JP2002191393A

JP2002191393A - 光学活性カルボン酸及びその対掌体エステルの製造方法

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Publication number: JP2002191393A
Application number: JP2000398589A
Authority: JP
Inventors: Akira Shimizu; 昌清水; Michihiko Kataoka; 道彦片岡
Original assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Rayon Co Ltd
Priority date: 2000-12-27
Filing date: 2000-12-27
Publication date: 2002-07-09
Anticipated expiration: 2020-12-27
Also published as: JP4658315B2

Abstract

(57)【要約】【課題】光学活性カルボン酸及びその対掌体エステル
の効率のよい製造法を提供する。【解決手段】ラセミ体カルボン酸エステルにアシネト
バクター属細菌を接触させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、医薬等の原料又は
中間体として有用な光学活性カルボン酸の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】一般式（II）

【化３】で表される光学活性カルボン酸の製造方法としては、特
開平07-32769号公報、特開平08-000285号公報、特開平0
8-259500号公報、特開平10-033191号公報および特開平1
1-080113号公報に記載のとおり、数属の微生物由来の菌
体あるいは酵素を用いて合成する方法が報告されてい
る。しかし、これらの方法で使用されている生体触媒
は、いずれもその種類が限定されており、一般的な方法
とは言い難い。

【０００３】一方、J. Chem. Soc., Chem.Commun.,108
0,（1987）でEryka Guibe-Jampelらは豚膵臓リパーゼを
もちい、α−メチルコハク酸−１−モノエステルを得る
方法が報告している。しかしながら、この方法で得られ
るモノエステルの光学純度、位置選択性は高いものの、
高価な動物由来の酵素を使用するため、工業的に有利な
方法とは言い難い。

【０００４】また、特開平２−１９５８９０号公報には
微生物由来の酵素を用いてα−メチルコハク酸ジエステ
ルを加水分解し、α−メチルコハク酸−４−モノエステ
ルを得る方法が記載されている。この方法では４−モノ
エステルが９５〜９８％と位置選択性は高いものの、立
体選択的な加水分解は殆ど達成されておらず、ラセミ体
ジエステルを原料とした場合、生成物の光学純度は16%
e.e.程度にすぎないという問題がある。さらに、 Chem.
Pharm. Bull. 41(6),1149 (1993)でT.Morimotoらは、
イタコン酸又はイタコン酸ジメチルを不斉還元し、光学
活性α−メチルコハク酸又は光学活性α−メチルコハク
酸ジメチルを得る方法も報告しているが、高価な不斉触
媒を使用しなければならないため、工業的に有利な方法
とは言い難い。

【０００５】さらに、光学活性β−ヒドロキシカルボン
酸の製造法としては、化学的又は微生物的方法としてβ
−ケト酸エステルの不斉還元法、光学分割法、１，３−
ジオールの酸化法、脂肪酸のβ−水酸化法、直接発酵法
等が報告されている。この中で、微生物の代謝経路を利
用した各種光学活性β−ヒドロキシカルボン酸の生産
が、工業的規模で実施されている（特公昭５９−２１５
９９号公報、特公昭５９−２１６００号公報、特公昭６
０−１６２３５号公報、特公昭６１−１２６７６号公報
等）。これらの微生物の代謝経路を利用した方法は、各
種脂肪酸、アルコールを原料として使用し、脂肪酸の主
代謝経路であるβ−酸化酵素系や、類縁の分岐状アミノ
酸代謝経路と共通すると思われる酵素系を利用するもの
である。

【０００６】また、J. Am. Chem. Soc.,111, 6354（198
9）には、２−アシルアミノ酸の光学分割には有効であ
るアシラーゼが３−アシルアミノイソ酪酸の光学分割に
は適用することができないことが報告されている。光学
活性３−アミノイソ酪酸の製造方法として、特開昭59-6
7252号公報記載の光学活性３−ヒドロキシイソ酪酸を出
発原料とする方法が公知であるが、工業的に有利な方法
とは言い難い。

