KR20050072066A

KR20050072066A - 미생물을 이용한 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1,2－프로판디올의 제조 방법

Info

Publication number: KR20050072066A
Application number: KR1020050000596A
Authority: KR
Inventors: 니시카와고우지; 스즈키도시오; 나카가와아츠시; 스즈키게이코; 나카야마사토시
Original assignee: 다이소 가부시키가이샤
Priority date: 2004-01-05
Filing date: 2005-01-04
Publication date: 2005-07-08
Also published as: EP1550730B1; US7235399B2; EP1550730A1; ATE371745T1; DE602005002146T2; US20050153409A1; DE602005002146D1

Abstract

3－클로로－2－메틸－1, ２－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, (R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올 또는 (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 미생물, 또는 그 처리물을 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용시키는 제1 공정과, 잔존하는 광학　활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 회수하는 제2 공정를 포함하는 광학　활성　3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법.

Description

미생물을 이용한 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법{METHOD FOR PRODUCING OPTICALLY ACTIVE 3-CHLORO-2-METHYL-1,2-PROPANEDIOL TAKING ADVANTAGE OF MICROORGANISM}

본 발명은, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물로부터, 미생물을 이용하여 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 광학 활성체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올(3-chloro-2-methyl-1,2-propanediol)의 광학 활성체(optically active isomers)는, 의약품·농약·생리 활성　물질 등의 광학 활성 화합물의 제조에 있어서 극히 중요하고 유용한 화합물이다. 예를 들면, (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올로부터, 일본국 특허 제2567430호에 기재된 방법에 의해 얻어지는 제3 메틸카르비놀 유도체는, d－α－토코페롤(천연 비타민E)의 제조 중간체로 유용하다. 또한, (R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올로부터, 일본국 특허 제2557068호에 기재된 방법에 의해 얻어지는 하이드로퀴논 유도체는 d－α－토코페롤의 제조 중간체로 유용하다.

따라서, 광학 활성인 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 효율적으로 제조할 수 있는 방법이 요망되고 있다.

여기서, 광학 활성 1，2－디올의 제조로서는,

(1) 라세미체 3－할로게노－1, 2－프로판디올(racemic 3-halogeno-1,2-propanediol)에 미생물을 작용시켜, 광학 활성 3－할로게노－1, 2－프로판디올을 얻는 방법(일본국 특허공개 소63－251098, 일본국 특허공개 평6－209781),

(2) 라세미체 1, 2－프로판디올에 미생물을 작용시켜, 광학 활성체　1, 2－프로판디올을 얻는 방법(일본국 특허공개 평6－30790),

(3) 코발트 살렌(cobalt salen) 촉매에 의한 광학 활성　1, 2－프로판디올(Science, vol.277, pp.936－938, 1997)의 제조 등이 알려져 있지만, 이들의 문헌에는, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올에 대해서는 전혀 기재되어 있지 않다.

또한, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조로는, 광학 활성 주석산 에스테르로부터 화학적으로 합성하는 방법이 알려져 있다(일본국 특허 2567430). 그러나, 동일한 공보에 기재된 방법은, 고가인 원료나 저온(－18℃)에서의 반응이 필요하기 때문에, 공정도 길고, 실용적인 방법은 아니다. 이에 비해, 미생물을 이용한 반응이라면, 고가인 원료를 사용하지 않고, 온화한 조건에서 반응이 가능할　것으로 기대된다.

광학 활성 알코올을 제조할 수 있는 미생물로서， 예를 들면 일본국 특허공개　2001－120296에는, 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－K－436－1주가, (R)－4－할로게노－1, 3－부탄디올을 입체 선택적으로 탈할로겐화하는 능력을 갖는다는　것이 기재되어 있다. 또한, 일본국 특허공고 평　1－51999에는, 슈도모나스(Pseudomonas)sp. OS－K－29주가, (R)－2, 3－디브로모－1－프로파놀 동화능력을 갖는다는　것이 기재되어 있다. 또한, 일본국 특허공개 평　3－191795, 특허공개 2001－149090, 및 특허공개　2002－253295에는 슈도모나스　sp. DS－SI－5주, 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) DS－S－RP8주, 및 알칼리게네스(Alcaligenes)　sp. DS－S－7G주가, (R)－3－할로게노－1, 2－프로판디올이나　(S)－1, 2－프로판디올 동화능력을 갖는다는　것이 기재되어 있다.

