JP2000014397A - 光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 不斉加水分解による光学活性２−ヒドロキシ
−２−トリフルオロメチル酢酸類の製造方法を提供する
こと。 【解決手段】 一般式（１） （式中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’はアルキル基、ア
ラルキル基またはアリール基を示し、＊は不斉炭素原子
であることを示す。）で示される２−ヒドロキシ−２−
トリフルオロメチル酢酸エステル類を、光学活性体の一
方を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用いて、
不斉加水分解する一般式（２） で示される光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ
メチル酢酸類の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、光学活性２−ヒド
ロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフル
オロメチル酢酸類は、医薬などの中間体として有用な化
合物である。従来、かかる光学活性２−ヒドロキシ−２
−トリフルオロメチル酢酸類を製造する方法としては、
例えばラセミの２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチ
ル酢酸類を光学活性アミン等の光学分割剤を用いて光学
分割する方法が知られている（J. Chem. Soc., 1951, 2
329.(1951年) あるいは J. Med. Chem.,39, 4592.(1996
年)）。しかしながら、光学分割法は、工業的製造にお
いては、光学分割剤の回収リサイクル工程が必須であ
る。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明者らは、
光学分割剤を用いないで光学活性２−ヒドロキシ−２−
トリフルオロメチル酢酸を得る方法、特に、ラセミの２
−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類
を光学選択的に加水分解することによって光学活性２−
ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類を製造する
方法について鋭意検討した結果、特定の酵素を用いるこ
とによって光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ
メチル酢酸類を容易に効率よく製造できることを見い出
し、本発明に至った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】すなわち本発明は、一般
式（１） （式中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’はアルキル基、ア
ラルキル基またはアリール基を示し、＊は不斉炭素原子
であることを示す。）で示される２−ヒドロキシ−２−
トリフルオロメチル酢酸エステル類を、光学活性体の一
方を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用いて、
不斉加水分解することを特徴とする一般式（２） （式中、Ｒおよび＊は前記と同じ意味を表わす。）で示
される光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチ
ル酢酸類の製造方法（以下、本発明製造方法と略する）
を提供するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明製造方法において用いられ
る原料である２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル
酢酸エステル類は、種々の方法で合成されるが、例え
ば、Ramaiahらの方法（Synlett, 1991, 643(1991年)）
やDarrallらの方法（J. Chem. Soc., 1951, 2329.(1951
年)）に準じて行うことで合成される。一般式（１）で
示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸
エステル類には、＊で示されるひとつの不斉炭素原子を
不斉中心とする２種類の光学活性体が存在するが、本発
明の方法に用いられる２−ヒドロキシ−２−トリフルオ
ロメチル酢酸エステル類（１）はこれらの光学活性体を
それぞれ等量ずつ含むラセミ体であってもよいし、一方
の光学活性体を過剰に含む光学活性な化合物であっても
よい。

【０００６】本発明製造方法において用いられる２−ヒ
ドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類
（１）において、Ｒはアルキル基を示すが、好ましくは
炭素数１〜５のアルキル基であり、例えばメチル基、エ
チル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、
イソブチル基、ｎ−ペンチル基等が挙げられる。Ｒ’は
アルキル基、アラルキル基またはアリール基を示すが、
好ましくは炭素数１〜５のアルキル基、ベンジル基、フ
ェニル基等が挙げられ、さらに好ましくは、メチル基、
エチル基、プロピル基またはブチル基等のアルキル基が
挙げられる。

【０００７】本発明製造方法において用いられる２−ヒ
ドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類
（１）に対して不斉加水分解能を有する酵素は、微生物
起源の酵素であってもよいし、動物起源の酵素であって
もよいし、植物起源の酵素であってもよい。

【０００８】微生物起源の酵素としては、例えばアルス
ロバクター(Arthrobacter)属、アスペルギルス(Aspergi
llus)属、バチルス(Bacillus)属、キャンディダ(Candid
a)属、クロモバクテリウム(Chromobacterium)属、フミ
コーラ(Humicola)属、ムコール(Mucor)属、シュードモ
ナス(Pseudomonas)属、リゾプス(Rhizopus)属、ストレ
プトミセス(Streptomyces)属、またはサーマス(Thermu
s)属の微生物を起源とする酵素、あるいはこれらの微生
物を突然変異剤もしくは紫外線により誘導された突然変
異体を起源とする酵素、あるいはこれらの微生物が有す
る酵素遺伝子が導入されることによって形質転換された
組み換え微生物が産生する酵素などが挙げられる。アス
ペルギルス属、バチルス属、キャンディダ属、クロモバ
クテリウム、フミコーラ属、ストレプトミセス属、サー
マス属等の微生物を起源とする酵素が特に好ましい結果
を与える。

