JPH0499495A - Ｒ（‐）―マンデル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はＲ（−）−マンデル酸の製造法に関する。

更に詳しくは、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルに対して不斉
加水分解能を有する微生物を用いて、Ｒ（−）−マンデ
ル酸を製造する方法に関する。Ｒ（−）−マンデル酸は
、セフェム系抗生物質の合成原料として、また、多種の
医農薬品の合成原料として工業的に重要である。

〔従来の技術とその問題点） Ｒ（−）−マンデル酸の製造法として公知のものに化学
的に合成したＲ、Ｓ−マンデル酸（ラセミ体）を（１）
分別結晶によるラセミ分割（特開昭５８−１７７９３３
号公報参照）　、（２）クロマトグラフィーにょるラセ
ミ分割（ＥＰ　９８７０７号公報参照）　、（３）ラセ
ミ体エステルと成し酵素的不斉加水分解にょるラセミ分
割ＣＫ、　Ｍｏｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ　３６．９１（１９８０）参照〕するなどのラ
セミ分割法、（４）キラル試薬を用いた化学的不斉合成
法［Ｄ、Ａ、　Ｅｖａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｊ。

＾−，Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　　■Ｌ、　４３４６　（
１９８５）参照〕などがｇる。また、生物学的方法とし
ては、上記のエステル不斉加水分解法のほかに、（５）
ベンゾイルギ酸の微生物的不斉還元法（特開昭５７−１
９８０９６号公報参照）　、（６）Ｄ−オキシニトリラ
ーゼにより不斉合成した１１（−）−マンデロニトリル
の加水分解（特開昭６３−２１９３８８号公報参照）、
（７）アルカリ土類金属、シュウトモナス属、ロドシュ
ウドモナス属、コリネバクテリウム属、アシネトバクタ
−属、バチルス属、マイコバクテリウム属、ロドコッカ
ス属またはキャンディダ属の微生物によるラセミ体のマ
ンゾロニトリルまたはマンデルアミドの不斉加水分解に
よるＲ（−）−マンデル酸の製造法（特開平２８４１９
８号公報参照）などが知られている。

しかし、ラセミ分割による方法はいずれの方法において
もプロセスの複雑化と各段階での収率の低下を引き起こ
すこと、キラル試薬を触媒とした不斉合成法ではキラル
試薬が高価である上に高い光学純度の生成物が得にくい
という問題がある。

生物学的方法であるベンゾイルギ酸の不斉還元法におい
ては基質の合成とＮＡＤＨ再成系の維持に難点が有り、
またＤ−オキシニトリラーゼ法は未だ充分な工業化研究
が行なわれていない、ラセミ体のマンゾロニトリルまた
はマンデルアミドからのＲ（−）−マンデル酸の生産に
関しては、ラセミ体の原料から直接優位量の光学活性体
を得るものではなく、残存する他方の光学活性を有する
未反応のニトリルもしくはアミドは回収され酸を用いた
加水分解により他方の光学活性な有機酸に変換されるか
、アルカリ処理によりラセミ体となし再び原料として使
用され、Ｒ（−）−マンデル酸の生産に利用されている
。この方法においても残存する他方の光学活性なマンゾ
ロニトリルまたはマンデルアミドの分離とアルカリ処理
によるラセミ化反応のプロセスは複雑となり、収率の低
下も引き起こされることになる。

このように従来の方法は種々の問題点を含み、いずれも
工業的に有利なＲ（−）−マンデル酸の製造法とはなり
難い。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らはＲ，Ｓ−マンデロニトリルまたはベンズア
ルデヒドと青酸を原料とし、Ｒ（−）−マンデル酸を工
業的に有利に製造する方法の開発を目的として検討を進
めた結果、先に、ソニートモナス（Ｐｓｅｕｄｏｓｏｎ
ａｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）
属、アシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）
属またはカセオバクタ−（Ｃａｓｓｏｂａｃｔｅｒ）属
等の微生物を用いて、中性付近ないし塩基性の水性媒体
中で、Ｒ３−マンデロニトリルまたはベンズアルデヒド
と青酸からほぼ化学量論的にＲ（−）−マンデル酸を生
成し得ることを見出し特許出願した（特願平２−８０６
９４号明細書参照）、その後、さらにマンゾロニトリル
の不斉加水分解活性を有する優れた微生物の探索を進め
た結果、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、ブレビ
バクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属また
はオーレオバクテリウム（＾ｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕ
簡）属に属する微生物を用いても上記同様な効果が得ら
れることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテ
リウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはオー
レオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕａ）属
に属し、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルのニトリル基を立体
選択的に加水分解する能力を有する微生物または該処理
物を、中性付近ないし塩基性の水性媒体中でＲ，Ｓ−マ
ンデロニトリルまたはベンズアルデヒドと青酸の混合物
に作用させることにより、原料のＲ，Ｓ−マンデロニト
リルまたはベンズアルデヒドと青酸から直接優位量のＲ
（−）マンデル酸を生成せしめることを特徴とするＲ（
−）−マンデル酸の製造法、である。