그러나, 일본국 특허공개 2001－120296, 특허공개 평3－191795, 특허공개 2001－149090, 특허공개 2002－253295 및 특허공고 평1－51999에 기재된 미생물은, 광학 활성 2급 알코올을 제조할 수 있을　뿐이고, 이들 문헌에는, 상기 미생물이 3급 알코올인 3－클로로－２－메틸－1, 2－프로판디올을 제조할 수 있다는 것은 전혀 기재되어 있지 않다.

또한, 일본국 특허공개 평3－191794에는, 슈도모나스(Pseudomonas)sp, DS－K－2D1주가, 2급 알코올인(S)－3－할로게노－1, 2－프로판디올 동화능력을 갖고, (R)－3－할로게노－1, 2－프로판디올을 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 미생물이라는 것이 기재되어 있다. 그러나, 이 균주는 3급 알코올인 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물(enantiomeric mixture)에서 고광학 순도의 광학 활성체　3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을　잔존시킬 수 있는 능력은 갖고 있지 않다.

이와 같이, 2급 알코올을 광학 분할할 수 있는 미생물이 반드시 3급 알코올을 광학 분할하는 능력을 갖고 있다고는 할 수 없다.

이상, 상술한 바와 같이, 미생물을 이용하여 광학 활성인 3－클로로－2－메틸－1， 2－프로판디올을 저가로 대량 생산할 수 있는 실용적인 방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않다.

본 발명은, 고광학 순도의 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1， 2－프로판디올을 간단하게 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해 본 발명자들은 연구를 거듭하여, 이하의 사실을 발견하였다.

(i) 특정 미생물이, 3－클로로－2－메틸－1, 2－메틸－1, 2－프로판디올에 대해, 입체 선택적인 분해능을 가지고 있고, 3－클로로－2－메틸－1，2－프로판디올의 에난티오머 혼합물로 작용하여, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는다.

(ii) 상기 미생물에 의한 입체 선택적인 분해 반응은, 호기적 조건하에서 수행하는 것에 의해 더욱 효율적으로 진행한다.

(iii) 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물은, 예를 들면 황산을 촉매제로 사용하여 2－메틸－에피클로로하이드린(2-methyl-epichlorohydrin)의 개환 반응 가수분해(ring-opening reaction hydrolysis)에 의해 화학적으로 용이하게 합성할 수 있다.

본 발명은, 상기 발견된 내용에 기초하여 완성되는 것이며, 이하의 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법을 제공한다.

1항. 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체 또는 S체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 미생물 또는 그의 처리물을, 3－클로로－２－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용시키는 제1의 공정과,

잔존하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 분취하는 제2의 공정을 포함하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법.

2항. 미생물이, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물이며, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이 그의 R체인 것을 특징으로 하는 1항에 기재된 방법.

3항. 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물이, 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－K－436－1주(국제 기탁 번호:FERM BP－7079) 및 슈도모나스(Pseudomonas)sp. OS－K－29주(국제 기탁 번호:FERM BP－994)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물인 것을 특징으로 하는 2항에 기재된 방법.

4항. 미생물이, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 S체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖고, 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물 및 알칼리게네스(Alcaligenes)속에 속하는 미생물로부터 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물이며, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이 그의 S체인 것을 특징으로 하는 1항에 기재된 방법.

5항. 미생물이, 슈도모나스　sp.DS－SI－5주(국제 기탁 번호:FERM BP－7080), 슈도모나스 니트로레듀센스 (Pseudomonas nitroreducens) DS－S－RP8주(국제 기탁 번호:FERM BP－7793), 및 알칼리게네스(Alcaligenes)sp. DS－S－7G주(국제 기탁 번호:FERM BP－3098)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물인 것을 특징으로 하는 4항에 기재된 방법.