【０００９】これらの微生物はいずれも通常の方法によ
って容易に液体培養することができる。培地としては、
通常の微生物培養に使用される炭素源、窒素源、無機物
等を適宜含む各種の培地を使用することができる。例え
ば、炭素源としては、グルコース、グリセリン、有機
酸、糖蜜など、窒素源としては、ペプトン、酵母エキ
ス、麦芽エキス、大豆粉、コーンスティープリカー、綿
実粉、乾燥酵母、カザミノ酸、塩化アンモニウム、硝酸
アンモニウム、硫酸アンモニウム、尿素など、無機物と
しては、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、マ
ンガン、コバルト、亜鉛等の塩類、硫酸塩類、およびリ
ン酸塩類、具体的には、塩化カリウム、塩化ナトリウ
ム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩
化コバルト、硫酸亜鉛、リン酸カリウム、リン酸ナトリ
ウムなどを使用することができる。また、上記微生物の
有する２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エ
ステル類の不斉水解能を高めるために、オリーブ油また
はトリブチリン等のトリグリセリドあるいは一般式
（１）で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメ
チル酢酸エステル類を適宜培地に添加してもよい。培養
は、通常、好気的に行うのが良く、振とう培養、または
通気撹拌培養が適当である。培養温度は、２０〜４０
℃、好ましくは、２５〜３５℃で、ｐＨは６〜８が好ま
しい。培養時間は、種々の条件によって異なるが、１〜
７日間程度が好ましい。また、必要に応じて固体培養法
も、２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エス
テル類の不斉水解能を有する微生物菌体が得られる方法
であれば適宜採用することができる。

【００１０】動物起源の酵素としては、例えば、豚内
蔵、牛内蔵、羊内蔵を起源とする酵素などが挙げられ
る。植物起源の酵素としては、例えば小麦胚芽を起源と
する酵素などが挙げられる。

【００１１】本発明製造方法において用いられる酵素は
市販品の中から選択して使用することもできる。市販品
の酵素としては、例えば、エステラーゼ(esterase)(Art
hrobacter sp.由来)、コレステロールエステラーゼ(cho
lesterol esterase)(Candidarugosa由来)、キラザイム
(CHIRAZYME)Ｅ−３(好熱性微生物由来)、キラザイムＥ
−４(好熱性微生物由来)、キラザイムＥ−５、キラザイ
ムＬ−１(Pseudomonascepacia由来)、キラザイムＬ−２
(Candida antarctica由来)、キラザイムＬ−６(Pseudom
onas sp.由来)、キラザイムＬ−７(ブタ腎臓由来)、キ
ラザイムＬ−１２(好熱性微生物由来)、キラザイムＰ−
１(Bacillus licheniformis由来)（以上、ベーリンガー
マンハイム(Boehringer Mannheim)社製）、リパーゼＡ
６(Aspergillus niger由来)、リパーゼＲ(Penicillium
roqueforti由来)、、リパーゼＮ(Rhizopus niveus由
来)、リパーゼＦ−ＡＰ１５(Rhizopus oryzae由来)、リ
パーゼＣＥ(Humicola sp.由来)、アシラーゼ(Aspergill
us melleus由来)、ＰＬＥ(ブタ肝臓由来)、パンクレア
チンＦ(ブタ腎臓由来)、プロテアーゼＰ３(Aspergillus
melleus由来)、プロテアーゼＡ(Aspergillus oryzae由
来)、プロテアーゼＭ(Aspergillus oryzae由来)、プロ
テアーゼＮ(Bacillus subtilis由来)、プロレザー(Baci
llus sp.由来)、ニューラーゼＦ(Rhizopus niveus由来)
（以上、天野製薬製）、リパーゼ(Cromobacterium visc
osum由来)（旭化成製）、リポサム(Pseudomonas sp.由
来)（昭和電工製）、リパーゼTYPEＩ(小麦胚芽由来)、
α−キモトリプシン(chymotrypsin)(ウシ腎臓由来)、γ
−キモトリプシン(ウシ腎臓由来)、δ−キモトリプシン
(ウシ腎臓由来)、プロテアーゼ(protease)(Streptomyce
s caespitosus由来)（以上、シグマ(Sigma)社製）、リ
パーゼ(lipase)(Mucor miehei由来)（Biocatalysts社
製）、エステラーゼ(esterase)４６０５４(Bacillus th
ermoglucosidasius由来)、リパーゼ６２２９３(Thermus
aquaticus由来)（以上、フルカ(Fluka)社製）等が挙げ
られる。

