JP4069742B2 - 微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 - Google Patents
微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4069742B2 JP4069742B2 JP2002372675A JP2002372675A JP4069742B2 JP 4069742 B2 JP4069742 B2 JP 4069742B2 JP 2002372675 A JP2002372675 A JP 2002372675A JP 2002372675 A JP2002372675 A JP 2002372675A JP 4069742 B2 JP4069742 B2 JP 4069742B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- carboxylic acid
- ethyl ester
- methyl
- optically active
- ester
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の合成における有用なキラルビルディングブロックや中間体となりうる光学活性ヒドロキシカルボン酸および光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、並びにそれらのアルキルエステルの微生物処理による製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハロバクテリア ハロビウム(Halobacterium halobium) をラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エステルに作用させた場合、カルボン酸エステル水解反応によりＲ体３−ヒドロキシブタン酸エステルが残存することが報告されている(非特許文献１参照)。しかしながら、立体選択的なエステル分解活性を有する微生物を用いたラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エステルからの高光学純度のＳ体３−ヒドロキシブタン酸エステルの製法は知られていない。
【０００３】
また、光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステル(ＴＨＦＡＥと略記することもある。)あるいはその酸(ＴＨＦＡと略記することもある。)の生物化学的な方法としては、微生物や動物由来のエステル分解酵素をＴＨＦＡＥに作用させ、立体選択的な加水分解により残存する該光学活性ＴＨＦＡＥと生成する該光学活性ＴＨＦＡに分割する方法が特許文献１及び特許文献２に開示されている。しかし、両法ともＴＨＦＡＥのアルキル側鎖の種類によってはその立体選択性が影響されるとともに、その立体選択性が低く、そして得られる光学活性体の収率も低い。
本発明者らは、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロロアルコールに、エンテロバクター(Enterobacter)属、キトロバクター(Citrobacter)属の微生物菌体あるいはその微生物抽出物を作用させ、Ｓ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換し、残存するもう一方のＲ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを同時に回収する方法(特許文献３、非特許文献２）を見出し、報告している。
【０００４】
本発明者らは、上記微生物菌体反応の基質特異性について、さらに鋭意研究した結果、カルボン酸エステルを立体選択的に加水分解する性質を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明で基質として用いられるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルあるいはテトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルは、４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロルアルコール化合物とは異なるため、立体選択的な脱クロル化反応の進行に伴って塩酸が生成するような反応ではなく、立体選択的なカルボン酸エステル加水分解活性により分割反応が進行していると考えられる。さらに本発明に係るこの反応では、α位やβ位にある不斉炭素を立体選択的に認識しながらそのカルボン酸エステルを立体選択的に加水分解することは極めて興味深い反応である。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０１／９２５５４号パンフレット
【特許文献２】
特開平１４−１７１９９４号公報
【特許文献３】
特開平９−４７２９６号公報
【非特許文献１】
Ehrler and Seebach, Helv. Chim. Acta, 72,793-799 (1989)
【非特許文献２】
Suzuki et al., Enzyme and Microb. Technol., 24, 13-20 (1999)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便で、安価で、そして工業的に有利な光学活性ヒドロキシカルボン酸および光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、並びにそれらのアルキルエステルの製法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記式［１］
Ｒ1−(ＣＨ2)n−ＣＨＯＨ−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＲ2 [1]
(式中、Ｒ1はメチル基またはベンジル基であり、Ｒ2はアルキル基であり、そしてｍが０のときｎは０または１であり、ｍが１のときｎは０である。)
で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステル、あるいはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルに、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物もしくはその産生物を作用させ、該エステルを光学分割し、残存する一方の光学活性カルボン酸アルキルエステルまたは生成する他方の光学活性カルボン酸を採取することを特徴とする光学活性ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルまたは光学活性ヒドロキシカルボン酸、あるいは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルまたは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の製法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、式［１］で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルまたはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステル(以下単にラセミ体カルボン酸アルキルエステルと総称する。）に、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物菌体もしくはその産生物を作用させ、立体選択的なエステル加水分解反応により、一方の光学活性体を該光学活性カルボン酸に変換し、もう一方の該光学活性カルボン酸アルキルエステルを残存せしめ、ついでいずれかの光学活性体を単離、回収することを特徴とする方法である。
【０００９】
本発明において、基質として用いられるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルの好ましい例は、３−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、乳酸メチルもしくはエチルエステル、または４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステルである。特に好ましい基質は、３−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステルである。ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルの好ましい例は、そのメチルもしくはエチルエステルである。
本発明に使用される菌体産生エステル分解酵素はＴＨＦＡＥの中でもそのメチルエステルに特異性が高く、効率的、かつ、高収率でＲ体メチルＴＨＦＡＥを調製することを初めて見出した。
本発明に使用される微生物は、ラセミ体カルボン酸アルキルエステルに対して、立体選択的なエステル分解反応を触媒する酵素を生産するエンテロバクター属に属する微生物およびキトロバクター属に属する微生物である。