6항. 제1의 공정을 호기적 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 1항에 기재된 방법.

7항. 제1의 공정에 있어서, 반응계의 pH는 4~6.5인 것을 특징으로 하는 1항에 기재된 방법.

8항. 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물은 2－메틸－에피클로로하이드린의 에난티오머 혼합물을 황산하의 산성 조건에서 개환 가수분해시키는 것에 의해 수득되는 것을 사용하는 1항에 기재된 방법.

본 발명에 의하면, 미생물을 이용한 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물로부터 고광학적 순도의 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이 수득될 수 있다. 이 방법은 미생물을 이용하여 광학 분할하기 때문에 간편하고, 고가인 원료나 시약을 요하지 않고, 또한 온화한 조건에서 행할　수행될 있다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 공업적으로 실용성이 높은 방법이다.

발명의 상세한 설명

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법은, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물(CAS NO.597－33－1)에 작용하고, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체(CAS NO.118609－22－6) 또는 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 S체(CAS NO.120255－23－4)를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 미생물(이하, '본 발명의 미생물'이라고도 함), 또는 그의 처리물을, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용시키는 제1의 공정과, 잔존하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 분취하는 제2의 공정을 포함하는 방법이다.

원료 화합물

3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머－혼합물은, 이에 한정되지 않지만, 예를 들면, 2－메틸－에피클로로하이드린의 에난티오머 혼합물의 화학적 개환 반응에 의해 수득될 수 있다. 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머가 합성될 수 있으면 어떠한 개환 반응이라도 좋으나, 바람직하게는 황산하의 산성 조건에서의 개환 반응으로 수득될 수 있다.

본 발명의 미생물

본 발명에 사용하는 미생물은, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하고, R체 또는 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는　한 특별히 한정되지 않는다.

(R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물로서는, 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 이 중에서도, 슈도모나스(Pseudomonas)sp.DS－K－436－1주(국제 기탁 번호:FERM BP－7079, 기탁일:1999년 10월 7일, 기탁기관:National Institute of Bioscience and Human-technology Agency of Industrial Science and Technology), 및 슈도모나스　sp. OS－K－29주(국제 기탁 번호:FERM BP－994, 기탁일:1984년 9월 14일, 기탁기관:Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology)가 바람직하다. (R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물은 1종을 단독으로 또는, 2종 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, (R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물을 이용하는 경우에는, (R)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 제조할 수 있다.

또한, (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물로서는, 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물, 및 알칼리게네스(Alcaligenes)속에 속하는 미생물을 들 수 있다. 이 중에서도, 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－SI－5주(국제 기탁 번호:FERM BP－7080, 기탁일:1999년 10월 7일, 기탁기관:National Institute of Bioscience and Human-technology Agency of Industrial Science and Technology), 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) DS－S－RP8주(국제 기탁 번호:FERM BP－7793, 기탁일:2001년 6월 29일, International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) 및 알칼리게네스(Alcaligenes) sp. DS－S－7G주(국제 기탁 번호:FERM BP－3098, 기탁일:1989년 11월 15일, 기탁기관:Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology)가 바람직하다. (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물은, 1종을 단독으로 또는　2종 이상을 조합시켜서 사용할 수 있다. 본 발명의 방법에 있어서, (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 잔존시키는 능력을 갖는 미생물을 이용하는 경우는, (S)－3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 제조할 수 있다.

본 발명의 미생물은, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 광학 활성체를 잔존시키는 능력을 갖는 한, 야생주, 변이주, 유전자 조작주，또는　세포 융합주 등 어느 것이어도 좋다.

제1 공정

제1 공정에 있어서, 미생물 또는 그의 처리물을 사용한다. '미생물의 처리물'에는, 균체 파쇄물, 균체로부터 추출된 효소 등이 포함된다. 미생물 및 그 처리물은 통상적인 방법에 따라 고정화한 것이라도 좋다.

