JP6201120B2 - 光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸の製造方法に関する。
光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、種々の医農薬中間体として重要な化合物である。これまでに、化学的な方法では、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸に光学分割剤を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法が報告されている。一方、化学的な方法とは別に、生物学的な方法により光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法も知られており、例えば、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸エステルに生物の酵素を作用させて立体選択的に加水分解する方法（特許文献１〜７、非特許文献１）、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸ニトリルに生物の酵素を作用させて立体選択的に加水分解する方法（特許文献８）が開示・報告されている。
同様に、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを立体選択的に加水分解する方法についても生物学的な方法が知られており、特許文献９に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属又はＢａｃｉｌｌｕｓ属の微生物を用いた方法が、特許文献１０に、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属又はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属の微生物を用いた方法が開示され、非特許文献２と非特許文献３ではＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属の微生物を用いた方法が開示・報告されている。
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ １０（１９９９）６７９−６８７
Ｏｒｇａｎｉｃ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２００２、６、４９７−５０４
Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ６０（２００４）、７４７−７５２
ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに生物の酵素を作用させて立体選択的に加水分解し、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法は知られていたが、使用される微生物は限られていた。
本発明の課題は、これまでに使用されていない微生物菌体を用いて、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを立体選択的に加水分解することにより、より経済的に且つ簡便に、高い光学純度で、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法を提供することにある。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意検討した結果、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを立体選択的に加水分解する新規微生物を見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明では、以下の[発明１]〜[発明１２]に記載する発明を提供する。
[発明１]
ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物、および／または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
ここで、上記ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［１］で表されるものであり、上記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、下記式［２］で表されるものである。
ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物、および／または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
ここで、上記ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［１］で表されるものであり、上記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、下記式［２］で表されるものである。
[発明２]
シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体である、
発明１に記載の方法。
シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）は、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体である、
発明１に記載の方法。
[発明３]
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸とともに、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドも製造される、発明１または２に記載の方法。
ここで、上記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［３］で表されるものである。
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸とともに、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドも製造される、発明１または２に記載の方法。
ここで、上記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［３］で表されるものである。
[発明４]
前記ラセミ体にシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸として、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸として、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が製造される、
発明１〜３のいずれか１つに記載の方法。
前記ラセミ体にシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸として、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸として、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が製造される、
発明１〜３のいずれか１つに記載の方法。
ここで、上記（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、下記式［４］で表されるものであり、上記（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、下記式［５］で表されるものである。
[発明５]
前記ラセミ体にシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドとして、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドとして、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが製造される、
請求項３に記載の方法。
前記ラセミ体にシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドとして、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが製造され、
前記ラセミ体にアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させたときは、前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドとして、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが製造される、
