KR100336443B1

KR100336443B1 - 광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 신규 미생물 및이를 이용한 (에스)-프로펜의 제조방법

Info

Publication number: KR100336443B1
Application number: KR1020000002565A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 이은교; 유연우
Original assignee: 복성해; 한국생명공학연구원
Priority date: 2000-01-20
Filing date: 2000-01-20
Publication date: 2002-05-15
Also published as: KR20010073740A

Abstract

본 발명은 광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 신규한 미생물 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1 및 이를 이용하여 (S)-프로펜을 광학선택적으로 제조하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 신균주 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1을 사용하면, 라세믹 프로펜 에스테르로부터 약리활성이 있는 광학적으로 순수한 (S)-프로펜을 고효율로 생산할 수 있다.

Description

광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 신규 미생물 및 이를 이용한 (에스)-프로펜의 제조방법{NOVEL MICROORGANISM EXHIBITING AN ACTIVITY OF ENANTIOSELECTIVE HYDROLASE AND PRODUCTION OF (S)-PROFEN USING SAME}

본 발명은 광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 신규한 미생물 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1 및 이를 이용하여 (S)-프로펜을 광학선택적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

화학합성에 의해 생산되는 의약품들은 같은 몰농도로 거울상 이성질체(enantiomer)가 혼합된 라세믹 물질(racemate)의 형태로 얻어지는 것이 일반적인데, 대부분 한 종류의 이성질체만이 약리 활성을 나타내며 다른 하나는 활성이 없거나 부작용을 일으키기도 한다. 이와 같이 안정성 및 활성의 측면에서 단일 거울상 이성질체의 생산이 중요시되고 있어, 최근 의약품 산업은 기존의 라세믹 의약품을 약리활성이 있는 단일 이성질체로 전환시키고, 앞으로 새롭게 개발될 의약품 역시 순수한 형태만을 생산하는 추세에 있다.

한편, 케토프로펜(2-[3-벤조일페닐] 프로피온산)은 비스테로이드계 소염진통제(non-steroidal anti-inflammatory drugs)로서 생체내 프로스타글란딘 (prostaglandin) 촉매의 활성을 감소시킴으로써 통증을 완화시키는 작용을 한다. 이러한 케토프로펜을 비롯한 이부프로펜, 나프록센, 페노프로펜 및 수프로펜 등과 같은 프로펜류 의약품은 키랄 중심의 한편에 벤젠고리를, 다른 한편에 메틸기 및 카복실기를 가지며, 약리작용은 대부분 (S)-프로펜에 의한 것으로 (R)-프로펜은 약리활성이 없는 것으로 알려져 있다.

따라서, 순수한 거울상 이성질체의 프로펜을 얻기 위한 여러 가지 방법들이 연구되었으며, 이들 중에는 키랄성을 갖는 라세믹 화합물로부터 얻는 합성법과 키랄성을 갖지 않는 화합물로부터 얻는 비대칭 합성법(asymmetric synthesis)이 있다.

구체적으로는, 라세믹 프로펜과 키랄성 물질(예: 페닐에틸아민, (-)-신초니딘(cinchonidine) 등)을 유기용매 상에서 반응시켜 순수한 프로펜을 결정으로 얻는 입체선택성 결정법이 미국 특허 제4,983,765호 및 제5,162,576호에 개시되어 있다.

또한, 효소를 생산하는 미생물 세포를 생촉매로서 사용하여 라세믹 화합물로부터 순수한 거울상 이성질체를 분리하는 방법이 선행기술에 개시되어 있는데, 뛰어난 광학선택성 및 반응조건의 온화함이라는 장점 때문에 화학촉매 대신에 효소의 사용이 많이 연구되고 있으며, 효소는 기질특이성이 넓어 비슷한 종류의 물질에도 폭넓게 응용이 가능하다.