본 발명에 있어서, '작용시키는'이란, 미생물 또는 그의 처리물과 기질인 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물을, 하나의 반응계 내에 공존시킴으로써, 효소와 기질을 접촉시키는 것을 말한다. 여기서 말하는 효소는, 균체내외 또는 미생물 처리물 중에 존재하는, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올에 대해 입체 선택적인 분해능을 갖는 효소이다.

구체적으로는, 본 발명의 미생물을 이용하는 경우에는, 이 미생물을 배양하여 얻어지는 배양액에 3－클로로－2－－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물을 첨가하여 반응시키면 좋다.

미생물을 배양하기 위한 배지 조성으로는, 통상 이 미생물이 생육하는 배지라면, 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 탄소원으로 글루코오스, 갈락토오스, 슈크로오스와 같은 탄수화물; 1, 2－프로판디올, 3－클로로－1, 2－프로판디올, 글리세롤과 같은 알코올류; 초산(acetic acid), 구연산(citric acid), 사과산(malic acid), 말레인산(maleic acid), 푸마르산(fumaric acid), 글루콘산(gluconic acid)과 같은 유기산 또는 그 염; 또는 그들의 혼합물을 포함하고;

질소원으로 황산 암모늄, 질산 암모늄, 인산 암모늄과 같은 무기　질소 화합물; 요소, 펩톤, 카제인(casein), 효모 엑기스, 육(肉) 엑기스, 콘 스팁 리커(con steep liquor)와 같은 유기 질소 화합물; 또는 그들의 혼합물을 포함하고;

인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 망간염, 철염, 아연염, 구리염과 같은 무기염을 포함하고, 또한 필요에 따라서 비타민류를 포함하는 배양액을 사용할 수 있다. 또한, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 생성 능력을 높이는 인자, 예를 들면 3－클로로－2－메틸－1，2－프로판디올 등을 배양액에 첨가해도 된다.

본 발명에 따른 미생물의 배양은 통상적인 방법에 따르는 것이 바람직하고, 예를 들면 pH 6~9정도, 바람직하게는 6.5~7.5정도의 배양액 중에서 20~40℃ 정도, 바람직하게는 25~37℃ 정도의 온도하에서 호기적으로 10~96시간 정도 배양하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여, 통상, 휴지기(dormant phase)의 균체가 얻어진다.

미생물은 증식기에 있는 것, 및 휴지기(정상기)에 있는 것 중 어느 하나를 사용할 수 있다. 입체 선택적 분해 활성(stereoselective decomposition)이 높고, 또는 입체 특이성이 높은(highly stereospecific) 것이 바람직하다.

입체 선택적인 분해 반응은, 배양액으로부터 분리한 균체를 적당한 용액, 예를 들면 완충액에 현탁한 현탁액에 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물을 첨가함으로써 수행될 수 있다.

또한, 미생물을 고정화한 것, 미생물 처리물, 또는 미생물 처리물을 고정화한 것을 이용하는 경우도, 이것들을 완충액과 같은 용액 안에 현탁 또는 용해시킨 것에, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물을 첨가함으로써 입체 선택적인 분해 반응을 수행할 수 있다.

어느 경우나, 반응 온도는 15~50℃정도가 바람직하고, 25~35℃ 정도가 보다 바람직하다. 상기 온도 범위라면 충분히 반응이 진행하고, 아울러 충분한 효소 활성을 얻을 수 있다.

반응　pH는 4~6.5정도가 바람직하고, 5~6정도가 더 바람직하다. 이는 알칼리성 조건하에서는, 기질이 폐환(ring-closure)하여 글라이시돌(glycidol)이 생성되기 쉬워 중성 내지는 산성 조건이 바람직하기 때문이다. 또한, 상기 범위이면, 충분한 효소 활성을 얻을 수 있다.

또한, 통기(aeration)에 의해 반응계를 호기적 조건으로 함으로써, 한층 더 효율적으로 분해 반응이 진행한다. 반응계내의 용존 산소 농도는 높을 수록 바람직하다. 반응계에 압력을 가함으로써 용존 산소 농도를 높게 할 수도 있다. 용존 산소 농도의 상한은 특별히 한정되지 않으나, 통상, 상압하에서는 8ppm정도이다.

