JPH09107959A - リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法 - Google Patents
リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法Info
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- JPH09107959A JPH09107959A JP7268269A JP26826995A JPH09107959A JP H09107959 A JPH09107959 A JP H09107959A JP 7268269 A JP7268269 A JP 7268269A JP 26826995 A JP26826995 A JP 26826995A JP H09107959 A JPH09107959 A JP H09107959A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 保存安定性に優れ、かつ比活性の高いリンゴ
酸脱水素酵素を提供する。 【解決手段】 以下の理化学的性質を有するリンゴ酸脱
水素酵素。 １）作用 下記の反応を触媒する、 【化１】 ２）基質特異性 オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×
１０-5Ｍである、３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適
ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定である、
４）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグ
ラフィーによる測定で７２，０００である、５）保存安
定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、
室温（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残
存活性を有する、６）熱安定性 １００ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃で１５分間の処理で失
活は見られない、７）比活性 オキザロ酢酸還元反応に
おいて、１０００Ｕ／ｍｇ以上である。
酸脱水素酵素を提供する。 【解決手段】 以下の理化学的性質を有するリンゴ酸脱
水素酵素。 １）作用 下記の反応を触媒する、 【化１】 ２）基質特異性 オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×
１０-5Ｍである、３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適
ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定である、
４）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグ
ラフィーによる測定で７２，０００である、５）保存安
定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、
室温（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残
存活性を有する、６）熱安定性 １００ｍＭのトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃で１５分間の処理で失
活は見られない、７）比活性 オキザロ酢酸還元反応に
おいて、１０００Ｕ／ｍｇ以上である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はリンゴ酸脱水素酵素
及びその製造方法に関するものである。
及びその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】リンゴ酸脱水素酵素は、オキザロ酢酸の
定量に使用されており、また、臨床検査試薬の分野にお
いては、現在リンゴ酸脱水素酵素を用いたＧＯＴ（グル
タミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の測定
が肝機能の診断に利用されている。
定量に使用されており、また、臨床検査試薬の分野にお
いては、現在リンゴ酸脱水素酵素を用いたＧＯＴ（グル
タミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の測定
が肝機能の診断に利用されている。
【０００３】従来、リンゴ酸脱水素酵素としては、ウシ
やブタ等の臓器由来のものと、シュードモナス・テスト
ステロニ（Pseudomonas testosteroni）〔ジャーナル
オブバクテリオロジー（J. of Bacteriol.） 123, 704
(1975) 〕、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis
）〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（J. of Bac
teriol.） 240, 1118(1965)〕、プロピオニバクテリウ
ム・シェルマーニ（Propionibacterium schermanii）
〔フェデレーション プロシーディング（Federation P
roceeding ）33, 1490(1974)〕、エシェリキア・コリ
（Escherichia coli）〔ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.） 242,1548(196
7)〕、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa
）〔アーキブバイオケミストリー バイオフィジック
