KR100845164B1 - 미생물에 의한 (ｒ)-1,2-프로판디올의 제조 방법 - Google Patents

미생물에 의한 (ｒ)-1,2-프로판디올의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 배양 배지에서 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화시키는 능력을 갖는 슈도모나스(Pseudomonas)속 또는 알칼리게네스(Alcaligenes)속에 속하는 미생물을 배양시킨 후, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리시키는 것을 포함하는 (R)-1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

미생물에 의한 (Ｒ)-1,2-프로판디올의 제조 방법{PROCESS FOR PREPARATION OF (R)-1,2-PROPANEDIOL BY MICROBES}
본 발명은, 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화시키는 능력을 갖는 미생물을 사용하는, 라세미 1,2-프로판디올로부터의 (R)-1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의해 제조되는 (R)-1,2-프로판디올은, 의약품, 농약 및 생리 활성 화합물 등의 광학 활성 화합물 제조의 중간체로서 매우 중요하고 유용하다.
광학 활성 1,2-프로판디올의 제조를 위한 화학적 방법에 관해서는, Kitamura et al. 의 BINAP 촉매를 사용하는 히드록시 아세톤의 환원에 의한 방법(Tetrahedron Lett., 32, 4163-4166 (1991)), 및 Jacobsen et al. 의 Co-Salen 촉매를 사용하는 비대칭 가수분해에 의한 방법(Science, 277, 936-938 (1997))이 공지되어 있다. 하지만 상기 방법으로는 광학적으로 고 순도를 갖는 1,2-프로판디올을 제조하기 위해서는 비싼 화학 촉매를 필요로 하므로, 상기 방법들을 경제적이라 말하기는 어렵다.
생물학적 방법에 대하여, 글리세롤 데히드로게나제를 사용하는, 1-히드록시- 2-프로파논 및 1-히드록시-2-부타논의 비대칭 환원으로 (R)-1,2-프로판디올을 제조하는 방법이 공지되어 있다(Journal of Organic Chemistry, 51, 25-36(1986)).
또한, Nikaido et al. 의, 슈도모나스(Pseudomonas)속 균주에 속하는 미생물의 휴지균체를 사용하는 입체선택적 산화 분해법에 의한 광학 활성 1,2-프로판디올의 제조 방법이 공지되어 있다(일본 특허 공개 A 6-30790). 상기 방법에 따라, 그의 실시예에 언급된 바와 같이, 1,2-프로판디올의 입체선택적 분해능을 갖는 다량의 미생물을 별도로 배양하고, 수득한 균체를 휴지 균체로 변화시킨 후, 상기 균체를 광학 분리시키는 것이 좋다.
또한, 본 발명자들은, 산화적 탈할로겐화 효소, 즉 알칼리게네스(Alcaligenes) sp. DS-S-7G 로부터 유래한 할로히드린 데히드로-데할로게나제를 사용하는 광학 활성 1,2-디올 및 할로게노히드린의 제조 방법을 보고하였다(Tetrahedron: Asymmetry, 5, 239-246 (1994), 일본 특허 공개 A 7-147993).
하지만, 상기 생물적 방법에서, NAD 또는 NADP 등의 보효소를 필요로 하고, 그의 재생 반응(재이용) 이 그의 반응 속도 제한 요인이 된다. 상기 방법은 광학 활성 1,2-프로판디올의 경제적인 제조 방법이라 말할 수 없으므로, 더욱 효과적이고 실제적인 방법을 개발하는 것이 요망된다.