【０００７】以上のように一般式（Ｉ）および（II）で
示される光学活性体の製造はその方法あるいは種類が限
定されており、アシネトバクター（Acinetobacter）属
由来の微生物の菌体あるいは酵素により製造するという
報告はない。従って、有効で且つ一般的な合成方法の開
発が望まれていた。

【０００８】

【発明が解決しようとする手段】本発明の課題は、光学
活性医農薬合成中間体として有用な光学活性カルボン酸
およびその対掌体エステルの一般的且つ工業的に有利な
製造方法を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ラセミ体カルボン酸
エステルを光学選択的に加水分解する活性を有する微生
物を新たに見い出し、本発明を完成した。すなわち、本
発明は、一般式（Ｉ）

【化４】 [式中、Ｒ₁は置換又は非置換のアルキル基、アルケニル
基、アラルキル基、アシル基、アミノ基、アミノアシル
基、水酸基、ニトリル基、ニトロ基、アルコキシル基、
水素原子、-ＣＯＯＲ'₃、（Ｒ'₃は置換又は非置換の炭
素原子数１〜６のアルキル基を示す）を示し、Ｒ₂は置
換又は非置換の炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、
Ｒ₃は置換又は非置換の炭素原子数１〜６のアルキル基
を示し、ｎ＝１〜３の整数を示す]で表されるラセミ体
カルボン酸エステルに、アシネトバクター（Acinetobac
ter）属に属し、且つ該エステル結合を不斉加水分解す
る能力を有する微生物菌体、菌体培養液、菌体処理物あ
るいはこれら微生物により生産される酵素を作用させる
ことを特徴とする下記一般式（II）；

【化５】（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびｎは前記と同義であり、＊は不
斉炭素を示す）で示される光学活性カルボン酸及びその
未反応対掌体エステルの製造方法である。また、本発
明はアシネトバクター（Acinetobacter）属由来の不斉
加水分解酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え体微生物を
用いることを特徴とする一般式（II）で示される光学活
性カルボン酸及びその未反応対掌体エステルの製造方
法、である。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において反応基質として使用可能な化合物は一般
式（Ｉ）に示される化合物が挙げられる。

【００１１】一般式(Ｉ) において、Ｒ₁は置換又は非
置換のアルキル基、アルケニル基、アラルキル基、アシ
ル基、アミノ基、アミノアシル基、水酸基、ニトリル
基、ニトロ基、アルコキシル基、水素原子、-ＣＯＯＲ'
₃、（Ｒ'₃は置換又は非置換の炭素原子数１〜６のアル
キル基を示す）を示し、具体的には、メチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチ
ル基、n-ヘキシル基等の炭素原子数１〜６のアルキル
基；エテン基、プロペン基、イソプロペン基、ブテン
基、イソブテン基、ｎ−ヘキセン基等の炭素原子数２〜
6のアルケニル基；ベンジル基などのアラルキル基；ア
セチル基、プロピオニル基等のアシル基；メトキシ基、
エトキシ基等のアルコキシル基等が例示される。

【００１２】また、一般式(Ｉ) 中、Ｒ1が-ＣＯＯＲ'₃
で示される場合において、Ｒ'3は置換又は非置換の炭
素原子数１〜６のアルキル基を示し、具体的にはメチル
基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル
基、イソブチル基、n-ヘキシル基等が挙げられる。さら
に、一般式(Ｉ) において、Ｒ₂は置換又は非置換のア
ルキル基を示し、具体的には、メチル基、エチル基、プ
ロピル基等が挙げられる。また、Ｒ3は置換又は非置換
のアルキル基を示し、具体的には、Ｒ₂のメチル基、エ
チル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソ
ブチル基、n-ヘキシル基等が挙げられる。これらのＲ₂
およびＲ₃で示される置換基は、その炭素原子に結合す
る水素原子がハロゲン等の置換基で置換されていてもよ
い。