【００１２】本発明製造方法において用いられる酵素の
純度あるいは形態については特に制限されるものではな
く、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、およびそ
れらの処理物などの種々の形態で用いることができる。
ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾
燥菌体、菌体摩砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波
処理物、菌体抽出物、またはアルカリ処理物等をいう。
さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素
を、例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、
セルロース、イオン交換樹脂等への吸着法、ポリアクリ
ルアミド法、含硫多糖ゲル法（例えばカラギーナンゲル
法）、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル等の公知方法により
固定化して用いてもよい。

【００１３】かかる酵素は目的とする光学活性２−ヒド
ロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類（２）に応じて
適宜選択される。酵素の使用量は反応時間の遅延や選択
性の低下が起こらないように適宜選択され、例えば精製
酵素、粗酵素、または市販品酵素を用いる場合、その使
用量は２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エ
ステル類（１）に対して通常は０．００１〜０．５重量
倍、好ましくは０．００２〜０．２重量倍であり、微生
物培養物、菌体、およびそれらの処理物を用いる場合、
その使用量は２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル
酢酸エステル類（１）に対して通常は０．０１〜１００
重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。

【００１４】不斉加水分解に用いられる水は、緩衝水溶
液であってもよい。緩衝水溶液としては、例えばリン酸
ナトリウム水溶液、リン酸カリウム水溶液などといった
リン酸アルカリ金属塩水溶液などの無機酸塩の緩衝水溶
液、酢酸ナトリウム水溶液、酢酸カリウム水溶液などと
いった酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩の緩衝水溶液
などが挙げられる。かかる水の使用量は２−ヒドロキシ
−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類（１）に対し
て通常０．５モル倍以上であればよく、場合によっては
溶媒量用いられ、通常は１００重量倍以下である。

【００１５】不斉加水分解は、疎水性有機溶媒、親水性
有機溶媒などの有機溶媒の存在下に行われてもよい。か
かる有機溶媒は、得られる２−ヒドロキシ−２−トリフ
ルオロメチル酢酸類（２）の光学純度がより向上するた
め好ましく用いられる。

【００１６】疎水性有機溶媒としては、例えばｔ−ブチ
ルメチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテ
ル類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン
などの炭化水素類などが、親水性有機溶媒としては、例
えばｔ−ブタノール、メタノール、エタノール、イソプ
ロパノール、ｎ−ブタノールなどのアルコール類、テト
ラヒドロフランなどのエーテル類、ジメチルスルホキサ
イドなどのスルホキサイド類、アセトンなどのケトン
類、アセトニトリルなどのニトリル類などがそれぞれ挙
げられる。これらの疎水性有機溶媒や親水性有機溶媒は
それぞれ単独または２種以上を組み合わせて用いられ、
疎水性有機溶媒と親水性有機溶媒とを組み合わせて用い
てもよい。

【００１７】かかる有機溶媒を用いる場合、その使用量
は通常２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸エ
ステル類（１）に対して１００重量倍以下、好ましくは
０．１〜５０重量倍の範囲である。

【００１８】不斉加水分解は、例えば水、２−ヒドロキ
シ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類および酵素
を混合する方法により行われ、有機溶媒を用いる場合に
は該有機溶媒中で水、２−ヒドロキシ−２−トリフルオ
ロメチル酢酸エステル類（１）および酵素を混合すれば
よい。

【００１９】反応系のｐＨは酵素による不斉加水分解が
選択性よく進行する値が適宜選択され、特に限定されな
いが、通常はｐＨ４〜１０の範囲である。反応温度は、
高すぎると酵素の安定性が低下する傾向にあり、また低
すぎると反応速度が低下する傾向にあるため、通常５〜
６５℃であり、好ましくは２０〜５０℃の範囲である。