본 발명의 목적은, 상기의 공지 방법과 비교하여, 라세미 1,2-프로판디올로부터 (R)-1,2-프로판디올을 더욱 경제적이고, 기술적으로 더욱 간편하게 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 우선적으로 (S)-1,2-프로판디올을 동화하는 능력을 갖고, 또한, 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화함으로써 생육 가능한 미생물을 연구하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 목적하는 미생물의 단리에 성공하였고, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 배양 배지 또는 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 완전 합성 배지에서, 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화시키는 능력을 갖는 슈도모나스속 또는 알칼리게네스속에 속하는 미생물을 배양시키고, (S)-1,2-프로판디올을 동화시킨 후, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리시키는 것을 특징으로 하는 (R)-1,2-프로판디올의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 미생물 (본 미생물로서 약술됨) (예: 슈도모나스 sp. DS-SI-5, 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) DS-S-RP8 및 알칼리게네스 sp. DS-S-7G) 은 또한 (R)-3-할로게노-1,2-프로판디올을 동화시키는 능력을 갖고, 그의 동화의 경우, 동화되는 (R)-3-할로게노-1,2-프로판디올과 동량의 수소 할라이드가 방출된다 (일본 특허 공개 B 4-73999, 일본 특허 공개 A 2001-149090). 따라서, 본 미생물은 할로게노히드린 화합물에 대해 입체선택적 탈할로겐화능을 나타내는 균주이다.
또한, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 는 4-클로로-1,3-부탄디올의 동화능을 갖지 않으나, 이 균주는 (S)-4-클로로-1,3-부탄디올에 대해 입체선택적 탈할로겐화 활성을 나타내어 (S)-히드록시-γ-부티로락톤을 생성한다 (일본 특허 공개 A 2001- 120296).
또한, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 는 1,3-프로판디올, 3-아미노-1,2-프로판디올, 1,2-부탄디올, 1,2-펜탄디올 및 1,2-헥산디올의 동화능을 갖지 않는다.
추가로, 본 발명자들은 본 미생물이 (S)-1,2-프로판디올의 입체선택적 동화능을 갖고, 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 완전 합성 배지에서 생육 가능하고, 미(未)동화 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰 중에 잔존하도록 한다는 것이 알려졌다.
본 발명은, 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화시키는 능력을 갖는 슈도모나스속 또는 알칼리게네스속에 속하는 미생물을 사용하여 (S)-1,2-프로판디올을 우선적으로 동화시키고, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리시킴으로써, 라세미 1,2-프로판디올로부터 (R)-1,2-프로판디올을 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 우선 라세미 1,2-프로판디올 또는 3-클로로-1,2-프로판디올을 단일 탄소원으로서, 각종 암모늄염 또는 질산염등의 무기 질소 화합물을 질소원으로서, 및 기타 소량의 금속염 또는 포스페이트를 함유하는 완전 합성 배지에서, 또는 육즙 배지 또는 펩톤 배지등의 유기 탄소 물질과 질소 물질, 및 유기 영양원을 함유하는 통상의 영양 배지에서 본 발명의 미생물을 배양하여 종균체를 제조한다.
이어서, 수득된 미량의 배양 브로쓰 또는 미생물을, 단일원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 매질 (본 발명에서 사용되는 배지로 약술됨) 에 접종시 키고, 배지를 배양하여 배양 브로쓰로부터 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 단리시킨다.
즉, 본 미생물을 사용하여 라세미 1,2-프로판디올로부터 (S)-1,2-프로판디올을 우선적으로 동화시킴으로써, 미동화된 (R)-1,2-프로디올이 배양 브로쓰에 잔존하고 단리된다.
배양은 바람직하게 최적 pH 및 최적 온도, 예를 들어, pH 4-10, 바람직하게는 5-9, 15-50℃, 바람직하게는 20-37℃ 의 온도에서 수행된다. 동화가 진행됨으로써 pH 값이 서서히 감소되는 경우, 알칼리 물질을 첨가함으로써 용액의 pH 를 최적 pH 로 조정하는 것이 필요하다. 상기 용액을 산-중화제 (예, 탄산칼슘 용액, 탄산나트륨 용액, 탄산칼륨 용액, 또는 탄산 암모늄 용액 등의 알칼리 카르보네이트 수용액, 수산화나트륨 용액, 수산화칼륨 용액 또는 수산화칼슘 용액 등의 수산화알칼리 수용액, 또는 암모니아 수용액) 로서 통상 사용되는 물질을 사용하여 최적 pH 범위로 제어하는 것이 바람직하다.