【００１３】本発明で用いる微生物は、アシネトバクタ
ー（Acinetobacter）属に属し、且つ一般式（Ｉ）で表
されるラセミ体カルボン酸エステルのエステル結合を不
斉加水分解する能力を有するものであればいかなるもの
でも使用可能であり、特に制限はないが、代表的なもの
として例えば、Acinetobacter calcoaceticus F46 (AKU
724)株等が例示される。本株は公知であり、京都大学
農学部（ＡＫＵ）などの微生物保存機関から入手でき
る。

【００１４】また、これらの微生物から単離した酵素遺
伝子を通常の方法で公知の各種宿主ベクター系に導入し
た遺伝子操作微生物の利用も可能である。これら遺伝子
操作微生物に特に制限はなく、Acinetobacter属由来で
且つ一般式（Ｉ）で表されるラセミ体カルボン酸エステ
ルのエステル結合を不斉加水分解できる酵素遺伝子が発
現されたものであれば、いかなる各種宿主ベクター系で
も構わない。

【００１５】本発明においてこれらの微生物を培養する
ための培地としては、通常これらの微生物が生育し得る
ものであれば何れのものでも使用できる。炭素源として
は、例えば、グルコース、シュークロースやマルトース
等の糖類、酢酸、クエン酸やフマル酸等の有機酸あるい
はその塩、エタノールやグリセロール等のアルコール類
等を使用できる。窒素源としては、例えば、ペプトン、
肉エキス、酵母エキスやアミノ酸等の一般天然窒素源の
他、各種無機、有機酸アンモニウム塩等が使用できる。
その他、無機塩、微量金属塩、ビタミン等が必要に応じ
て適宜添加される。また、高い酵素活性を得るために、
一般式（Ｉ）で示されるカルボン酸エステル、エステル
結合あるいはアミド結合を持つ化合物等を酵素産生の誘
導物質として培地に添加することも有効である。その培
養は常法に従って行えばよく、例えば、ｐＨ４〜１０、
温度１５〜４０℃の範囲にて好気的に６〜９６時間培養
する。

【００１６】不斉加水分解反応を行うに際しては、該微
生物を培地中で培養して得られる培養物をそのままか、
又は該培養物から遠心分離などの集菌操作によって得ら
れる培養上清、菌体、若しくは菌体処理物の存在下で一
般式（Ｉ）に示されるラセミ体カルボン酸エステルを不
斉加水分解することにより光学活性カルボン酸及びその
対掌体エステル加水分解物及びその未反応対掌体を製造
することもできる。菌体処理物としては、アセトン、ト
ルエン等で処理した菌体、菌体の破砕物、菌体を破砕し
た無細胞抽出物などが挙げられる。また、これらを通常
の方法で固定化したものも含まれる。

【００１７】さらに、微生物菌体、菌体培養液および菌
体処理物のみならず、これら微生物により生産される酵
素を用いることができる。本発明において使用できる酵
素は、一般式（Ｉ）に示されるラセミ体カルボン酸エス
テルを不斉加水分解して光学活性カルボン酸及びその対
掌体エステルを製造する能力を有するアシネトバクター
（Acinetobacter）属微生物から分離されたものであれ
ば種類及び製造源は問わない。その中でも一般にリパー
ゼ類、エステラーゼ類、プロテアーゼ類およびアミダー
ゼ類と称される酵素が特に有効であり、粗酵素又は精製
酵素を使用することができる。

【００１８】上記不斉加水分解酵素を反応に供するに際
しては、該酵素が活性を示す限りその使用形態は特に限
定されず、酵素を適当な担体に固定化して使用すること
もできる。酵素を固定化して用いることにより、反応終
了後の光学活性カルボン酸及びその対掌体エステル加水
分解物及びその未反応対掌体並びに酵素の分離・回収が
容易になるとともに、酵素の再利用も可能となる。本発
明においては、これら酵素、酵素固定化物、微生物、菌
体培養液、または菌体処理物を通常１種類用いるが、同
様な能力を有する２種以上のそれを混合して用いること
も可能である。