ス（Arch. Biochem. Biophys. ）109, 466(1965)〕、サ
ーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（特
開昭５５−９９１８８号公報）等の微生物由来のものが
知られている。
やブタ等の臓器由来のものと、シュードモナス・テスト
ステロニ（Pseudomonas testosteroni）〔ジャーナル
オブバクテリオロジー（J. of Bacteriol.） 123, 704
(1975) 〕、バチルス・サチルス（Bacillus subtilis
）〔ジャーナル オブ バクテリオロジー（J. of Bac
teriol.） 240, 1118(1965)〕、プロピオニバクテリウ
ム・シェルマーニ（Propionibacterium schermanii）
〔フェデレーション プロシーディング（Federation P
roceeding ）33, 1490(1974)〕、エシェリキア・コリ
（Escherichia coli）〔ジャーナル オブ バイオロジ
カル ケミストリー（J. Biol. Chem.） 242,1548(196
7)〕、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa
）〔アーキブバイオケミストリー バイオフィジック
ス（Arch. Biochem. Biophys. ）109, 466(1965)〕、サ
ーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）（特
開昭５５−９９１８８号公報）等の微生物由来のものが
知られている。
【０００４】しかし、ブタやウシ等の高等動物の臓器由
来のリンゴ酸脱水素酵素は、比活性においては満足でき
るもの、その保存安定性において十分満足できるもので
はなく、特に近年の臨床検査試薬の液状試薬への移行に
対応できるだけの保存安定性を備えていないという欠点
があった。また、高等動物の臓器を材料としているた
め、原材料の確保、大量精製の困難さ等にも問題点を有
していた。
来のリンゴ酸脱水素酵素は、比活性においては満足でき
るもの、その保存安定性において十分満足できるもので
はなく、特に近年の臨床検査試薬の液状試薬への移行に
対応できるだけの保存安定性を備えていないという欠点
があった。また、高等動物の臓器を材料としているた
め、原材料の確保、大量精製の困難さ等にも問題点を有
していた。
【０００５】また、微生物由来のリンゴ酸脱水素酵素
は、原材料の確保や大量精製が容易であり、さらに、例
えばサーマス・サーモフィラス由来の酵素は非常に保存
安定性に優れていることが報告されている（特開昭５５
−９９１８８号公報）が、その比活性は精製酵素標品で
あってもせいぜい数十Ｕ／ｍｇ蛋白質程度であるため、
これらの酵素を臨床検査試薬に組み込む場合、添加する
酵素量が多くなり、この結果、測定結果が酵素中に含ま
れる夾雑蛋白質の影響を受け易くなるという問題点があ
った。
は、原材料の確保や大量精製が容易であり、さらに、例
えばサーマス・サーモフィラス由来の酵素は非常に保存
安定性に優れていることが報告されている（特開昭５５
−９９１８８号公報）が、その比活性は精製酵素標品で
あってもせいぜい数十Ｕ／ｍｇ蛋白質程度であるため、
これらの酵素を臨床検査試薬に組み込む場合、添加する
酵素量が多くなり、この結果、測定結果が酵素中に含ま
れる夾雑蛋白質の影響を受け易くなるという問題点があ
った。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、保存安定性
に優れ、かつ比活性の高いリンゴ酸脱水素酵素及びその
製造方法を提供することを目的とするものである。
に優れ、かつ比活性の高いリンゴ酸脱水素酵素及びその
製造方法を提供することを目的とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、このよう
なリンゴ酸脱水素酵素を求めて多数の微生物を対象に鋭
意研究した結果、従来見いだされていなかったストレプ
トマイセス属に属する放線菌に上記の性能を有するリン
ゴ酸脱水素酵素が存在するということを見出し、本発明
を完成するに至った。
なリンゴ酸脱水素酵素を求めて多数の微生物を対象に鋭
意研究した結果、従来見いだされていなかったストレプ
トマイセス属に属する放線菌に上記の性能を有するリン
ゴ酸脱水素酵素が存在するということを見出し、本発明
を完成するに至った。
【０００８】すなわち、第１の発明は、以下の理化学的
性質を有するリンゴ酸脱水素酵素を要旨とするものであ
る。
性質を有するリンゴ酸脱水素酵素を要旨とするものであ
る。
【０００９】１）作用 次の反応を触媒する。
【００１０】
【化２】
【００１１】２）基質特異性 オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×１０-5Ｍである。
【００１２】３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定であ
る。
る。
【００１３】４）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによ
る測定で７２，０００である。
る測定で７２，０００である。
【００１４】５）保存安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、室温
（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残存活
性を有する。
（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残存活
性を有する。
【００１５】６）熱安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃
で１５分間の処理で失活は見られない。
で１５分間の処理で失活は見られない。