【００２０】かかる不斉加水分解によって一般式（１）
で示される２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢
酸エステル類の一方の光学活性体が、＊で示される不斉
炭素原子の周りの立体配置を維持したまま優先的に加水
分解されて、目的とする光学活性２−ヒドロキシ−２−
トリフルオロメチル酢酸類（２）が生成する。

【００２１】反応後の反応混合物を水層と有機層とに分
液し、水層として光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフ
ルオロメチル酢酸類（２）の水溶液を得る。先の反応に
おいて疎水性有機溶媒を用いた場合などには、得られた
反応混合物をそのまま分液してもよいが、先の反応にお
いて疎水性有機溶媒を用いなかった場合や、その使用量
が少ないために容易には分液できない場合、あるいは水
の使用量が少ないために容易には分液できない場合に
は、疎水性有機溶媒または水などを適宜加えた後に分液
すればよい。疎水性有機溶媒としては例えばｔ−ブチル
メチルエーテル、イソプロピルエーテルなどのエーテル
類、トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタンな
どの炭化水素類、ジクロロメタン、ジクロロエタン、ク
ロロホルム、クロロベンゼン、オルトジクロロベンゼン
などのハロゲン化炭化水素類、酢酸エチル、酢酸メチ
ル、酢酸ブチルなどのエステル類などが挙げられる。

【００２２】次いで、得られた光学活性２−ヒドロキシ
−２−トリフルオロメチル酢酸類（２）の水溶液から水
を留去することによって、目的の光学活性２−ヒドロキ
シ−２−トリフルオロメチル酢酸類（２）を取り出すこ
とができる。また、反応液に酸を加えた後、適当な有機
溶媒を用いて抽出し、その有機溶媒を留去することによ
っても取り出すことができる。得られた光学活性２−ヒ
ドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸類（２）はさら
に再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによって精製
されてもよい。

【００２３】かくして得られる光学活性２−ヒドロキシ
−２−トリフルオロメチル酢酸類（２）としては、例え
ば（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチルプ
ロピオン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオ
ロメチルプロピオン酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−
トリフルオロメチル酪酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２
−トリフルオロメチル酪酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−
２−トリフルオロメチル吉草酸、（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−２−トリフルオロメチル吉草酸、（Ｓ）−２−ヒド
ロキシ−２−トリフルオロメチルヘキサン酸、（Ｒ）−
２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチルヘキサン酸、
（Ｓ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチルヘプ
タン酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメ
チルヘプタン酸、（Ｓ）−２−ヒドロキシ−３−メチル
−２−トリフルオロメチル酪酸、（Ｒ）−２−ヒドロキ
シ−３−メチル−２−トリフルオロメチル酪酸、（Ｓ）
−２−ヒドロキシ−４−メチル−２−トリフルオロメチ
ル吉草酸、（Ｒ）−２−ヒドロキシ−４−メチル−２−
トリフルオロメチル吉草酸などが挙げられる。

【００２４】なお、不斉加水分解に際して加水分解され
なかった２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢酸
エステル類（１）の他方の光学活性体は、分液後の有機
層に含まれており、これは溶媒留去などの方法によって
容易に有機層から取り出すことができる。

【００２５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、特定の酵素を用
いることによってラセミの２−ヒドロキシ−２−トリフ
ルオロメチル酢酸エステル類を光学選択的に加水分解し
て光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチル酢
酸類を容易に効率よく製造することができる。

【００２６】

【実施例】以下、実施例により本発明をより詳細に説明
するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではな
い。

【００２７】実施例１〜１０ 表１に示した種々の酵素５．５ｍｇあるいは１．４ｍｇ
を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに加え
溶解させた。これにラセミの２−ヒドロキシ−２−トリ
フルオロメチルプロピオン酸エチル２８ｍｇを加えて４
０℃に昇温し、攪拌した。２時間後、反応液の一部を取
って、ＨＰＬＣ〔カラム：スミキラル ＯＡ−５００
０、４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（住化分析センター社
製）〕にて分析し、生成した２−ヒドロキシ−２−トリ
フルオロメチルプロピオン酸の光学異性体比および転換
率を求めた。結果を表２に示す。