具体的には本発明者らにより土壌から分離されたEnterobacter sp DS-S-75株、Citrobacter freundii DS-S-13株、Citrobacter freundii DS-K-40株を挙げることができる。これらの微生物は、既に独立行政法人産業技術総合研究所(旧工業技術院微生物工業研究所)に以下の国際寄託番号で寄託されている。
Enterobacter sp DS-S-75株：FERM BP-5494、Citrobacter freundii DS-S-13株：FERM BP-5492、Citrobacter freundii DS-K-40株：FERM BP-5493。
【００１０】
上記微生物Enterobacter sp DS-S-75株、Citrobacter freundii DS-S-13株、およびCitrobacter freundii DS-K-40株を培養するための培地組成としては通常これらの微生物が生育する培地ならばいずれでも使用することができる。
例えば、炭素源としてグリセロール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールなどのアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトースなどの炭水化物またはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカーなどの有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨを５〜９、好ましくは６.５〜７.０、培養温度は２０〜４０oＣ、好ましくは２５〜３７oＣの範囲で好気的に１０〜９６時間行なうことが好ましい。
【００１１】
ラセミ体カルボン酸アルキルエステルに上記微生物あるいはその微生物産生物を作用させて残存する該光学活性カルボン酸アルキルエステルおよびその生成物である該光学活性カルボン酸を得る方法としては、本発明に係る微生物を
１)上記培養方法により得た微生物の培養液、あるいは２)その培養液から遠心分離あるいは膜分離により得た菌体およびその菌体処理物(菌体破砕物あるいは菌体抽出液)、または３)それらを常法により固定化したものとし、緩衝液に混合した微生物菌体混合液に基質を添加する方法がある。
反応温度は１５〜５０oＣが好ましく、反応ｐＨは６〜９が好ましい。反応液中の基質濃度は０.１〜２０％(v/v)が好ましく、基質は初期に一括していれてもよいし、分割添加してもよい。分割添加する場合に中和に要したアルカリの量を指標として、添加基質量を計算し分解活性に応じて基質を添加してもよい。なお、使用するアルカリは特に限定されず、強塩基、弱塩基共に使用できるが、弱塩基を用いた場合、反応速度や立体選択性が向上する場合がある。
【００１２】
反応は通常、撹拌あるいは振盪しながら行い、反応時間は基質濃度、生育菌体量により異なるが数時間〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィーなどの分析により残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で反応を終了するのがよい。
反応中に立体選択的なエステル加水分解反応に伴い生成する該光学活性カルボン酸によるｐＨの低下に対して、弱塩基性のアルカリ金属化合物水溶液あるいはその懸濁液、またはアンモニア水溶液により、その反応ｐＨを微生物あるいはその菌体産生酵素の至適ｐＨで制御することにより、高光学純度の該光学活性カルボン酸エステル並びに該光学活性カルボン酸を効果的に得ることができる。
弱塩基性のアルカリ金属化合物としては、炭酸アルカリ金属塩、炭酸水素アルカリ金属塩、炭酸アンモニウム塩、炭酸水素アンモニウム塩である。具体的には、アンモニア水、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸カルシウムの水溶液あるいは水懸濁液を挙げることができる。
【００１３】
このようにして反応液中に残存する該光学活性カルボン酸アルキルエステル並びに該光学活性カルボン酸は一般的な方法で回収および精製できる。例えば反応液から菌体を遠心分離で除いた後、上清を酢酸エチルなどの溶媒で抽出し、酢酸エチル相に該光学活性カルボン酸アルキルエステルを、水相に該光学活性カルボン酸を分画抽出することができる。
また、菌体除去後の上清をエバポレーターにより濃縮して水相を除去し、酢酸エチル等で溶媒置換を行なう。その溶液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し、該光学活性カルボン酸アルキルエステル並びに該光学活性カルボン酸の粗シロップを得ることができる。さらに蒸留やシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。
【００１４】
【実施例】
以下実施例をもって、本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り(w/v)を表す。
実施例１
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地(pH7.2)２.５Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター(培養器)を１２１℃、１５分間滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地(pH7.2)で３０℃、１６時間振盪培養して種菌を調製し、上記培地に２％(v/v)量無菌的に接種した。そして温度３０℃、通気量０.５Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液(pH7.2)で３回洗浄し、１００ｇの休止菌体を調製した。その休止菌体５０ｇを上記同緩衝液２５００ｍｌを入れた同５Ｌ容のジャーファーメンターに懸濁し(菌体濁度９.５ ＯＤ(660nmの濁度))、２００ｇのラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを加え、３０℃で攪拌しながら４時間光学分割反応を行った。なお、ｐＨ中和剤として５％の炭酸カルシウム(25g)を反応液に添加した。
【００１５】
そのときの反応液中に残存する３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをガスクロマトグラフィー(カラム担体：PEG20M,60-80メッシュ)で分析した結果、その残存率は４８％であった。
反応終了後、菌体を除去し等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で溶媒を除去し、７７ｇの３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを含有するシロップを得た。該物質の同定および定量は同ガスクロマトグラフィーにより行ない、オリジナル化合物とのリテンションタイムより確認した。このシロップ中の３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ酢酸化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ(0.25mm ｘ 30m)を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。その結果、回収した３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルは光学純度９９.１％ｅｅのＳ体であることが判明した。
【００１６】
一方、水中に残存する３−ヒドロキシブタン酸は、同ガスクロマトグラフィーによりオリジナル化合物とのリテンションタイムにより同定と定量を行った。その際、水溶液のｐＨを塩酸によりｐＨ４にしてから行なった。その結果、２.２％(w/v)の３−ヒドロキシブタン酸が残存していることが判明した。水溶液をエバポレーターにより除去し、３−ヒドロキシブタン酸のシロップを４４ｇ得た。
ついで、３０ml容の三角フラスコにこのシロップを５０mg入れ、氷冷しながら４-ジメチルアミノピリジンを１２２mg、ジクロロメタンを１０ml、塩酸飽和エタノールを１００μｌ、塩酸１−エチル３−(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを１１５ｍｇを加え１０分ほど撹拌した後、蓋をして室温で一晩撹拌した。有機層を１Ｎ塩酸で２回洗浄した後デシケーターにて溶媒を除去し、３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルへと変換した。これを上記３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルと同様にトリフルオロ酢酸化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ(0.25mm ｘ 30m)を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行ない、このエステル変換体は光学純度９８.２％ｅｅのＲ体であった。その結果、水中に残存した３−ヒドロキシブタン酸はＲ体であることが判明した。
光学純度分析条件：
カラム温度；９０℃、窒素流量；０.３ｍｌ／ｍｉｎ、スプリット比；１００：１、リテンションタイム Ｒ体；７.８分、Ｓ体；１１.９分
【００１７】
実施例２
