JPH01281093A

JPH01281093A - （ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体の製造方法

Info

Publication number: JPH01281093A
Application number: JP10993888A
Authority: JP
Inventors: Teruyuki Nikaido; 輝之二階堂; Akikazu Matsuyama; 彰収松山; Yoshinori Kobayashi; 良則小林
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1988-04-30
Filing date: 1988-04-30
Publication date: 1989-11-13

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は種々の医薬品や光学活性な生理活性物質の重要
な中間体である、（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体の製
造方法に関する。

（従来技術及び発明が解決しようとする課題）従来、光
学活性（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体を製造する方法
としては、ベンジルマグネシウムクロリドと＜Ｓ＞−グ
リシド酸より化学的に合成する方法（特開昭６２−２１
２３２９号）等が知られている。しかしこの方法では、
（Ｓ）−グリシド酸の原料であるＤ−セリンが工業的に
高価である等の問題点を有していた。また、微生物の不
斉還元能を利用して式（１）で表される２−ケト酸誘導
体から式（２）で表される（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘
導体を得る方法は知られていない。

本発明は微生物を用いた不斉還元法により光学純度の高
い（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体を得ることを目的と
する。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、簡便な方法で、かつ光学純度の高い光学
活性（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体を得る方法として
微生物による不斉還元方法に着目し、この目的に適した
微生物を探索した結果、ラクトバチルス属、ストレプト
コッカス属、スポロラクトバチルス属、アルカリ土類金
属、ニジエリシア属、セラチア属、シュードモナス属、
アルスロバクタ−属、バチルス属、ブレビバクテリウム
属、スタフィロコッカス属、オーレオバクテリウム属、
フラボバクテリウム属、バクテリウム属、バラコツカス
属、シトロバクタ−属、プロタミノバクタ−属、コリネ
バクテリウム属、およびステファノアスカス属に属する
微生物が本発明の目的を達成し得ることを見出だし本発
明に至った。

即ち、本発明は式（１）（ここで、Ｘｌ　、Ｘ２は水素原子、ハロゲン原子、水
酸基、ニトロ基、アルキル基を、Ｒはアルキル基、フェ
ニル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。

）で表される２−ケト酸誘導体に、ラクトバチルス属、
ストレプトコツカス属。スポロラクトバチルス属、アル
カリ土類金属、ニジエリシア属、セラチア属、シュード
モナス属、アルスロバクタ−属、バチルス属、ブレビバ
クテリウム属、スタフィロコッカス属、オーレオバクテ
リウム属、フラボバクテリウム属、バクテリウム属、バ
ラコツカス属、シトロバクタ−属、１０タミノバクター
属、コリネバクテリウム属、またはステファノアスカス
属に属し、該２一ケ１−酸誘導体を式（２）で表される
（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体に不斉的に還元する能
力を有する微生物またはその処理物を作用させることを
特徴とする（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体の製造方法式（２）（ここで、Ｘｌ　、Ｘ２は水素原子、ハロゲン原子、水
酸基、ニトロ基、アルキル基を、Ｒはアルキル基、フェ
ニル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。

である。

本発明において原料として用いられる２−ケト酸誘導体
は、前記式（１）で示されるものであり、例えば、ベン
ゾイルギ酸、フェニルピルビン酸、２−ケト−４−フェ
ニル酪酸、２−ケト−５−フェニル吉草酸等のメチルエ
ステル、エチルエステル等があげられる。

本発明に使用し得る微生物は、ラクトバチルス属、スト
レプトコッカス属、スポロラクトバチルス属、アルカリ
土類金属、ニジエリシア属、セラチア属、シュードモナ
ス属、アルスロバクタ−属。