請求項３に記載の方法。
ここで、上記（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［６］で表されるものであり、上記（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドは、下記式［７］で表されるものである。
[発明６]
発明３に記載の方法により得られた光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物、または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
発明３に記載の方法により得られた光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物、または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
[発明７]
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造し、
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する、
発明６に記載の方法。
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造し、
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する、
発明６に記載の方法。
ここで、上記（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸、および上記（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、前記式［５］および式［４］と同じである。
[発明８]
前記微生物菌体は、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養により単離されたものである、発明１〜７のいずれか１つに記載の方法。
前記微生物菌体は、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養により単離されたものである、発明１〜７のいずれか１つに記載の方法。
[発明９]
前記微生物菌体またはその細胞抽出物を含む液体に対し、該微生物菌体またはその細胞抽出物を作用させるラセミ体または光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを、０．１〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加する、発明１〜８のいずれか１つに記載の方法。
前記微生物菌体またはその細胞抽出物を含む液体に対し、該微生物菌体またはその細胞抽出物を作用させるラセミ体または光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを、０．１〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加する、発明１〜８のいずれか１つに記載の方法。
[発明１０]
前記作用させる際の反応温度が２０〜３０℃である、発明１〜９のいずれか１つに記載の方法。
前記作用させる際の反応温度が２０〜３０℃である、発明１〜９のいずれか１つに記載の方法。
[発明１１]
受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体。
受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体。
[発明１２]
受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体。
受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体。
前述したように、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに微生物を作用させて立体選択的に加水分解し、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法は従来から知られていたが、使用される微生物種は限られていた。そこで本発明者らは、高い立体選択性で該アミドを加水分解するシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）及びアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）を新たに見出し、経済的に且つ簡便に、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸（すなわち、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸、又は（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸）を製造する方法を新たに見出した。
本発明では、微生物は培養した菌体をそのまま用いることが出来るのは勿論、超音波やガラスビーズで破砕した菌体、アクリルアミド等で固定化した菌体、アセトンやグルタルアルデヒドなどの有機化合物で処理した菌体、アルミナ、シリカ、ゼオライト及び珪藻土等の無機担体に担持した菌体、該微生物より調製した無細胞抽出液や精製酵素、該微生物よりクローニングした遺伝子を導入した遺伝子組換え体も用いることが出来る。
医農薬中間体として重要な光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を経済的に且つ簡便に製造することが出来る。
以下に、本発明について詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
本発明において、「ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド」とは、「ラセミ体である３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド」を意味する。また、「光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸」および「光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド」とは、それぞれ、「光学活性を有する３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸」および「光学活性を有する３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド」を意味する。
本発明において基質として用いるラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドは、公知の化合物であり、従来技術（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ（１９５４），３６６−３７４．）に基づいて当業者が適宜調製しても良いし、市販されているものを用いても良い。
本発明において、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドそのもの自体は当然、それ以外に水又は炭素数１〜４のアルコールとの混合物も同等に用いることが出来る。本発明において、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を得るために使用することの出来る微生物菌体は、高い立体選択性を有する微生物菌体が好ましく、Ｒ体の立体選択性を有する微生物菌体としては、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（より具体的には、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体が好ましい）、Ｓ体の立体選択性を有する微生物菌体としては、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（より具体的には、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体が好ましい）である。
上記シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）およびアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）は、後述の単離方法にて土壌より単離を行い、生物学的分類を行った。