예를 들어, 광학적으로 순수한 케토프로펜의 시판을 준비하고 있는 세프라코사(Sepraco Co., 미국)의 미국 특허 제5,457,051호에는 케토프로펜으로부터 케토프로펜 클로린에스테르를 합성한 후 (R)-이성질체에 선택성이 있는 보베리아 바시아나(Bauveria bassiana) 유래의 리파아제(lipase)를 이용하여 (R)-케토프로펜을 선택적으로 가수분해하는 공정이 개시되어 있다. 또한, 미국 특허 제5,516,690호에는 트리코스포론 레바치(Trichosporon laibacchii)를 이용하여 케토프로펜 에스테르로부터 (S)-케토프로펜을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법들은 제조하고자 하는 순수 거울상 이성질체로의 광학선택성에 한계를 가지고 있다.

이에, 본 발명자들은 광학선택성이 탁월한 효소를 생산하는 미생물을 개발하기 위해 노력한 결과, 토양에서 분리된 수도모나스 종(Pseudomonas sp.)의 신균주가 탁월한 광학선택성 가수분해효소 활성을 가져 순수한 (S)-프로펜을 효율적으로 생산할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 신규 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 미생물을 사용하여 (S)-프로펜을 광학선택적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 미생물 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1(KCTC 0688BP); 및 상기 미생물을 라세믹 프로펜 에스테르와 반응시켜 (S)-프로펜을 제조하는 방법이 제공된다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따른 신규 미생물 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1은 토양에서 분리되는 토양 미생물로서 트리부티린(tributyrin)을 선별배지로 하여 분리될 수 있다. 이 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1은 막대 형태를 가지며 pH 6.0 내지 7.0 및 약 30℃의 호기 조건에서 빠른 성장을 보인다. 또한, 이 미생물은 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1999년 11월 8일자로 기탁번호 제 KCTC 0688BP 호로 기탁되어 있다.

본 발명에 따른 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1는 광학선택성 가수분해효소 활성을 가져 미생물내 가수분해효소에 의해 라세믹 프로펜 에스테르를 광학선택적으로 (S)-프로펜으로 전환시킨다. 라세믹 프로펜 에스테르는 통상적인 방법으로 라세믹 프로펜으로부터 합성될 수 있으며, 광학선택적으로 전환되는 (S)-프로펜의 예로는 케토프로펜, 이부프로펜, 나프록센, 페노프로펜 및 수프로펜 등을 들 수 있다.

본 발명에 따르면, 미생물에 의한 순수한 거울상 이성질체로의 전환반응은 미생물의 세포 성장과 동시에, 또는 회수 균체를 이용하여 수행될 수 있다. 상기 전환반응이 세포 성장과 동시에 수행되는 경우에는 프로펜 에스테르가 성장배지의 기질로서 사용되며, 이때 배양 초기부터 프로펜 에스테르 기질을 첨가하기보다는 초기 정상상(플라스크 배양시 16 내지 20시간 경과)에 첨가하는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 회수 균체를 이용하여 전환반응을 수행하는 경우에도 초기 정상상까지배양한 세포를 원심분리기 등으로 회수하여 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는, 프로펜 에스테르가 유기용매와 비슷한 에스테르 형태이어서 세포 성장에 저해를 주기 때문이다.

이와 같이, 본 발명에 따른 (S)-프로펜의 제조반응은 효소 반응으로서 가수분해효소가 활성을 나타내는 pH 범위로서 5.0 내지 9.5, 바람직하게는 8.0 내지 9.0을, 온도 범위로서 15 내지 60℃, 바람직하게는 25 내지 50℃를 유지시키는 것이 중요하며, 상기 바람직한 pH 및 온도 범위내에서만이 본 발명에 따른 미생물의 활성 및 광학선택성을 최대로 이끌 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 미생물의 광학선택성을 증가시키기 위해, 계면활성제 및 유기용매를 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 계면활성제 및 유기용매는 불용성인 프로펜 에스테르 기질과 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1 사이의 반응성을 향상시켜 (S)-프로펜으로의 광학선택성의 증가를 가져올 수 있다. 본 발명에 사용되는 계면활성제의 예로는 트리톤(triton) X-15, 45, 100, 165 및 305, 및 트윈(tween) 20 및 80 등을 들 수 있으며, 0.1 내지 20 중량%로 반응액에 첨가될 수 있다. 또한, 본 발명에 사용되는 유기용매의 예로는 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 사이클로헥산, 헥산, 에탄올, 클로로포름 및 벤젠 등을 들 수 있으며, 0.1 내지 50 중량%로 반응액에 첨가될 수 있다.

