4 vond geen reactie plaats bij afwezigheid van de cellen (blanco 15 reactie) alsook bij afwezigheid van α-oxoglutaraat.

Door toevoeging van dit hulpmiddel nam de enantiomere overmaat van cis-(lS,2R)-aminoindanol in het reactiemengsel echter toe, waar de omzetting van het ongewenste enantiomeer werd aangetoond. Door toevoeging 20 van Triton X100 kon de reactie verder worden verbeterd.

1005832

Claims (14)

1. Werkwijze voor de bereiding van optisch actief 5 cis-(lS,2R)-aminoindanol, met het kenmerk, dat een racemisch mengsel van cis-l-amino-2-indanol in contact wordt gebracht met een micro-organisme of delen daarvan, waardoor cis-(lR,2S)-aminoindanol overwegend wordt gemetaboliseerd en cis-(lS,2R)-10 aminoindanol overwegend achterblijft.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het verkregen reactiemengsel wordt onderworpen aan biomassaverwijdering en aan pH-shift.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin eerst de 15 biomassa wordt verwijderd van het reactiemengsel en vervolgens de supernatant wordt onderworpen aan de pH-shift.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin een slurry-mineralisatie wordt uitgevoerd waarna het 20 reactiemengsel wordt onderworpen aan een pH-shift naar lagere waarden, gevolgd door biomassa-verwijdering en isolatie van het cis-(lS,2R)-aminoindanol.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 2-4, waarin 25 vervolgens cis-(lS,2R)-aminoindanol wordt geëxtraheerd in een organisch oplosmiddel.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 2-5, waarin vervolgens cis-(lS,2R)-aminoindanol wordt geïsoleerd via kristallisatie.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, met het kenmerk, dat het micro-organisme behoort tot het geslacht Klebsiella. Pseudomonas of Aarobacterium.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het micro-organisme behoort tot een soort 35 gekozen uit Klebsiella oxvtoca. Pseudomonas putida en Aarobacterium radiobacter. 1005832 - 14 -

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het micro-organisme Klebsiella oxvtoca DSM 11495, of Aarobacterium radiobacter DSM 11479 is.

10. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-9, 5 waarin levende cellen worden gebruikt onder omstandigheden die groei van de cellen mogelijk maken.

11. Werkwijze volgens één van de conclusies 1-9, waarin in een tweestapsproces het micro-organisme 10 eerst wordt gekweekt en vervolgens na groei en afscheiding van de cellen biomassa of delen daarvan in contact worden gebracht met racemisch cis-l-amino-2-indanol.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin bovendien 15 componenten van het medium die de reactie ondersteunen aan het reactiemengsel worden toegevoegd.

13. Werkwijze volgens een der conclusies 1-12, waarin vervolgens het verkregen optisch actieve cis- 2 0 (IS,2R)-aminoindanol wordt omgezet in een HIV- protease-inhibitor.

14. Werkwijze zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden. 1005832