単離されたシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）は１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓと９９．９％の相同性を示したが、明確な相違点も確認され、また、生理・生化学的性状試験の結果においてＳ． ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓの性状に類似点が多く認められたものの、ウレアーゼ活性や４％塩化ナトリウム存在下で生育した点は、Ｓ． ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓの性状と異なり、これまでに知られていない微生物であると言える。以下に、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）の生理・生化学的性状を示す。
単離されたシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）は１６ＳｒＤＮＡ塩基配列解析の結果、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓと９９．９％の相同性を示したが、明確な相違点も確認され、また、生理・生化学的性状試験の結果においてＳ． ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓの性状に類似点が多く認められたものの、ウレアーゼ活性や４％塩化ナトリウム存在下で生育した点は、Ｓ． ｚｏｏｇｌｏｅｏｉｄｅｓの性状と異なり、これまでに知られていない微生物であると言える。以下に、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）の生理・生化学的性状を示す。
＜シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）＞
細胞形態：桿菌（0.7-0.8×1.5-2.0 μm）
グラム染色性：−
胞子の有無：−
運動性：＋
コロニー形態：淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応：＋
オキシダーゼ反応：＋
グルコースからの酸/ガス産生（酸産生/ガス産生）：−/−
O/Fテスト（酸化/発酵）：−/−
細胞形態：桿菌（0.7-0.8×1.5-2.0 μm）
グラム染色性：−
胞子の有無：−
運動性：＋
コロニー形態：淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応：＋
オキシダーゼ反応：＋
グルコースからの酸/ガス産生（酸産生/ガス産生）：−/−
O/Fテスト（酸化/発酵）：−/−
同様に、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）についてはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に対し高い相同性を示したが、基準株に由来する１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列を見出すことは出来ず、また、生理・生化学性状試験の結果においてＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ属の性状に類似点が多く認められたものの、性状の一致する既知主を見出すことが出来ず、これまでに知られていない微生物であると言える。以下に、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）の生理・生化学的性状を示す。
＜アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）＞
細胞形態：桿菌（24時間：0.7-0.8×1.5-2.5 μm、72時間：0.7-0.8×1.0-1.2 μm） rod coccus cycle あり
グラム染色性：＋
胞子の有無：−
運動性：−
コロニー形態：淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応：＋
オキシダーゼ反応：−
グルコースからの酸/ガス産生（酸産生/ガス産生）：−/−
O/Fテスト（酸化/発酵）：−/−
細胞形態：桿菌（24時間：0.7-0.8×1.5-2.5 μm、72時間：0.7-0.8×1.0-1.2 μm） rod coccus cycle あり
グラム染色性：＋
胞子の有無：−
運動性：−
コロニー形態：淡黄色円形レンズ状
カタラーゼ反応：＋
オキシダーゼ反応：−
グルコースからの酸/ガス産生（酸産生/ガス産生）：−/−
O/Fテスト（酸化/発酵）：−/−
ここで、受託番号が「ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７」である微生物菌体は、「Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６」と称し2013年2月5日付で、また受託番号が「ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６」である微生物菌体は、「Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２」と称し2013年2月5日付で、いずれも、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に寄託されたものである。なお、これら微生物菌体は、一般に市販されているものであり、当業者が容易に入手できる。
３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを立体選択的に加水分解する微生物菌体は、通常の微生物学的方法を用いて土壌、汚泥、排水又は動植物といった環境中から単離することが出来るが、ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養を実施することで、より効率的に当該加水分解反応に適した微生物菌体を単離することが出来る。
単離された微生物菌体の培養には、通常、微生物菌体の培養に用いられる栄養成分を含む培地（固体培地又は液体培地）が使用出来るが、水溶性である３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの加水分解を行う場合には、液体培地が好ましい。培地は、炭素源としてグルコース、スクロース、マルトース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール、デキストロース等の糖類、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、グリセロール等のアルコール類、クエン酸、グルタミン酸、リンゴ酸等の有機酸類が、そして窒素源としてアンモニウム塩、ペプトン、ポリペプトン、カザミノ酸、アミノ酸、尿素、酵母エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー等が用いられる。さらに、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム等の無機塩類や、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類等の培地組成が適宜添加出来る。
これらの炭素源、窒素源、その他培地組成のうち、炭素源については微生物菌体が十分に増殖する量であり且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜８０ｇ、好ましくは１０〜４０ｇ加える。窒素源についても同様で、微生物菌体が十分に増殖する量且つ増殖を阻害しない量を加えることが好ましく、通常、培地１Ｌに対して５〜６０ｇ、好ましくは１０〜５０ｇ、培地組成としての無機塩類やビタミン類については微生物菌体の増殖に必要な種類を加える必要があるが、高い濃度の場合には増殖が阻害されるため、通常、培地１Ｌに対して０．００００００００１〜１０ｇ加える。なお、これらは微生物に応じて複数の種類を組み合わせて使用することが出来る。
培地におけるｐＨは、微生物菌体の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。培養における温度範囲は微生物菌体の増殖に好適な範囲で調整する必要があり、通常１０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃で行う。培養を円滑に進めるためには培地を攪拌することが好ましく、試験管やフラスコ等の小規模な器具の場合には振盪機を用いて、好ましくは５０〜５００ｒｐｍ、より好ましくは１００〜４００ｒｐｍで行う。培養時間は微生物の増殖が収束する時間であれば良く、６〜９６時間、好ましくは１２〜７２時間で行う。
