JP4536484B2 - 光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法 - Google Patents
光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法 Download PDFInfo
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本発明は、光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法等に関する。一般式（２）で表される光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルは種々の医薬品、例えば、血糖及び血中脂質低下作用を有する糖尿病治療薬（例えば、特許文献１参照）等の有効成分の重要合成中間体である。
従来、一般式（２）で示される光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを製造するには、ｐ−メトキシフェネチルマグネシウムブロマイドと光学活性クリシド酸エステルとより化学合成する方法（例えば、特許文献１参照）等が知られている。
しかしながら、光学活性グリシド酸エステルの原料である光学活性セリンが工業的に高価である等の問題点を有している。
本発明者等は、かかる状況の下鋭意検討した結果、本発明に至った。
本発明は、
１．一般式（１）
１．一般式（１）
で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルを、一般式（２）
で示される光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルに不斉的に還元する能力を有する、アルスロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、ヤマダジーマ（Yamadazyma）属、キャンディダ（Candida）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、クロエッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属及びコマガタエラ（Komagataella）属に属する微生物群の中から選ばれた微生物又はその処理物を一般式（１）で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルに接触させることを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法（以下、本発明製造方法と記すこともある。）；
２．前記微生物が、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus ）、シュードモナス・ニトロレヂュセンス（Pseudomonas nitroreducens）、シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta ）、シュードモナス・ピッケッティ（Pseudomonas picketti） 、シュードモナス・オキサラティクス（Pseudomonas oxalaticus） 、シュードモナス・キャリオフィリ（Pseudomonas caryophylli ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Yamadazyma farinosa ）、キャンディダ・エルノビイ（Candida ernobii）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・メタノリカ（Candida methanolica）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）、コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス（Corynebacterium hydrocarboclastus） 、クロエッケラ・アフリカーナ（Kloeckera africana）、ピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）又はコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）であることを特徴とする前項１記載の製造方法；
３．前項１又は２記載の製造方法により製造された光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを回収することを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法；
等を提供するものである。
本発明により、光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを効果的に製造することができる。
一般式（１）で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステル、及び、一般式（２）で示される２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルにおいて、Ｒで示されるＣ１−Ｃ８アルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基を挙げることができる。
本発明製造方法において用いられる触媒としての微生物の菌体又はその処理物は、一般式（１）で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルを一般式（２）で示される光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルに不斉的に還元する能力を有する微生物の菌体又はその処理物であればよく、例えば、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus ）等のアルスロバクター属に属する微生物、シュードモナス・ニトロレヂュセンス（Pseudomonas nitroreducens）、シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta ）、シュードモナス・ピッケッティ（Pseudomonas picketti） 、シュードモナス・オキサラティクス（Pseudomonas oxalaticus） 、シュードモナス・キャリオフィリ（Pseudomonas caryophylli ）等のシュードモナス属に属する微生物、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属に属する微生物、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Yamadazyma farinosa ）等のヤマダジーマ属に属する微生物、キャンディダ・エルノビイ（Candida ernobii）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・メタノリカ（Candida methanolica）、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）等のキャンディダ属に属する微生物、コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス（Corynebacterium hydrocarboclastus）等のコリネバクテリウム属に属する微生物、クロエッケラ・アフリカーナ（Kloeckera africana）等のクロエッケラ属に属する微生物、ピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）等のピキア属に属する微生物、或いは、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）等のコマガタエラ属に属する微生物等の菌体又はその処理物を挙げることができる。