반응액 중의 기질 농도는 0.1~20%(v/v)정도가 바람직하고, 1~10%(v/v)정도가 더 바람직하다. 상기의 농도 범위라면, 효율적으로 광학 활성체를 얻을 수 있고, 아울러 충분한 효소 활성을 얻을 수 있다.

기질은 초기에 일괄해서 가해도 좋고, 분할해서 첨가될 수 있다. 미생물 또는 그 처리물의 사용량은, 1~120시간 내로 반응이 완료되는 양으로 할 수 있다.

반응은, 통상 교반 또는 진탕(振蕩)하면서 수행될 수 있다. 반응 시간은 기질 농도, 미생물 또는 그 처리물의 양 등에 의해 다르지만, 1~120시간 내로 종료시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는 가스크로마토그래피 등의 분석에 의해, 목적으로 하는 광학 활성체의 광학 순도를 측정하여 종점을 결정하는 것이 좋다.

반응의 진행에 따라서, 반응액의 pH가 서서히 저하 또는 상승하는 경우는, 적당한 알칼리 또는 산을 첨가함으로써 배양액 중의 pH를 최적 범위내로 조절할 수 있다. 예를 들면, 알칼리로서는 탄산 칼슘　현탁액，탄산　나트륨 용액, 탄산 칼륨, 탄산 암모늄과 같은 탄산 알칼리염 수용액; 수산화 나트륨 수용액, 수산화 칼륨 수용액, 수산화 칼슘 수용액과 같은 수산화 알칼리염 수용액; 암모니아 수용액 등의 통상의 산을 중화시키는데 사용되는 것을 사용할 수 있다. 또한 산으로는, 염산, 인산 등의 통상의 알칼리를 중화시키는 데에 사용되는 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 미생물 또는 그 처리물을 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용시킴으로써, 입체 선택 또는 입체 특이적으로 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체 또는 S체가 분해된다.

제2 공정

이와 같이 하여 얻어진 반응액 중에 잔존하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 일반적인 방법으로 회수할 수 있다. 예를 들면, 반응액에서 균체를 원심 분리액에서 제외한 후, 상청액(supernatant)을 증발기(evaporator)에 의해 농축하고, 초산 에틸(ethyl acetate), 에테르 등의 용매로 추출할 수 있다. 또한, 이 추출액을 무수 황산 마그네슘 등을 이용하여 건조시킨　후, 감압하에서 용매를 제거함으로써, 광학 활성체 3－클로로－메틸－1, 2－프로판디올의 시럽을 얻을 수 있다. 또한, 추출, 증류, 각종 크로마토그래피와 같은 통상적인 방법으로 정제할 수 있다.

이하, 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다. 실시예 중의 %는 특별히 기재가 없는 한 %(w/v)을 나타낸다.

<실시예 1> 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 합성

유기 합성용 3L의 플라스크에, 이온 교환수 1700g, 농축황산　2.7g을 첨가하고, 반응액의 온도를 65－70℃로 유지하고, 교반하면서 2－메틸－에피클로로하이드린 1014.5g(다이셀 화학사제)을 적하하고, 숙성도 포함해서 5시간 반응시켰다. 반응액 중의 2－메틸－에피클로로하이드린 및 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 정량은, 가스크로마토그래피(GL 사이언스사제의 칼럼 담체:PEG20M, 60－80 메시(0.31－0.42mm))에 의해 수행하였다. 탄산 수소 나트륨을 첨가하여 반응액의 pH를 6.0으로 조정한 후, 농축하고, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 시럽을 1200g 수득하였다.

<실시예 2> 슈도모나스　sp.DS－K－436－1주를 이용한 반응

펩톤 10g/L, 효모 엑기스 10g/L, 글리세린 10g/L로 이루어지는 조성의 배지 100ml(pH7.0)를, 500ml용의 배플(baffles)이 부착된 3각 플라스코에 넣고, 121℃에서 15분간, 가압 증기 멸균하였다. 이어서, 미리 동일한 영양 배지 플레이트에서 생육시킨 슈도모나스 sp. DS－K－436－1주를 하나의 백금 루프로 접종(接種)하여 30 ℃에서 24시간 호기적으로 배양하였다. 얻어진 배양액을 원심분리하고, 균체를 회수하였다.