基質である３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに微生物を作用させるには、通常、微生物菌体を培養した懸濁液をそのまま反応に使用することが出来る。培養中に生じる成分が還元反応に悪影響を与える場合には、遠心分離等の操作で培養液から微生物菌体を１度回収して得られた菌体（静止菌体）を用いて、再び懸濁液を調製して反応に使用しても良い。また、培養した微生物菌体の細胞を破砕等して得られたものや、培養した微生物菌体から調製した酵素などの、各種細胞抽出物も反応に使用することも出来る。
反応を効率的に進めるには、該懸濁液中の微生物菌体の密度を高める必要があるが、密度が高過ぎると自己溶解酵素の産生や終末代謝産物の蓄積等により反応が阻害される場合があり、通常１０6〜１０12ｃｆｕ／ｍＬ（「ｃｆｕ」は寒天培地上に形成されるコロニーの数を意味する、ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）、好ましくは１０7〜１０11ｃｆｕ／ｍＬ、より好ましくは１０8〜１０10ｃｆｕ／ｍＬで行う。
該懸濁液への３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの添加量は、該加水分解反応が進む濃度であれば量は問わないが、懸濁液に対して０．０５〜５０％（ｗ／ｖ）が好ましく、０．１〜４０％（ｗ／ｖ）がより好ましい。また、該懸濁液への３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの添加方法については、加水分解反応をモニタリングしながら好ましい範囲を維持する様に、逐次的に添加するのが好ましい。
反応温度は微生物菌体の酵素反応に好適な範囲を維持する必要があり、通常５〜５０℃、好ましくは１０〜４０℃、より好ましくは２０〜３０℃で行う。また、反応時のｐＨも微生物菌体の酵素反応に好適な範囲を維持する必要があり、通常４．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０で行う。
該懸濁液が静置状態にあると微生物菌体が沈降して反応効率が低下するため、反応時は懸濁液を攪拌しながら行う。反応時間は目的物の生成具合によって決定され、通常１〜３１２時間で行う。
該懸濁液が静置状態にあると微生物菌体が沈降して反応効率が低下するため、反応時は懸濁液を攪拌しながら行う。反応時間は目的物の生成具合によって決定され、通常１〜３１２時間で行う。
生成された光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を反応終了液から回収するには、有機合成における一般的な単離方法が採用出来る。反応終了後、有機溶媒による抽出等の通常の後処理操作を行うことにより、粗生成物を得ることが出来る。得られた粗生成物は、必要に応じて、脱水、活性炭、蒸留、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の精製操作を行うことが出来、得られた生成物の光学純度をより高めるための操作（キラルカラムクロマトグラフィー、光学分割剤、再結晶（特許第４１０５７９７号に記載の方法など）を行うことも可能である。
以上に述べた本発明の製造方法によれば、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから、特定の微生物菌体またはその細胞抽出物を用いることにより、立体選択的な加水分解反応を行い、光学活性を有する３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を９０％ｅｅ以上（好ましくは、９５％ｅｅ以上、さらに好ましくは９９％ｅｅ以上）の光学純度で製造することができる。具体的には、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を用いた場合は、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を、上記光学純度で製造することができ、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）を用いた場合は、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を、上記光学純度で製造することができる。
また本発明の製造方法においては、目的生成物である光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸とともに、未反応基質としての光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドも併せて得ることができる。具体的には、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が生成された場合は、未反応基質として（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを得ることができ、他方、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸が生成された場合は、未反応基質として（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを得ることができる。
さらに、上記の反応（先の反応）で得られた光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドは、さらにこれを基質として用いる加水分解反応（後の反応）を行うことにより、結果として、先の反応で生成された光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸とは逆の光学活性を有する３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸も併せて得ることができる。すなわち、先の反応と後の反応とで、逆の立体選択性を有する微生物菌体（つまり、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）とアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．））を用いることで、Ｒ体とＳ体の両方の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を併せて生成することができ、さらに加水分解前の３，３，３−トリフルオロメチルプロピオン酸アミドよりも高い光学純度で３，３，３−トリフルオロメチルプロピオン酸を得ることができる。なお、上記の後の反応においては、例えば、鉱酸などの加水分解活性を有する公知の物質を用いることもできるが、この場合、光学純度は加水分解前と同等である。
本発明においては、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸（生成物）の製造に用いた微生物菌体（シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．））は、該生成物を反応終了液から回収後、再度、新たに光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸の製造に利用することができる。この再利用は、例えば、少なくとも３回行うことができる。このように、微生物菌体を繰り返し生成反応に用いることにより、微生物菌体の１回の培養から、複数回の生成反応を行うことができるため、経済的にも優れるほか、基質となる３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの濃度が低い条件下であっても、生成反応の回数でその条件を補うことができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを加水分解する微生物の単離］