【００２８】実施例１１〜２４ 表３に示した種々の酵素１．６ｍｇを１００ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに加え溶解させた。これに
ラセミの２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチルプロ
ピオン酸エチル２７．４ｍｇを加えて４０℃に昇温し、
攪拌した。１２時間後、反応液の一部を取って、ＨＰＬ
Ｃ〔カラム：スミキラル ＯＡ−５０００、４．６ｍｍ
φ×１５ｃｍ（住化分析センター社製）〕にて分析し、
生成した２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチルプロ
ピオン酸の光学異性体比および転換率を求めた。結果を
表４に示す。

【００２９】実施例２５ ５００ｍｌ容三角フラスコに液体培地（水１Ｌにグリセ
ロ−ル５ｇ、酵母エキス６ｇ及びリン酸一カリウム９
ｇ、リン酸二カリウム４ｇを溶解し、ｐＨ７．０とす
る。）１００ｍｌを入れて滅菌した後、アンピシリンを
５０μｇ／ｍｌになるように加え、参考例１で示した方
法で作成したアルスロバクタ−(Arthrobacter)ＳＣ−６
−９８−２８株由来のエステラ−ゼ遺伝子組換え微生物
の斜面培養から１白金耳接種し、３０℃で２４時間回転
振とう培養した。次に３Ｌ容の小型培養槽（丸菱バイオ
エンジ社製、ＭＤＬ型）に滅菌した液体培地（水１Ｌに
グリセロ−ル１５ｇ、酵母エキス２５ｇ及びリン酸一カ
リウム０．４ｇ、硫酸マグネシウム２ｇ硫酸第一鉄０．
１ｇを溶解し、ｐＨ７．０とする。）１５００ｍｌを仕
込み、そこへ上記の三角フラスコで培養した培養液１５
ｍｌを接種した。３０℃で通気攪拌培養を始め、対数増
殖期中期（培養１０〜１５時間）にＩＰＴＧ（イソプロ
ピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド）を終濃度１ｍＭにな
るように添加した後、滅菌した培地を流加し、さらに培
養を継続、計４０時間培養することにより、微生物培養
物Ａを得た。

【００３０】実施例２６ 参考例２で示した方法で作成したクロモバクテリウム(C
hromobacterium)ＳＣ−ＹＭ−１株由来のエステラ−ゼ
遺伝子組換え微生物を、実施例２５記載の方法と同様に
して培養し、微生物培養物Ｂを得た。

【００３１】実施例２７〜２８ 実施例２５及び２６で得られた微生物培養物５．５μｌ
を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）２ｍｌに加え
懸濁させた。これにラセミの２−ヒドロキシ−２−トリ
フルオロメチルプロピオン酸エチル２８ｍｇを加えて４
０℃に昇温し、攪拌した。２時間後、反応液の一部を取
って、ＨＰＬＣ〔カラム：スミキラルＯＡ−５０００、
４．６ｍｍφ×１５ｃｍ（住化分析センター社製）〕に
て分析し、生成した２−ヒドロキシ−２−トリフルオロ
メチルプロピオン酸の光学異性体比および転換率を求め
た。結果を表５に示す。

【００３２】参考例１ 実施例２５で使用したアルスロバクターＳＣ−６−９８
−２８株（ＦＥＲＭＰ−１１８５１）由来のエステラー
ゼ遺伝子組換え体微生物は特開平５−５６７８７号公報
記載の方法に準じて作成した。即ち、特開平５−５６７
８７号公報記載実施例の方法に準じてアルスロバクター
ＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ遺伝子を含
むプラスミドｐＡＧＥ−１を調製した。これを制限酵素
ＮｓｐＶ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化することによりエステ
ラーゼの翻訳領域を切り出し、エステラーゼ遺伝子の開
始コドンＧＴＧをＡＴＧに変換するために合成したＤＮ
Ａ断片および、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで
消化したｌａｃプロモータを有する発現ベクターｐＵＣ
１１８（宝酒造株式会社製）とライゲーションを行っ
た。この様にして、ｌａｃプロモーターの下流にアルス
ロバクターＳＣ−６−９８−２８株由来のエステラーゼ
遺伝子を有する大腸菌用発現プラスミドを作成した後、
定法に従い大腸菌ＪＭ１０５株に導入することにより組
換え体微生物を構築した。