균체를 100ml의 20mM 인산 칼륨 완충액(pH7.0)에 현탁하였다. 현탁액에 실시예1에서　합성한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올과 CaCO₃을 각각 최종 농도가 1.0%(v/v)와 1.5%가 되도록 첨가하고, 30 ℃, 120rpm으로 24시간 반응시켰다. 반응액 중에 잔존하는 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 가스크로마토그래피(GL 사이언스사제의 칼럼 담체: PEG20M, 60－80메시(0.31－0.42mm))로 분석하였다.

반응 종료 후, 반응액을 꺼내어 원심분리에 의해 균체를 제거하고, 상청액을 얻었다. 이 상청액을 증발기로 농축하고, 에테르에 의해 추출하였다. 이어서 무수황산 마그네슘에 의해 건조시킨 후, 감압하에서 에테르를 제거하고, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 시럽을 얻었다.

본 물질의 광학 순도의 측정은, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 광학 이성체를 수산화 나트륨 수용액을 이용해서 알칼리 처리함으로써, 대응하는 2－메틸글라이시돌(2-methylglycidol)의 광학 이성체로 변환한 후, 아스텍사제의 캐필러리 칼럼(capillary column)　A－PH[0.25mm(ID)×30m(Length)]를 사용한 가스크로마토그래피에 의해 광학 이성체의 분석을 수행하였다. 광학 이성체의 분석 조건은 이하와 같다.

칼럼 온도: 45℃

검출기 온도: 150℃

캐리어 가스: 헬륨

초기 유량: 1.6ml/min

선속도: 35cm/sec

검출기: FID

스플릿비(split ratio): 130/1

2－메틸글라이시돌의 보유시간(retention time)은, R체가 35분, S체가 31분이었다. 리텐션타임 및 R체, 및 S체의 동정(identyfy)은, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 선광도(rotational angle)를 측정하는 것에 의해 수행하였다(일본국 특허 제2567430호, 본 발명의 실시예 9).

수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율은 17.6%이었다. 또한, 얻어진 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도99%　e.e.이상의 R체 3－클로로－2－메틸－１,2－프로판디올이었다.

<실시예 3> 슈도모나스　sp. OS－K－29주를 이용한 반응

균주를 슈도모나스 sp. OS－K－29주로 변경한 이외는, 실시예 1과 동일한 조작을 수행했다. 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율은 22.1%이었다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸1, 2－프로판디올은 광학 순도99%　e.e이상의 R체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 4> 슈도모나스　sp－DS－SI－5주를 이용한 반응

균주를 슈도모나스　sp.DS－SI－5주로 변경하고, 실시예 1에서 합성한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 사용량을 2.5%(v/v)로 변경하고, CaCO₃의 사용량을 3.6%로 변경하고, 반응 시간을 48시간으로 변경한 이외는 실시예2와 동일한 조작을 수행했다.

수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율은 40.9%이었다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99%　e.e.이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 5> 슈도모나스　니트로레듀센스　ＤＳ－Ｓ－ＲＰ　８주를　이용한　반응

균주를 슈도모나스　니트로레듀센스　ＤＳ－Ｓ－ＲＰ　８주로　변경하고，　반응　시간을　４８시간으로　변경한　것　이외는　실시예２와　동일한　조작을　수행하였다．

수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율은 36.0%이었다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99%　e.e이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 6> 알칼리게네스( Alcaligenes )sp.DS－S－7G주를 이용한 반응

균주를 알칼리게네스(Alcaligenes)sp.DS－S－7G주로 변경하고, 균체 조제용의 배지를 펩톤　10g/L, 효모 엑기스　10g/L, 글루콘산 나트륨　10g/L로 이루어지는 조성의 배지(pH7.0)로 변경하고, 실시예2에서 합성한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 사용량을 3.0%(v/v)로하고, CaC0₃의 사용량을 4.2%로 변경한 이외는 실시예1과 동일한 조작을 수행하였다.