蒸留水１０００ｍＬにグリセロール５．０ｇ、リン酸二水素カリウム２．０ｇ、リン酸水素二カリウム２．０ｇ、塩化ナトリウム１．０ｇ、酵母エキス０．５ｇ、硫酸マグネシウム七水和物０．２ｇ、ビタミン混合溶液１．０ｍＬ、微量元素溶液１．０ｍＬを添加し、ｐＨを７．０に調整した後、試験管に２．５ｍＬずつ分注し、高圧蒸気滅菌を行い単離用培地を調製した。ビタミン混合溶液は次の組成から成る、蒸留水１００ｍＬ、イノシトール２０ｍｇ、ニコチン酸４．０ｍｇ、パントテン酸カルシウム４．０ｍｇ、ピリドキシン塩酸塩４．０ｍｇ、チアミン塩酸塩４．０ｍｇ、ｐ−アミノ安息香酸２．０ｍｇ、リボフラビン２．０ｍｇ、葉酸０．１ｍｇ、ビオチン０．０２ｍｇ。微量元素溶液は以下の組成から成る、蒸留水１００ｍＬ、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン−N、N、N’、N’−四酢酸一水和物５００ｍｇ、硫酸鉄七水和物２００ｍｇ、ホウ酸七水和物３０ｍｇ、塩化コバルト六水和物２０ｍｇ、硫酸亜鉛七水和物１０ｍｇ、塩化マンガン七水和物３．０ｍｇ、モリブデン酸ナトリウム３．０ｍｇ、塩化ニッケル六水和物２．０ｍｇ塩化銅二水和物１．０ｍｇ。滅菌後の培地２．５ｍＬにフィルター滅菌（０．２μｍ）した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの１０％水溶液を５０μＬ添加した。任意の量の土壌サンプルを基質添加後の単離用培地に添加し、３００ｒｐｍ、３０℃で３〜４日間振盪培養を行った。培養後の培養液５０μＬを再度同一の培地に添加し、同様に振盪培養を行った。この操作を４回繰り返して微生物を集積後、培養液１０μＬを寒天により固化した同じ組成の培地（φ９ｃｍシャーレ内）に塗布し、３０℃で１〜２日間静置培養を行った。培養後の寒天培地から単一コロニーを採取し、同様の寒天培地に３０℃で１〜２日間培養後、４℃で保存した。
［静止菌体を用いた３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの加水分解反応］
高圧蒸気滅菌した単離用培地２．５ｍＬにフィルター滅菌（０．２μＬ）した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの１０％水溶液を５０μＬ添加した。これに実施例１で単離した菌株を接種し、３００ｒｐｍ、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養後の培養液を２．０ｍＬ採取し、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い上清を除去した。沈殿した菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。この操作を２回繰り返し、菌体を洗浄した。洗浄した菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）９８０μＬと１０％３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液２０μＬを加え、１，０００ｒｐｍ、３０℃で１８時間振盪し、反応液を後述に示す条件でＨＰＬＣ分析を行った。
単離した菌株の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに対する反応性と生成した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸の立体選択性を表１に示す。
２０％ｅｅ以上の立体選択性が認められた菌株の詳細な結果を表２に示す。
［ＨＰＬＣ分析］
反応液１．０ｍＬを２０，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離を行い、上清６００μＬに超純水４００μＬを加え、２０，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離を行った。３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸への変換を確認するために、上清をカラム：Ｉｎｔｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３（５μｍ×４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶媒：０．１％Ｈ３ＰＯ４：ＣＨ３ＣＮ（９：１）、流速：０．８ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出波長；２１０ｎｍ、保持時間：３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド：９．０分、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：１６．７分にてＨＰＬＣ分析を行った。この分析により３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸への変換が確認出来た菌株に関しては、立体選択性の評価を行うために上清をカラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００（５μｍ×４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、溶媒：２ｍＭ ＣｕＳＯ４：２−プロパノール（９：１）、流速１．０ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出波長：２５４ｎｍ、保持時間：（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：２２分、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：２６分にてＨＰＬＣ分析を行った。
反応液１．０ｍＬを２０，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離を行い、上清６００μＬに超純水４００μＬを加え、２０，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離を行った。３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸への変換を確認するために、上清をカラム：Ｉｎｔｅｒｔｓｉｌ（登録商標） ＯＤＳ−３（５μｍ×４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）、溶媒：０．１％Ｈ３ＰＯ４：ＣＨ３ＣＮ（９：１）、流速：０．８ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出波長；２１０ｎｍ、保持時間：３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド：９．０分、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：１６．７分にてＨＰＬＣ分析を行った。この分析により３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸への変換が確認出来た菌株に関しては、立体選択性の評価を行うために上清をカラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ ＯＡ−５０００（５μｍ×４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）、溶媒：２ｍＭ ＣｕＳＯ４：２−プロパノール（９：１）、流速１．０ｍＬ/分、カラム温度：４０℃、検出波長：２５４ｎｍ、保持時間：（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：２２分、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸：２６分にてＨＰＬＣ分析を行った。
菌株番号６−１と２３−３の微生物菌体は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列解析および生理・生化学性状試験の結果に基づいて、それぞれ順に、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）とアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）であると同定した。前者のシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）は、「Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６」と称し2013年2月5日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託し（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）、他方、後者のアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）は、「Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２」と称し2013年2月5日付で上記特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）。
［Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）を用いた光学分割］