バチルス属、ブレビバクテリウム属、スタフィロコッカ
ス属、オーレオバクテリウム属、フラボバクテリウム属
、バクテリウム属、バラコツカス属、シトロバクタ−属
、プロタミノバクタ−属、コリネバクテリウム属、また
はステファノアスカス属に属し、２−ケト酸誘導体を（
Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体に不斉的に還元する能力
を有するものであればいずれも使用可能であるが、具体
的には、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂ
ａｃ　ｉ　ＩＩｕｓ　ｐｌａｎｊａｒｌＪｌｌ）　Ｉ　
Ｆ　Ｏ３０７０、ストレプトコッカス・フェカリス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌｉｓ）　ＩＦ
Ｏ１２９６４，スポロラクトバチルス・イヌリヌス（５
ｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉ　ｆｌｕｓ　１ｎｕｌｉｎ
ｕｓ）’Ｔ’　Ｕ　Ａ　３４３し、アルカリゲネス・フ
ァエカリス＝（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｆａｃｃａｌ
ｉｓ）　　Ｉ　Ｆ　０３１６０　、ニジエリシア・コリ
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ
３５４４、セラチア・マルセッセンス（５ｅｒｒａｔ　
ｉａ　ｌ１ａｒＣ（３ＳＣ１３ｎＳ）　ＩＡＭ１２１４
３．シュードモナス・オーレオファシェンス（Ｐｓｅｕ
ｄｏｉｏｎａｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）　　Ｉ　
Ｆ　０３５２２、アルスロバクタ−・シンプレックス（
＾ｒｔｈｒｏ　ｂａｃｔｅｒ　５ｉｉｐｌｅｘ）　　Ｉ
　ＦＯ１２０６９、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏ３００７、ブレ
ビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉ　ｂａ
ｃｕｔａｒｉｕＩｌａｎｎｏｎｉａｇｅｎｅｓ）　Ｉ　
Ａ　Ｍ　１６４１、スタフィロコッカス・アウレウス（
Ｓｔａｐｈｙｌ。

ｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｅｕｓ）　　Ｉ　Ｆ　Ｏ３０６
０、オーレオバクテリウム・テスタセウム（＾ｕｒｅｏ
ｂａｃｔｅｒｉＵｆｆｉ　ｔｅｓｔａｃｅｕｎ）　Ｉ　
Ｆ　Ｏ１２６７５、フラボバクテリウム・スアベオレン
ス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｕａｖｅｏｌｅ
ｎｓ）　ＩＦＯ３７５２，バクテリウム・ミコイデス（
Ｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｔｍｙｃｏｉｄｅｓ）　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３０４０、パラコツカス・デニトリフィカンス（Ｐａ
ｒａｃｏｃｃｕｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ　１ｃａｎｓ）Ｉ
ＦＯ１２４４２，シトロバクタ−・フロインディー　（
Ｃ１ｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｆｒｅｕｎｄｉｉ）　ＡＨｔ
Ｊ　１５３４、プロタミノバクタ−・ルーバー（ｐｒｏ
ｔａｒＭｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｅｒ）　Ｉ　Ａ　
Ｍ　１０８１　、コリネバクテリウム−Ｘクイ（Ｃｏｒ
ｙｒｉｅｂａｃｔｅｒｉｕｉ　ｅｑｕｉｉ）　Ｉ　Ｆ　
Ｏ３７３０、ステファノアスカス・シフェリ−（５ｔｅ
ｐｈａｎｏａｓｃｕｓ　ｃｉｆｅｒｒｉｉ）　Ｉ　Ｐ　
０１８５４等を挙げることができる。またこれらの変異
株も用いることができる。

本発明に用いられる培地は、面が増殖し得るものであれ
ば特に制限はない０例えば炭素源としては、グルコース
、シュクロース等の糖類、エタノール、グリセロール等
のアルコール類、酢酸、プロピオン酸等の有機酸類、パ
ラフィン等の炭水化物類、またはこれらの混合物、窒素
源としては、硫酸アンモニウム、酵母エキス、尿素等の
無機有機含窒素化合物、そのｆｌ！！ｓ機塩、微量金属
塩、ビタミン類等、通常の培養に用いられる栄養源を適
宜混合して用いることができる。また必要に応じて微生
物の増殖を促進する因子や培地のＰＨ保持するのに有効
な物質を添加することも可能である。

Ｆ？ｉ養方法は、培地のｐＨを４．０〜９．５、培養温
度を２０〜４５℃の範囲にしてその微生物の生育に適し
た酸素濃度条件下１〜５日間培養するのが好ましい。

本発明において微生物と２−ケト酸誘導体を反応させる
方法としては、（１）苗木培養液をそのまま用い、該培
養液に２−ケト酸誘導体を添加する方法、（２）遠心分
離等により分離した菌体をそのまま、或いは洗浄した後
、！ＩＷｉ液、水等に再＠濁し、得られた！ｇｉ濁液に
２−ケト酸誘導体を添加する方法、（３）菌体破砕物、
アセトン処理、凍結乾燥等による菌体処理物を用いる方
法、（４）これらの菌体を担体に固定化して用いる方法
等、公知の方法が適用できる。なお、（１）等の反応の
際、グルコース、シュクロース等の炭素源をエネルギー
源として添加すると（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体の
生産性が向上し、好ましい。