【００１６】７）比活性 オキザロ酢酸還元反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白
質以上である。
質以上である。
【００１７】また、第２の発明は、ストレプトマイセス
属に属する微生物又はその変異株を培養し、培養物から
リンゴ酸脱水素酵素を採取することを特徴とする上記の
リンゴ酸脱水素酵素の製造方法を要旨とするものであ
る。
属に属する微生物又はその変異株を培養し、培養物から
リンゴ酸脱水素酵素を採取することを特徴とする上記の
リンゴ酸脱水素酵素の製造方法を要旨とするものであ
る。
【００１８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
まず、本発明のリンゴ酸脱水素酵素の理化学的性質を示
す。
まず、本発明のリンゴ酸脱水素酵素の理化学的性質を示
す。
【００１９】（１）作用 下記の反応を触媒する。
【００２０】
【化３】
【００２１】（２）基質特異性 ０．５〜２０×１０-5Ｍのオキザロ酢酸を含む９５ｍＭ
のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最終濃度が１Ｕ／
ミリリットルとなるように酵素を加えて３０℃で反応さ
せて反応速度を求め、Lineweaver-Burk プロットを作成
した。この結果、オキザロ酢酸に対するＫｍ値は２．７
×１０-5Ｍであった。
のトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最終濃度が１Ｕ／
ミリリットルとなるように酵素を加えて３０℃で反応さ
せて反応速度を求め、Lineweaver-Burk プロットを作成
した。この結果、オキザロ酢酸に対するＫｍ値は２．７
×１０-5Ｍであった。
【００２２】また、０．５〜２０×１０-5ＭのＮＡＤＨ
を含む９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最
終濃度が１Ｕ／ミリリットルとなるように酵素を加えて
３０℃で反応させて反応速度を求め、Lineweaver-Burk
プロットを作成した。この結果、ＮＡＤＨに対するＫｍ
値は１．４×１０-5Ｍであった。
を含む９５ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に、最
終濃度が１Ｕ／ミリリットルとなるように酵素を加えて
３０℃で反応させて反応速度を求め、Lineweaver-Burk
プロットを作成した。この結果、ＮＡＤＨに対するＫｍ
値は１．４×１０-5Ｍであった。
【００２３】（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 ０．５ｍＭのオキザロ酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨ
からなるアッセイミクスチャーを基質とし、各ｐＨの１
００ｍＭの緩衝液中で３０℃で５分間反応させた結果、
図１に示すとおり、至適ｐＨは８〜９であった。また、
各ｐＨの１００ｍＭの緩衝液中で４℃で２４時間放置し
た後の残存活性を測定した結果、図２に示すとおり、ｐ
Ｈ７〜１１で優れた安定性を示し、ｐＨ９付近で最も安
定であった。なお、緩衝液としては、ｐＨ４〜６は酢酸
緩衝液、ｐＨ６〜８は燐酸緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１はグリシン緩衝液を用
いた。また、本発明においてリンゴ酸脱水素酵素の活性
は、以下の方法により測定した。０．５ｍＭのオキザロ
酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含む９５ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）１ミリリットルに１０マイク
ロリットルの酵素溶液を加えて３０℃で５分間反応さ
せ、この間の３４０ｎｍの吸光度の減少値を測定した。
１分間当たりの吸光度の減少値をΔＡ340 とし、次式に
より活性値を算出した。なお、本発明において１Ｕと
は、１分間に１μＭのＮＡＤＨをＮＡＤに変換する酵素
量をいう。
からなるアッセイミクスチャーを基質とし、各ｐＨの１
００ｍＭの緩衝液中で３０℃で５分間反応させた結果、
図１に示すとおり、至適ｐＨは８〜９であった。また、
各ｐＨの１００ｍＭの緩衝液中で４℃で２４時間放置し
た後の残存活性を測定した結果、図２に示すとおり、ｐ
Ｈ７〜１１で優れた安定性を示し、ｐＨ９付近で最も安
定であった。なお、緩衝液としては、ｐＨ４〜６は酢酸
緩衝液、ｐＨ６〜８は燐酸緩衝液、ｐＨ８〜９はトリス
−塩酸緩衝液、ｐＨ８．５〜１１はグリシン緩衝液を用
いた。また、本発明においてリンゴ酸脱水素酵素の活性
は、以下の方法により測定した。０．５ｍＭのオキザロ
酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨを含む９５ｍＭのトリ
ス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）１ミリリットルに１０マイク
ロリットルの酵素溶液を加えて３０℃で５分間反応さ
せ、この間の３４０ｎｍの吸光度の減少値を測定した。
１分間当たりの吸光度の減少値をΔＡ340 とし、次式に
より活性値を算出した。なお、本発明において１Ｕと
は、１分間に１μＭのＮＡＤＨをＮＡＤに変換する酵素
量をいう。
【００２４】
【数１】
【００２５】図１は本発明の酵素の酵素活性に対するｐ
Ｈの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸
にｐＨを示しており、酵素活性は測定値が最高値を示し
たときの活性を１００とした相対活性で表した。また、
図２は、本発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示
すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示し