【００３３】参考例２ 実施例２６で使用したクロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−
１株由来のエステラーゼ遺伝子組換え体微生物は特開平
７−２１３２８０号公報記載の方法に準じて作成した。
即ち、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４００９）由来のエステラーゼ遺伝子に部位特
異的変異を導入した遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１６
０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを作成し、大腸菌ＪＭ１０
５株に導入することにより組換え微生物を構築した。以
下にプラスミドｐＣＣ１６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍ
の構築方法を示す。 プラスミドｐＣＣ１６０Ａの調製 まず、クロモバクテリウムＳＣ−ＹＭ−１由来の野生型
エステラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＣＣ１０１を特
開平７−２１３２８０号公報記載の実施例１〜５記載の
方法に準じて作成した。同実施例７記載の方法に準じ
て、プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮ
Ａとし、同実施例６記載の方法に準じて作成した特開平
７−２１３２８０号公報記載の配列番号２７で示される
変異プライマ−ＭＹ−１（１００ｐｍｏｌ）および同配
列番号１１で示される変異プライマー１６０Ａ（１００
ｐｍｏｌ）を用いて、GeneAmp PCR Reagent キット（宝
酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片を増幅した。得られ
たＰＣＲ産物（２７０ｂｐＤＮＡ断片）をＳＵＰＲＥＣ
−０２カラム（宝酒造株式会社製）を使用して精製し
た。続いて、同様にプラスミドｐＣＣ１０１（０．５μ
ｇ）を鋳型ＤＮＡとし、同配列番号２６で示される変異
プライマーＲＶ−Ｃ（５０ｐｍｏｌ）および先に精製し
た２７０ｂｐＤＮＡ断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマー
としてGeneAmp PCRReagentキット（宝酒造株式会社製）
によりＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制
限酵素ＣｅｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化し、サンプル
を４％アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒ
ｏｓｅ（宝酒造株式会社製）で電気泳動後、約２４０ｂ
ｐのＤＮＡ断片を分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キ
ット（Ｂｉｏ１０１、Ｉｎｃ製）を用いて精製した。一
方、プラスミドｐＣＣ１０１（３μｇ）を制限酵素Ｃｅ
ｌＩＩＩおよびＣｌａＩで消化後、アルカリフォスファ
ターゼ処理を行った。ついでこのＤＮＡ断片（４.２ｋ
ｂｐ）と先に調製して得られた変異の導入された約２４
０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝
酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方法に従って
大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。このようにして得
られた形質転換体から定法に従いプラスミドｐＣＣ１６
０Ａを調製した後、ダイデオキシ法により変異箇所の塩
基配列を決定し、設計どおりの変異が導入されているこ
とを確認した。 プラスミドｐＣＣ１８９Ｙの調製 ｐＣＣ１６０Ａの調製の場合の用いた変異プライマー１
６０Ａを同実施例６記載の方法に準じて作成した同配列
番号２４で示される変異プライマー１８９Ｙに変更し
て、その他はプラスミドｐＣＣ１６０Ａの調製の場合と
同様にして、プラスミドｐＣＣ１８９Ｙを調製した後、
ダイデオキシ法により変異箇所の塩基配列を決定し、設
計どおりの変異が導入されていることを確認した。 プラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍの調製 プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡと
し、同配列番号３０で示される変異プライマーＭＹ−２
（１００ｐｍｏｌ）および同配列番号２８で示される変
異プライマーＡ３６３ｔｅｒｍ（１００ｐｍｏｌ）を用
いて、GeneAmpPCR Reagent キット（宝酒造株式会社
製）によりＤＮＡ断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物
（１５０ｂｐ断片）をＳＵＰＲＥＣ−０２カラム（宝酒
造株式会社製）を使用して精製した。 続いて、同様に
プラスミドｐＣＣ１０１（０．５μｇ）を鋳型ＤＮＡと
し、同配列番号２９で示される変異プライマーＲＶ−Ｄ
（５０ｐｍｏｌ）および先に精製した１５０ｂｐＤＮＡ
断片（５０ｐｍｏｌ）をプライマーとしてGeneAmp PCR
Reagentキット（宝酒造株式会社製）によりＤＮＡ断片
を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｔＰＩ
およびＸｂａＩで消化し、サンプルを４％アガロースゲ
ル（ＮｕＳｉｅｖｅ３：１Ａｇａｒｏｓｅ（宝酒造社株
式会社製）で電気泳動し、約２８０ｂｐのＤＮＡ断片を
分離し、ジーンクリーンＤＮＡ精製キット（Ｂｉｏ１０
１、Ｉｎｃ製）を用いて精製した。一方、ｐＣＣ１０１
（３μｇ）をＢｓｔＰＩおよびＸｂａＩで消化し、アル
カリフォスファターゼ処理を行った。ついでこの４．２
ｋｂｐのＤＮＡ断片と先に調製して得られた変異の導入
された２８０ｂｐのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーション
キット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の方
法に従って大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。得られ
た形質転換体から定法に従ってプラスミドｐＣＣ３６３
ｔｅｒｍを調製した後、ダイデオキシ法により変異箇所
の塩基配列を決定し、設計どうりの変異が導入されてい
ることを確認した。 多重変異型エステラーゼ生産プラスミドの構築 で得られた変異体プラスミドｐＣＣ１６０Ａ（１０μ
ｇ）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＦｓｐＩで消化して得
た０. ６ｋｂｐのＤＮＡ断片、で得られた変異体プラ
スミドｐＣＣ１８９Ｙ（１０μｇ）をＦｓｐＩおよびＢ
ｓｔＰＩで消化して得た０.４ｋｂｐの断片およびで
得られたプラスミドｐＣＣ３６３ｔｅｒｍ（３μｇ）を
制限酵素ＢｓｔＰＩおよびＥｃｏＲＩで消化して得た
３. ４ｋｂｐのＤＮＡ断片の３種をＤＮＡライゲーショ
ンキット（宝酒造株式会社製）を用いて連結し、通常の
方法に従って大腸菌ＪＭ１０５株に形質転換し、多重変
異型エステラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＣＣ１
６０Ａ１８９Ｙ３６３ｔｅｒｍを含有する形質転換体を
得た。