【００１９】本発明において、一般式（Ｉ）で示される
カルボン酸エステルの光学選択的加水分解は、以下の方
法で行うことができる。反応溶媒に基質である一般式
（Ｉ）で示されるカルボン酸エステルを溶解もしくは懸
濁する。また、基質を反応溶媒に添加する前に又は添加
した後に触媒となる上記不斉加水分解する能力を有する
酵素、酵素固定化物、微生物、菌体培養液、または菌体
処理物を添加する。そして、反応温度、必要により反応
液のpHを制御しながら、一般式（Ｉ）で示されるカルボ
ン酸エステルの半量程度が加水分解されるまで反応を行
う。場合によっては反応の初期段階で反応を中断した
り、又は過剰に反応させることもある。反応液の基質濃
度は、0.1〜80質量％の間で特に制限はないが、生産性
等を考慮すると１〜50質量％の濃度で実施するのが好ま
しい。反応液の酵素濃度は、通常、0.01〜10質量％であ
り、好ましくは 0.05〜５重量％である。反応液のpHは
用いる酵素の至適pHに依存するが、一般的にはpH４〜11
の範囲である。化学的加水分解反応による光学純度の低
下及び収率の低下を抑えることができるという点でpH５
〜９で行うのが好ましい。また、エステル結合部分が不
斉加水分解される場合は反応が進行するに従いpHが低下
してくるが、この場合は適当な中和剤、例えば、水酸化
ナトリウム、水酸化カリウム水溶液等を添加して最適pH
に調整することが望ましい。反応温度は５〜70℃が好ま
しく、10〜50℃がより好ましい。

【００２０】反応溶媒は、通常イオン交換水、緩衝液等
の水性媒体を使用するが、有機溶媒を含んだ系でも反応
を行うことができる。有機溶媒としては、例えば、メタ
ノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノー
ル、ブタノール、イソブタノール、t-ブチルアルコー
ル、t-アミルアルコール等のアルコール系溶媒、ペンタ
ン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族炭化水素
系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化
水素系溶媒、塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭
素、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素系溶媒、ジ
エチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒド
ロフラン、ジオキサン等のエーテル系溶媒、酢酸エチ
ル、酢酸プロピル、酢酸ブチル等のエステル系溶媒、ア
セトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン
等のケトン系溶媒、その他アセトニトリル、N,N-ジメチ
ルホルムアミド等を適宜使用できる。また、これらの有
機溶媒を水への溶解度以上に加えて２層系で反応を行う
ことも可能である。有機溶媒を反応系に共存させること
で、選択率、変換率、収率などが向上する場合もある。
反応時間は、通常、１時間〜１週間、好ましくは１〜72
時間であり、そのような時間で反応が終了する反応条件
を選択することが好ましい。

【００２１】尚、以上のような基質濃度、酵素濃度、p
H、温度、溶媒、反応時間及びその他の反応条件はその
条件における反応収率、光学収率等を考慮して目的とす
る光学活性化合物が最も多く採取できる条件を適宜選択
することが望ましい。

【００２２】かくして、上記の反応により、一般式
（Ｉ）で示されるカルボン酸エステルが不斉加水分解さ
れて、光学活性カルボン酸及びその対掌体エステル加水
分解物が生成する。生成した光学活性カルボン酸及びそ
の対掌体エステル加水分解物および未反応対掌体の反応
混合液からの単離は抽出、蒸留、カラム分離など通常の
公知の単離法で行うことができる。生成した光学活性カ
ルボン酸及びその未反応対掌体エステルの分離は、例え
ば、ｐＨを中性付近に調整後、ジエチルエーテル、ジイ
ソプロピルエーテル等のエーテル類；酢酸エチル等のエ
ステル類；ヘキサン、オクタン、ベンゼン、トルエン等
の炭化水素類；塩化メチレン等のハロゲン化炭化水素等
一般的な溶媒により未反応対掌体を抽出分離することが
できる。一方、生成した光学活性カルボン酸は抽出後の
水層のｐＨを下げた後、前述の有機溶媒を適宜選択し、
抽出すれば回収できる。