매질 중 기질, 즉, 탄소원으로서의 라세미 1,2-프로판디올의 농도는 바람직하게 1-15% (v/v) 이고, 기질은 초기 단계에 1 회 또는 수회에 걸쳐 첨가될 수 있다.
통상 배양은 교반 또는 진동하, 또는 통기 교반 배양하에서 수행될 수 있고, 배양 시간은 기질-농도 및 다른 배양 조건에 의존하지만, 바람직하게는 24-120 시간 내에 완결된다.
가스 크로마토그래피 등에 의해 기질, 즉 라세미 1,2-프로판디올의 잔량이 기질의 초기 농도의 50%가 되는 경우, 배양이 바람직하게 퀀칭 (quenching) 되거 나, 종말점은 바람직하게 배지 내의 광학 활성 화합물의 광학 순도의 측정으로 결정된다. 즉, 정확하게 기질내에 (S)-1,2-프로판디올, 즉, 라세미 1,2-프로판디올이 완전히 동화되는 경우, 배양이 퀀칭되는 것이 바람직하다.
배양 브로쓰에 잔존하는 수득된 (R)-1,2-프로판디올을 회수하고, 통상의 방법으로 정제한다. 예를 들어, 원심분리에 의해 배지로부터 세포를 제거한 후, 상청액을 증발기로 농축시키고, 에틸아세테이트 등의 용매로 추출한다. 상기 추출물을 무수 마그네슘 술페이트로 건조시킨 후, 용매를 진공에서 증발시켜 (R)-1,2-프로판디올을 시럽으로 수득하였다. 시럽을 증류로써 더 정제할 수 있다.
본 발명의 실험의 경우, 본 미생물을 그의 사전 배양없이, 본 발명에 사용되는 배지에 직접적으로 접종시킬 수 있고, 배지를 상기와 유사한 방법으로 배양하여 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 회수하거나 단리할 수 있다.
본 광학적 분리 방법에 따라, 사용되는 배지는, 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 완전한 합성 배지이기 때문에 거의 오염되지 않고, (S)-1,2-프로판디올은 본 미생물에 의해 동화되고, (S)-1,2-프로판디올은 본 미생물에의해 동화되기 때문에, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리(회수) 하는 것은 지극히 용이하다.
이전의 종균 배양에 사용되는 배지는 본 미생물을 상기 배지에서 사육할 수 있는 한 제한되지 않는다.
예를 들어, 글루코스 또는 프룩토스 등의 탄수화물, 라세미 3-클로로-1,2-프로판디올, (R)-3-클로로-1,2-프로판디올, 라세미 3-브로모-1,2-프로판디올, (R)- 3-브로모-1,2-프로판디올 또는 라세미 1,2-프로판디올 등의 알콜, 아세트산, 시트르산, 말산, 말레산, 푸마르산 또는 글루콘산 등의 유기산, 또는 그의 염, 또는 그의 혼합물이 탄소원으로서 예시된다.
예를 들어, 황산 암모늄, 질산 암모늄 또는 인산 암모늄과 같은 무기 질소 화합물, 우레아와 같은 유기 질소 화합물, 펩톤, 카세인, 효모 추출물, 고기(meat) 추출물, 옥수수 침지액 또는 그의 혼합물들이 질소원으로서 예시된다.
추가로, 인산염, 마그네슘염, 칼륨염, 망간염, 철염, 아연염, 구리염 등의 무기 염, 또는 적합하다면 비타민이 사용 가능하다.
고 효소 활성을 갖는 미생물을 제조하기 위한 효소-유도 첨가제로서, 상기 배지, 펩톤 배지 등의 영양배지, 또는 육즙 배지에, 라세미 3-클로로-1,2-프로판디올 또는 라세미 3-브로모-1,2-프로판디올 등의 라세미 3-할로게노-1,2-프로판디올, 또는 라세미 1,2-프로판디올을 첨가할 수 있다.
