JP3789234B2 - 6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用するキノリン酸を原料とした6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法に関する。6−ヒドロキシピコリン酸は医農薬中間体、合成樹脂原料などとして用いられ、産業上有用な化合物である。
【0002】
【従来の技術】
6−ヒドロキシピコリン酸は、従来、工業的にはキノリンの酸化により生じるキノリン酸の脱炭酸、あるいは、シアノピリジンの酸化によって生成するピコリン酸をさらに化学的に水酸化する方法により製造されている。しかしながら、この方法は工程が複雑なため収率が良くなく、また、高温、高圧下で大量の有機溶媒を用いるため爆発などの危険が伴うほか、触媒の処理等環境への影響も無視できない。
【0003】
微生物培養環境においてもニトリル化合物から対応するカルボン酸に転化しさらに水酸化して6−ヒドロキシピコリン酸を製造するという報告(特開平08−332094号公報、特開平05−115278号公報)はあるが、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成したという報告はこれまでにない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、常温、常圧の条件下で実施でき、安全かつ極めて単純な工程で、キノリン酸から直接6-ヒドロキシピコリン酸を製造する方法を提供することにある。
【0005】
本発明の目的は、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物の酵素的作用によりキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を製造方法を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、アルカリゲネス属に属する微生物の中に、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成する微生物を見出し、生産性を高めるため培養条件、反応条件を鋭意検討した結果、極めて安全で単純な方法で、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を著量製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物を液体培地中で培養し、得られた培養菌体または該菌体の処理物を、水性溶媒中でキノリン酸に接触させて6−ヒドロキシピコリン酸を生成、蓄積せしめ、これを水性溶媒より採取することを特徴とする6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法、および該製造方法に使用されるアルカリゲネス属に属する微生物に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明に用いることのできるキノリン酸には、キノリン酸の他、水酸基含有キノリン酸、N−アルキル基置換キノリン酸、アルコキシ基含有キノリン酸、N−アルキル基置換水酸基含有キノリン酸等が含まれる。
【0009】
本発明で使用される微生物(以下「本発明微生物」という)はキノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力のある微生物であればその起源は何ら問わない。そのようなものは好ましくは、細菌及び放線菌に属する微生物であって、具体的にアルカリゲネス sp.UK21(FERM P−16950)を例示することができる。UK21は、茨城県つくば市東1丁目1番3号にある、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成10年8月21日より上記受託番号にて寄託されている。
【0010】
本発明に於いて使用されるUK21株の分類学的上の菌学的性質は次のとおりである。
菌株の特性
細胞形状 棒状
幅 μm 0.5〜0.7
長さ μm 1.5〜2.5
グラム反応 −
3%KOHによる分解 +
アミノペプチダ−ゼ(Cemy) +
オキシダ−ゼ +
カタラ−ゼ +
運動性 +
べん毛 >1、周べん毛
ADH −
ウレア−ゼ −
ゼラチンの加水分解 −
脱窒 +
PNG −
資化性
グルコ−ス −
フェニル酢酸 −
クエン酸塩 +
リンゴ酸 +
アラビノ−ス −
マンノ−ス −
マンニト−ル −
アジピン酸 +
カプリン酸 +
グルコン酸 −
マルト−ス −
セロビオ−ス −
酸発生(OF試験)
グルコ−ス好気的 −
キシロ−ス好気的 −
【0011】
以上の点から、本菌株はアルカリゲネス属に属する微生物であることが解ったが、16SrDNAの部分塩基配列では他のアルカリゲネスの種との相同性は92〜96%であった。最も相同性の高い種はアルカリゲネス デフラグランス(Alcaligenes defragrans)で、96.1%であった。細胞膜の脂肪酸組成はアルカリゲネスの標準的な組成とはやや異なっていた。幾つかの生理学的試験からは、この菌はアルカリゲネス デニトリフィカンス(Alcaligenes denitrificans)に近いと考えられたが、16Sの相同性の低さからこの種だとは言い難い。これらの結果と、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成するという能力を有するところから従来のものとは異なる新菌株と認め、アルカリゲネスsp.(Alcaligenes sp.)UK21と命名した。