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体乳酸エチルエステルに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、２００ｇのラセミ体乳酸エチルエステルより、５６ｇのＲ体乳酸エチルエステルを得た。その光学純度は９８．７％ｅｅであった。
また、水中から得られた乳酸は９０ｇであった。該乳酸は実施例１と同様の方法で該エチルエステル体に変換後、光学純度を分析し、その光学純度は６５．１％ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＲ体；５.２分、Ｓ体；５.４分である。
【００１８】
実施例３
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、２００ｇのラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルより、７５ｇのＲ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを得た。その光学純度は９９.２%ｅｅであった。
また、水中から得られた２−ヒドロキシブタン酸は４７ｇであった。該カルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、光学純度を分析し、その光学純度は９５.１%ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＲ体；９.４分、Ｓ体；１０.８分である。
【００１９】
実施例４
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルに変え、そしてその添加量を５０ｇに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物を定量した。
５０ｇのラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルより、４.８ｇのエチルエステル体と３０．２ｇのカルボン酸を得た。
得られたエチルエステル体の光学純度はダイセル社製ＣＨＩＲＡＬＥＬ ＯＤ(25cm ｘ 0.46cm)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HLPC)により光学純度の分析を行なった。
そのときの分析条件は、展開溶媒；ヘキサン/イソプロパノール(100：1)、流速；０.５ｍｌ、カラム温度；２５℃、検出：ＵＶ２５０ｎｍであった。
その結果、該エチルエステル体の光学純度は９８．１％ｅｅのＲ体であった。
また、生成したカルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、前記と同様にして光学純度を分析した。その光学純度は１９．４％ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＳ体；３７.５分、Ｒ体；６１.３分である。
【００２０】
実施例１−４をまとめた表を以下に示す。
【表１】
【００２１】
実施例５−１２
使用する微生物をEnterobacter sp. DS-S-75株からCitrobacter freundii DS-S-13株あるいはCitrobacter freundii DS-K-40株に変更した以外は実施例１〜実施例４と同様の方法で反応を行った。なお、基質として用いたラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステル、ラセミ体乳酸エチルエステル、ラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステル、ラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルはそれぞれ５０ｇを使用し、また、使用した休止菌体はそれぞれ５０ｇ(湿重量)とした。
生成物の定量並びに光学純度の分析は実施例１あるいは実施例４と同様にして行なった。
なお、生成した各カルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、それぞれの光学純度を分析した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】
実施例１３
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（pH7.2）２．５Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター（培養器）を１２１℃，１５分滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン，酵母エキス，グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（pH7.2）で３０℃、１６時間振とう培養して種菌を調製し、上記培地に２％（V/V）量無菌的に接種した。そして温度３０℃、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（pH7.2）で３回洗浄し、１００ｇの休止菌体を調製した。その休止菌体１００ｇを上記同緩衝液２５００ｍｌを入れた同５Ｌ容のジャーファーメンターに懸濁し（菌体濁度19 OD （660nmの濁度））、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを加え、３０℃で攪拌しながら２４時間光学分割反応を行った。ｐＨ中和剤として５％の炭酸カルシウム（25g）を反応に添加した。そのときの反応液中に残存するテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー（カラム担体：PEG20M，60−80メッシュ）で分析した結果、その残存率は４０％であった。
なお、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルは、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸と５当量のメタノールを触媒量の硫酸存在下、８０℃で５時間還流して合成した。反応終了後、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルをエチルエーテルにより抽出し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステル標品を得た。
【００２５】
分割反応終了後、菌体を除去し等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で溶媒を除去し、３６ｇのテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを含有するシロップを得た。
該メチルエステルの同定および定量は同ガスクロマトグラフィーにより行ない、オリジナル化合物とのリテンションタイムより確認した。
このシロップ中のテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（0.25mm ｘ 30m）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。その結果、回収したテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルは光学純度９９．１％ｅｅのＲ体であることが判明した。なお、Ｒ体、Ｓ体のリテンションタイムはそれぞれ８．０分と９．０分であった。
【００２６】
一方、水中に残存するテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は、同ガスクロマトグラフィーによりオリジナル化合物とのリテンションタイムにより同定と定量を行った。その際、水溶液のｐＨを塩酸によりｐＨ４にしてから行なった。水溶液をエバポレーターにより除去し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸のシロップを５７ｇ得た。光学純度の分析は得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸を実施例１の方法に準じてメチルエステルへと変換後、前述の方法により分析した。その結果、生成したテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は光学純度６５．１％ｅｅのＳ体であることが判明した。
光学純度分析条件
カラム温度 １２０℃、窒素流量 ０．３ｍｌ／ｍｉｎ、スプリット比 １００：１、リテンションタイム Ｒ体；８．０分、Ｓ体；９．０分
【００２７】
実施例１４
基質をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルからテトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１３と同様の方法で反応を行なった。そして実施例１３と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルより３５．２ｇのＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルを得た。その光学純度は９８．7％ｅｅであった。また、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は５１ｇであった。該カルボン酸を実施例１の方法に準じてメチルエステルに変換後に分析した光学純度は６５．1％ｅｅのＳ体であった。