１．培地調製
培地（0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0）を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121 ℃、20分間）した。ビタミン混合溶液（0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン）、微量元素溶液（0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物）。
培地（0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0）を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121 ℃、20分間）した。ビタミン混合溶液（0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン）、微量元素溶液（0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物）。
２．前培養
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL（試験管）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Arthrobactersp. S-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL（試験管）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Arthrobactersp. S-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
３．本培養
オートクレーブ滅菌した培地500 mL（振盪三角フラスコ）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地500 mL（振盪三角フラスコ）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
４．集菌
培養液500 mLから、200 mLずつ2つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液500 mLから、200 mLずつ2つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
５．静止菌体反応
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
６．HPLCによる反応の追跡
反応開始後それぞれ1, 2, 3, 4, 5時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図１）。
反応開始後それぞれ1, 2, 3, 4, 5時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図１）。
７．反応終了後
反応開始5時間後にアミド約50%がカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mg（43%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 89.4 mg（47%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。立体選択性の評価のために、得られた(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、89.6% eeであった。
反応開始5時間後にアミド約50%がカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mg（43%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 89.4 mg（47%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。立体選択性の評価のために、得られた(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、89.6% eeであった。
［Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）を用いた光学分割］
１．培地調製
培地（0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0）を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121 ℃、20分間）した。ビタミン混合溶液（0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン）、微量元素溶液（0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物）。
培地（0.2%リン酸二水素カリウム、0.2%リン酸水素二カリウム、0.1%塩化ナトリウム、0.05%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム七水和物、0.1%ビタミン混合溶液、0.1%微量元素溶液、1%グリセロール、pH 7.0）を2.5 mLずつ試験管に分注し、オートクレーブ滅菌（121 ℃、20分間）した。ビタミン混合溶液（0.02%イノシトール、4 × 10-3%ニコチン酸、4 × 10-3%パントテン酸カルシウム、4 × 10-3%ピリドキシン塩酸塩、4 × 10-3%チアミン塩酸塩、2 × 10-3% 4-アミノ安息香酸、2 × 10-3%リボフラビン、1 × 10-3%葉酸、2 × 10-5%ビオチン）、微量元素溶液（0.5%トランス-1,2-ジアミノシクロヘキサン-N,N,N’,N’-四酢酸一水和物、0.2%硫酸鉄七水和物、0.03%ホウ酸、0.02%塩化コバルト六水和物、0.01%硫酸亜鉛七水和物、3 × 10-3%塩化マンガン七水和物、3 × 10-3%モリブデン酸ナトリウム、2 × 10-3%塩化ニッケル六水和物、1 × 10-3%塩化銅二水和物）。
２．前培養
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL（試験管）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Shinellasp. R-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地5.0 mL（試験管）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液200 μLを添加後、Shinellasp. R-2株を植菌し、300 rpm、30 ℃で24時間振盪培養した。
３．本培養
オートクレーブ滅菌した培地500 mL（振盪三角フラスコ）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で48時間振盪培養した。
オートクレーブ滅菌した培地500 mL（振盪三角フラスコ）に、フィルター滅菌したラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの5%水溶液20 mLをそれぞれ添加後、前培養液5.0 mLを添加し、150 rpm、30 ℃で48時間振盪培養した。
４．集菌
培養液500 mLから、100 mLずつ4つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液500 mLから、100 mLずつ4つの遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
５．静止菌体反応
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
培養液200 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）100.0 mLで懸濁し、ラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 200 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
６．HPLCによる反応の追跡
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図２）。
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図２）。