【0012】
本発明に使用される微生物としては、同菌株に突然変異処理を施し、6−ヒドロキシピコリン酸の生産性が増大したものを選択して用いてもよい。そのような突然変異体としては、例えば、キノリン酸および/または6−ヒドロキシピコリン酸に対する耐性の向上した変異株、6−ヒドロキシピコリン酸を分解しなくなった変異株、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸生成に関与する酵素類の生産性の高い変異株などが挙げられる。
【0013】
次に本発明微生物の培養方法について説明する。
細菌を増殖させる培地としては通常、これらの細菌が生育し得る液体培地であれば良い。
培地の炭素源としては、グルコース、デンプン等の糖類等、菌体が資化し生育できる炭化水素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、微量金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【0014】
培養温度は微生物の生育に適当な温度であり、好ましくは15〜45℃、より好ましくは25〜35℃である。培養の際のpHはpH4〜10、好ましくはpH6〜8付近である。
【0015】
培養は、嫌気下でも好気下でもいずれも行うことができるが、増殖速度が速いことから好気下での振盪培養が好ましく、また常圧下で行いうる。但し、培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じてキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸への変換能力が最大になるように設定することが重要であることは当然である。
【0016】
また、本発明微生物が含有する、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸の生産に関与する酵素類を多量に生産させるために、生成物である6−ヒドロキシピコリン酸を培地に添加することもできる。6−ヒドロキシピコリン酸の添加量は培地に対して0.01〜1.0w/w%、好ましくは0.1〜0.5w/w%になるよう添加することができる。
【0017】
本発明微生物を用いてキノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成、蓄積させる工程はバッチ式でも、また、バイオリアクターを用いた連続式でも可能である。上記の培養方法で増殖させた菌体をろ過または遠心分離により回収する。得られた菌体はそのまま生理食塩水等に懸濁してキノリン酸との反応に供してもよいし、破砕菌体、菌体培養液、粗酵素、精製酵素等の菌体処理物としてもよい。培養菌体または該菌体処理物は、キノリン酸を含む水系溶媒に懸濁させるか、または公知の固定化法で固定化し、固定化物を、キノリン酸を含む水系溶媒と接触させることによって6−ヒドロキシピコリン酸を反応液中に蓄積せしめ、これを採取する。水性溶媒としては、例えば、トリス−HCl緩衝液等の緩衝液を用いることができる。
【0018】
キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成するための反応に用いるキノリン酸は100〜10000mM、好ましくは100〜2000mMの濃度で供給する。供給は1度に添加しても良いが、基質による阻害性が見られるような場合には少量ずつ数回に分けて添加することもできる。反応時の菌体濃度は乾物重ベースで1〜100g/lの範囲で行われる。
【0019】
反応液中の6−ヒドロキシピコリン酸は常法に従い回収すれば良い。すなわち、反応液をろ過、遠心分離等により処理した後、溶剤抽出等の方法により回収する。また溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて酸性化することにより、6−ヒドロキシピコリン酸を回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することができる。
【0020】
なお、本発明の製造法においては6−ヒドロキシピコリン酸の検出及び定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって行われる。すなわち、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、リン酸水溶液とアセトニトリルの混合物を移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析が可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長230nm付近で行う。
【0021】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【0022】
〔実施例1〕
下記組成の培地A10mlを100ml容の培養フラスコに入れ、121℃、1.2気圧にて15分間オートクレーブ滅菌を行った。
【0023】
培地A
Pepton 0.5 g
Meat extract 0.5 g
Yeast extract 0.0 g
NaCl 0.02g
Tap water 100ml
【0024】
これに培地Aに寒天1.5%を加えた個体培地で維持している菌体(アルカリゲネスsp.UK21)を1白金耳接種した。28℃の恒温室にて1日間振盪培養後、下記組成の培地Bに移植し更に3日間培養した。