なお、該エチルエステルのリテンションタイムはそれぞれ Ｒ体 ８．２分、Ｓ体 ９．２分であった。
【００２８】
実施例１５
用いた微生物をCitrobacter freundii DS-S-13株、あるいはCitrobacter freundii DS-S-40株に変更した以外は実施例１３と同様の方法で光学分割反応を行った。そして実施例１３と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルよりそれぞれ３２．１ｇと３３．１ｇのＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを得た。光学純度はそれぞれ９８．５％ｅｅと９８．２％ｅｅであった。
また、得られた各テトラヒドロフラン−２−カルボン酸は実施例１に準じてそれぞれメチルエステルに変換後に測定した結果、それぞれ光学純度は６７．３％ｅｅと６５．１%ｅｅのＳ体であった。
【００２９】
実施例１６
基質をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルからラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１５と同様の方法で光学分割反応を行った。
１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルより、Citrobacter freundii DS-S-13株、あるいはCitrobacter freundii DS-S-40株ではそれぞれ３３．２ｇと３４．５ｇのエチルエステル体と６７．１ｇと６２．６ｇのカルボン酸を得た。得られたエチルエステル体の光学純度はそれぞれ９９．１％ｅｅと９８．５％ｅｅのＲ体であることが判明した。また、生成した該カルボン酸は実施例１の方法に準じて該メチルエステル体に変換後、光学純度を測定した。その結果、それぞれ６６．４％ｅｅと６７．２％ｅｅのＳ体であった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によればエンテロバクター属に属する微生物(例えば、Enterobacter sp. DS-S-75株)、キトロバクター属に属する微生物(例えば、 Citrobacter freundii DS-S-13株、Citrobacter freundii DS-K-40株)を利用したエステル加水分解反応によるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステル［１］の光学分割反応において、高光学純度の該光学活性ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルと光学活性ヒドロキシカルボン酸を効率的に産生することができる。また、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルの光学分割反応において、高光学純度の該光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸と光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を効率的に産生することができる。
【発明の属する技術分野】
本発明は医薬・農薬・生理活性物質などの光学活性化合物の合成における有用なキラルビルディングブロックや中間体となりうる光学活性ヒドロキシカルボン酸および光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、並びにそれらのアルキルエステルの微生物処理による製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ハロバクテリア ハロビウム(Halobacterium halobium) をラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エステルに作用させた場合、カルボン酸エステル水解反応によりＲ体３−ヒドロキシブタン酸エステルが残存することが報告されている(非特許文献１参照)。しかしながら、立体選択的なエステル分解活性を有する微生物を用いたラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エステルからの高光学純度のＳ体３−ヒドロキシブタン酸エステルの製法は知られていない。
【０００３】
また、光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステル(ＴＨＦＡＥと略記することもある。)あるいはその酸(ＴＨＦＡと略記することもある。)の生物化学的な方法としては、微生物や動物由来のエステル分解酵素をＴＨＦＡＥに作用させ、立体選択的な加水分解により残存する該光学活性ＴＨＦＡＥと生成する該光学活性ＴＨＦＡに分割する方法が特許文献１及び特許文献２に開示されている。しかし、両法ともＴＨＦＡＥのアルキル側鎖の種類によってはその立体選択性が影響されるとともに、その立体選択性が低く、そして得られる光学活性体の収率も低い。
本発明者らは、ラセミ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロロアルコールに、エンテロバクター(Enterobacter)属、キトロバクター(Citrobacter)属の微生物菌体あるいはその微生物抽出物を作用させ、Ｓ体３−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに変換し、残存するもう一方のＲ体４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルを同時に回収する方法(特許文献３、非特許文献２）を見出し、報告している。
【０００４】
本発明者らは、上記微生物菌体反応の基質特異性について、さらに鋭意研究した結果、カルボン酸エステルを立体選択的に加水分解する性質を見出し、本発明を完成するに至った。
本発明で基質として用いられるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルあるいはテトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルは、４−クロロ−３−ヒドロキシブタン酸エステルのようなクロルアルコール化合物とは異なるため、立体選択的な脱クロル化反応の進行に伴って塩酸が生成するような反応ではなく、立体選択的なカルボン酸エステル加水分解活性により分割反応が進行していると考えられる。さらに本発明に係るこの反応では、α位やβ位にある不斉炭素を立体選択的に認識しながらそのカルボン酸エステルを立体選択的に加水分解することは極めて興味深い反応である。
【０００５】
【特許文献１】
国際公開第０１／９２５５４号パンフレット
【特許文献２】
特開平１４−１７１９９４号公報
【特許文献３】
特開平９−４７２９６号公報
【非特許文献１】
Ehrler and Seebach, Helv. Chim. Acta, 72,793-799 (1989)
【非特許文献２】
Suzuki et al., Enzyme and Microb. Technol., 24, 13-20 (1999)
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便で、安価で、そして工業的に有利な光学活性ヒドロキシカルボン酸および光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸、並びにそれらのアルキルエステルの製法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、下記式［１］
Ｒ1−(ＣＨ2)n−ＣＨＯＨ−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＲ2 [1]
(式中、Ｒ1はメチル基またはベンジル基であり、Ｒ2はアルキル基であり、そしてｍが０のときｎは０または１であり、ｍが１のときｎは０である。)
で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステル、あるいはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルに、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物もしくはその産生物を作用させ、該エステルを光学分割し、残存する一方の光学活性カルボン酸アルキルエステルまたは生成する他方の光学活性カルボン酸を採取することを特徴とする光学活性ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルまたは光学活性ヒドロキシカルボン酸、あるいは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルまたは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の製法に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、式［１］で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルまたはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステル(以下単にラセミ体カルボン酸アルキルエステルと総称する。）に、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物菌体もしくはその産生物を作用させ、立体選択的なエステル加水分解反応により、一方の光学活性体を該光学活性カルボン酸に変換し、もう一方の該光学活性カルボン酸アルキルエステルを残存せしめ、ついでいずれかの光学活性体を単離、回収することを特徴とする方法である。