ており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性
を１００とした相対活性で表した。
Ｈの影響を示すグラフであり、縦軸に酵素活性を、横軸
にｐＨを示しており、酵素活性は測定値が最高値を示し
たときの活性を１００とした相対活性で表した。また、
図２は、本発明の酵素の安定性に対するｐＨの影響を示
すグラフであり、縦軸に残存活性を、横軸にｐＨを示し
ており、残存活性は測定値が最高値を示したときの活性
を１００とした相対活性で表した。
【００２６】（４）作用適温の範囲 ０．５ｍＭのオキザロ酢酸及び０．２５ｍＭのＮＡＤＨ
からなるアッセイミクスチャーを基質とし、９５ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で１０〜７０℃で５分
間反応させた結果、作用適温は２０〜５０℃であった。
からなるアッセイミクスチャーを基質とし、９５ｍＭの
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で１０〜７０℃で５分
間反応させた結果、作用適温は２０〜５０℃であった。
【００２７】（５）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによ
る測定で７２，０００である。
る測定で７２，０００である。
【００２８】（６）保存安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中で室温
（約２５℃）で２０日間放置した後、９０％以上の残存
活性を有する。
（約２５℃）で２０日間放置した後、９０％以上の残存
活性を有する。
【００２９】（７）熱安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）に酵素を１
０Ｕ／ミリリットルになるように加え、２０〜６５℃の
各温度において１５分間インキュベートした後の残存活
性を測定した結果、図３に示すとおり、５０℃で１５分
間の処理で失活は見られなかった。図３は本発明の酵素
の安定性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸
に残存活性を、横軸に温度を示しており、残存活性は測
定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活
性で表した。
０Ｕ／ミリリットルになるように加え、２０〜６５℃の
各温度において１５分間インキュベートした後の残存活
性を測定した結果、図３に示すとおり、５０℃で１５分
間の処理で失活は見られなかった。図３は本発明の酵素
の安定性に対する温度の影響を示すグラフであり、縦軸
に残存活性を、横軸に温度を示しており、残存活性は測
定値が最高値を示したときの活性を１００とした相対活
性で表した。
【００３０】（８）比活性 ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一のバンドを与え
る本発明の酵素の精製標品の比活性はオキザロ酢酸還元
反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白質以上である。な
お、本発明において蛋白量はプロテインアッセイキット
（バイオラッド社製）を用いて測定した。
る本発明の酵素の精製標品の比活性はオキザロ酢酸還元
反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白質以上である。な
お、本発明において蛋白量はプロテインアッセイキット
（バイオラッド社製）を用いて測定した。
【００３１】次に、本発明の酵素を得るには、本発明の
酵素の産生能を有する微生物、例えば、ストレプトマイ
セス属に属する微生物又はその変異株を培養し、その培
養物より目的とする酵素を採取すればよい。その具体的
菌株として、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomy
ces sp.) Ｗ１０８〔以下、Ｗ１０８と略記する。（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４９３５）〕が挙げられる。
酵素の産生能を有する微生物、例えば、ストレプトマイ
セス属に属する微生物又はその変異株を培養し、その培
養物より目的とする酵素を採取すればよい。その具体的
菌株として、ストレプトマイセス・エスピー(Streptomy
ces sp.) Ｗ１０８〔以下、Ｗ１０８と略記する。（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４９３５）〕が挙げられる。
【００３２】このＷ１０８株の菌学的性質を放線菌の同
定実験法（日本放線菌研究会編）に従って調べた結果を
以下に示す。
定実験法（日本放線菌研究会編）に従って調べた結果を
以下に示す。
【００３３】 （ａ）形態的性質 （１）菌糸 気菌糸形成 有 基生菌糸の分断 無 （２）胞子 胞子連鎖 有 （ｂ）培養的性質 ＩＳＰ−２寒天平板培養 裏面の色相は淡黄色、気菌糸の色相は白 色、色素の生産は認められない ＩＳＰ−２寒天平板培養 裏面の色相は淡黄色、気菌糸の色相は白 色〜灰色、色素の生産は認められない （ｃ）生理学的性質 生育温度範囲 ２０〜５５℃（至適生育温度４５℃） メラニン様色素の合成 無 炭素源の利用性 Ｌ−アラビノース 可 Ｄ−フラクトース 可 Ｄ−グルコース 可 イノシトール 可 Ｄ−マンニトール 可 ラフィノース 可 Ｌ−ラムノース 不可 シュークロース 可 Ｄ−キシロース 可 （ｄ）化学分類学的性質 細胞壁タイプ Ｉ型 LL−ジアミノピメリン酸 有 meso−ジアミノピメリン酸 無 ジアミノ酪酸 有 グリシン 有 アスパラギン酸 無 オルニチン 無 リジン 無 アラビノール 無 ガラクトース 無 キノン系 MK-9(H8,H6,H4) 以上の結果よりバージィーズ・マニュアル・オブ・シス
テマティック・バクテリオロジー〔Bergey's Mannual o