본 발명의 신균주 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1을 사용하면, 라세믹 프로펜 에스테르로부터 약리활성이 있는 광학적으로 순수한 (S)-프로펜을 고효율로 생산할 수 있다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.

참조예: 라세믹 케토프로펜 에틸에스테르의 제조

라세믹 케토프로펜 30g 및 에탄올 100ml를 혼합하고 촉매로서 황산 2.5ml를 사용하여 90℃에서 5시간동안 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 미반응 에탄올은 진공증발기를 사용하여 제거하고, 미반응 라세믹 케토프로펜은 1M의 탄산나트륨(NaHCO₃)으로 3회 이상 추출하여 상층에서 제거함으로써 하층에서 목적하는 라세믹 케토프로펜 에틸에스테르를 수득하였다.

실시예 1: 수도모나스 종( Pseudomonas sp. ) BHY-1의 분리 및 동정

수집된 각종 토양시료를 적당히 희석하여 하기 표 1의 조성을 갖는 TS 배지에 접종하고 30℃에서 1일간 배양하여 투명환(clear zone)을 형성하는 균주를 선별하였다. 선별배지로는 트리부티린 10g/L를 사용하였다. 이어, 선별된 균주를 분리하고, API 키트 분석 및 기체 크로마토그래피에 의한 지방산 분석(MIDI)에 따라 균학적 연구를 수행하였다. 그 결과, 분리된 상기 균주가 수도모나스 종임을 알 수 있었으며, 이 균주를 케토프로펜 에스테르 25mM이 첨가된 TS 배지에 접종하여 30℃에서 1일간 배양하면서 관찰한 결과 (S)-케토프로펜으로의 거울상 이성질화 과잉율 및 이성질화비가 매우 높음을 확인하였다.

본 발명자들은 이 균주를 수도모나스 종 BHY-1로 명명하고, 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 11월 8일자로 기탁번호 제 KCTC 0688BP 호로 기탁하였다.

배지 조성	농도 (g/L)
트립톤(Tryptone)	17
소이톤(Soytone)	3
염화나트륨(NaCl)	5
인산칼륨(K₂HPO₄)	2.5
포도당	2 - 20

실시예 2: 성장 세포를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 온도의 영향

상기 표 1의 조성을 갖는 성장 배지(TS 배지: pH 8.5) 50mL를 함유하는 500mL 플라스크에 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1을 균체 농도가 100g/L가 되도록 첨가한 후, 각각 25, 30, 37 및 50℃에서 배양하였다. 배양한지 18시간이 경과한 후 세포가 초기 정상상에 도달하면, 상기 참조예에서 수득된 라세믹 케토프로펜 에틸에스테르를 기질로서(기질량: 25mM) 상기 배양액에 첨가하고 각각의 배양온도와 동일한 온도에서 24시간동안 반응시켰다.

결과적으로 생성된 반응액을 액체 크로마토그래피에 의해 분석하여 생성된 (S)-케토프로펜과 (R)-케토프로펜의 농도를 결정하고, 이들의 양으로부터 (S)-케토프로펜 전환율(conversion rate)(%), 거울상 이성질화 과잉율(enantiomeric excess rate)(%) 및 거울상 이성질화비(enantiomeric ratio) 각각을 하기 수학식 1 내지 3에 따라 계산하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

온도(℃)	25	30	37	50
전환율(%)	12.8	16.0	15.0	16.1
거울상 이성질화 과잉율(%)	93.1	96.0	95.2	95.4
거울상 이성질화비	32.0	58.6	47.7	50.8

상기 표 2로부터 알 수 있듯이, 온도에 따라 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1의 광학선택성은 변화하였으며, 30℃에서 전환율 및 광학선택성이 가장 높았고, 50℃의 높은 온도에서도 활성을 보였다.