さらに具体的には例えば、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ１９０６５、シュードモナス・ニトロレヂュセンス（Pseudomonas nitroreducens）ＪＣＭ２７８２ｔ、シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta）ＪＣＭ２７８８ｔ、シュードモナス・ピッケッティ（Pseudomonas picketti）ＪＣＭ５９６９ｔ、シュードモナス・オキサラティクス（Pseudomonas oxalaticus）ＩＦＯ１３５９３ｔ、シュードモナス・キャリオフィリ（Pseudomonas caryophylli）ＩＦＯ１３５９１、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）ＡＴＣＣ２６０１２、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Yamadazyma farinosa）ＩＦＯ１９３、キャンディダ・エルノビイ（Candida ernobii）ＡＴＣＣ２００００、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）ＩＦＯ１５４５、キャンディダ・メタノリカ（Candida methanolica）ＡＴＣＣ２６１７５、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＩＦＯ０７０５、コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス（Corynebacterium hydrocarboclastus）ＡＴＣＣ２１１３１、クロエッケラ・アフリカーナ（Kloeckera africana）ＩＦＯ０８６９、ピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）ＩＦＯ０１８９、及び、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）ＡＴＣＣ７６２７３の菌体又はその処理物が挙げられる。
さらに具体的には例えば、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus）ＡＴＣＣ１９０６５、シュードモナス・ニトロレヂュセンス（Pseudomonas nitroreducens）ＪＣＭ２７８２ｔ、シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta）ＪＣＭ２７８８ｔ、シュードモナス・ピッケッティ（Pseudomonas picketti）ＪＣＭ５９６９ｔ、シュードモナス・オキサラティクス（Pseudomonas oxalaticus）ＩＦＯ１３５９３ｔ、シュードモナス・キャリオフィリ（Pseudomonas caryophylli）ＩＦＯ１３５９１、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）ＡＴＣＣ２６０１２、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Yamadazyma farinosa）ＩＦＯ１９３、キャンディダ・エルノビイ（Candida ernobii）ＡＴＣＣ２００００、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）ＩＦＯ１５４５、キャンディダ・メタノリカ（Candida methanolica）ＡＴＣＣ２６１７５、キャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）ＩＦＯ０７０５、コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス（Corynebacterium hydrocarboclastus）ＡＴＣＣ２１１３１、クロエッケラ・アフリカーナ（Kloeckera africana）ＩＦＯ０８６９、ピキア・メンブラナファシエンス（Pichia membranaefaciens）ＩＦＯ０１８９、及び、コマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）ＡＴＣＣ７６２７３の菌体又はその処理物が挙げられる。
このような微生物の菌体又はその処理物を触媒とすることにより、一般式（１）で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルのカルボニル基を光学選択的に不斉還元できる。
次に、本微生物の調製方法について説明する。
本微生物は、炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物を培養するための培地を用いて培養すればよい。
本微生物は、炭素源、窒素源、有機塩、無機塩等を適宜含有する各種の微生物を培養するための培地を用いて培養すればよい。
当該培地に含まれる炭素源としては、例えば、グルコース、スクロース、グリセロール、でんぷん、有機酸又は廃糖蜜が挙げられ、窒素源としては、例えば、酵母エキス、肉エキス、ペプトン、カザミノ酸、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティプリカー（corn steep liquor）、綿実粉、乾燥酵母、硫安又は硝酸ナトリウムが挙げられ、有機塩及び無機塩としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、炭酸ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸カルシウム、酢酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸銅、硫酸亜鉛、硫酸第１鉄又は塩化コバルトが挙げられる。
培養方法としては、例えば、固体培養、液体培養（例えば、試験管培養、フラスコ培養、ジャーファーメンター培養等）が挙げられる。
培養温度及び培養液のｐＨは、本微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は約１５〜４５℃の範囲、培養液のｐＨは約４〜８の範囲を挙げることができる。培養時間は、培養条件により適宜選択することができるが、通常、約１〜７日間である。
培養温度及び培養液のｐＨは、本微生物が生育する範囲であれば特に限定されるものではないが、例えば、培養温度は約１５〜４５℃の範囲、培養液のｐＨは約４〜８の範囲を挙げることができる。培養時間は、培養条件により適宜選択することができるが、通常、約１〜７日間である。
本微生物の菌体は、そのまま本発明製造方法の触媒として用いることができる。本微生物の菌体をそのまま用いる方法としては、（１）培養液をそのまま用いる方法、（２）培養液の遠心分離等により菌体を集め、集められた菌体（必要に応じて、緩衝液又は水で洗浄した後の湿菌体）を用いる方法等を挙げることができる。