종균 배양의 제조를 위한 배양은 통상의 방법에서와 같이, 예를 들어, pH 4-10, 바람직하게는 5-9, 15-50 ℃, 바람직하게는 20-37 ℃ 의 온도에서, 통기하면서 20-96 시간동안 수행될 수 있다.
상기된 바와 같이, 본 미생물은, (S)-1,2-프로판디올의 동화능을 갖고, 단일 탄소원으로서 (S)-1,2-프로판디올을 동화시킴으로써 생육 가능한 슈도모나스속 및 알칼리게네스속에 속하며, 바람직한 것은 슈도모나스 sp. DS-SI-5, 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP-8 및 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 이다.
상기 균주는 그들의 생리적 및 세균학적 성질로부터, 슈도모나스속 및 알칼 리게네스속의 종 또는 균주에 속하는 균주로서 확인되며, 하기 수탁 번호로, 부다페스트 조약에 의해, International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 에 수탁되었다.
슈도모나스 sp. DS-SI-5 의 수탁번호: FERM BP-7080, 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 의 수탁번호: FERM BP-7793, 및 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 의 수탁번호: FERM BP-3098.
슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP-8 (FERM BP-7793) 은 공보에 기술되지 않은 새로운 균주이고, 그의 생리적 및 세균학적 성질을 하기 나타낸다.
각종 배지에서의 생육
1. 육즙 한천 평판 배지 (30℃, 3일간 배양)
콜로니의 생육 속도 보통
콜로니의 형상 원형
콜로니 표면의 형상 평활
콜로니의 융기상태 凸 모양
콜로니의 원주 완전
콜로니의 내용 균질
콜로니의 색조 담황색
콜로니의 투명도 반투명
콜로니의 광택 있음
가용성 색소의 형성 없음
2. 육즙 한천 사면 배지(30℃, 3일간배양)
생육 정도 양호
생육 조건 점질(stringy)
콜로니의 표면 형상 凸 모양
콜로니의 단면 형상 편평
콜로니의 광택 있음
콜로니의 색조 담황색
콜로니의 투명도 반투명
3. 육즙 액체 배지(30℃, 3일간배양)
생육 정도 양호
가스 발생 없음
배지의 착색 없음
성상 침강
4. 육즙 한천 천자 (stuck) 배지(30℃, 3일간배양)
생육의 장소 표면
표면의 생육 상태 양호
5. 육즙 젤라틴 천자 배지: 액화되지 않음
6. 생리학적 성질
질산염의 환원 +
V-P 시험 -
MR 시험 -
인돌의 생성 -
PPA -
H2S 의 생성 +
리신의 탈탄산 +
시트르산의 이용 +
무기 질소의 이용 암모늄 술페이트 +
녹말의 가수분해 -
카탈라제 +
우레아제 -
옥시다제 +
탈질반응 +
아르기닌 데히드라제 +
β-갈락토시다제 -
에수클린(esuclin) 의 가수분해 -
형광 색소의 생성 킹 A (King's A) 킹 B (King's B) - +
리트머스 밀크 응고 환원 - -
PHB 의 축적 +
O-F 시험
D-글루코스 0
D-갈락토스 0
D-프룩토스 0
글리세롤 0
D-만니톨 -
D-글루코네이트 -
탄소원의 이용
D-글루코스 +
D-갈락토스 -
D-프룩토스 +
D-만노스 -
D-말토스 -
글리세롤 -
D-만니톨 -
D-글루코네이트 +
7. 형태학적 성질
세포 형태 간상
세포 크기(㎛) 1.3 - 1.6
세포 너비(㎛) 0.4 - 0.6
세포의 다형태성 없음
플라겔라 극성, 단일형
운동성 +
그람 염색성 -
포자 -
항산성 -
캡슐 없음
본 발명은 하기 실시예에 의해 상술될 것이나, 하기 실시예에 의해 한정되지 않는다. 실시예 중 백분율(%)은 다르게 정의되지 않는한, %(w/v)를 의미한다.