【0025】
培地B
キノリン酸 0.25g
KH2PO4 0.1 g
K2HPO4 0.3 g
Galactose 1.0 g
Yeast extract 1.0 g
MgSO4・7H2O 0.05g
Metal solution (*) 1.0 ml
Tap Water 100 ml
【0026】
*)Metal solution
CaCl2・2H2O 400mg
H3BO3 300mg
CuSO4・5H2O 40mg
KI 100mg
FeSO4・7H2O 200mg
MnSO4・7H2O 400mg
Na2MoO4・2H2O 200mg
conc.HCl 10 ml
Distilled water 1000 ml
【0027】
菌体は遠心分離(8,500rpm 20min.4.0℃ )して集菌し、生理食塩水(0.85% NaCl水溶液)に懸濁して休止菌体を調製した。
休止菌体によるキノリン酸の変換反応は、1Mキノリン酸0.5ml、0.5Mトリス−HCl緩衝液(pH8.0)0.5ml、及び菌体懸濁液(12mg/ml)1.0mlを混合し、30℃、4時間振とうして実施した。菌体の添加で反応を開始し、2mlMeOHの添加により反応を停止した。
反応終了後、菌体を除去するために遠心分離(8,500rpmで10分間)し、上清をHPLCで分析した。
測定の結果、得られた化合物のピ−クは標品の6-ヒドロキシピコリン酸のピ−クと一致した。
【0028】
HPLC分析条件
カラム:Wakosil−II5C18−HG(4.6×150mm)
溶媒:10mMKH2PO4(pH2.5)/CH3CN=99/1(V/V)
流量:1.0ml/min.
検出波長:230nm
【0029】
〔実施例2〕
培地Bを用いて実施例1と同様の方法で休止菌体を作成した。この休止菌体60mg(乾燥重)を用いて、キノリン酸100mMを含む100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)20mlでキノリン酸の変換反応を行った。反応経過に従い伴い2〜3時間毎に100mMずつ9回に分けてキノリン酸を追加添加し、48時間後に反応を停止した。得られた反応生成物を実施例1と同様にHPLCで分析したところ6-ヒドロキシピコリン酸132g/l(953mM)に相当しモル収率は95.3%であった。
反応生成物を同定するため、反応終了後、菌体を遠心分離(3000rpm、10分間)で除去し、上清をDowex−1(OH form 1×2−200:ダウケミカル社製)を詰めたカラム (19×115mM)にのせた。蒸留水、2N酢酸100ml、3N酢酸300mlで洗浄後、3N酢酸300mlで溶出した。70℃で酢酸臭がなくなるまで水を添加しながら減圧濃縮を繰り返した後、蒸発乾固した。次に、得られた固形物に少量の蒸留水を加え熱溶解した後室温で結晶化した。更に、蒸留水により再結晶を行い白色の針状結晶1.8gを得た。再結晶により得られた反応生成物をGC/MS、NMR、IRで分析した結果、生成物は標品の6-ヒドロキシピコリン酸と一致した。
【0030】
〔実施例3〕
培地B100mlに6-ヒドロキシピコリン酸0.2mgを添加した、培地Cを用いて実施例1と同様の方法で休止菌体を作成した。この休止菌体60mg(乾燥重)を用いて、キノリン酸100mMを含む100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)20mlでキノリン酸の変換反応を行ったところ13.2g/l(95.3mM)の6-ヒドロキシピコリン酸の蓄積を認めた。
【0031】
【発明の効果】
本発明によれば、高温、高圧に調節する機能を具備しない簡便な装置を用い、常温、常圧の条件下で実施できる微生物の培養を利用して、安全かつ極めて単純な工程でキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を製造できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物を利用するキノリン酸を原料とした6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法に関する。6−ヒドロキシピコリン酸は医農薬中間体、合成樹脂原料などとして用いられ、産業上有用な化合物である。
【0002】
【従来の技術】
6−ヒドロキシピコリン酸は、従来、工業的にはキノリンの酸化により生じるキノリン酸の脱炭酸、あるいは、シアノピリジンの酸化によって生成するピコリン酸をさらに化学的に水酸化する方法により製造されている。しかしながら、この方法は工程が複雑なため収率が良くなく、また、高温、高圧下で大量の有機溶媒を用いるため爆発などの危険が伴うほか、触媒の処理等環境への影響も無視できない。
【0003】
微生物培養環境においてもニトリル化合物から対応するカルボン酸に転化しさらに水酸化して6−ヒドロキシピコリン酸を製造するという報告(特開平08−332094号公報、特開平05−115278号公報)はあるが、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成したという報告はこれまでにない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、常温、常圧の条件下で実施でき、安全かつ極めて単純な工程で、キノリン酸から直接6-ヒドロキシピコリン酸を製造する方法を提供することにある。
【0005】