f systematic Bacteriology vol. 4(1989)〕を基に検索
したところ、Ｗ１０８株はストレプトマイセス属に属す
る放線菌であると同定された。この菌株は新規なリンゴ
酸脱水素酵素を生産する点において新規な菌株であると
判断できることから、ストレプトマイセス・エスピー(S
treptomyces sp.) Ｗ１０８と命名し、平成７年５月２
２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１４９３５
である。
テマティック・バクテリオロジー〔Bergey's Mannual o
f systematic Bacteriology vol. 4(1989)〕を基に検索
したところ、Ｗ１０８株はストレプトマイセス属に属す
る放線菌であると同定された。この菌株は新規なリンゴ
酸脱水素酵素を生産する点において新規な菌株であると
判断できることから、ストレプトマイセス・エスピー(S
treptomyces sp.) Ｗ１０８と命名し、平成７年５月２
２日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託した。その寄託番号は、ＦＥＲＭ Ｐ−１４９３５
である。
【００３４】本発明においては、この他にも、Ｗ１０８
株の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトマイセ
ス属に属する菌種でリンゴ酸脱水素酵素産生能を有する
菌株はすべて使用することができる。また、それらのリ
ンゴ酸脱水素酵素遺伝子を組み入れた組換え微生物も生
産菌として使用することができる。
株の自然的及び人工的変異株は勿論、ストレプトマイセ
ス属に属する菌種でリンゴ酸脱水素酵素産生能を有する
菌株はすべて使用することができる。また、それらのリ
ンゴ酸脱水素酵素遺伝子を組み入れた組換え微生物も生
産菌として使用することができる。
【００３５】これらの菌株を培養する際の培地として
は、一般によく用いられる培地を使用することができ
る。具体的には、炭素源としては、グルコース、シュー
クロース、マルトース、グリセロール、廃糖蜜、クエン
酸、リンゴ酸等の有機酸等が利用でき、窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等の無
機及び有機の窒素源が利用できる。また、必要に応じて
各種のミネラル、無機塩類、ビタミン等を添加して培養
することもできる。
は、一般によく用いられる培地を使用することができ
る。具体的には、炭素源としては、グルコース、シュー
クロース、マルトース、グリセロール、廃糖蜜、クエン
酸、リンゴ酸等の有機酸等が利用でき、窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ペプトン、
肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー等の無
機及び有機の窒素源が利用できる。また、必要に応じて
各種のミネラル、無機塩類、ビタミン等を添加して培養
することもできる。
【００３６】培養条件としては、通常、好気的条件で行
われ、液体培養、固体培養のどちらでもよい。培養温度
としては、２０〜５５℃、好ましくは３０〜５０℃、さ
らに好ましくは４０〜４５℃で行うのがよい。また、培
養時のｐＨとしては、４〜９、好ましくは５〜８、さら
に好ましくは６〜７がよい。また、培養時間としては、
３〜４８時間、好ましくは６〜２４時間、さらに好まし
くは８〜１６時間がよいが、培養の条件により最適条件
が変わることは言うまでもない。このような条件で培養
することにより、菌体内にリンゴ酸脱水素酵素を生成、
蓄積させることができる。
われ、液体培養、固体培養のどちらでもよい。培養温度
としては、２０〜５５℃、好ましくは３０〜５０℃、さ
らに好ましくは４０〜４５℃で行うのがよい。また、培
養時のｐＨとしては、４〜９、好ましくは５〜８、さら
に好ましくは６〜７がよい。また、培養時間としては、
３〜４８時間、好ましくは６〜２４時間、さらに好まし
くは８〜１６時間がよいが、培養の条件により最適条件
が変わることは言うまでもない。このような条件で培養
することにより、菌体内にリンゴ酸脱水素酵素を生成、
蓄積させることができる。
【００３７】このように培養して得られた培養物から本
発明の酵素を精製取得する方法としては、通常の酵素精
製手段を組み合わせて行えばよい。例えば、培養物から
遠心分離、ろ過等の一般的な菌体回収方法により得た菌
体を超音波、フレンチプレス、自己消化、有機溶媒処
理、界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理等により
破砕し、緩衝液等で菌体内に含まれる酵素を抽出する。
このようにして得られた粗酵素液をＤＥＡＥ−セルロー
ス、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ホス
ホセルロース（以上、ファルマシア製）等のイオン交換
樹脂、チバクロンブル−Ｈ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、チ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア製）等のアフィニティークロマト
用樹脂、フェニルセファロース、オクチルセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）等の疎水クロマト用樹
脂、セファデックスＧ１００、Ｇ２００等のゲルろ過用
樹脂を組み合わせて用い、クロマトグラフィーにより目
的の酵素を精製することができる。また、カラムクロマ
トグラフィーの前処理として硫酸ストレプトマイシンや
硫酸プロタミンによる除核酸処理を行ってもよい。さら
に、溶媒を用いる分別沈澱、硫酸アンモニウム等の塩類
を用いる塩析を適宜組み合わせて精製に用いることがで
きる。
発明の酵素を精製取得する方法としては、通常の酵素精
製手段を組み合わせて行えばよい。例えば、培養物から