수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율은 22.4%이었다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99% e.e.이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 7> 슈도모나스　니트로레듀센스　ＤＳ－Ｓ－ＲＰ　８주를　이용한　반응

글루콘산 나트륨 2.0%

글리세린 1.0%

황산 암모늄 1.0%

인산 제2 나트륨 0.02%

인산 제2 칼륨 0.02%

인산 제1 나트륨 0.04%

황산 마그네슘 0.05%

황산철 0.001%

황산구리 0.0001%

질산 망간 0.0001%

탄산 칼슘 1.0%

로 이루어지는 조성의 배지 100ml(pH7.0)를, 500ml의 배플이 부착된 3각 플라스크에 넣고, 121℃로 15분간, 가압 증기 멸균하였다. 이어서, 실시예 2와 동일한 방법으로 수득한 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) DS－S－RP　8주의 배양액 1ml(1%(v/v)량)를 상기 합성 배지에 무균적으로 접종하고, 30℃에서 24시간 호기적으로 배양을 했다. 수득된 배양액에 실시예1에서 합성한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올과 CaCO₃을 각각 최종 농도가 2.0%(v/v)와 3.0%가 되도록 첨가하고, 30℃, 120rm에서 72시간 반응시켰다.

실시예 2와 동일한 방법으로 반응액 중의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존율과 광학 순도를 구한 결과, 잔존율은 47%였다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99%e.e.이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 8> 슈도모나스 sp.DS－SI－5주를 이용한 반응

펩톤 10g/L, 효모 엑기스 10g/L, 글리세린 10g/L로 이루어지는 조성의 배지 3.5L(pH7.0)을, 넣은 5L 크기의 배양기를 121℃, 15분간 가압 증기 멸균하였다. 이어서, 실시예2와 동일한 방법으로 수득된 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－SI－5주의 배양액 3.5ml(0.1%(v/v)량)을 상기 배지에 무균적으로 접종하고, 30 ℃로 450rpm, 통기량 0.1vvm에서 24시간 배양하였다. 여기서, 실시예1에서 합성한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올 87.5g(2.5%)를 가하고 30℃로 450rpm, 0.1vvm에서 72시간 반응시켰다. 반응중 반응의 진행에 의해 pH가 서서히 저하하기 때문에, 25%(v/v) NaOH를 적하하고 pH를 6.0으로 유지하였다. 반응 종료 후, 실시예2와 동일한 방법으로 반응액 중의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존량, 광학 순도를 측정하였다. 반응 종료후의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 농도는 1.1%(잔존율 44.0%)이었다. 또한, 수득된 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99%e.e.이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 9> 용존 산소 농도의 영향

펩톤 10g/L, 효모 엑기스 10g/L, 글리세린 10g/L로 이루어지는 조성의 배지 1000L(pH7.0)를 넣은 1300L 크기 배양기를 128℃, 20분간 가압 증기 멸균하였다. 이어서, 실시예2와 동일한 방법으로 수득된 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－SI－5주의 배양액 500ml(0.05%(v/v)량)을 상기 배지에 무균적으로 접종하고, 30 ℃, 120rpm, 통기량 0.2vvm에서 24시간 배양하였다. 여기에, 실시예1과 동일하게 합성한 라세스체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올 25kg(2.5%)를 가하고 30℃로 120rpm, 통기량 0.4vvm에서 72시간 반응시켰다. 반응중, 반응의 진행에 따라 pH가 저하하기 때문에, 25% (w/w) NaOH 를 적하함으로써 pH를 6.0으로 유지하였다.

실시예 2와 동일한 방법으로 반응액 중의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 잔존량, 광학 순도를 측정하였다. 반응 종료 후의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 농도는 1.1%(잔존율 44.0%)이었다. 또한 얻어진 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올은 광학 순도 99% e.e([α]²⁰ _D=+5.92˚, c=3%, CHCl₃) 이상의 S체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이었다.