【０００９】
本発明において、基質として用いられるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルの好ましい例は、３−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、乳酸メチルもしくはエチルエステル、または４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステルである。特に好ましい基質は、３−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステル、２−ヒドロキシブタン酸メチルもしくはエチルエステルである。ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルの好ましい例は、そのメチルもしくはエチルエステルである。
本発明に使用される菌体産生エステル分解酵素はＴＨＦＡＥの中でもそのメチルエステルに特異性が高く、効率的、かつ、高収率でＲ体メチルＴＨＦＡＥを調製することを初めて見出した。
本発明に使用される微生物は、ラセミ体カルボン酸アルキルエステルに対して、立体選択的なエステル分解反応を触媒する酵素を生産するエンテロバクター属に属する微生物およびキトロバクター属に属する微生物である。
具体的には本発明者らにより土壌から分離されたEnterobacter sp DS-S-75株、Citrobacter freundii DS-S-13株、Citrobacter freundii DS-K-40株を挙げることができる。これらの微生物は、既に独立行政法人産業技術総合研究所(旧工業技術院微生物工業研究所)に以下の国際寄託番号で寄託されている。
Enterobacter sp DS-S-75株：FERM BP-5494、Citrobacter freundii DS-S-13株：FERM BP-5492、Citrobacter freundii DS-K-40株：FERM BP-5493。
【００１０】
上記微生物Enterobacter sp DS-S-75株、Citrobacter freundii DS-S-13株、およびCitrobacter freundii DS-K-40株を培養するための培地組成としては通常これらの微生物が生育する培地ならばいずれでも使用することができる。
例えば、炭素源としてグリセロール、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトールなどのアルコール類、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸とその塩類などの有機酸、Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−ガラクトースなどの炭水化物またはそれらの混合物を、窒素源として硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機窒素化合物および尿素、ペプトン、カゼイン、酵母エキス、肉エキス、コーンスチープリカーなどの有機窒素化合物とそれらの混合物を挙げることができる。その他、無機塩としてリン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩など、さらに必要に応じてビタミン類を加えてもよい。
上記微生物の培養は常法によればよく、例えばｐＨを５〜９、好ましくは６.５〜７.０、培養温度は２０〜４０oＣ、好ましくは２５〜３７oＣの範囲で好気的に１０〜９６時間行なうことが好ましい。
【００１１】
ラセミ体カルボン酸アルキルエステルに上記微生物あるいはその微生物産生物を作用させて残存する該光学活性カルボン酸アルキルエステルおよびその生成物である該光学活性カルボン酸を得る方法としては、本発明に係る微生物を
１)上記培養方法により得た微生物の培養液、あるいは２)その培養液から遠心分離あるいは膜分離により得た菌体およびその菌体処理物(菌体破砕物あるいは菌体抽出液)、または３)それらを常法により固定化したものとし、緩衝液に混合した微生物菌体混合液に基質を添加する方法がある。
反応温度は１５〜５０oＣが好ましく、反応ｐＨは６〜９が好ましい。反応液中の基質濃度は０.１〜２０％(v/v)が好ましく、基質は初期に一括していれてもよいし、分割添加してもよい。分割添加する場合に中和に要したアルカリの量を指標として、添加基質量を計算し分解活性に応じて基質を添加してもよい。なお、使用するアルカリは特に限定されず、強塩基、弱塩基共に使用できるが、弱塩基を用いた場合、反応速度や立体選択性が向上する場合がある。
【００１２】
反応は通常、撹拌あるいは振盪しながら行い、反応時間は基質濃度、生育菌体量により異なるが数時間〜１２０時間で終了するのがよい。好ましくはガスクロマトグラフィーなどの分析により残存基質量が初期基質濃度に比して５０％で反応を終了するのがよい。
反応中に立体選択的なエステル加水分解反応に伴い生成する該光学活性カルボン酸によるｐＨの低下に対して、弱塩基性のアルカリ金属化合物水溶液あるいはその懸濁液、またはアンモニア水溶液により、その反応ｐＨを微生物あるいはその菌体産生酵素の至適ｐＨで制御することにより、高光学純度の該光学活性カルボン酸エステル並びに該光学活性カルボン酸を効果的に得ることができる。
弱塩基性のアルカリ金属化合物としては、炭酸アルカリ金属塩、炭酸水素アルカリ金属塩、炭酸アンモニウム塩、炭酸水素アンモニウム塩である。具体的には、アンモニア水、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸アンモニウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、炭酸カルシウムの水溶液あるいは水懸濁液を挙げることができる。
【００１３】
このようにして反応液中に残存する該光学活性カルボン酸アルキルエステル並びに該光学活性カルボン酸は一般的な方法で回収および精製できる。例えば反応液から菌体を遠心分離で除いた後、上清を酢酸エチルなどの溶媒で抽出し、酢酸エチル相に該光学活性カルボン酸アルキルエステルを、水相に該光学活性カルボン酸を分画抽出することができる。
また、菌体除去後の上清をエバポレーターにより濃縮して水相を除去し、酢酸エチル等で溶媒置換を行なう。その溶液を無水硫酸マグネシウムにより脱水した後、減圧下で溶媒を除去し、該光学活性カルボン酸アルキルエステル並びに該光学活性カルボン酸の粗シロップを得ることができる。さらに蒸留やシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより精製してもよい。
【００１４】
【実施例】
以下実施例をもって、本発明を詳細に説明するが本発明はこれらの例に限定されるものではない。なお、実施例中の％は特に記載のない限り(w/v)を表す。
実施例１
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地(pH7.2)２.５Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター(培養器)を１２１℃、１５分間滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１.０％含む栄養培地(pH7.2)で３０℃、１６時間振盪培養して種菌を調製し、上記培地に２％(v/v)量無菌的に接種した。そして温度３０℃、通気量０.５Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液(pH7.2)で３回洗浄し、１００ｇの休止菌体を調製した。その休止菌体５０ｇを上記同緩衝液２５００ｍｌを入れた同５Ｌ容のジャーファーメンターに懸濁し(菌体濁度９.５ ＯＤ(660nmの濁度))、２００ｇのラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを加え、３０℃で攪拌しながら４時間光学分割反応を行った。なお、ｐＨ中和剤として５％の炭酸カルシウム(25g)を反応液に添加した。
【００１５】
そのときの反応液中に残存する３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをガスクロマトグラフィー(カラム担体：PEG20M,60-80メッシュ)で分析した結果、その残存率は４８％であった。