上記したところを要旨とする本発明は、Ｒ，Ｓ−マンデ
ロニトリルが、中性付近ないしは塩基性の水性媒体中で
、ベンズアルデヒドと青酸との間で解離平衡することに
よりマンゾロニトリルが容易にラセミ化するという性質
を利用し、このラセミ化反応の系とマンゾロニトリルの
不斉加水分解活性を有する微生物とを共役させることに
より、Ｒ，Ｓマンゾロニトリルを直接Ｒ一体優位にＲ（
−）−マンデル酸に変換し得るとの本発明者らにより見
出された知見に基づくものである。

本発明で使用する微生物は、例えば、ノカルディア　ア
ステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ａｓｔｅｒｏｉｄｅ
ｓ）ＩＰｏ　３３８４、バチルス　サブチリス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　ＡＴＣＣ２１６９７
、ブレビバクテリウム　アセチリカム（Ｂｒｅｖｉｂａ
ｃｔｅｒｉｕ閣ａｃｅｔｙｌｊｃｕ−）　　ＩＡＭ　１
７９０およびオーレオバクテリウム　テスタセウム（Ａ
ｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕａ　ｔｅｓｔａｃｅｕｍ）　
ＩＡＭ　１５６１が挙げられ・またこれらの変異株を用
いることもできる。

これらの微生物はいずれも公知であり、財団法人　醗酵
研究所（ＩＦＯ）　　アメリカン　タイプカルチャー　
コレクション（ＡＴＣＣ）または東京大学応用微生物研
究所（ＪＡＭ）から容易に入手することができる。

次に本発明の実施態様について説明する。

本発明に使用される微生物の培養は資化し得るグリセロ
ール、グルコース、サッカロースなどの炭素源、尿素、
硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素源、微
生物の生育に必須の塩化マグネシウム、塩化カルシウム
、塩化鉄などの無機栄養素などを含有した通常の培地を
用いて行なわれる。またこれらの培地に酵母エキス、肉
エキス、糖蜜などの天然培地を添加したものも使用する
ことができる。

培養初期または中期に生育を大きく阻害しない濃度のケ
イ皮酸ニトリル、ベンジルシアニド、イソブチロニトリ
ル、ベンゾニトリル、１−シクロヘキセニルアセトニト
リル、β−フェニルプロピオニトリル、４−シアノピリ
ジン、フェニルスルフォニルアセトニトリル、Ｔ−ブチ
ロニトリルなどのニトリル類またはイソブチルアミド、
４−ピリジンカルボン酸アミド、フェニルアセトアミド
などのアミド類を酵素誘導物質として添加することによ
り高い酵素活性が得られる。

使用する培地のｐＨは４〜１０、培養温度は５〜５０工
の範囲で選べばよく、培養は１〜１４日程度、好気的に
行ない活性が最大となるまで継続すればよい。

Ｒ，Ｓ−マンデル酸の不斉加水分解反応は、上記の方法
にて培養した微生物の菌体または菌体処理物（菌体の破
砕物、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素等）を、水また
は緩衝液等の水性媒体中で、マンゾロニトリルまたはベ
ンズアルデヒドと青酸の混合物に接触させることによっ
て行われる。

本発明においては、前述のようにマンゾロニトリルをラ
セミ化するために、反応系を中性付近なむ）しは塩基性
に保つことが必須であり、ｐＨを４〜１１・好ましくは
６〜１０に調整する。その他、本発明における反応条件
は、ベンズアルデヒドや青酸に対する酵素の感受性によ
り一概に特定し得ないが、通常反応液中のマンゾロニト
リルは０．１〜２．０重量％、好ましくは０．２〜１．
０重量％、ベンズアルデヒドは０．１〜１．０重量％、
好ましくは０．１〜０．５重量％、青酸は０．１〜０．
５重量％、好ましくは０．１〜０．２重量％であり、マ
ンゾロニトリルに対する微生物等の使用量は、乾燥面体
として０．０１〜５．０重置％、反応温度は０〜５０°
Ｃ１好ましくは１０〜３０°Ｃで０．１〜２４時間反応
させればよい。