遠心分離、ろ過等の一般的な菌体回収方法により得た菌
体を超音波、フレンチプレス、自己消化、有機溶媒処
理、界面活性剤処理、リゾチーム等の酵素処理等により
破砕し、緩衝液等で菌体内に含まれる酵素を抽出する。
このようにして得られた粗酵素液をＤＥＡＥ−セルロー
ス、ＤＥＡＥ−セファロース、Ｑ−セファロース、ホス
ホセルロース（以上、ファルマシア製）等のイオン交換
樹脂、チバクロンブル−Ｈ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、チ
バクロンイエローＨＥ−３Ｇ、ブルーセファロースＣＬ
−６Ｂ（ファルマシア製）等のアフィニティークロマト
用樹脂、フェニルセファロース、オクチルセファロース
ＣＬ−４Ｂ（ファルマシア製）等の疎水クロマト用樹
脂、セファデックスＧ１００、Ｇ２００等のゲルろ過用
樹脂を組み合わせて用い、クロマトグラフィーにより目
的の酵素を精製することができる。また、カラムクロマ
トグラフィーの前処理として硫酸ストレプトマイシンや
硫酸プロタミンによる除核酸処理を行ってもよい。さら
に、溶媒を用いる分別沈澱、硫酸アンモニウム等の塩類
を用いる塩析を適宜組み合わせて精製に用いることがで
きる。
【００３８】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、実施例中の％は重量％を示す。
する。なお、実施例中の％は重量％を示す。
【００３９】実施例１ １％グルコース、１％シュークロース、１％ファーマメ
ディア、０．５％大豆粉、１％変性でんぷん、０．５％
ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培地
（ｐＨ６．７）５００ミリリットルにＷ１０８株を接種
し、４５℃で３日間振とう培養した。このようにして得
た培養液を１．５％グルコース、１％酵母エキス、０．
２％ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培
地（ｐＨ６．７）２０リットルを仕込んだ３０リットル
スケールのジャーファーメンターに接種し、４５℃、通
気条件２０リットル／分、撹はん４００ｒｐｍで１２時
間培養を行った後、遠心分離にて菌体を回収し、７８０
ｇの湿菌体を得た。
ディア、０．５％大豆粉、１％変性でんぷん、０．５％
ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培地
（ｐＨ６．７）５００ミリリットルにＷ１０８株を接種
し、４５℃で３日間振とう培養した。このようにして得
た培養液を１．５％グルコース、１％酵母エキス、０．
２％ポリペプトン、０．２％炭酸カルシウムからなる培
地（ｐＨ６．７）２０リットルを仕込んだ３０リットル
スケールのジャーファーメンターに接種し、４５℃、通
気条件２０リットル／分、撹はん４００ｒｐｍで１２時
間培養を行った後、遠心分離にて菌体を回収し、７８０
ｇの湿菌体を得た。
【００４０】得られた湿菌体のうち２０ｇを２ｍＭのＥ
ＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２
５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ８）１８０ミリリットルに懸
濁し、超音波破砕機（KUBOTA INSONATOR 201M ）を用い
て１２０ワットで１５分破砕した。その後、遠心分離に
より未破砕の菌体及び菌体残査を除き、粗酵素液を得
た。このようにして得られた粗酵素液を上記の２５ｍＭ
の燐酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦ
（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）に
アプライした。このカラムを同緩衝液で洗浄した後、０
〜０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配により、リン
ゴ酸脱水素酵素を溶出した。活性画分を集め、１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ６）
で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア社製）カラム（１００ミリリットル）にアプライ
した。１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩
衝液（ｐＨ６）で洗浄後、０．５〜０Ｍの硫酸アンモニ
ウムによる直線濃度勾配により、リンゴ酸脱水素酵素を
溶出した。リンゴ酸脱水素酵素画分を集め、透析により
硫酸アンモニウムを除いた後、２５ｍＭの燐酸緩衝液
（ｐＨ６）で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）に
アプライした。同緩衝液で洗浄した後、０〜０．５Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配によりリンゴ酸脱水素酵素
を溶出した。このようにして比活性１２５０．４（Ｕ／
ｍｇ）のリンゴ酸脱水素酵素を得ることができた。この
ようにして得られたリンゴ酸脱水素酵素は、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で単一なバンドを与えた。以上に
述べた精製の各ステップでの比活性、活性の回収率等を
表１にまとめた。
ＤＴＡ及び２ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む２
５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ８）１８０ミリリットルに懸
濁し、超音波破砕機（KUBOTA INSONATOR 201M ）を用い
て１２０ワットで１５分破砕した。その後、遠心分離に
より未破砕の菌体及び菌体残査を除き、粗酵素液を得
た。このようにして得られた粗酵素液を上記の２５ｍＭ