【００２３】さらに、未反応対掌体エステルは、光学活
性を維持したまま公知の方法で加水分解することにがで
き、また、反対に光学活性カルボン酸は光学活性を維持
したまま通常の方法でエステル化することができる。従
って、目的に応じて任意の立体配置を持ったエステルあ
るいはカルボン酸を取得することができる。さらに、前
述の方法で再びエステル化された光学活性カルボン酸
は、同酵素の基質として反応を複数回繰り返すことで、
より光学純度の高い目的化合物を得ることが可能であ
る。また、同様に光学選択性の異なる（逆の）酵素を任
意に組み合わせて反応を繰り返すことで光学純度が高い
目的化合物を得ることも可能である。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
るが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

【００２５】〔実施例１〕ＬＢ培地（ペプトン10g、酵
母エキス 5g、食塩 5g、蒸留水１Ｌ）100mlでAcineto
bacter calcoaceticus F46(AKU 724)株を30℃、48時間
培養した。遠心分離で集菌、洗浄後、50mMリン酸バッフ
ァー(pH7.0)5mlに懸濁し、菌体濃縮液とした。90mlの50
mMリン酸バッファー(pH7.0)にラセミ体メチルコハク酸
ジメチル 5gを懸濁し、上記菌体濃縮液を加え、室温で
約20時間反応した。反応終了液を酢酸エチルで抽出、濃
縮し、未反応のエステルを回収した。未反応メチルコハ
ク酸ジメチルの光学純度を測定したところ、Ｓ体50％ee
であった。なお、光学純度分析はダイセル化学株式会社
製キラルセルＯＤカラム（移動層ヘキサン/イソプロパ
ノール/トリフロロ酢酸＝90/10/0.1）にて分析した。

【００２６】〔実施例２〕実施例１同様にAcinetobacte
r calcoaceticus F46 (AKU 724)菌体濃縮液を調製し、
原料をβ-ヒドロキシイソ酪酸メチルに代え、酵素反応
を行った。反応終了液を酢酸エチルで抽出し、未反応の
エステルを回収した。抽出液を濃縮後、未反応β-ヒド
ロキシイソ酪酸メチルの比旋光度を測定したところ、
[α]²⁵ _D＝＋10.2（C=2、メタノール）であった。

【００２７】〔実施例３〕実施例１同様にAcinetobacte
r calcoaceticus F46(AKU 724)菌体濃縮液を調製し、原
料をα−メチルグルタル酸ジメチルに代え、酵素反応を
行った。反応終了液を酢酸エチルで抽出し、未反応のエ
ステルを回収した。抽出液を濃縮後、未反応α−メチル
グルタル酸ジメチルの光学純度を測定したところ、Ｓ体
60％eeであった。なお光学純度分析は特開平08-000285
号記載の方法に従い分析した。

【００２８】〔実施例４〕実施例１同様にAcinetobacte
r calcoaceticus F46 (AKU 724)菌体濃縮液を調製し、
原料をβ−シアノイソ酪酸メチルに代え、酵素反応を行
った。反応終了液を酢酸エチルで抽出し、未反応のエス
テルを回収した。抽出液を濃縮後、未反応β−シアノイ
ソ酪酸メチルの光学純度を測定したところ、Ｓ体53％ee
であった。なお光学純度分析はダイセル化学株式会社製
キラルセルＯＤカラム（移動層ヘキサン/イソプロパノ
ール/トリフロロ酢酸＝90/10/0.1）にて分析した。

【００２９】〔実施例５〕実施例１同様にAcinetobacte
r calcoaceticus F46 (AKU 724)菌体濃縮液を調製し、
原料を３−アセチルアミノイソ酪酸メチルに代え、酵素
反応を行った。反応終了液を酢酸エチルで抽出し、未反
応のエステルを回収した。抽出液を濃縮後、未反応３−
アセチルアミノイソ酪酸メチルの比旋光度を測定したと
ころ、d(+)体73％e.e.であった。なお光学純度分析は特
開平10-033191号記載の方法に従い分析した。