【００３４】

【表１】

【００３５】

【表２】

【００３６】

【表３】

【００３７】

【表４】

【００３８】

【表５】

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【旧寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所

【旧受託番号】 微工研菌寄第Ｐ−１４００９
号

【新寄託機関の名称】 通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所

【新受託番号】 ＦＥＲＭ ＢＰ−６７０３

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】一般式（１） （式中、Ｒはアルキル基を示し、Ｒ’はアルキル基、ア
   ラルキル基またはアリール基を示し、＊は不斉炭素原子
   であることを示す。）で示される２−ヒドロキシ−２−
   トリフルオロメチル酢酸エステル類を、光学活性体の一
   方を優先的に加水分解する能力を有する酵素を用いて、
   不斉加水分解することを特徴とする一般式（２） （式中、Ｒおよび＊は前記と同じ意味を表わす。）で示
   される光学活性２−ヒドロキシ−２−トリフルオロメチ
   ル酢酸類の製造方法。
2. 【請求項２】前記一般式（１）で示される２−ヒドロキ
   シ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類および一般
   式（２）で示される光学活性２−ヒドロキシ−２−トリ
   フルオロメチル酢酸類において、Ｒが炭素数１〜５のア
   ルキル基である請求項１に記載の製造方法。
3. 【請求項３】前記一般式（１）で示される２−ヒドロキ
   シ−２−トリフルオロメチル酢酸エステル類において、
   Ｒ’が炭素数１〜５のアルキル基である請求項２に記載
   の製造方法。
4. 【請求項４】酵素が微生物起源の酵素、動物起源の酵素
   または植物起源の酵素である請求項１、２または３に記
   載の製造方法。
5. 【請求項５】酵素がアルスロバクター(Arthrobacter)
   属、アスペルギルス(Aspergillus)属、バチルス(Bacill
   us)属、キャンディダ(Candida)属、クロモバクテリウム
   (Chromobacterium)属、フミコーラ(Humicola)属、ムコ
   ール(Mucor)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、リゾ
   プス(Rhizopus)属、ストレプトミセス(Streptomyces)
   属、またはサーマス(Thermus)属の微生物を起源とする
   酵素である請求項１、２または３に記載の製造方法。
6. 【請求項６】酵素がブタ肝臓、ブタ膵臓または牛腎臓を
   起源とする酵素である請求項１、２または３に記載の製
   造方法。
7. 【請求項７】酵素が小麦を起源とする酵素である請求項
   １、２または３に記載の製造方法。