の燐酸緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦＦ
（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）に
アプライした。このカラムを同緩衝液で洗浄した後、０
〜０．５Ｍの塩化カリウムの直線濃度勾配により、リン
ゴ酸脱水素酵素を溶出した。活性画分を集め、１Ｍの硫
酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩衝液（ｐＨ６）
で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（ファル
マシア社製）カラム（１００ミリリットル）にアプライ
した。１Ｍの硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭの燐酸緩
衝液（ｐＨ６）で洗浄後、０．５〜０Ｍの硫酸アンモニ
ウムによる直線濃度勾配により、リンゴ酸脱水素酵素を
溶出した。リンゴ酸脱水素酵素画分を集め、透析により
硫酸アンモニウムを除いた後、２５ｍＭの燐酸緩衝液
（ｐＨ６）で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ
（ファルマシア社製）カラム（１００ミリリットル）に
アプライした。同緩衝液で洗浄した後、０〜０．５Ｍの
塩化カリウムの直線濃度勾配によりリンゴ酸脱水素酵素
を溶出した。このようにして比活性１２５０．４（Ｕ／
ｍｇ）のリンゴ酸脱水素酵素を得ることができた。この
ようにして得られたリンゴ酸脱水素酵素は、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で単一なバンドを与えた。以上に
述べた精製の各ステップでの比活性、活性の回収率等を
表１にまとめた。
【００４１】
【表１】
【００４２】参考例１、比較例１、２ 実施例１で得たリンゴ酸脱水素酵素（参考例１）と、ブ
タ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハ
イム社製、比較例１）及びサーマス・サーモフィラス由
来のリンゴ酸脱水素酵素（天野製薬社製、比較例２）と
の比活性を測定した。その結果を表２に示す。
タ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハ
イム社製、比較例１）及びサーマス・サーモフィラス由
来のリンゴ酸脱水素酵素（天野製薬社製、比較例２）と
の比活性を測定した。その結果を表２に示す。
【００４３】
【表２】
【００４４】参考例２、比較例３ 実施例１で得たリンゴ酸脱水素酵素（参考例２）と、ブ
タ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハ
イム社製、比較例３）の保存安定性を以下のようにして
測定した。それぞれの酵素を１０Ｕ／ミリリットルとな
るように１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）で
希釈した後、２８℃の恒温槽で４２日間保存した。この
間の残存活性を経時的に測定した。
タ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素（ベーリンガーマンハ
イム社製、比較例３）の保存安定性を以下のようにして
測定した。それぞれの酵素を１０Ｕ／ミリリットルとな
るように１００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）で
希釈した後、２８℃の恒温槽で４２日間保存した。この
間の残存活性を経時的に測定した。
【００４５】その結果を図４に示す。図４は本発明のリ
ンゴ酸脱水素酵素及びブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵
素の保存安定性を示すグラフであり、縦軸に残存活性
を、横軸に日数を示した。なお、残存活性は、保存開始
時の活性を１００とした相対活性で示した。
ンゴ酸脱水素酵素及びブタ心臓由来のリンゴ酸脱水素酵
素の保存安定性を示すグラフであり、縦軸に残存活性
を、横軸に日数を示した。なお、残存活性は、保存開始
時の活性を１００とした相対活性で示した。
【００４６】表２及び図４からわかるように、本発明の
リンゴ酸脱水素酵素は比活性が高く、また保存安定性に
優れている。これに対して、サーマス・サーモフィラス
由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性が低く、また、ブタ
心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性は高いものの保
存安定性がよくない。
リンゴ酸脱水素酵素は比活性が高く、また保存安定性に
優れている。これに対して、サーマス・サーモフィラス
由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性が低く、また、ブタ
心臓由来のリンゴ酸脱水素酵素は比活性は高いものの保
存安定性がよくない。
【００４７】
【発明の効果】本発明のリンゴ酸脱水素酵素は、保存安
定性に優れ、かつ比活性が高い。このため、本発明のリ
ンゴ酸脱水素酵素は、オキザロ酢酸の定量やＧＯＴ（グ
ルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の検
査用試薬に用いることに適している。また、本発明の製
造方法によれば、このような酵素を容易に製造すること
ができる。
定性に優れ、かつ比活性が高い。このため、本発明のリ
ンゴ酸脱水素酵素は、オキザロ酢酸の定量やＧＯＴ（グ
ルタミン酸−オキザロ酢酸−トランスアミナーゼ）の検
査用試薬に用いることに適している。また、本発明の製
造方法によれば、このような酵素を容易に製造すること
ができる。
【図１】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の活性に対するｐ