【００３０】〔参考例１〕ペプトン0.5％、酵母エキス
0.5％、K2PO4 0.1％、フルオレン 0.01％を含む培地５
ＬでAcinetobacter calcoaceticus F46(AKU 724)株を28
℃、３日間培養した。遠心分離で集菌後、10mMリン酸バ
ッファー(pH7.0)110mlに懸濁させ、超音波破砕した。破
砕液を遠心分離で不溶物を除去し、無細胞抽出液とし
た。この無細胞抽出液から硫酸アンモニウム40〜80％飽
和画分を遠心分離にて回収した。沈殿を35mlの同バッフ
ァーに溶解させ透析後、ＤＥＡＥ-Ｓｅｐｈａｃｅｌカ
ラム（1.7×26cm）に供し、NaClの０→0.6Mのリニアー
グラジェントで溶出させた。活性画分をまとめて、NaCl
を4Mになるよう加えて、Ｐｈｅｎｙｌ-Ｓｕｐｅｒｏｓ
ｅＨＲ10/10カラムに供した。 NaClの４→０Ｍのリニア
ーグラジェントで溶出させた。活性画分をまとめて限外
ろ過により濃縮し、さらにゲルろ過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ
２００ＨＲ１０/３０カラム）による精製を実施し、精
製酵素溶液とした。なお、酵素活性は50mMリン酸バッフ
ァー(pH7.0)20mlにβ−アセチルチオイソ酪酸メチル50m
M相当量を加え、酵素溶液を適当量を添加し、30℃で反
応させた。反応中、0.05Ｎ苛性ソーダで滴定し、初期10
分間の加水分解速度より算出した。

【００３１】〔実施例７〜10〕9.5mlの100mMリン酸バッ
ファー(pH7.0)に表１に示すラセミ体原料0.5gを懸濁
し、参考例により得られた精製酵素溶液0.2mlを加え、
室温で約10時間反応した。反応終了液を酢酸エチルで抽
出、濃縮し、未反応のエステルを回収した。各化合物は
実施例１〜５と同様に処理し、光学純度を測定した。そ
の結果を表１に示した。

【表１】

【００３２】〔参考例２〕参考例１で取得した精製酵素
を公知の方法でＮ末端およびＣ末端のアミノ酸配列を解
析した。その結果より、図１に示すディジェネレートプ
ライマー（配列番号１及び２）を設計し、 Acinetobact
er calcoaceticus F46 (AKU 724)株より調製した染色体
ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ（宝酒造；Ex Tap）にて目的
遺伝子を増幅させた。配列番号１：gtigayatht tytayaarga ytgg 配列番号２：arrtcyttrt tnatigtytc igcytg 得られた部分断片をプローブとしてXbaＩにて処理した
染色体ＤＮＡにサザンハイブリダイゼーションを行っ
た。アガロース電気泳動にてシグナルの得られたＤＮＡ
断片を回収し、プラスミドベクターpBluescript SK+に
ライゲーションした。これをエセリキア・コリ（Escher
ichia coli)ＤＨ５αに形質転換し、コロニーハイブリ
ダイゼーションによりポジティブクローンのスクリーニ
ングを行った。得られたポジティブクローンよりプラス
ミドを回収し、デリューションミュータントを作成した
後、シーケンス解析により、目的遺伝子の全長を含む5.
7kbのＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片をプラス
ミドpKK223-3のtacプロモーターの下流につなぎ、発現
用プラスミドpDCH21を作成した。これを大腸菌JM109株
に形質転換した。