７．反応終了後
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 89.6 mg（47%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 92.4 mg（49%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。立体選択性の評価のために、得られた(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、91.3% eeであった。
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 89.6 mg（47%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 92.4 mg（49%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。立体選択性の評価のために、得られた(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、91.3% eeであった。
［光学分割（２段階反応）の実施例；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）を用いた静止菌体反応の回収原料（(R)-アミド）に対する、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）を用いた静止菌体反応による(R)-カルボン酸への変換］
１．菌体の培養までは、前述の実施例３および４と同様。
２．静止菌体反応（2段階目）
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）50.0 mLで懸濁し、Arthrobactersp. S-2株を用いて光学分割した(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）50.0 mLで懸濁し、Arthrobactersp. S-2株を用いて光学分割した(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド 80.9 mgを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
３．HPLCによる反応の追跡
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図３）。
反応開始後それぞれ2, 4, 6, 8, 10, 12時間後に反応液1.0 mLずつを採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清800 μLを20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清600 μLを、HPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図３）。
４．反応終了後
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 65.8 mg（92%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。Arthrobacter sp. S-2株とShinella sp. R-6株を用いた2段階の通算収率は、40%であった。立体選択性の評価のために、得られた(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、>99.9% eeであった。
反応開始12時間後にアミドがほぼ完全にカルボン酸へと転換されたことを確認後、反応液100 mLを遠沈管に分注し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。菌体に蒸留水10 mLを加え懸濁し、9,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を採取した。この洗浄操作を2回繰返し行った。混合した反応上清に酢酸エチル50 mLを加え、未反応の(Ｓ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを抽出した。抽出後の水層に希塩酸を加え、pHを4程度にした後、ジエチルエーテル30 mLを加え、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を抽出した。この抽出操作を5回繰返し行った。混合した有機層は無水硫酸ナトリウムで乾燥した。綿栓吸引濾過で硫酸ナトリウムを除去後、減圧濃縮、真空下での乾燥を経て、(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸 65.8 mg（92%、サンプリング分を考慮した換算収率）を得た。Arthrobacter sp. S-2株とShinella sp. R-6株を用いた2段階の通算収率は、40%であった。立体選択性の評価のために、得られた(Ｒ)−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸をキラルカラムでのHPLC分析［カラム：SUMICHIRAL OA-5000（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：2 mM硫酸銅水溶液‐2-プロパノール（9 / 1）、流速：1.0 mL/分、カラム温度：40 ℃、保持時間：(R) 22.8分、(S) 26.4分］した結果、>99.9% eeであった。
［基質濃度の検討；Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）］
１．集菌
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
２．静止菌体反応
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
３．HPLCによる反応の追跡
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図５）。
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した（図５）。
４．結果
以上の検討から、基質濃度2.0%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
以上の検討から、基質濃度2.0%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
［基質濃度の検討；Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６株（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）］
１．集菌
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
培養液500 mLから、100 mLを遠沈管に分注し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。菌体に20 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）を加え懸濁し、9,500 × g、4 ℃で10分間遠心分離し、上清を除去した。この洗浄操作を2回繰返し行った。
２．静止菌体反応
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
培養液100 mLから集菌し洗浄した菌体を20 mMリン酸カリウム緩衝液（pH 7.0）40 mLで懸濁し、4.0 mLずつ試験管10本に分注した。各濃度のラセミ体の３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液1.0 mLを加え、150 rpm、30 ℃で振盪した。
３．HPLCによる反応の追跡
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した。
反応開始それぞれ2, 4, 8, 24時間後ごとに反応液を採取し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清を超純水で適宜希釈し、20,000 × g、4 ℃で10分間遠心分離した。上清をHPLC分析［カラム：COSMOSIL C18-MS-II（5 μm × 4.6 mm × 150 mm）、展開溶媒：0.1%リン酸‐アセトニトリル（9 / 1）、流速：0.8 mL/分、カラム温度：40℃、保持時間：アミド4.7分、カルボン酸7.6分］した。