本発明の目的は、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物の酵素的作用によりキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を製造方法を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決すべく検討を重ねた結果、アルカリゲネス属に属する微生物の中に、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成する微生物を見出し、生産性を高めるため培養条件、反応条件を鋭意検討した結果、極めて安全で単純な方法で、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を著量製造できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物を液体培地中で培養し、得られた培養菌体または該菌体の処理物を、水性溶媒中でキノリン酸に接触させて6−ヒドロキシピコリン酸を生成、蓄積せしめ、これを水性溶媒より採取することを特徴とする6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法、および該製造方法に使用されるアルカリゲネス属に属する微生物に関する。
【0008】
【発明の実施の形態】
本発明に用いることのできるキノリン酸には、キノリン酸の他、水酸基含有キノリン酸、N−アルキル基置換キノリン酸、アルコキシ基含有キノリン酸、N−アルキル基置換水酸基含有キノリン酸等が含まれる。
【0009】
本発明で使用される微生物(以下「本発明微生物」という)はキノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力のある微生物であればその起源は何ら問わない。そのようなものは好ましくは、細菌及び放線菌に属する微生物であって、具体的にアルカリゲネス sp.UK21(FERM P−16950)を例示することができる。UK21は、茨城県つくば市東1丁目1番3号にある、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成10年8月21日より上記受託番号にて寄託されている。
【0010】
本発明に於いて使用されるUK21株の分類学的上の菌学的性質は次のとおりである。
菌株の特性
細胞形状 棒状
幅 μm 0.5〜0.7
長さ μm 1.5〜2.5
グラム反応 −
3%KOHによる分解 +
アミノペプチダ−ゼ(Cemy) +
オキシダ−ゼ +
カタラ−ゼ +
運動性 +
べん毛 >1、周べん毛
ADH −
ウレア−ゼ −
ゼラチンの加水分解 −
脱窒 +
PNG −
資化性
グルコ−ス −
フェニル酢酸 −
クエン酸塩 +
リンゴ酸 +
アラビノ−ス −
マンノ−ス −
マンニト−ル −
アジピン酸 +
カプリン酸 +
グルコン酸 −
マルト−ス −
セロビオ−ス −
酸発生(OF試験)
グルコ−ス好気的 −
キシロ−ス好気的 −
【0011】
以上の点から、本菌株はアルカリゲネス属に属する微生物であることが解ったが、16SrDNAの部分塩基配列では他のアルカリゲネスの種との相同性は92〜96%であった。最も相同性の高い種はアルカリゲネス デフラグランス(Alcaligenes defragrans)で、96.1%であった。細胞膜の脂肪酸組成はアルカリゲネスの標準的な組成とはやや異なっていた。幾つかの生理学的試験からは、この菌はアルカリゲネス デニトリフィカンス(Alcaligenes denitrificans)に近いと考えられたが、16Sの相同性の低さからこの種だとは言い難い。これらの結果と、キノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成するという能力を有するところから従来のものとは異なる新菌株と認め、アルカリゲネスsp.(Alcaligenes sp.)UK21と命名した。
【0012】
本発明に使用される微生物としては、同菌株に突然変異処理を施し、6−ヒドロキシピコリン酸の生産性が増大したものを選択して用いてもよい。そのような突然変異体としては、例えば、キノリン酸および/または6−ヒドロキシピコリン酸に対する耐性の向上した変異株、6−ヒドロキシピコリン酸を分解しなくなった変異株、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸生成に関与する酵素類の生産性の高い変異株などが挙げられる。
【0013】
次に本発明微生物の培養方法について説明する。
細菌を増殖させる培地としては通常、これらの細菌が生育し得る液体培地であれば良い。
培地の炭素源としては、グルコース、デンプン等の糖類等、菌体が資化し生育できる炭化水素化合物であればいずれでも使用可能である。窒素源としては、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源、酵母エキス、ペプトン、肉エキスなどの有機窒素源を使用することができる。これらの他に、必要に応じて、無機塩類、微量金属塩、ビタミンなどを添加することもできる。
【0014】
培養温度は微生物の生育に適当な温度であり、好ましくは15〜45℃、より好ましくは25〜35℃である。培養の際のpHはpH4〜10、好ましくはpH6〜8付近である。
【0015】
培養は、嫌気下でも好気下でもいずれも行うことができるが、増殖速度が速いことから好気下での振盪培養が好ましく、また常圧下で行いうる。但し、培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じてキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸への変換能力が最大になるように設定することが重要であることは当然である。