また本発明製造方法の触媒として、本微生物の菌体処理物を用いることもできる。当該菌体処理物としては、例えば、培養して得られた菌体を有機溶媒（アセトン、エタノール等）処理したもの、凍結乾燥処理したもの若しくはアルカリ処理したもの、又は、菌体を物理的若しくは酵素的に破砕したもの、又は、これらのものから分離・抽出された粗酵素等を挙げることができる。さらに、菌体処理物には、前記処理を施した後、公知の方法により固定化処理したものも含まれる。固定化物を得る方法としては、例えば、担体結合法（シリカゲルやセラミック等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に本発明タンパク質等を吸着させる方法）及び包括法（ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に本発明タンパク質等を閉じ込める方法）が挙げられる。
本発明製造方法は、通常、水及び還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと記す。）又は還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤＨと記す。）の存在下に行われる。この際に用いられる水は、緩衝水溶液であってもよい。当該緩衝液に用いられる緩衝剤としては、例えば、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸のアルカリ金属塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。
また本発明製造方法は、さらに疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物が挙げられる。
また本発明製造方法は、さらに親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類及びこれらの混合物が挙げられる。
また本発明製造方法は、さらに疎水性有機溶媒を用いて、水と疎水性有機溶媒との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる疎水性有機溶媒としては、例えば、ギ酸エチル、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸ブチル等のエステル類、ｎ−ブチルアルコール、ｎ−アミルアルコール、ｎ−オクチルアルコール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、メチル−ｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素類及びこれらの混合物が挙げられる。
また本発明製造方法は、さらに親水性有機溶媒を用いて、水と水性媒体との存在下で行うこともできる。この場合に用いられる親水性有機溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン、ジメトキシエタン、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類及びこれらの混合物が挙げられる。
本発明製造方法は、通常、水層のｐＨが３〜１０の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
本発明製造方法は、通常、約０〜６０℃の範囲内で行われるが、反応が進行する範囲内で適宜変化させてもよい。
本発明製造方法は、通常、約０．５時間〜約１０日間の範囲内で行われる。反応の終点は、原料化合物である５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルの添加終了後、例えば、反応液中の当該５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルの量を、液体クロマトグラフィー、ガスクロマトグラフィー等により測定することにより確認することができる。
本発明製造方法における原料化合物である５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルの濃度は、通常、５０％（ｗ／ｖ）の以下であり、反応系中の当該５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステル濃度をほぼ一定に保つために、当該５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルを反応系に連続又は逐次加えてもよい。
本発明製造方法では、必要に応じて反応系に、例えば、グルコース、シュークロース、フルクトース等の糖類、又は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００若しくはＴｗｅｅｎ６０等の界面活性剤等を加えることもできる。
反応終了後、反応液を有機溶媒抽出、濃縮等の通常の後処理を行うことにより、前記５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルに対応した２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを反応液から回収すればよい。回収された２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルは、必要に応じて、カラムクロマトグラフィー、蒸留等によりさらに精製することもできる。
また、本発明製造方法は、通常、ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨの存在下に行われる。本発明製造方法における原料化合物である５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルの還元反応の進行に伴い、当該ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨは、酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ+と記す）又は酸化型β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下、ＮＡＤ+と記す）に変換される。変換により生じたＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+は、還元型（ＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨ）に変換する能力を有するタンパク質により元のＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに戻すことができるので、上記方法の反応系内には、ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質を共存させることもできる。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としてのグルコース脱水素酵素はＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する際、基質としてグルコースを要するものであり、グルコースを酸化し、グルコノラクトンに変換する能力を有するタンパク質又はそのタンパク質を発現する微生物又はその処理物であってもよい。
また、ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。ここで処理物とは、前述にある「菌体処理物」と同等なものを意味する。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としては、例えば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素及び有機脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素等）等が挙げられる。
ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質としてのグルコース脱水素酵素はＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する際、基質としてグルコースを要するものであり、グルコースを酸化し、グルコノラクトンに変換する能力を有するタンパク質又はそのタンパク質を発現する微生物又はその処理物であってもよい。
また、ＮＡＤＰ+又はＮＡＤ+をＮＡＤＰＨ又はＮＡＤＨに変換する能力を有するタンパク質がグルコース脱水素酵素である場合には、反応系内にグルコース等を共存させることにより当該タンパク質の活性が増強される場合もあり、例えば、反応液にこれらを加えてもよい。
また、当該タンパク質は、酵素そのものであってもよいし、また当該酵素をもつ微生物又は当該微生物の処理物の形態で反応系内に共存させてもよい。ここで処理物とは、前述にある「菌体処理物」と同等なものを意味する。
以下、本発明製造方法を実施例により詳細に説明するが、本発明製造方法はこれらの例に限定されるものではない。
実施例１ （原料５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルの合成）
（１）４−メトキシけい皮酸エチルの合成
４−メトキシけい皮酸２５０ｇ（１４００ｍｍｏｌ）、エタノール５５０ｍＬ及び濃硫酸７８ｍＬ（１４００ｍｍｏｌ）の混合物を１０時間還流した。液体クロマトグラフィーにて反応の完了を確認した後、得られた混合物を１０００ｍＬの氷水中に注ぎ込んだ。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１０００ｍＬ、５００ｍＬ）、合一した有機溶媒相を５００ｍＬの上水にて２回洗浄した後、これを５００ｍＬの５％重曹水でさらに洗浄した。得られた混合物を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、これをエバポレータ-にて濃縮し、さらに真空ポンプで乾燥することにより、２９０．９ｇの４−メトキシけい皮酸エチルを得た（定量的）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．３３（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、３Ｈ）、３.８４（ｓ、３Ｈ）、４.２５（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、６．３１（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）
（１）４−メトキシけい皮酸エチルの合成
４−メトキシけい皮酸２５０ｇ（１４００ｍｍｏｌ）、エタノール５５０ｍＬ及び濃硫酸７８ｍＬ（１４００ｍｍｏｌ）の混合物を１０時間還流した。液体クロマトグラフィーにて反応の完了を確認した後、得られた混合物を１０００ｍＬの氷水中に注ぎ込んだ。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１０００ｍＬ、５００ｍＬ）、合一した有機溶媒相を５００ｍＬの上水にて２回洗浄した後、これを５００ｍＬの５％重曹水でさらに洗浄した。得られた混合物を、硫酸ナトリウムを用いて乾燥した後、これをエバポレータ-にて濃縮し、さらに真空ポンプで乾燥することにより、２９０．９ｇの４−メトキシけい皮酸エチルを得た（定量的）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．３３（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ、３Ｈ）、３.８４（ｓ、３Ｈ）、４.２５（ｑ、Ｊ＝７Ｈｚ、２Ｈ）、６．３１（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）、６．９０（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．４８（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．６４（ｄ、Ｊ＝１６Ｈｚ、１Ｈ）
（２）３−（４−メトキシフェニル）−１−プロパノールの合成
４−メトキシけい皮酸エチル１４５．５ｇ（７００ｍｍｏｌ）を含む１１６４グラムのテトラヒドロフラン溶液を０℃まで冷却した後、これに１３２ｇの水素化ホウ素ナトリウム（３５００ｍｍｏｌ）を発熱、発泡に注意しながら５回に分けて３５分間かけて添加した。次いで、当該混合物を６２℃まで昇温した後、これにメタノール２９１グラムを３時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き２時間保温した後、５℃以下まで冷却した。
得られた混合物を、５℃以下に冷却された３Ｎ塩酸８００ｍＬ中に、１５℃以下を保ちながらゆっくり加えた。全量を加えた後、さらに３Ｎ塩酸にてｐＨを６．９に調整した。このようにして得られた混合物をトルエンで２回抽出し（１０００ｍＬ、５００ｍＬ）、合一した有機溶媒相をエバポレータ-にて濃縮した後、さらに真空下蒸留精製することにより、６６．７ｇの３−（４−メトキシフェニル）−１−プロパノールを得た（１０５〜１１０℃／０．２ｍｍＨｇ、５７．３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．８１−１．９１（ｍ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６６（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、６．８３（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
４−メトキシけい皮酸エチル１４５．５ｇ（７００ｍｍｏｌ）を含む１１６４グラムのテトラヒドロフラン溶液を０℃まで冷却した後、これに１３２ｇの水素化ホウ素ナトリウム（３５００ｍｍｏｌ）を発熱、発泡に注意しながら５回に分けて３５分間かけて添加した。次いで、当該混合物を６２℃まで昇温した後、これにメタノール２９１グラムを３時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き２時間保温した後、５℃以下まで冷却した。
得られた混合物を、５℃以下に冷却された３Ｎ塩酸８００ｍＬ中に、１５℃以下を保ちながらゆっくり加えた。全量を加えた後、さらに３Ｎ塩酸にてｐＨを６．９に調整した。このようにして得られた混合物をトルエンで２回抽出し（１０００ｍＬ、５００ｍＬ）、合一した有機溶媒相をエバポレータ-にて濃縮した後、さらに真空下蒸留精製することにより、６６．７ｇの３−（４−メトキシフェニル）−１−プロパノールを得た（１０５〜１１０℃／０．２ｍｍＨｇ、５７．３％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．８１−１．９１（ｍ、２Ｈ）、２．６５（ｔ、Ｊ＝７．７Ｈｚ、２Ｈ）、３．６６（ｔ、Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、６．８３（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（３）１−クロロ−３−（４−メトキシフェニル）プロパンの合成