反応終了後、菌体を除去し等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で溶媒を除去し、７７ｇの３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを含有するシロップを得た。該物質の同定および定量は同ガスクロマトグラフィーにより行ない、オリジナル化合物とのリテンションタイムより確認した。このシロップ中の３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを無水トリフルオロ酢酸によりトリフルオロ酢酸化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ(0.25mm ｘ 30m)を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。その結果、回収した３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルは光学純度９９.１％ｅｅのＳ体であることが判明した。
【００１６】
一方、水中に残存する３−ヒドロキシブタン酸は、同ガスクロマトグラフィーによりオリジナル化合物とのリテンションタイムにより同定と定量を行った。その際、水溶液のｐＨを塩酸によりｐＨ４にしてから行なった。その結果、２.２％(w/v)の３−ヒドロキシブタン酸が残存していることが判明した。水溶液をエバポレーターにより除去し、３−ヒドロキシブタン酸のシロップを４４ｇ得た。
ついで、３０ml容の三角フラスコにこのシロップを５０mg入れ、氷冷しながら４-ジメチルアミノピリジンを１２２mg、ジクロロメタンを１０ml、塩酸飽和エタノールを１００μｌ、塩酸１−エチル３−(３-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドを１１５ｍｇを加え１０分ほど撹拌した後、蓋をして室温で一晩撹拌した。有機層を１Ｎ塩酸で２回洗浄した後デシケーターにて溶媒を除去し、３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルへと変換した。これを上記３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルと同様にトリフルオロ酢酸化した後、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ(0.25mm ｘ 30m)を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行ない、このエステル変換体は光学純度９８.２％ｅｅのＲ体であった。その結果、水中に残存した３−ヒドロキシブタン酸はＲ体であることが判明した。
光学純度分析条件：
カラム温度；９０℃、窒素流量；０.３ｍｌ／ｍｉｎ、スプリット比；１００：１、リテンションタイム Ｒ体；７.８分、Ｓ体；１１.９分
【００１７】
実施例２
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体乳酸エチルエステルに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、２００ｇのラセミ体乳酸エチルエステルより、５６ｇのＲ体乳酸エチルエステルを得た。その光学純度は９８．７％ｅｅであった。
また、水中から得られた乳酸は９０ｇであった。該乳酸は実施例１と同様の方法で該エチルエステル体に変換後、光学純度を分析し、その光学純度は６５．１％ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＲ体；５.２分、Ｓ体；５.４分である。
【００１８】
実施例３
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、２００ｇのラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルより、７５ｇのＲ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルを得た。その光学純度は９９.２%ｅｅであった。
また、水中から得られた２−ヒドロキシブタン酸は４７ｇであった。該カルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、光学純度を分析し、その光学純度は９５.１%ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＲ体；９.４分、Ｓ体；１０.８分である。
【００１９】
実施例４
ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステルをラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルに変え、そしてその添加量を５０ｇに変えた以外は実施例１と同様の方法で反応を行ない、そして実施例１と同様にして生成物を定量した。
５０ｇのラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルより、４.８ｇのエチルエステル体と３０．２ｇのカルボン酸を得た。
得られたエチルエステル体の光学純度はダイセル社製ＣＨＩＲＡＬＥＬ ＯＤ(25cm ｘ 0.46cm)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HLPC)により光学純度の分析を行なった。
そのときの分析条件は、展開溶媒；ヘキサン/イソプロパノール(100：1)、流速；０.５ｍｌ、カラム温度；２５℃、検出：ＵＶ２５０ｎｍであった。
その結果、該エチルエステル体の光学純度は９８．１％ｅｅのＲ体であった。
また、生成したカルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、前記と同様にして光学純度を分析した。その光学純度は１９．４％ｅｅのＳ体であった。
なお、リテンションタイムはそれぞれＳ体；３７.５分、Ｒ体；６１.３分である。
【００２０】
実施例１−４をまとめた表を以下に示す。
【表１】
実施例５−１２
使用する微生物をEnterobacter sp. DS-S-75株からCitrobacter freundii DS-S-13株あるいはCitrobacter freundii DS-K-40株に変更した以外は実施例１〜実施例４と同様の方法で反応を行った。なお、基質として用いたラセミ体３−ヒドロキシブタン酸エチルエステル、ラセミ体乳酸エチルエステル、ラセミ体２−ヒドロキシブタン酸エチルエステル、ラセミ体４−フェニル−２−ヒドロキシブタン酸エチルエステルはそれぞれ５０ｇを使用し、また、使用した休止菌体はそれぞれ５０ｇ(湿重量)とした。
生成物の定量並びに光学純度の分析は実施例１あるいは実施例４と同様にして行なった。
なお、生成した各カルボン酸は実施例１と同様の方法でエチルエステル体に変換後、それぞれの光学純度を分析した。
【００２２】
【表２】
【表３】
実施例１３
ペプトン、酵母エキス、グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（pH7.2）２．５Ｌを入れた５Ｌ容ジャーファーメンター（培養器）を１２１℃，１５分滅菌した。予め供試菌であるEnterobacter sp. DS-S-75株をペプトン，酵母エキス，グリセロールをそれぞれ１．０％含む栄養培地（pH7.2）で３０℃、１６時間振とう培養して種菌を調製し、上記培地に２％（V/V）量無菌的に接種した。そして温度３０℃、通気量０．５Ｌ／ｍｉｎ、回転数５００ｒｐｍの条件で約２４時間、通気攪拌培養を行なった。培養終了後、培養液を取り出し遠心分離にて集菌し、２ｍＭの硫酸マグネシウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（pH7.2）で３回洗浄し、１００ｇの休止菌体を調製した。その休止菌体１００ｇを上記同緩衝液２５００ｍｌを入れた同５Ｌ容のジャーファーメンターに懸濁し（菌体濁度19 OD （660nmの濁度））、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを加え、３０℃で攪拌しながら２４時間光学分割反応を行った。ｐＨ中和剤として５％の炭酸カルシウム（25g）を反応に添加した。そのときの反応液中に残存するテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー（カラム担体：PEG20M，60−80メッシュ）で分析した結果、その残存率は４０％であった。
なお、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルは、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸と５当量のメタノールを触媒量の硫酸存在下、８０℃で５時間還流して合成した。反応終了後、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルをエチルエーテルにより抽出し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステル標品を得た。
【００２５】
分割反応終了後、菌体を除去し等量の酢酸エチルで３回抽出した。酢酸エチル層を無水硫酸マグネシウムにより脱水後、減圧下で溶媒を除去し、３６ｇのテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを含有するシロップを得た。
該メチルエステルの同定および定量は同ガスクロマトグラフィーにより行ない、オリジナル化合物とのリテンションタイムより確認した。