참고로, TS 배지에서 탄소원으로 사용된 포도당 이외에 갈락토즈, 프럭토즈, 락토즈, 말토즈 또는 설탕 등을 사용하였을 경우에도 거울상 이성질화 과잉율이 99% 이상을 나타내었다.

실시예 3: 성장 세포를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 기질 첨가시기의 영향

30℃에서 라세믹 케토프로펜 에틸에스테르 기질을 접종 초기 및 초기 정상상(배양한지 18시간 경과)에 첨가하여 24시간동안 반응시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

기질 첨가시기	접종 초기	초기 정상상
전환율(%)	13.5	19.7
거울상 이성질화 과잉율(%)	92.8	100
거울상 이성질화비	30.8	100

실시예 4: 성장 세포를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 계면활성제의 영향

30℃에서 계면활성제로서 트리톤 X-15, 45, 100 및 165, 및 트윈 80 각각을 2%씩 배양액에 첨가하여 96시간동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

계면활성제 종류	기준*	트리톤X-15	트리톤X-45	트리톤X-100	트리톤X-165	트윈 80
전환율(%)	18.5	31.0	41.6	45.8	48.2	27.7
거울상 이성질화 과잉율(%)	99.3	75.8	100	100	99.4	100
거울상 이성질화비	100	100	100	100	100	100
* 기준 : 계면활성제를 첨가하지 않은 경우

상기 표 4로부터, 계면활성제는 전환율과 광학선택성의 상당한 증가를 가져왔으며, 특히 트리톤 X-100 및 165는 약 2.5배의 전환율의 증가를 가져왔음을 알 수 있다.

실시예 5: 성장 세포를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 유기용매의 영향

30℃에서 유기용매로서 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 사이클로헥산, 클로로포름 및 벤젠 각각을 5%씩 배양액에 첨가하여 120시간동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

유기용매 종류	기준*	디메틸포름아미드	테트라하이드로푸란	사이클로헥산	클로로포름	벤젠
전환율(%)	18.1	10.2	10.6	14.4	1.6	6.9
거울상 이성질화 과잉율(%)	93.8	100	94.2	96.7	100	100
거울상 이성질화비	33.7	100	35.8	57.1	100	100
* 기준 : 유기용매를 첨가하지 않은 경우

상기 표 5로부터, 유기용매는 전환율은 다소 감소시키나 광학선택성은 증가시켜 최종적으로 거울상 이성질화비를 증가시키며, 특히 디메틸포름아미드, 클로로포름 및 벤젠은 광학선택성을 상당히 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 6: 회수 균체를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 pH의 영향

상기 표 1의 조성을 갖는 성장 배지(TS 배지: pH 8.5) 200mL를 함유하는 1L 플라스크에 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1을 접종한 후 37℃에서 배양하였다. 배양한지 18시간이 경과하여 초기 정상상에 이르렀을 때 배양세포를 원심분리기로 회수하여 전세포 효소로 사용하는 실험을 수행하였다. 회수된 배양세포액에 상기 참조예에서 수득된 라세믹 케토프로펜 에틸에스테르를 25mM 첨가한 후, 시트르산 완충용액을 사용하여 pH를 4.0, 5.0 및 6.0으로, 다르게는 트리스(Tris-HCl) 완충용액을 사용하여 pH를 7.0, 8.0, 8.5 및 9.0으로 각각 조절한 다음, 30℃에서 24시간동안 반응시켰다.

상기 실시예 2와 동일한 방법으로 반응액을 분석하여 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

pH	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	8.5	9.0
전환율(%)	0	3.0	4.8	6.6	9.9	14.5	13.5
거울상 이성질화 과잉율(%)	0	92.6	88.7	90.8	86.5	92.3	87.5
거울상 이성질화비	0	28.4	17.5	22.1	15.2	29.1	17.2

상기 표 6으로부터 알 수 있듯이, pH 8.5인 경우에 미생물은 가장 높은 활성을 나타내었다.