塩化チオニル４８ｇ（４００ｍｍｏｌ）を６５℃まで昇温した後、これに３−（４−メトキシフェニル）−１−プロパノール３３．２ｇ（２００ｍｍｏｌ）を３．５時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き７０℃で２時間保温した後、２００ｇの氷水中に注ぎ込んだ。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１００ｍＬ×２回）、合一した有機溶媒相を２回水洗した。得られた水先物をエバポレーターにて濃縮した後、さらに真空下蒸留精製することにより、２８．７７ｇの１−クロロ−３−（４−メトキシフェニル）プロパンを得た（９１〜９５℃／２．８ｍｍＨｇ、７７．９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．００−２．１０（ｍ、２Ｈ）、２．７２（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、６．８４（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．５Ｈｚ、２Ｈ）
塩化チオニル４８ｇ（４００ｍｍｏｌ）を６５℃まで昇温した後、これに３−（４−メトキシフェニル）−１−プロパノール３３．２ｇ（２００ｍｍｏｌ）を３．５時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き７０℃で２時間保温した後、２００ｇの氷水中に注ぎ込んだ。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１００ｍＬ×２回）、合一した有機溶媒相を２回水洗した。得られた水先物をエバポレーターにて濃縮した後、さらに真空下蒸留精製することにより、２８．７７ｇの１−クロロ−３−（４−メトキシフェニル）プロパンを得た（９１〜９５℃／２．８ｍｍＨｇ、７７．９％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：２．００−２．１０（ｍ、２Ｈ）、２．７２（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３．５２（ｔ、Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、６．８４（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．５Ｈｚ、２Ｈ）、７．１１（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．５Ｈｚ、２Ｈ）
（４）５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルの合成
マグネシウム３．６ｇ（１５０ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０ｇ）との混合物中に、ジブロモエタン１００μＬを注入することにより、活性化されたマグネシウムを含む混合物を得た。得られた混合物を６５℃まで昇温した後、当該混合物（５．２ｇ（１３６ｍｍｏｌ）を１−クロロ−３−（４−メトキシフェニル）プロパンに３時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き８０℃で２時間保温した後、室温まで冷却することにより、Grignard剤を調製した。
−７０℃以下まで冷却されたシュウ酸ジエチル３９．７ｇ（２７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｇ）溶液に、上記のGrignardを−５０℃以下で１時間かけて滴下した後、これを−１０℃まで昇温し、さらに−1０℃で２．５時間保温した。得られた混合物に、３Ｎ塩酸５０ｍＬと上水５０ｍＬとを加えた。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１００ｍＬ×２回）、合一した有機溶媒相を５％食塩水５０ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた乾燥物をエバポレータ-にて濃縮した後、バス温９５℃、３ｍｍＨｇで低沸点成分（主に過剰のシュウ酸ジエチル）を留去し、さらに高真空下蒸留精製することにより、２８．７５ｇの５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルを得た（１２８〜１３３℃／０．１ｍｍＨｇ、８４．４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．３６（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、１．９０−１．９８（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、４．３０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．８３（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０９（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
マグネシウム３．６ｇ（１５０ｍｍｏｌ）とテトラヒドロフラン（５０ｇ）との混合物中に、ジブロモエタン１００μＬを注入することにより、活性化されたマグネシウムを含む混合物を得た。得られた混合物を６５℃まで昇温した後、当該混合物（５．２ｇ（１３６ｍｍｏｌ）を１−クロロ−３−（４−メトキシフェニル）プロパンに３時間かけて滴下した。得られた混合物を引き続き８０℃で２時間保温した後、室温まで冷却することにより、Grignard剤を調製した。
−７０℃以下まで冷却されたシュウ酸ジエチル３９．７ｇ（２７２ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（１００ｇ）溶液に、上記のGrignardを−５０℃以下で１時間かけて滴下した後、これを−１０℃まで昇温し、さらに−1０℃で２．５時間保温した。得られた混合物に、３Ｎ塩酸５０ｍＬと上水５０ｍＬとを加えた。当該混合物をトルエンで２回抽出し（１００ｍＬ×２回）、合一した有機溶媒相を５％食塩水５０ｍＬで洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。得られた乾燥物をエバポレータ-にて濃縮した後、バス温９５℃、３ｍｍＨｇで低沸点成分（主に過剰のシュウ酸ジエチル）を留去し、さらに高真空下蒸留精製することにより、２８．７５ｇの５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルを得た（１２８〜１３３℃／０．１ｍｍＨｇ、８４．４％）。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．３６（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、１．９０−１．９８（ｍ、２Ｈ）、２．６１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、４．３０（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．８３（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０９（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（５）５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルの合成