２−ケト酸誘導体は、そのまま、或いは反応に影響を与
えないような有機溶媒に溶解したり、界面活性剤等に分
散させなりして、反応の始めから一括して、或いは分割
して添加してもよい、また、２−ケト酸誘導体は、アン
モニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩
として用いることもできる。

反応はｐＨ３〜９の範囲で１０〜６０℃の温度で行うの
が好ましく、１〜１２０時間、攪拌下で行う、基質の濃
度は特に制限されないが、０．１〜１０％程度が好まし
い。

反応によって生成した（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体
の採取は、反応液から直接、或いは菌体分離後、有機溶
媒で抽出し、カラムクロマトグラフィー、蒸溜等の通常
の精製方法を用いれば容易に得ることができる。

（実施例）以下、実施例にて本発明を具体的説明するが。

本発明はこれに限定されるものではない。

なお、実施例における光学純度は、光学分割カラムを用
いた高速液体クロマトグラフィー（カラム：キラルセル
ＯＢ（ダイセル化学工業（株）製）、溶媒：ｎ−ヘキサ
ン／２−プロパツール＝１９：１）により測定した。

実施例１グルコース２％、酵母エキス０．５％、ペプトン０．３
％、肉エキス０．３％、リン酸−カリウム０．１％、リ
ン酸ニアンモニウム０．２％、炭酸カルシウム０．５％
より成る組成の培地１００ｍ１を５００　ｒｎｌ容三角
フラスコに入れ、滅菌後、ラクトバチルス・プランタラ
ムＩＦＯ３０７０を植菌し３０℃で３０時間回転振盪培
養を行った。

培養終了後、遠心分離により菌体を分離、生理食塩水で
１回洗浄し生菌体を得た。

次に１００ｍ１容三角フラスコに蒸留水７．５０１１１
を入れ、これに上記生菌体を懸濁し、グルコース１．２
ｇを添加した。３０℃で１０分間回転振盪させた後、２
−ケト−４−フェニル酪酸エチルエステル０．１ｇと炭
酸カルシウム０．３ｇを添加し３０°Ｃで２０時間振盪
反応させた。

反応終了後、酢酸エチル２０　＋０１を用いて抽出を行
い、酢酸エチル層をガスクロマトグラフィーで分析し、
反応収率を調べたところ３０％であった。

次に無水芒硝で脱水後、脱溶媒を行い、得られた油状物
をエタノールに溶解し、高速液体クロマトグラフィーに
て光学純度を測定した。その結果得られた（Ｓ）−２−
ヒドロキシ４−フェニル酪酸エチルエステルの光学純度
はり６％ｅ、ｅ、であった。

実施例２微生物をストレプトコッカス・フェカリスＩＦ０１２６
９４に変えた以外は実施例１と同様に実験を行なった。

その結果、反応収率は３３％、得られた（Ｓ）−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステルの光、学純
度は８５％ｅ、ｅ、であった。

実施例３微生物をスポロラクトバチルス・イヌリヌスＴＵＡ３４
３Ｌに変えた以外は実施例１と同様に実験を行なった。

その結果、反応収率は１０％、得られた（Ｓ）−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステルの光学純度
は９１％ｅ、ｅ、であった。

実施例４実施例１で述べた方法のうち、培地から炭酸カルシウム
を除き、培養を往復振盪で行う他は全く同様な方法によ
り表１に示す菌株について実験を行った。得られた結果
を表１に示す。

（以下余白）実施例３ＹＭ培地（酵母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ。

ベグトン５ｇ、グルコース２０ｇ、ｐＨ６，０）１００
　［＋１１を５００　ｍｌ容坂ロフラスコに入れ、滅菌
後、ステファノアスカス・シフェリ−ＩＦ０１８５４を
植菌し、４８時間振盪培養を行った。

培養終了後、遠心分離で菌を分離し生理食塩水で１回洗
浄し、生菌体を得た。

次に１００ｍ１容三角フラスコに蒸溜水７．５ｍｌを入
れ、これに上記生菌体を懸濁し、シュクロースを１．２
ｇを添加した。３０℃で１０分間往復振盪させた後、２
−ケト−４−フェニル酪酸エチルエステル０．１ｇを添
加し、３０℃で２０時間往復振盪反応させた。

反応終了後、酢酸エチル２０１＋１１を用いて抽出を行
い、以後実施例１と同様に処理し反応収率と光学純度を
求めた。その結果、反応収率は１２％、（Ｓ）−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステルの光学純度
は４８％ｆ３．８．であった。