このシロップ中のテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを、アステック社製のキャピラリーカラムＧ−ＴＡ（0.25mm ｘ 30m）を用いたガスクロマトグラフィーにより光学異性体の分析を行なった。その結果、回収したテトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルは光学純度９９．１％ｅｅのＲ体であることが判明した。なお、Ｒ体、Ｓ体のリテンションタイムはそれぞれ８．０分と９．０分であった。
【００２６】
一方、水中に残存するテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は、同ガスクロマトグラフィーによりオリジナル化合物とのリテンションタイムにより同定と定量を行った。その際、水溶液のｐＨを塩酸によりｐＨ４にしてから行なった。水溶液をエバポレーターにより除去し、テトラヒドロフラン−２−カルボン酸のシロップを５７ｇ得た。光学純度の分析は得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸を実施例１の方法に準じてメチルエステルへと変換後、前述の方法により分析した。その結果、生成したテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は光学純度６５．１％ｅｅのＳ体であることが判明した。
光学純度分析条件
カラム温度 １２０℃、窒素流量 ０．３ｍｌ／ｍｉｎ、スプリット比 １００：１、リテンションタイム Ｒ体；８．０分、Ｓ体；９．０分
【００２７】
実施例１４
基質をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルからテトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１３と同様の方法で反応を行なった。そして実施例１３と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルより３５．２ｇのＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルを得た。その光学純度は９８．7％ｅｅであった。また、得られたテトラヒドロフラン−２−カルボン酸は５１ｇであった。該カルボン酸を実施例１の方法に準じてメチルエステルに変換後に分析した光学純度は６５．1％ｅｅのＳ体であった。
なお、該エチルエステルのリテンションタイムはそれぞれ Ｒ体 ８．２分、Ｓ体 ９．２分であった。
【００２８】
実施例１５
用いた微生物をCitrobacter freundii DS-S-13株、あるいはCitrobacter freundii DS-S-40株に変更した以外は実施例１３と同様の方法で光学分割反応を行った。そして実施例１３と同様にして生成物の定量並びに光学純度の分析を行なった。
その結果、１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルよりそれぞれ３２．１ｇと３３．１ｇのＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルを得た。光学純度はそれぞれ９８．５％ｅｅと９８．２％ｅｅであった。
また、得られた各テトラヒドロフラン−２−カルボン酸は実施例１に準じてそれぞれメチルエステルに変換後に測定した結果、それぞれ光学純度は６７．３％ｅｅと６５．１%ｅｅのＳ体であった。
【００２９】
実施例１６
基質をラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルエステルからラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルに変えた以外は実施例１５と同様の方法で光学分割反応を行った。
１００ｇのラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸エチルエステルより、Citrobacter freundii DS-S-13株、あるいはCitrobacter freundii DS-S-40株ではそれぞれ３３．２ｇと３４．５ｇのエチルエステル体と６７．１ｇと６２．６ｇのカルボン酸を得た。得られたエチルエステル体の光学純度はそれぞれ９９．１％ｅｅと９８．５％ｅｅのＲ体であることが判明した。また、生成した該カルボン酸は実施例１の方法に準じて該メチルエステル体に変換後、光学純度を測定した。その結果、それぞれ６６．４％ｅｅと６７．２％ｅｅのＳ体であった。
【００３０】
【発明の効果】
本発明によればエンテロバクター属に属する微生物(例えば、Enterobacter sp. DS-S-75株)、キトロバクター属に属する微生物(例えば、 Citrobacter freundii DS-S-13株、Citrobacter freundii DS-K-40株)を利用したエステル加水分解反応によるラセミ体ヒドロキシカルボン酸アルキルエステル［１］の光学分割反応において、高光学純度の該光学活性ヒドロキシカルボン酸アルキルエステルと光学活性ヒドロキシカルボン酸を効率的に産生することができる。また、ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸アルキルエステルの光学分割反応において、高光学純度の該光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸と光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を効率的に産生することができる。
Claims (15)
- 下記式［１］
Ｒ1−(ＣＨ2)n−ＣＨＯＨ−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＲ2 [1]
(式中、Ｒ1はメチル基またはベンジル基であり、Ｒ2はメチル基またはエチル基であり、そしてｍが０のときｎは０または１であり、ｍが１のときｎは０である。)
で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸メチル若しくはエチルエステル、あるいはラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチル若しくはエチルエステルに、エンテロバクター(Enterobacter)属またはキトロバクター(Citrobacter)属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物、その微生物培養液より得られる菌体またはその菌体処理物を作用させ、該エステルを光学分割し、残存する一方の光学活性カルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは生成する他方の光学活性カルボン酸を採取することを特徴とする光学活性ヒドロキシカルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは光学活性ヒドロキシカルボン酸、あるいは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の製法。 - 下記式［１］
Ｒ1−(ＣＨ2)n−ＣＨＯＨ−(ＣＨ2)m−ＣＯＯＲ2 [1]
(式中、Ｒ1はメチル基またはベンジル基であり、Ｒ2はメチル基またはエチル基であり、そしてｍが０のときｎは０または１であり、ｍが１のときｎは０である。)
で示されるラセミ体ヒドロキシカルボン酸メチル若しくはエチルエステルに、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物、その微生物培養液より得られる菌体またはその菌体処理物を作用させ、該エステルを光学分割し、残存する一方の光学活性カルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは生成する他方の光学活性カルボン酸を採取することを特徴とする光学活性ヒドロキシカルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは光学活性ヒドロキシカルボン酸の製法。 - ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチル若しくはエチルエステルに、エンテロバクター属またはキトロバクター属に属する、カルボン酸エステル分解活性を有する微生物、その微生物培養液より得られる菌体またはその菌体処理物を作用させ、該エステルを光学分割し、残存する一方の光学活性カルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは生成する他方の光学活性カルボン酸を採取することを特徴とする光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチル若しくはエチルエステルまたは光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸の製法。
- ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＳ体３−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体２−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＲ体２−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体乳酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＲ体乳酸メチルまたはエチルエステルを採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＲ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルまたはエチルエステルを採取する請求項１または３記載の製法。