４．結果
以上の検討から、基質濃度0.5%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
以上の検討から、基質濃度0.5%以下の場合、反応時間24時間以内に光学分割が達成されることが示された。
［無細胞抽出液を用いた３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの加水分解反応］
実施例１〜２で用いた単離用培地２．５ｍＬにフィルター滅菌（０．２μＬ）した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの１０％水溶液を５０μＬ添加した。これに、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）と、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）をそれぞれ植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養後の培養液をそれぞれ２．４ｍＬずつ採取し、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行った。この洗浄操作を２回繰り返し行った。洗浄した菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を６００μＬ加え、ガラスビーズ（０．１ｍｍ）を加え、２，５００ｒｐｍ、４℃、６０秒間の菌体破砕操作を３回行った（６０秒間のインターバル）。破砕した菌体は２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液５００μＬに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４８０μＬと１０％３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液２０μＬを加え、１，０００ｒｐｍ、３０℃で４時間振盪し、前述に示すＨＰＬＣ分析を行った。
実施例１〜２で用いた単離用培地２．５ｍＬにフィルター滅菌（０．２μＬ）した３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの１０％水溶液を５０μＬ添加した。これに、Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ． Ｒ−６（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２７）と、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． Ｓ−２（受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ−１５２６）をそれぞれ植菌し、３００ｒｐｍ、３０℃で４８時間振盪培養を行った。培養後の培養液をそれぞれ２．４ｍＬずつ採取し、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い、上清を除去した。菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加え、２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行った。この洗浄操作を２回繰り返し行った。洗浄した菌体に２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を６００μＬ加え、ガラスビーズ（０．１ｍｍ）を加え、２，５００ｒｐｍ、４℃、６０秒間の菌体破砕操作を３回行った（６０秒間のインターバル）。破砕した菌体は２０，０００×ｇ、４℃で５分間の遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無細胞抽出液５００μＬに２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４８０μＬと１０％３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミド水溶液２０μＬを加え、１，０００ｒｐｍ、３０℃で４時間振盪し、前述に示すＨＰＬＣ分析を行った。
無細胞抽出液での３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドの加水分解反応の結果を表３に示す。
本発明で対象とする光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸は、医農薬中間体として利用出来る。
Claims (10)
- ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体として受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７であるシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸としての（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
- 前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸とともに、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドも製造される、請求項１に記載の方法。
- 前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドとして、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが製造される、請求項２に記載の方法。
- 請求項２に記載の方法により得られた光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドに、微生物菌体としてのシネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物、または微生物菌体としてのアルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する方法。
- 前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｓ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造し、
前記光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドが（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−メチルプロピオン酸アミドであるときは、シネラ・エスピー（Ｓｈｉｎｅｌｌａ ｓｐ．）もしくはその細胞抽出物を作用させて、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を製造する、
請求項４に記載の方法。 - シネラ・エスピーは、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体であり、
アルスロバクター・エスピーは、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２６である微生物菌体である、
請求項４または５に記載の方法。 - 前記微生物菌体は、３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを主要な窒素源として含む培地を用いた集積培養により単離されたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記微生物菌体またはその細胞抽出物を含む液体に対し、該微生物菌体またはその細胞抽出物を作用させるラセミ体または光学活性３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドを、０．１〜４０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記作用させる際の反応温度が２０〜３０℃である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- ラセミ体３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸アミドから、（Ｒ）−３，３，３−トリフルオロ−２−ヒドロキシ−２−メチルプロピオン酸を生成し得る、受託番号がＮＩＴＥ Ｐ−１５２７である微生物菌体。
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