Ｈの影響を示すグラフである。
Ｈの影響を示すグラフである。
【図２】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の安定性に対する
ｐＨの影響を示すグラフである。
ｐＨの影響を示すグラフである。
【図３】本発明のリンゴ酸脱水素酵素の安定性に対する
温度の影響を示すグラフである。
温度の影響を示すグラフである。
【図４】本発明のリンゴ酸脱水素酵素及びブタ心臓由来
のリンゴ酸脱水素酵素の保存安定性を示すグラフであ
る。
のリンゴ酸脱水素酵素の保存安定性を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 鈍宝 宗彦 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ株 式会社中央研究所内
Claims (2)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するリンゴ酸脱
水素酵素。 １）作用 次の反応を触媒する。 【化１】 ２）基質特異性 オキザロ酢酸に対するＫｍが２．７×１０-5Ｍである。 ３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 至適ｐＨが８〜９であって、ｐＨ７〜１１で安定であ
る。 ４）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルクロマトグラフィーによ
る測定で７２，０００である。 ５）保存安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、室温
（２５℃）で２０日間放置した後、９５％以上の残存活
性を有する。 ６）熱安定性 １００ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９）中、５０℃
で１５分間の処理で失活は見られない。 ７）比活性 オキザロ酢酸還元反応において、１０００Ｕ／ｍｇ蛋白
質以上である。 - 【請求項２】 ストレプトマイセス属に属する微生物又
はその変異株を培養し、培養物からリンゴ酸脱水素酵素
を採取することを特徴とする請求項１記載のリンゴ酸脱
水素酵素の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26826995A JP3745803B2 (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26826995A JP3745803B2 (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107959A true JPH09107959A (ja) | 1997-04-28 |
| JP3745803B2 JP3745803B2 (ja) | 2006-02-15 |
Family
ID=17456227
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26826995A Expired - Lifetime JP3745803B2 (ja) | 1995-10-17 | 1995-10-17 | リンゴ酸脱水素酵素及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3745803B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
| CN112592940A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-02 | 江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司 | 一种n-笏甲氧羰基-葵烷基乙醛的生物酶合成方法 |
| CN116656637A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-08-29 | 上海逐药科技有限公司 | 一种苹果酸脱氢酶的变体 |
-
1995
- 1995-10-17 JP JP26826995A patent/JP3745803B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006254795A (ja) * | 2005-03-17 | 2006-09-28 | Shimane Univ | アスパラギン酸脱水素酵素、アラニン脱水素酵素、ｌ−アスパラギン酸製造方法、および、ｄ−リンゴ酸製造方法 |
| CN112592940A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-02 | 江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司 | 一种n-笏甲氧羰基-葵烷基乙醛的生物酶合成方法 |
| CN112592940B (zh) * | 2020-12-16 | 2023-05-02 | 江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司 | 一种n-（9-笏基甲氧羰基）-癸基氨基乙醛的生物酶合成方法 |
| CN116656637A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-08-29 | 上海逐药科技有限公司 | 一种苹果酸脱氢酶的变体 |
| CN116656637B (zh) * | 2023-07-07 | 2024-05-14 | 上海逐药科技有限公司 | 一种苹果酸脱氢酶的变体 |
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|---|---|
| JP3745803B2 (ja) | 2006-02-15 |
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