실시예 1
하기로 구성되는 배지(100 ml, pH 6.9)
황산암모늄 1.0%
디소듐 히드로겐포스페이트·12H2O 0.02%
디포타슘 히드로겐포스페이트 0.02%
소듐 디히드로겐포스페이트·2H2O 0.04%
황산마그네슘 0.05%
황산철·7H2O 0.001%
황산구리·5H2O 0.0001%
질산망간·7H2O 0.0001% 및
탄산칼슘 2.0%
를 배플이 있는 엘렌마이어 플라스크(500 ml) 에 붓고, 배지를 가압 하에 121℃에서 15 분 동안 살균했다. 라세미 1,2-프로판디올(1 ml)을 그곳에 첨가하여, 라세미 1,2-프로판디올을 단일 탄소원으로서 함유하는 완전 합성 배지를 제조했다.
이어서, 폴리펩톤(1.0%), 효모 추출물(1.0%) 및 D-글루코스(1.0%)를 함유하는 한천사면배지 상에서 미리 배양된 슈도모나스 sp. DS-SI-5의 세포의 루프풀(loopful)을 상기 완전 합성 배지에 제한적으로 심었다. 배지를 2 일 동안 30℃에서 교반하며(130 rpm) 배양했다.
배지 중에 생육된 균주의 탁도는 8.1 OD(660 nm)였다. 그 때 1,2-프로판디올의 잔존율은 기체 크로마토그래피(칼럼 담체: PEG20M, 60 - 80 메쉬)로 측정하여 45%였다.
배양 후, 배양 브로쓰 중의 세포를 꺼내어 원심분리로 제거하여 상청액을 수득했다. 증발기를 사용하여 상청액을 2 ml로 농축하여 에틸 아세테이트로 추출했다.
추출물을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 용매를 진공에서 증류해 1,2-프로판디올을 시럽으로 수득했다(0.36 g).
트리플루오로아세트산 무수물로 트리플루오로아세틸화한 후, 모세관이 있는 기체 크로마토그래피에 적용시킴으로써 1,2-프로판디올의 광학적 순도 측정을 수행했다: CHIRALDEX G-TA, 미국 아스텍사 (astec) (내부 지름 0.25 mm ×길이 30m)(Suzuki et al., Tetrahedron: Asymmetry, Vol. 5, 239 - 246 (1994)).
그 결과, 회수된 1,2-프로판디올은 광학적 순도가 99% ee 이상이었으며, (R)-형이었다.
상기 기체 크로마토그래피 분리의 조건은 하기와 같다:
분리 온도: 칼럼 온도(60℃), 주입 온도: 200℃, 캐리어 기체: 질소(유속 0.5 ml/분), 스플릿 비율: 200/1, 검출: FID 200℃.
1,2-프로판디올 유도체의 체류 시간: (R)-형, 11.4 분; (S)-형, 17.6 분
실시예 2 및 3
상기 실시예 1 과 같은 방식으로, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 대신에, 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 또는 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 를 사용함으로써, 하기 결과를 수득했다.
균주 잔존율 광학적 순도
실시예 2 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 43% >99%ee
실시예 3 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 30% >98ee
실시예 4
완전 합성 배지에 첨가된 라세미 1,2-프로판디올 8 ml 을 사용한 것을 제외하고, 상기 실시예 1 과 동일한 방식으로 완전 합성 배지 중에서 광학적 분리를 수행했다.
5 일 동안 배양 후 배지 중 생육된 균주의 탁도는 5.9 OD(660 nm)였다. 그 때 1,2-프로판디올의 잔존율은 기체 크로마토그래피로 측정한 결과 26%였다(칼럼 담체: PEG20M, 60 - 80 메쉬).
배양 후, 배양 브로쓰를 꺼내어 세포를 원심분리로 제거하여 상청액을 수득했다. 증발기로 상청액을 2 ml로 농축하고, 에틸 아세테이트로 추출했다. 추출물을 무수 황산 마그네슘 상에서 건조하고, 용매를 진공에서 증류하여 1,2-프로판디올(1.8 g) 을 시럽으로서 수득했다.