【0016】
また、本発明微生物が含有する、キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸の生産に関与する酵素類を多量に生産させるために、生成物である6−ヒドロキシピコリン酸を培地に添加することもできる。6−ヒドロキシピコリン酸の添加量は培地に対して0.01〜1.0w/w%、好ましくは0.1〜0.5w/w%になるよう添加することができる。
【0017】
本発明微生物を用いてキノリン酸から直接6−ヒドロキシピコリン酸を生成、蓄積させる工程はバッチ式でも、また、バイオリアクターを用いた連続式でも可能である。上記の培養方法で増殖させた菌体をろ過または遠心分離により回収する。得られた菌体はそのまま生理食塩水等に懸濁してキノリン酸との反応に供してもよいし、破砕菌体、菌体培養液、粗酵素、精製酵素等の菌体処理物としてもよい。培養菌体または該菌体処理物は、キノリン酸を含む水系溶媒に懸濁させるか、または公知の固定化法で固定化し、固定化物を、キノリン酸を含む水系溶媒と接触させることによって6−ヒドロキシピコリン酸を反応液中に蓄積せしめ、これを採取する。水性溶媒としては、例えば、トリス−HCl緩衝液等の緩衝液を用いることができる。
【0018】
キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成するための反応に用いるキノリン酸は100〜10000mM、好ましくは100〜2000mMの濃度で供給する。供給は1度に添加しても良いが、基質による阻害性が見られるような場合には少量ずつ数回に分けて添加することもできる。反応時の菌体濃度は乾物重ベースで1〜100g/lの範囲で行われる。
【0019】
反応液中の6−ヒドロキシピコリン酸は常法に従い回収すれば良い。すなわち、反応液をろ過、遠心分離等により処理した後、溶剤抽出等の方法により回収する。また溶液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて酸性化することにより、6−ヒドロキシピコリン酸を回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することができる。
【0020】
なお、本発明の製造法においては6−ヒドロキシピコリン酸の検出及び定量は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって行われる。すなわち、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、リン酸水溶液とアセトニトリルの混合物を移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィーによって分析が可能である。検出は紫外部分光検出器によって波長230nm付近で行う。
【0021】
【実施例】
以下に代表的な実施例を示し本発明の具体的な説明を行うが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【0022】
〔実施例1〕
下記組成の培地A10mlを100ml容の培養フラスコに入れ、121℃、1.2気圧にて15分間オートクレーブ滅菌を行った。
【0023】
培地A
Pepton 0.5 g
Meat extract 0.5 g
Yeast extract 0.0 g
NaCl 0.02g
Tap water 100ml
【0024】
これに培地Aに寒天1.5%を加えた個体培地で維持している菌体(アルカリゲネスsp.UK21)を1白金耳接種した。28℃の恒温室にて1日間振盪培養後、下記組成の培地Bに移植し更に3日間培養した。
【0025】
培地B
キノリン酸 0.25g
KH2PO4 0.1 g
K2HPO4 0.3 g
Galactose 1.0 g
Yeast extract 1.0 g
MgSO4・7H2O 0.05g
Metal solution (*) 1.0 ml
Tap Water 100 ml
【0026】
*)Metal solution
CaCl2・2H2O 400mg
H3BO3 300mg
CuSO4・5H2O 40mg
KI 100mg
FeSO4・7H2O 200mg
MnSO4・7H2O 400mg
Na2MoO4・2H2O 200mg
conc.HCl 10 ml
Distilled water 1000 ml
【0027】
菌体は遠心分離(8,500rpm 20min.4.0℃ )して集菌し、生理食塩水(0.85% NaCl水溶液)に懸濁して休止菌体を調製した。
休止菌体によるキノリン酸の変換反応は、1Mキノリン酸0.5ml、0.5Mトリス−HCl緩衝液(pH8.0)0.5ml、及び菌体懸濁液(12mg/ml)1.0mlを混合し、30℃、4時間振とうして実施した。菌体の添加で反応を開始し、2mlMeOHの添加により反応を停止した。
反応終了後、菌体を除去するために遠心分離(8,500rpmで10分間)し、上清をHPLCで分析した。
測定の結果、得られた化合物のピ−クは標品の6-ヒドロキシピコリン酸のピ−クと一致した。
【0028】
HPLC分析条件
カラム:Wakosil−II5C18−HG(4.6×150mm)
溶媒:10mMKH2PO4(pH2.5)/CH3CN=99/1(V/V)
流量:1.0ml/min.