<실시예 10> 용존 산소의 영향

반응에 이용한 라세미체 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 양이 13.7kg(1.37%)인 점, 반응 중의 통기량을 반응 0~6시간은 0.1vvm, 6~48시간은 0.2vvm, 48~72시간은 0.4vvm에서 행한 이외는, 실시예 9와 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 통기량이 적고(0.1－0.2vvm), 용존 산소 농도가 낮을 때의 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 광학 순도의 상승은 작았다(반응0~36시간). 통기량을 높이면(0.4vvm) 용존 산소 용도가 상승하고, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 광학 순도의 상승도 커졌다(반응 36~72시간).

실시예9, 및 10에 대해서, 반응중의 용존 산소 농도 및 광학 순도의 추이를 이하의 표1에 나타낸다. 용존 산소 농도를 높이면, 광학 순도가 현저히 향상하는 것을 알 수 있다.

반응 시간	실시예 9			실시예 10
반응 시간	통기량(vvm)	용존 산소 농도(ppm)	광학 순도(%ee)	통기량(vvm)	용존 산소 농도(ppm)	광학 순도(%ee)
0	0.4	0		0.1	0
3	0.4	0.6		0.1	0
6	0.4	2.7		0.2	0
12	0.4	3.9		0.2	0	0
18	0.4	4.5		0.2	0
24	0.4	5.0	77.9	0.2	0	7.6
30	0.4	5.3		0.2	0
36	0.4	5.5	90.1	0.2	0	20.3
42	0.4	5.5		0.2	0.4
48	0.4	5.4	94.5	0.4	1.5
54	0.4	5.3		0.4	4.4
60	0.4	5.2		0.4	4.8
66	0.4	5.3	99.0	0.4	5.0	85.3
72	0.4	5.2		0.4	5.0	93.5

이상과 같이, 본 발명의 미생물을 이용한 반응에 의해, 99%e.e.이상이라는 높은 광학 순도의 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 간단하게 대량 생산할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims

3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체 또는 S체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 미생물 또는 그의 처리물을, 3－클로로－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용시키는 제1의 공정;및

잔존하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올을 분취하는 제2의 공정;

을 포함하는 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 제조 방법.
제1항에 있어서,

미생물이, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 R체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖는 적어도 1종의 슈도모나스(pseudomonas)속에 속하는 미생물이며, 광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이 그의 R체인 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제2항에 있어서,

슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물이, 슈도모나스(Pseudomonas)sp. DS－K－436－1주(국제 기탁 번호:FERM BP－7079)및 슈도모나스(Pseudomonas)sp. OS－K－29주(국제 기탁 번호: FERM BP－994)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물인 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제1항에 있어서,

미생물이, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물에 작용하여, 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 S체를 잔존시킬 수 있는 능력을 갖고, 슈도모나스(Pseudomonas)속에 속하는 미생물 및 알칼리게네스(Alcaligenes)속에 속하는 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물이며,

광학 활성 3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올이 그의 S체인 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제4항에 이어서,

미생물이, 슈도모나스(Pseudomonas)sp.DS－SI－5주(국제 기탁 번호:FERM BP－7080), 슈도모나스 니트로레듀센스 (Pseudomonas nitroreducens) DS－S－RP8주(국제 기탁 번호: FERM BP－7793), 및 알칼리게네스 (Alcaligenes)sp. DS－S－7G주(국제 기탁 번호: FERM BP－3098)로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 미생물인 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제1항에 있어서,

제1 공정을 호기적 조건하에서 수행하는 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제1항에 있어서,

제1 공정에 있어서, 반응계의 pH는 4~6.5인 것을 특징으로 하는

제조 방법.
제1항에 있어서,

3－클로로－2－메틸－1, 2－프로판디올의 에난티오머 혼합물은 2－메틸－에피클로로하이드린의 에난티오머 혼합물을 황산하의 산성 조건에서 개환 가수분해시켜 수득되는 것을 사용하는

제조 방법.