실시예 1 과 동일한 방법으로 상기와 같이 수득된 1,2-프로판디올의 측정을 수행했다. 그 결과 1,2-프로판디올은 광학적 순도가 99%ee 이상이었으며, (R)-형이었다.
실시예 5
상기 실시예 4 와 동일한 방식으로, 슈도모나스 sp.DS-SI-5 대신 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 을 사용함으로써 하기 결과를 수득했다. 잔존율: 35%, 광학적 순도: >99%ee
실시예 6
폴리펩톤(1.0%), 효모 추출물(1.0%) 및 D-글루코스(1.0%)로 구성된 영양배지(100ml, pH 7.2)를 배플이 있는 엘렌마이어 플라스크(500 ml) 에 붓고, 배지를 가압 하에 121℃에서 15 분 동안 살균하여, 수성 영양 배지를 제조했다.
이어서, 상기 배지를 함유하는 영양 한천 배지에서 미리 배양된 슈도모나스 sp. DS-SI-5의 세포의 루프풀(loopful)을 상기 수성 영양 배지에 심었다. 배지를 24 시간 동안 30℃에서 교반하며(130 rpm) 배양했다.
배지에서 생육된 균주의 탁도는 10.2 OD(660 nm)였다. 세포를 원심분리로 수집하고, 포스페이트 완충액(50 mM, pH 7.2) 으로 2 번 세척하여 세척된 세포를 준비했다. 이어서, 실시예 1 에서 나타낸 라세미 1,2-프로판디올을 단일 탄소원으로서 함유하는 배지(100 ml) 중 세포를 현탁하여, 배지를 2 일 동안 교반하며(130 rpm) 30℃에서 배양했다.
용액 중 잔존하는 1,2-프로판디올의 비율은 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 측정했고, 그 비율은 42%였다. 배양 후, 세포를 원심분리로 제거하여 상청액을 수득했다. 상청액으로부터 1,2-프로판디올의 회수는 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 수행하여, 0.35 g 의 1,2-프로판디올을 수득했다.
상기와 같이 수득된 1,2-프로판디올의 각각의 광학 이성질체의 측정은 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 수행했다. 그 결과, 1,2-프로판디올은 광학적 순도가 99%ee 이상이었으며, (R)-형이었다.
실시예 7 및 8
상기 실시예 6 과 동일한 방식으로, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 대신에, 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 또는 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 를 사용함으로써, 하기 결과를 수득했다.
균주 잔존율 광학적 순도
실시예 7 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 41% >99%ee
실시예 8 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 28% >98%ee
실시예 9
종모배양기(Jar fermenter, Mitsuwa Rikagaku Co., Ltd.제조(5 L), 모델 KMJ5B)에 하기로 구성되는 배지(2.5 L, pH 6.9)를 붓고;
황산암모늄 1.0%
디소듐 히드로겐포스페이트·12H2O 0.02%
디포타슘 히드로겐포스페이트 0.02%
소듐 디히드로겐포스페이트·2H2O 0.04%
황산마그네슘 0.05%
황산철·7H2O 0.001%
황산구리·5H2O 0.0001%
질산망간·7H2O 0.0001%
배지를 가압 하에 15 분 동안 121℃에서 살균했다. 배지에 라세미 1,2-프로판디올(25 ml) 을 첨가하여, 라세미 1,2-프로판디올을 단일 탄소원으로서 함유하는 완전 합성 배지를 제조했다.
이어서, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 를 폴리펩톤(1.0%), 효모 추출물(1.0%) 및 D-글루코오스(1.0%)를 함유하는 영양 배지(pH 7.2) 중 교반하여, 30℃ 에서 24 시간 동안 미리 배양해, 이 배양 브로쓰(50 ml, 2%(v/v))를 라세미 1,2-프로판디올을 단독 탄소원으로서 함유하는 상기 완전 합성 배지에 접종했다. 배지를 하기 조건 하에 3 일 동안 교반하며 호기성 조건으로 배양했다.