実施例４実施例１で用いた培地２」を含む５ｊ容ジャーファーメ
ンタ−にラクトバチルス・プランタラムＩＦ０３０７０
を植菌し、３０℃で撹拌１１００ｒｐにて３０時間培養
した。

培養終了後、遠心分離にて集菌し、水１Ｎにて菌体を洗
浄した。しかる後、この菌体を水２００ｍ１に懸濁し、
１１容三角フラスコに入れ２−ケト−４−フェニル酪酸
エチルエステル２ｇ、グルコース２０ｇ、炭酸カルシウ
ム２ｇを添加し、３０°Ｃで攪拌下４８時間反応させた
。

反応終了後、１００　ｍｉの酢酸エチルで２回抽出した
。酢酸エチル層を無水芒硝で脱水した後、減圧下、親溶
剤し、次いで、常法によりバス温１５０℃、減圧度０．
５ｍｍＨｇで蒸溜を行い（沸点１１５〜１１８’Ｃ）目
的物（Ｓ）−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチル
エステル１．１ｇ（収率５５％、光学純度９８％ｅ、ｅ
、）を得た。

（発明の効果）本発明の微生物を用いた不斉還元法による（Ｓ）−２−
ヒドロキシ酸誘導体の製造方法は光学純度の高い（Ｓ）
−２−ヒドロキシ酸誘導体を簡便に製造できることを可
能にさせるものであり、工業的製造方法として極めて有
利である。

特許出願人　ダイセル化学工業株式会社手　　続　　補
　　正　　書　（自発）昭和６３年　８月１１７　日昭和６３年特許願第１０９９３８号２、発明の名称（Ｓ）−２−しドロキシ酸誘導体の製造方法３、補正を
する者代表者児島章部、・− ７１，補正の対象明細書の発明の詳細な説明の欄５、補正の内容（１）明細書画９頁１行目の「炭水化物」を「炭化水素
」と補正する。

（１）明りｌ書第１０頁９〜１２行目の「また、２−ケ
１へ酸誘導体は。

アンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウ
ム塩として用いることもできる。」を削除する。

（１）明細書筒１１頁３行目の「具体的」を「具体的に
」と補正する。

（１）明細書筒１１頁５行目の「実施例における」のあ
とに、「反応収率は、ガスクロマトグラフィー（カラム
：　Ｔｈｅｒｎｏｎ　３０００゜２ｍ、ｔ８０℃）にて
測定し、」を挿入する。

（１）明細書筒１１頁２０行目のｒ７．５Ｊを「１０」
と補正する。

（１）明細書筒１３頁１１行目の「除き、ｊのあとに、
’５００　ｍｌ容坂ロフラスコにて」を挿入する。

（１）明細書節１５頁２〜３行目の［酵母エキス３ｇ、
麦芽エキス３ｇ、ペプトン５ｇ、グルコース２０ｇ」を
「酵母エキス０．３ｇ、麦芽エキス０．３ｇ、ペプトン
０．５ｇ、グルコース２ｇ」と補正する。

（１）明細書筒１５頁９行目の’７．５Ｊを「１０」と
補正する。

（１）明Ｍｉｌｌ書第１６頁１３〜１４行目ノ１−バス
温１５０°Ｃ１」を削除する。

Claims

【特許請求の範囲】　式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｘ１、Ｘ２は水素原子、ハロゲン原子、水酸
基、ニトロ基、アルキル基を、Ｒはアルキル基、フェニ
ル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。）で表される２−ケト酸誘導体に、ラクトバチルス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ストレプトコッカス（
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、スポロラクトバチル
ス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アル
カリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、エシェリシ
ア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒ
ａｔｉａ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ）属、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテ
リウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、スタフィ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、オー
レオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属
、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）属、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、パラコ
ッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属、シトロバクター（
Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、プロタミノバクター（Ｐ
ｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ）属、コリネバクテリウ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、またはステ
ファノアスカス（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ）属に属
し、該２−ケト酸誘導体を式（２）で表される（Ｓ）−
２−ヒドロキシ酸誘導体に不斉的に還元する能力を有す
る微生物またはその処理物を作用させることを特徴とす
る（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸誘導体の製造方法。式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｘ１、Ｘ２は水素原子、ハロゲン原子、水酸
基、ニトロ基、アルキル基を、Ｒはアルキル基、フェニ
ル基を示し、ｎは０〜３の整数を示す。