かくして、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルまたはベンズアル
デヒドと青酸は水性媒体中で起こるラセミ化反応とニト
リルの不斉加水分解反応との共役により高収率で光学活
性なＲ（−）−マンデル酸に変換され蓄積される。生成
物の単離は、濃縮、イオン交換、電気透析、抽出、晶析
などの公知の方法を利用して行うことができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、ラセミ体のＲ，Ｓ−マンデロニトリル
またはベンズアルデヒドと青酸から直接優位量（５０〜
１００χ）のＲ（−）−マンデル酸が製造でき、化学量
論的に全ての原料をＲ（−）−マンデル酸に変換するこ
とも可能であり、極めて効率のよいＲ（−）マンデル酸
の製造法を提供し得る。

〔実験例〕

次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１および比較例１ （１）　　　培　　養 表１に示す微生物を下記の条件で培養した。

）培　地 グリセロール 酵母エキス リン酸−カリウム リン酸ニナトリウム 硫酸ナトリウム ０．５ ０．０２ ０．６８ ０．７１ ０．２８ （ｗ／ｖ） （ｗ／ν） （ｗ／ｖ） （ｗ／ｖ） （−／ν） 塩化マグネシウム　　　０．０４％（ｗ／ν）塩化カル
シウム　　　　　０．００４％（賛ハ）硫酸マンガン　
　　　４Ｘ１０−’％（ｗハ）塩化鉄　　　　　　　６
Ｘ１０−’％（ｗ／ｖ）硫酸亜鉛　　　　　　３Ｘ１０
−’％（ｗ／ｖ）寒　　天　　　　　　　　　　　　　
　１，８　　％　（ｗ／ν）ベンジルシアニド　　　　
０．０５％（ｗ／ｖ）ｐｉ（７，５ ｊ）培養条件 斜面培地から１白金耳の菌体を採り、上記平板培地上に
塗布し、３０゛Ｃで７２時間好気条件下で培養した。

（２１Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルからのＲ（−）−マン
デル酸の生産 平板培地から菌体を採取し遠心分離により各々の菌体を
５０ｍＭＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７，５）で３回洗浄した
。沈殿菌体を１．５ｄの同様の緩衝液に再懸濁し、終濃
度１４＋＋Ｍのラセミ体のマンゾロニトリルを添加し３
０°Ｃで２４時間振盪しながら反応を行った０反応終了
後、各々の反応液を遠心分離し菌体を除去し遠心上清中
のマンデル酸の含量を液体クロマトグラフィー（カラム
、　５ＩＩＯＤＥＸ　００ＳＦ５１１Ａ、キャリア；０
．２Ｍ　ＨｓＰＯ４ニアセトニトリル−４＝１、モニタ
ー−２０８ｎｍ）で分析し、生産されたマンデル酸の光
学純度を液体クロマトグラフィー（カラム；　Ｃ）ＩＩ
ＲＡＬＰＡＫＷ）Ｉ、キャリア；　０．２５ｓ＋Ｍ硫酸
銅水溶液、モニター；２０８ｎ＋＊）で分析した。

尚、比較の為、特開平２−８４１９８号公報記載のアル
カリゲネス　フェカリス＾ＴＣＣ８７５０株についても
、上記同様に培養し加水分解反応（比較例１）を試みた
。

結果を表−１に示した。

実施例２ （１）　　培養 オーレオバクテリウム　テスタセウムＪＡＭ　１５６１
株を実施例１と同様の培養条件で培養した。

（２）　　ベンズアルデヒドと青酸からのＲ（−）−マ
ンデル酸の生産 得られた培養液から実施例１と同様の方法で菌体を取得
し、５０ｍＭリン緩衝液（ｐＨ７，５）　１．５ｍに懸
濁し、休止菌体懸濁液を調製した（ＯＤｉｓ。＝４０）
この液にベンズアルデヒドと青酸を各々につ％ｚで終濃
度１５１１Ｍとなる欅な濃度に添加し、３０°Ｃで２４
時間振盪しながら反応を行った０反応終了後、遠心分離
により菌体を除去し、得られた遠心上清中のマンデン酸
の含量と光学純度を実施例１と同様の分析条件で分析し
たところ、光学純度９７．１％ｅｅのＲ（−）−マンデ
ル酸を１３．５−蓄積しており・変換収率は９０．０％
であった。

＼＼ ＼、

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、バチルス（Ｂａ
   ｃｉｌｌ−ｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属またはオーレオバクテリウム（
   Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属し、Ｒ，Ｓ−マ
   ンデロニトリルのニトリル基を立体選択的に加水分解す
   る能力を有する微生物または該処理物を、中性付近ない
   し塩基性の水性媒体中で、Ｒ，Ｓ−マンデロニトリルま
   たはベンズアルデヒドと青酸の混合物に作用させること
   により、原料のＲ，Ｓ−マンデロニトリルまたはベンズ
   アルデヒドと青酸から直接優位量のＲ（−）−マンデル
   酸を生成せしめることを特徴とするＲ（−）−マンデル
   酸の製造法。