【００３３】〔実施例11〜14〕1mM IPTG（イソプロピル
-β-D-チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地 100ml
で参考例２で作成した組換え大腸菌を37℃、18時間培養
した。遠心分離で集菌、洗浄後、50mMリン酸バッファー
(pH7.0)5mlに懸濁し、菌体濃縮液とした。90mlの50mMリ
ン酸バッファー(pH7.0)に表２に示すラセミ体原料 5gを
懸濁し、上記菌体濃縮液を加え、室温で約20時間反応し
た。この間、反応液のｐＨは、１０％ＮａＯＨ水溶液を
用いて7.0に調整した。反応終了液を酢酸エチルで抽
出、濃縮し、未反応のエステルを回収した。各化合物は
実施例２〜５と同様に処理し、光学純度を測定した。そ
の結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】〔実施例15〕実施例14と同様にラセミ体メ
チルコハク酸ジメチルを反応した。反応終了液を酢酸エ
チルで抽出、濃縮し、未反応のエステルを回収した。未
反応メチルコハク酸ジメチルの光学純度を測定したとこ
ろ、Ｓ体99％eeであった。次いで水層のpHを希硫酸で2.
0に下げた後、水相中のカルボン酸分を酢酸エチルで抽
出した。溶媒を蒸発除去し、光学活性α−メチルコハク
酸−４−モノエステルを得た。これをメタノール／硫酸
でエステル化し、光学分割カラム（キラルセルＯＤ、ダ
イセル化学工業（株）社製）を用いて光学純度を測定し
たところ、（Ｒ）体で95％eeであった。また、¹Ｈ−Ｎ
ＭＲより、得られたモノエステルは４−エステルのみ
で、１−エステルの混在は認められなかった。

【００３６】

【発明の効果】本発明によれば、医薬、農薬等の原料又
は合成中間体として有用な光学活性カルボン酸及びその
対掌体エステル類を酵素反応により効率よく製造するこ
とが可能である。

【００３７】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Rayon Co., LTD <120> The method of producing optically active carboxylic acid <130> P1206723000 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 1 gtigayatht tytayaarga ytgg 24 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic DNA <400> 2 arrtcyttrt tdatigtytc igcytg 26

【００３８】

【配列表フリーテキスト】配列番号１：合成 DNA 配列番号２：合成 DNA

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）【化１】 [式中、Ｒ₁は置換又は非置換のアルキル基、アルケニル
基、アラルキル基、アシル基、アミノ基、アミノアシル
基、水酸基、ニトリル基、ニトロ基、アルコキシル基、
水素原子、-ＣＯＯＲ'₃、（Ｒ'₃は置換又は非置換の炭
素原子数１〜６のアルキル基を示す）を示し、Ｒ₂は置
換又は非置換の炭素原子数１〜３のアルキル基を示し、
Ｒ₃は置換又は非置換の炭素原子数１〜６のアルキル基
を示し、ｎ＝１〜３の整数を示す]で表されるラセミ体
カルボン酸エステルに、アシネトバクター（Acinetobac
ter）属に属し、且つ該エステル結合を不斉加水分解能
を有する微生物菌体、菌体培養液、菌体処理物又は該微
生物により生産される酵素を作用させることを特徴とす
る下記一般式（II）；【化２】（式中、Ｒ₁、Ｒ₂およびｎは前記と同義であり、＊は不
斉炭素を示す）で示される光学活性カルボン酸及びその
未反応対掌体エステルの製造方法。
【請求項２】不斉加水分解能を有する微生物が、アシ
ネトバクター（Acinetobacter）属由来の不斉加水分解
酵素遺伝子を導入した遺伝子組換え体微生物である請求
項１記載の光学活性カルボン酸及びその未反応対掌体エ
ステルの製造方法。
【請求項３】一般式（Ｉ）及び（II）に示すＲ₁が-Ｃ
ＯＯＲ'₃である請求項１又は２記載の光学活性カルボン
酸及びその未反応対掌体エステルの製造方法。
【請求項４】一般式（Ｉ）及び（II）に示すＲ₁が水
酸基である請求項１又は２記載の光学活性カルボン酸及
びその未反応対掌体エステルの製造方法。
【請求項５】一般式（Ｉ）及び（II）に示すＲ₁がア
ミノアシル基である請求項１又は２記載の光学活性カル
ボン酸及びその未反応対掌体エステルの製造方法。
【請求項６】一般式（Ｉ）及び（II）に示すＲ₁がニ
トリル基であること請求項１又は２記載の光学活性カル
ボン酸及びその未反応対掌体エステルの製造方法。