検出波長:230nm
【0029】
〔実施例2〕
培地Bを用いて実施例1と同様の方法で休止菌体を作成した。この休止菌体60mg(乾燥重)を用いて、キノリン酸100mMを含む100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)20mlでキノリン酸の変換反応を行った。反応経過に従い伴い2〜3時間毎に100mMずつ9回に分けてキノリン酸を追加添加し、48時間後に反応を停止した。得られた反応生成物を実施例1と同様にHPLCで分析したところ6-ヒドロキシピコリン酸132g/l(953mM)に相当しモル収率は95.3%であった。
反応生成物を同定するため、反応終了後、菌体を遠心分離(3000rpm、10分間)で除去し、上清をDowex−1(OH form 1×2−200:ダウケミカル社製)を詰めたカラム (19×115mM)にのせた。蒸留水、2N酢酸100ml、3N酢酸300mlで洗浄後、3N酢酸300mlで溶出した。70℃で酢酸臭がなくなるまで水を添加しながら減圧濃縮を繰り返した後、蒸発乾固した。次に、得られた固形物に少量の蒸留水を加え熱溶解した後室温で結晶化した。更に、蒸留水により再結晶を行い白色の針状結晶1.8gを得た。再結晶により得られた反応生成物をGC/MS、NMR、IRで分析した結果、生成物は標品の6-ヒドロキシピコリン酸と一致した。
【0030】
〔実施例3〕
培地B100mlに6-ヒドロキシピコリン酸0.2mgを添加した、培地Cを用いて実施例1と同様の方法で休止菌体を作成した。この休止菌体60mg(乾燥重)を用いて、キノリン酸100mMを含む100mMトリス−HCl緩衝液(pH7.5)20mlでキノリン酸の変換反応を行ったところ13.2g/l(95.3mM)の6-ヒドロキシピコリン酸の蓄積を認めた。
【0031】
【発明の効果】
本発明によれば、高温、高圧に調節する機能を具備しない簡便な装置を用い、常温、常圧の条件下で実施できる微生物の培養を利用して、安全かつ極めて単純な工程でキノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を製造できる。
Claims (6)
- キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物を液体培地中で培養し、得られた培養菌体または該菌体の処理物を、水性溶媒中でキノリン酸に接触させて6−ヒドロキシピコリン酸を生成、蓄積せしめ、これを水性溶媒より採取することを特徴とする6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
- 培地中に6−ヒドロキシピコリン酸を添加することを特徴とする請求項1に記載の6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
- キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有する微生物がアルカリゲネス属に属する微生物であることを特徴とする請求項1又は2に記載の6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
- アルカリゲネス属に属する微生物がアルカリゲネス sp.UK21(FERM P−16950)である請求項3に記載の6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
- 6−ヒドロキシピコリン酸が、N−位および、または、OH基に置換基を有する化合物、および、または、カルボキシル基がエステル化した化合物である請求項1〜4の何れか一項に記載の6−ヒドロキシピコリン酸の製造方法。
- キノリン酸から6−ヒドロキシピコリン酸を生成する能力を有するアルカリゲネス sp.UK21(FERM P−16950)。
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