실시예 7: 회수 균체를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 온도의 영향

pH 8.5에서 온도를 각각 25, 30, 37 및 50℃로 변화시켜 반응시킨 것을 제외하고는 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.

온도(℃)	25	30	37	50
전환율(%)	11.8	14.5	17.7	17.6
거울상 이성질화 과잉율(%)	93.1	92.3	95.2	95.4
거울상 이성질화비	32	29	48	51

상기 표 7로부터 알 수 있듯이, 온도가 높을수록 높은 활성을 나타내었으며, 37℃ 이후부터는 비슷한 활성을 보였다.

실시예 8: 회수 균체를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 계면활성제의 영향

37℃ 및 pH 8.5에서 계면활성제로서 트리톤 X-15, 45, 100 및 165, 및 트윈 80 각각을 2%씩 반응액에 첨가하여 24시간동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

계면활성제 종류	기준*	트리톤X-15	트리톤X-45	트리톤X-100	트리톤X-165	트윈 80
전환율(%)	14.0	28.9	30.2	21.3	33.2	32.5
거울상 이성질화 과잉율(%)	95.9	98.8	98.3	97.7	96.7	97.9
거울상 이성질화비	57.1	100	100	100	100	100
* 기준 : 계면활성제를 첨가하지 않은 경우

상기 표 8로부터, 계면활성제가 전환율과 광학선택성의 상당한 증가를 가져옴을 알 수 있다.

실시예 9: 회수 균체를 이용한 (S)-케토프로펜의 제조시 유기용매의 영향

37℃ 및 pH 8.5에서 유기용매로서 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 헥산, 에탄올 및 벤젠 각각을 5%씩 반응액에 첨가하여 24시간동안 반응시킨 것을 제외하고는, 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실험을 수행하여 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

유기용매 종류	기준*	디메틸포름아미드	테트라하이드로푸란	헥산	에탄올	벤젠
전환율(%)	24.2	33.1	28.5	31.1	14.5	15.4
거울상 이성질화 과잉율(%)	91.0	98.1	100	97.3	100	100
거울상 이성질화비	28.1	100	100	100	100	100
* 기준 : 유기용매를 첨가하지 않은 경우

상기 표 9로부터, 에탄올 및 벤젠의 경우, 전환율은 다소 감소시키나 광학선택성은 증가시켜 최종적으로 거울상 이성질화비를 증가시키고, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란 및 헥산의 경우에는 전환율 및 광학선택성 모두를 증가시킴을 알 수 있다.

Claims

광학선택성 가수분해효소 활성을 갖는 수도모나스 종(Pseudomonas sp.) BHY-1(KCTC 0688BP).
수도모나스 종 BHY-1(KCTC 0688BP)을 라세믹 프로펜 에스테르와 반응시켜 (S)-프로펜을 제조하는 방법.
제 2 항에 있어서,

수도모나스 종 BHY-1이 배양을 거쳐 초기 정상상에 도달한 것임을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,

수도모나스 종 BHY-1을 배양하여 세포가 초기 정상상에 도달하면 배양액에 프로펜 에스테르를 첨가하여 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서,

배양된 수도모나스 종 BHY-1을 회수하여 프로펜 에스테르와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

라세믹 프로펜 에스테르로부터 (S)-프로펜으로의 전환반응을 pH 2.0 내지 9.5 및 15 내지 60℃의 온도 범위에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

트리톤(triton) X-15, 45, 100, 165 및 305, 및 트윈(tween) 20 및 80으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 계면활성제를 반응액에 0.1 내지 20 중량%로 첨가함으로써 광학선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서,

디메틸포름아미드, 테트라하이드로푸란, 사이클로헥산, 헥산, 에탄올, 클로로포름 및 벤젠으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매를 반응액에 0.1 내지 50 중량%로 첨가함으로써 광학선택성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.