온도: 30℃, 통기: 0.5 L/분, 교반: 500 rpm.
pH 의 측정 및 제어는 연결된 pH 제어기로 수행했고, 3N 수산화나트륨 수용 액으로 브로쓰 중 pH 를 6.9 로 맞추었다. 생성물의 정량 분석 및 확인은 실시예 1 에서와 동일한 방식으로 수행했다.
배양 완결 후, 배지 중 생육된 균주의 탁도는 7.1 OD(660 nm에서)였으며, 그 때 잔존하는 1,2-프로판디올의 비율은 40%였다. 원심분리로, 배양된 세포를 배양 브로쓰로부터 제거하여 상청액을 수득했다. 상청액으로부터의 1,2-프로판디올의 회수는 실시예 1 과 동일한 방법으로 수행해 9.1 g의 1,2-프로판디올을 수득했다.
상기와 같이 수득된 1,2-프로판디올의 측정은 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 수행되었다. 그 결과, 1,2-프로판디올은 광학적 순도가 99%ee 이상이었으며 (R)-형이었다.
실시예 10 및 11
상기 실시예 9 와 동일한 방법으로, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 대신에 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 또는 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 를 사용함으로써, 하기 결과를 수득했다.
균주 잔존율 광학적 순도
실시예 10 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 38% >99%ee
실시예 11 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 31% >98ee
실시예 12
완전 합성 배지에 첨가된 라세미 1,2-프로판디올 250 ml을 사용한 것을 제외하고, 광학적 분리는 실시예 9 와 동일한 방식으로 완전 합성 배지 중에서 수행되었다.
5 일 동안 배양 후, 배지 중 생육된 균주의 탁도는 20.1 OD(660 nm)였으며, 그 때 잔존하는 1,2-프로판디올의 비율은 35%였다. 이어서, 배양 브로쓰로부터 1,2-프로판디올의 회수는 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 수행되어 70.1 g의 1,2-프로판디올을 수득했다.
상기와 같이 수득된 1,2-프로판디올의 측정은 실시예 1 에서와 동일한 방법으로 수행되었다. 그 결과, 1,2-프로판디올의 광학적 순도는 99%ee 이상이었으며, (R)-형이었다.
실시예 13
상기 실시예 12 와 동일한 방법으로, 슈도모나스 sp. DS-SI-5 대신에 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 를 사용함으로써, 하기 결과를 수득했다. 잔존율: 36%, 광학적 순도:>99%ee
본 발명에 따라, 슈도모나스 속 또는 알칼리게네스 속에 속하는 미생물, 예컨대 슈도모나스 sp. DS-SI-5, 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 또는 알칼리게네스 sp. DS-S-7G 를 사용하여 라세미 1,2-프로판디올 중 (S)-1,2-프로판디올을 우선적으로 동화함으로써, 공업적으로 및 경제적으로 (R)-1,2-프로판디올을 수득할 수 있다.



Claims (5)

  1. 삭제
  2. 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 배양 배지에서 슈도모나스(Pseudomonas) sp. DS-SI-5 (수탁 번호: FERM BP-7080) 를 배양시키고, 입체선택적으로 (S)-1,2-프로판디올을 동화시킨 후, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리시키는 것을 포함하는 (R)-1,2-프로판디올의 제조 방법.
  3. 단일 탄소원으로서 라세미 1,2-프로판디올을 함유하는 배양 배지에서 슈도모나스 니트로레듀센스(Pseudomonas nitroreducens) DS-S-RP8 (수탁 번호: FERM BP-7793) 을 배양시키고, 입체선택적으로 (S)-1,2-프로판디올을 동화시킨 후, 잔존 (R)-1,2-프로판디올을 배양 브로쓰로부터 단리시키는 것을 포함하는 (R)-1,2-프로판디올의 제조 방법.
  4. 삭제
  5. 슈도모나스 니트로레듀센스 DS-S-RP8 (수탁 번호: FERM BP-7793).
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