- ラセミ体３−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＲ体３−ヒドロキシブタン酸を採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体２−ヒドロキシブタン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＳ体２−ヒドロキシブタン酸を採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体乳酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＳ体乳酸を採取する請求項１または２記載の製法。
- ラセミ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸メチルまたはエチルエステルを基質として用いてＳ体テトラヒドロフラン−２−カルボン酸を採取する請求項１または３記載の製法。
- 使用する微生物がエンテロバクター属に属する微生物である請求項１−１１のいずれかに記載の製法。
- 使用する微生物がキトロバクター属に属する微生物である請求項１−１１のいずれかに記載の製法。
- 使用する微生物がエンテロバクター(Enterobacter) sp. DS-S-75株(国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９４)である請求項１−１２のいずれかに記載の製法。
- 使用する微生物がキトロバクター フロインジー (Citrobacter freundii)DS-S-13株(国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９２)またはキトロバクターフロインジー(Citrobacter freundii)DS-K-40株(国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−５４９３)である請求項１−１１のいずれかまたは１３記載の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002372675A JP4069742B2 (ja) | 2001-12-25 | 2002-12-24 | 微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001391726 | 2001-12-25 | ||
| JP2001-391726 | 2001-12-25 | ||
| JP2002372675A JP4069742B2 (ja) | 2001-12-25 | 2002-12-24 | 微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003250595A JP2003250595A (ja) | 2003-09-09 |
| JP4069742B2 true JP4069742B2 (ja) | 2008-04-02 |
Family
ID=28677069
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002372675A Expired - Fee Related JP4069742B2 (ja) | 2001-12-25 | 2002-12-24 | 微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4069742B2 (ja) |
-
2002
- 2002-12-24 JP JP2002372675A patent/JP4069742B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003250595A (ja) | 2003-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20100261251A1 (en) | Microbial kinetic resolution of ethyl-3,4-epoxybutyrate | |
| JP4069742B2 (ja) | 微生物によるカルボン酸エステルの光学分割法 | |
| JP3705046B2 (ja) | 微生物による光学活性４−ハロゲノ−１，３−ブタンジオール及びその誘導体の製法 | |
| JP3687497B2 (ja) | 微生物培養法による光学活性１，２−ジオール類の製造法 | |
| CN102559553B (zh) | 一株无色杆菌及其不对称催化还原碳碳双键的方法 | |
| JP3758566B2 (ja) | 微生物培養法によるｒ体１，２−プロパンジオールの製法 | |
| KR20050072066A (ko) | 미생물을 이용한 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1,2－프로판디올의 제조 방법 | |
| JP4475407B2 (ja) | 微生物を利用した光学活性３−クロロ−２−メチル−１，２−プロパンジオールの製造方法 | |
| JP4042557B2 (ja) | 光学活性テトラヒドロフラン−２−カルボン酸及びそのエステルの製法 | |
| JP4061862B2 (ja) | 微生物によるクロロヒドリンの光学分割法 | |
| JP4306453B2 (ja) | 微生物利用によるｓ体１，２−プロパンジオールの製法 | |
| EP1445324A1 (en) | Process for producing optically active chroman derivative and intermediate | |
| JPH0947296A (ja) | 微生物によるクロロヒドリンの光学分割方法 | |
| JP4793131B2 (ja) | 光学活性２，３−ジクロロ−２−メチル−１−プロパノールおよび光学活性２−メチルエピクロルヒドリンの製造方法 | |
| JP3659123B2 (ja) | ４−ハロゲノ−３−アルカノイルオキシブチロニトリルの光学分割方法 | |
| JP3192835B2 (ja) | （ｓ）−１，３−ブタンジオールの製法 | |
| JP3970898B2 (ja) | 光学活性α−メチルアルカンジカルボン酸−ω−モノエステル及びその対掌体ジエステルを製造する方法 | |
| JP2828720B2 (ja) | 光学活性１，３―ブタンジオールの製造方法 | |
| JPH06319589A (ja) | 光学活性δ−ラクトンの製造法 | |
| JP3088205B2 (ja) | 光学活性１，３−ブタンジオールの製法 | |
| JP2000093191A (ja) | 光学活性化合物の製造方法 | |
| JPH0661271B2 (ja) | 光学活性２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の製造方法 | |
| JPH01132393A (ja) | ピメリン酸モノエステル誘導体の製造方法 | |
| JP2000287696A (ja) | 光学活性な１−アセトキシ−３−ハロゲノ−２−プロパノールの製法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050524 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070814 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20071010 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071225 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20080107 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110125 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110125 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120125 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120125 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130125 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130125 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140125 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |