JP2014168431A - 光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、ラセミ体3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物、および/または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する方法である。
【選択図】なし
Description
ラセミ体3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物、および/または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する方法。
ここで、上記ラセミ体3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドは、下記式[1]で表されるものであり、上記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸は、下記式[2]で表されるものである。
シネラ・エスピー(Shinella sp.)は、受領番号がNITE AP−1527である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)は、受領番号がNITE AP−1526である微生物菌体である、
発明1に記載の方法。
前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸とともに、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドも製造される、発明1または2に記載の方法。
ここで、上記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドは、下記式[3]で表されるものである。
前記ラセミ体にシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸として、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸が製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸として、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸が製造される、
発明1〜3のいずれか1つに記載の方法。
前記ラセミ体にシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドとして、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドとして、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが製造される、
請求項3に記載の方法。
発明3に記載の方法により得られた光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物、または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する方法。
前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドであるときは、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造し、
前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドであるときは、シネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する、
発明6に記載の方法。
前記微生物菌体は、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養により単離されたものである、発明1〜7のいずれか1つに記載の方法。
前記微生物菌体またはその細胞抽出物を含む液体に対し、該微生物菌体またはその細胞抽出物を作用させるラセミ体または光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを、0.1〜40%(w/v)の濃度で添加する、発明1〜8のいずれか1つに記載の方法。
前記作用させる際の反応温度が20〜30℃である、発明1〜9のいずれか1つに記載の方法。
受託番号がNITE AP−1526である微生物菌体。
受託番号がNITE AP−1527である微生物菌体。
単離されたシネラ・エスピー(Shinella sp.)(受領番号:NITE AP−1527)は16SrDNA塩基配列解析の結果、Shinella zoogloeoidesと99.9%の相同性を示したが、明確な相違点も確認され、また、生理・生化学的性状試験の結果においてS. zoogloeoidesの性状に類似点が多く認められたものの、ウレアーゼ活性や4%塩化ナトリウム存在下で生育した点は、S. zoogloeoidesの性状と異なり、これまでに知られていない微生物であると言える。以下に、シネラ・エスピー(Shinella sp.)(受領番号:NITE AP−1527)の生理・生化学的性状を示す。
細胞形態:桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0 μm)
グラム染色性:−
胞子の有無:−
運動性:+
コロニー形態:淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応:+
オキシダーゼ反応:+
グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):−/−
O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
細胞形態:桿菌(24時間:0.7-0.8×1.5-2.5 μm、72時間:0.7-0.8×1.0-1.2 μm) rod coccus cycle あり
グラム染色性:+
胞子の有無:−
運動性:−
コロニー形態:淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応:+
オキシダーゼ反応:−
グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):−/−
O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
該懸濁液が静置状態にあると微生物菌体が沈降して反応効率が低下するため、反応時は懸濁液を攪拌しながら行う。反応時間は目的物の生成具合によって決定され、通常1〜312時間で行う。
反応液1.0mLを20,000×g、4℃で10分間の遠心分離を行い、上清600μLに超純水400μLを加え、20,000×g、4℃で10分間の遠心分離を行った。3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドから3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸への変換を確認するために、上清をカラム:Intertsil(登録商標) ODS−3(5μm×4.6mm×250mm)、溶媒:0.1%H3PO4:CH3CN(9:1)、流速:0.8mL/分、カラム温度:40℃、検出波長;210nm、保持時間:3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド:9.0分、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸:16.7分にてHPLC分析を行った。この分析により3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドから3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸への変換が確認出来た菌株に関しては、立体選択性の評価を行うために上清をカラム:Sumichiral OA−5000(5μm×4.6mm×150mm)、溶媒:2mM CuSO4:2−プロパノール(9:1)、流速1.0mL/分、カラム温度:40℃、検出波長:254nm、保持時間:(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸:22分、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸:26分にてHPLC分析を行った。
培地(0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0)を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌(121 ℃、20分間)した。ビタミン混合溶液(0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン)、微量元素溶液(0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物)。
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL(試験管)に、フィルター滅菌したラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Arthrobactersp. S-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地500 mL(振盪三角フラスコ)に、フィルター滅菌したラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
培養液500 mLから、200 mLずつ2つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
反応開始後それぞれ1, 2, 3, 4, 5時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析[カラム:COSMOSIL C18-MS-II(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:0.1%リン酸‐アセトニトリル(9 / 1)、流速:0.8 mL/分、カラム温度:40℃、保持時間:アミド4.7分、カルボン酸7.6分]した(図1)。
反応開始5時間後にアミド約50%がカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mg(43%、サンプリング分を考慮した換算収率)を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸 89.4 mg(47%、サンプリング分を考慮した換算収率)を得た。立体選択性の評価のために、得られた(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析[カラム:SUMICHIRAL OA-5000(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール(9 / 1)、流速:1.0 mL/分、カラム温度:40 ℃、保持時間:(R) 22.8分、(S) 26.4分]した結果、89.6% eeであった。
培地(0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0)を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌(121 ℃、20分間)した。ビタミン混合溶液(0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン)、微量元素溶液(0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物)。
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL(試験管)に、フィルター滅菌したラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Shinellasp. R-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地500 mL(振盪三角フラスコ)に、フィルター滅菌したラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で48時間振盪培養した。
培養液500 mLから、100 mLずつ4つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析[カラム:COSMOSIL C18-MS-II(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:0.1%リン酸‐アセトニトリル(9 / 1)、流速:0.8 mL/分、カラム温度:40℃、保持時間:アミド4.7分、カルボン酸7.6分]した(図2)。
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド 89.6 mg(47%、サンプリング分を考慮した換算収率)を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸 92.4 mg(49%、サンプリング分を考慮した換算収率)を得た。立体選択性の評価のために、得られた(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析[カラム:SUMICHIRAL OA-5000(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール(9 / 1)、流速:1.0 mL/分、カラム温度:40 ℃、保持時間:(R) 22.8分、(S) 26.4分]した結果、91.3% eeであった。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)50.0 mLで懸濁し、Arthrobactersp. S-2株を用いて光学分割した(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析[カラム:COSMOSIL C18-MS-II(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:0.1%リン酸‐アセトニトリル(9 / 1)、流速:0.8 mL/分、カラム温度:40℃、保持時間:アミド4.7分、カルボン酸7.6分]した(図3)。
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸 65.8 mg(92%、サンプリング分を考慮した換算収率)を得た。Arthrobacter sp. S-2株とShinella sp. R-6株を用いた2段階の通算収率は、40%であった。立体選択性の評価のために、得られた(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析[カラム:SUMICHIRAL OA-5000(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール(9 / 1)、流速:1.0 mL/分、カラム温度:40 ℃、保持時間:(R) 22.8分、(S) 26.4分]した結果、>99.9% eeであった。
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析[カラム:COSMOSIL C18-MS-II(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:0.1%リン酸‐アセトニトリル(9 / 1)、流速:0.8 mL/分、カラム温度:40℃、保持時間:アミド4.7分、カルボン酸7.6分]した(図5)。
以上の検討から、基質濃度2.0%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析[カラム:COSMOSIL C18-MS-II(5 μm × 4.6 mm × 150 mm)、展開溶媒:0.1%リン酸‐アセトニトリル(9 / 1)、流速:0.8 mL/分、カラム温度:40℃、保持時間:アミド4.7分、カルボン酸7.6分]した。
以上の検討から、基質濃度0.5%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
実施例1〜2で用いた単離用培地2.5mLにフィルター滅菌(0.2μL)した3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの10%水溶液を50μL添加した。これに、Shinella sp. R−6(受領番号:NITE AP−1527)と、Arthrobacter sp. S−2(受領番号:NITE AP−1526)をそれぞれ植菌し、300rpm、30℃で48時間振盪培養を行った。培養後の培養液をそれぞれ2.4mLずつ採取し、20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行い、上清を除去した。菌体に20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を加え、20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行った。この洗浄操作を2回繰り返し行った。洗浄した菌体に20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を600μL加え、ガラスビーズ(0.1mm)を加え、2,500rpm、4℃、60秒間の菌体破砕操作を3回行った(60秒間のインターバル)。破砕した菌体は20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液500μLに20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)480μLと10%3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド水溶液20μLを加え、1,000rpm、30℃で4時間振盪し、前述に示すHPLC分析を行った。
シネラ・エスピー(Shinella sp.)は、受託番号がNITE P−1527である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)は、受託番号がNITE P−1526である微生物菌体である、
発明1に記載の方法。
受託番号がNITE P−1526である微生物菌体。
受託番号がNITE P−1527である微生物菌体。
単離されたシネラ・エスピー(Shinella sp.)(受託番号:NITE P−1527)は16SrDNA塩基配列解析の結果、Shinella zoogloeoidesと99.9%の相同性を示したが、明確な相違点も確認され、また、生理・生化学的性状試験の結果においてS. zoogloeoidesの性状に類似点が多く認められたものの、ウレアーゼ活性や4%塩化ナトリウム存在下で生育した点は、S. zoogloeoidesの性状と異なり、これまでに知られていない微生物であると言える。以下に、シネラ・エスピー(Shinella sp.)(受託番号:NITE P−1527)の生理・生化学的性状を示す。
細胞形態:桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0 μm)
グラム染色性:−
胞子の有無:−
運動性:+
コロニー形態:淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応:+
オキシダーゼ反応:+
グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):−/−
O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
細胞形態:桿菌(24時間:0.7-0.8×1.5-2.5 μm、72時間:0.7-0.8×1.0-1.2 μm) rod coccus cycle あり
グラム染色性:+
胞子の有無:−
運動性:−
コロニー形態:淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応:+
オキシダーゼ反応:−
グルコースからの酸/ガス産生(酸産生/ガス産生):−/−
O/Fテスト(酸化/発酵):−/−
実施例1〜2で用いた単離用培地2.5mLにフィルター滅菌(0.2μL)した3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドの10%水溶液を50μL添加した。これに、Shinella sp. R−6(受託番号:NITE P−1527)と、Arthrobacter sp. S−2(受託番号:NITE P−1526)をそれぞれ植菌し、300rpm、30℃で48時間振盪培養を行った。培養後の培養液をそれぞれ2.4mLずつ採取し、20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行い、上清を除去した。菌体に20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を加え、20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行った。この洗浄操作を2回繰り返し行った。洗浄した菌体に20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を600μL加え、ガラスビーズ(0.1mm)を加え、2,500rpm、4℃、60秒間の菌体破砕操作を3回行った(60秒間のインターバル)。破砕した菌体は20,000×g、4℃で5分間の遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液500μLに20mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)480μLと10%3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミド水溶液20μLを加え、1,000rpm、30℃で4時間振盪し、前述に示すHPLC分析を行った。
Claims (12)
- ラセミ体3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物、および/または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する方法。
- シネラ・エスピー(Shinella sp.)は、受領番号がNITE AP−1527である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)は、受領番号がNITE AP−1526である微生物菌体である、
請求項1に記載の方法。 - 前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸とともに、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドも製造される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ラセミ体にシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸として、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸が製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸として、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸が製造される、
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ラセミ体にシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドとして、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドとして、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが製造される、
請求項3に記載の方法。 - 請求項3に記載の方法により得られた光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物、または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する方法。
- 前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドであるときは、アルスロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、(S)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造し、
前記光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドが(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−メチルプロピオン酸アミドであるときは、シネラ・エスピー(Shinella sp.)もしくはその細胞抽出物を作用させて、(R)−3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸を製造する、
請求項6に記載の方法。 - 前記微生物菌体は、3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養により単離されたものである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物菌体またはその細胞抽出物を含む液体に対し、該微生物菌体またはその細胞抽出物を作用させるラセミ体または光学活性3,3,3−トリフルオロ−2−ヒドロキシ−2−メチルプロピオン酸アミドを、0.1〜40%(w/v)の濃度で添加する、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記作用させる際の反応温度が20〜30℃である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 受託番号がNITE AP−1526である微生物菌体。
- 受託番号がNITE AP−1527である微生物菌体。
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