上記と同様の方法で、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルを合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．９０−１．９９（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、３.８５（ｓ、３Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０８（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
上記と同様の方法で、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルを合成した。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．９０−１．９９（ｍ、２Ｈ）、２．６０（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ、２Ｈ）、２．８４（ｔ、Ｊ＝７．３Ｈｚ、２Ｈ）、３.７９（ｓ、３Ｈ）、３.８５（ｓ、３Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０８（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
実施例２ （本発明製造方法による、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルからの光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの製造例（その１））
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これに表１で示された各種の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、０．８５％食塩水にて洗浄した後、乾燥させ、乾燥菌体を得た。ねじ口試験管に５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル３ｍｇ、前記の乾燥菌体１０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５ｍｇ、ＮＡＤＨ５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．３５ｍｌ及び酢酸ブチル０．１５ｍｌを添加し、３０℃で16時間振とうした後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。得られた２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの生成率および光学純度分析の結果を表１に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．２８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、１．５９−１．８６（ｍ、４Ｈ）、２．５１−２．６７（ｍ、２Ｈ）、２．７６（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３.７８（ｓ、３Ｈ）、４．１５−４．２０（ｍ、１Ｈ）、４．２３（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０９（ｄｄ、Ｊ＝１．８、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、肉エキス３ｇ、硫酸アンモニウム０．２ｇ、リン酸２水素カリウム１ｇ及び硫酸マグネシウム７水和物０．５ｇを加えた後、ｐＨを７．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これに表１で示された各種の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、０．８５％食塩水にて洗浄した後、乾燥させ、乾燥菌体を得た。ねじ口試験管に５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル３ｍｇ、前記の乾燥菌体１０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５ｍｇ、ＮＡＤＨ５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．３５ｍｌ及び酢酸ブチル０．１５ｍｌを添加し、３０℃で16時間振とうした後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。得られた２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの生成率および光学純度分析の結果を表１に示す。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．２８（ｔ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、３Ｈ）、１．５９−１．８６（ｍ、４Ｈ）、２．５１−２．６７（ｍ、２Ｈ）、２．７６（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３.７８（ｓ、３Ｈ）、４．１５−４．２０（ｍ、１Ｈ）、４．２３（ｑ、Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．０９（ｄｄ、Ｊ＝１．８、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
実施例３ （本発明製造方法による、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルからの光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの製造例（その２））
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これに表２で示された各種の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、０．８５％食塩水にて洗浄した後、乾燥させ、乾燥菌体を得た。ねじ口試験管に５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル３ｍｇ、前記の乾燥菌体１０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５ｍｇ、ＮＡＤＨ５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．３５ｍｌ及び酢酸ブチル０．１５ｍｌを添加し、３０℃で16時間振とうした後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。得られた２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの生成率および光学純度分析の結果を表２に示す。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これに表２で示された各種の菌体を植菌した。これを３０℃で好気条件下、振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、０．８５％食塩水にて洗浄した後、乾燥させ、乾燥菌体を得た。ねじ口試験管に５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル３ｍｇ、前記の乾燥菌体１０ｍｇ、ＮＡＤＰＨ５ｍｇ、ＮＡＤＨ５ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．３５ｍｌ及び酢酸ブチル０．１５ｍｌを添加し、３０℃で16時間振とうした後、反応液に酢酸エチルを２ｍｌ添加した後、遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。得られた２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの生成率および光学純度分析の結果を表２に示す。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
実施例４ （本発明製造方法による、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルからの光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの製造例（その３））
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れたものを２本準備し、それぞれにＹａｍａｄａｚｙｍａ ｆａｒｉｎｏｓａ ＩＦＯ１９３株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、2日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、５．４ｇの湿菌体を得た。
５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル６００ｍｇ、前記の湿菌体５．４ｇ、ＮＡＤ＋６０ｍｇ、グルコース９００ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）９ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌ及び酢酸ブチル６ｍｌを混合した。当該混合物を３０℃で２５時間攪拌した。尚、攪拌中は反応液のｐＨが６．８〜７．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に加えた。攪拌終了後、反応液を遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。反応に用いた５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルの量に対して２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルは８６．７％生成していた。また下記条件で当該有機層中の２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの光学純度を測定した結果、（Ｒ）体が９８ ％ｅ．ｅ．であった。さらに当該有機層を濃縮することにより、粗（Ｒ）−２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルを得る。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れたものを２本準備し、それぞれにＹａｍａｄａｚｙｍａ ｆａｒｉｎｏｓａ ＩＦＯ１９３株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、2日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）により菌体を分離し、５．４ｇの湿菌体を得た。
５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチル６００ｍｇ、前記の湿菌体５．４ｇ、ＮＡＤ＋６０ｍｇ、グルコース９００ｍｇ、グルコース脱水素酵素（天野製薬製）９ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）３０ｍｌ及び酢酸ブチル６ｍｌを混合した。当該混合物を３０℃で２５時間攪拌した。尚、攪拌中は反応液のｐＨが６．８〜７．２となるように２Ｍ炭酸ナトリウム水溶液を徐々に加えた。攪拌終了後、反応液を遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。反応に用いた５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エチルの量に対して２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルは８６．７％生成していた。また下記条件で当該有機層中の２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルの光学純度を測定した結果、（Ｒ）体が９８ ％ｅ．ｅ．であった。さらに当該有機層を濃縮することにより、粗（Ｒ）−２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エチルを得る。
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
実施例５ （本発明製造方法による、５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルからの光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルの製造例（その４））
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これにＹａｍａｄａｚｙｍａ ｆａｒｉｎｏｓａ ＩＦＯ１９３株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、2日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）より菌体を分離し、２．８ｇの湿菌体を得た。
５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチル２ｍｇ、前記の湿菌体０．２ｇ、ＮＡＤＨ１０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌ及び酢酸ブチル０．１ｇを混合した。当該混合物を３０℃で８時間攪拌した。攪拌終了後、酢酸ブチルを１．９ｍｌ添加した後、反応液を遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。反応に用いた５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルの量に対して２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルは１９．６％生成していた。また下記条件で当該有機層中の２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルの光学純度を測定した結果、（Ｒ）体が９５ ％ｅ．ｅ．であった。さらに当該有機層を濃縮することにより、粗（Ｒ）−２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルを得る。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．６０−１．８２（ｍ、４Ｈ）、２．５６−２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．７１（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３.７８（ｓ、３Ｈ）、４．１７−４．２３（ｍ、１Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１０（ｄｄ、Ｊ＝１．８、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
バッフルフラスコに滅菌済み培地（１Ｌの水に、グルコース２０ｇ、ポリペプトン５ｇ、酵母エキス３ｇ、及び、麦芽エキス３ｇを加えた後、ｐＨを６．０に調整したもの）１００ｍｌを入れ、これにＹａｍａｄａｚｙｍａ ｆａｒｉｎｏｓａ ＩＦＯ１９３株を植菌した。これを３０℃で好気条件下、2日間振盪培養した。培養終了後、遠心分離（６０００×ｇ、１０分）より菌体を分離し、２．８ｇの湿菌体を得た。
５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチル２ｍｇ、前記の湿菌体０．２ｇ、ＮＡＤＨ１０ｍｇ、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌ及び酢酸ブチル０．１ｇを混合した。当該混合物を３０℃で８時間攪拌した。攪拌終了後、酢酸ブチルを１．９ｍｌ添加した後、反応液を遠心分離（１０００×ｇ、５分）することにより、有機層を回収した。当該有機層を下記条件で液体クロマトグラフィーによる含量分析及び光学純度分析に供試した。反応に用いた５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸メチルの量に対して２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルは１９．６％生成していた。また下記条件で当該有機層中の２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルの光学純度を測定した結果、（Ｒ）体が９５ ％ｅ．ｅ．であった。さらに当該有機層を濃縮することにより、粗（Ｒ）−２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸メチルを得る。
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δｐｐｍ：１．６０−１．８２（ｍ、４Ｈ）、２．５６−２．６２（ｍ、２Ｈ）、２．７１（ｄ、Ｊ＝５．７Ｈｚ、１Ｈ）、３.７８（ｓ、３Ｈ）、４．１７−４．２３（ｍ、１Ｈ）、６．８２（ｄｄ、Ｊ＝２．０、６．６Ｈｚ、２Ｈ）、７．１０（ｄｄ、Ｊ＝１．８、６．６Ｈｚ、２Ｈ）
（含量分析条件）
カラム：ＳＵＭＩＰＡＸ ＯＤＳ Ａ−２１２（５μｍ、６ｍｍΦ×１５ｃｍ）
移動相：Ａ液 ０．１％トリフルオロ酢酸水溶液、Ｂ液 ０．１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液
時間(分) Ａ液（％）：Ｂ液（％）
０ ８０：２０
２０ １０：９０
３０ １：９９
３０.１ ８０：２０
流量：１．０ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２９０ｎｍ
（光学異性体分析条件）
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（ダイセル化学工業社製）
移動相：ヘキサン／２−プロパノール／トリフルオロ酢酸＝９０／１０／０．１
流量：０．５ｍｌ／分
カラム温度：４０℃
検出：２５４ｎｍ
本発明により、光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを効率的に製造することができる。
Claims (5)
- 一般式（１）
で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルを、一般式（２）
で示される光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルに不斉的に還元する能力を有する、アルスロバクター（Arthrobacter）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、ヤマダジーマ（Yamadazyma）属、キャンディダ（Candida）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、クロエッケラ（Kloeckera）属、ピキア（Pichia）属及びコマガタエラ（Komagataella）属に属する微生物群の中から選ばれた微生物又はその処理物を一般式（１）で示される５−（４−メトキシフェニル）−２−オキソペンタン酸エステルに接触させることを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法。 - 前記微生物が、ヤマダジーマ（Yamadazyma）属、クロエッケラ（Kloeckera）属及びコマガタエラ（Komagataella）属に属する微生物群の中から選ばれた微生物であり、前記光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルがＲ体であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
- 前記微生物が、アルスロバクター・パラフィネウス（Arthrobacter paraffineus ）、シュードモナス・ディミヌタ（Pseudomonas diminuta ）、シュードモナス・ピッケッティ（Pseudomonas picketti）、シュードモナス・オキサラティクス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・キャリオフィリ（Pseudomonas caryophylli ）、コリネバクテリウム・ヒドロカルボクラスタス（Corynebacterium hydrocarboclastus）、又はキャンディダ・マグノリエ（Candida magnoliae）であり、前記光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルがＳ体であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
- 前記微生物が、シュードモナス・ニトロレヂュセンス（Pseudomonas nitroreducens）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、ヤマダジーマ・ファリノーサ（Yamadazyma farinosa）、キャンディダ・エルノビイ（Candida ernobii）、キャンディダ・リポリティカ（Candida lipolytica）、キャンディダ・メタノリカ（Candida methanolica）、クロエッケラ・アフリカーナ（Kloeckera africana）、又はコマガタエラ・パストリス（Komagataella pastoris）であり、前記光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルがＲ体であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
- 請求項１〜４のいずれか記載の製造方法により製造された光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルを回収することを特徴とする光学活性２−ヒドロキシ−５−（４−メトキシフェニル）−ペンタン酸エステルの製造方法。
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