JPH01317394A - Ｌ―α―アミノ酸類の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 崖１」Ｊυ限止汰顆 本発明は、微生物を利用してＤＬ−α−アミノニトリル
化合物から相当するし一α−アミノ酸類を製造する方法
に関する。Ｌ−α−アミノ酸類は、食品、飼料、医薬及
び化粧品等の種々の分野に利用される重要な化学物質で
ある。

狐米茨街 従来、Ｌ−α−アミノ酸類を製造する方法としては、発
酵法、合成法、酵素法及び抽出法が知られている。これ
らの方法のうち、合成法によるし一α−アミノ酸の製造
は、ストレッカー法或はその変法を用いてＤＬ−α−ア
ミノ酸を合成し、次いで該アミノ酸を光学分割して！、
−α−アミノ酸を製造するものであって、光学分割の方
法としてアミノアシラーゼを用いる酵素法等を採用して
いる（「化学」誌増刊「不斉合成と光学分割の進歩」昭
和５７年１０月１５日発行、第１７５頁）。

しかし、上記合成法によるし一α−アミノ酸の製造法は
、光学分割段階においてコスト高となるため、経済的理
由から近年、アミノ酸の製造に占める割合が徐々に低下
してきている。

また、上記ストレッカー法によるα−ア°ミノ酸の合成
における合成中間体である　α−アミノニトリルから微
生物を利用して　α−アミノ酸を製造しようとする試み
も報告されている（Ｙ、Ｆｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、、
［ジャーナルオブフアーメンテーションテクノロジイＪ
　（Ｊ、Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｔｅｈｎｏｌ、）　４９．１
０１１　（１９７１）　）。

しかし、この報告では、コリネバクテリウム（Ｃｏｒ−
ｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、）に属する微生物を
用いてＤＬ−α−アミノプロピオニトリル並びにＤＬ−
α−アミノイソバレロニトリルを加水分解してＤＬ−ア
ラニン並びにＤＬ−バリンを製造するものであって、Ｌ
−α−アミノ酸は直接得られない。また、ブレビバクテ
リウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、）の
菌株Ｒ３１２を用いてＤＬ−α−アミノニトリルを加水
分解してアミノ酸を製造する報告（Ｊ−ＣＪａｌｌａｇ
ａｓ　ｅｔ　ａｌ。

「アドバンヌオブバイオケミカルエンジニアリングＪ　
（Ａｄｖ、Ｂｉｏｃｈｅ＊、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ＋
）１４．１　（１９Ｂ０）〕においても、ＤＬ−α−ア
ミノニトリルからはＤＬ−α−アミノ酸しか得られてい
ない。因に、上記報告は、ブレビバクテリウム属の菌株
Ｒ３１２から得られた変異株であるブレビバクテリウム
ｓｐ、Ａ４を用いることによりＤＬ−α−アミノニトリ
ルからし一α−アミノ酸とＤ−α−アミノ酸アミドとを
生成し得ることを開示しているが、ＤＬ−α−アミノニ
トリルからし一α−アミノ酸のみを直接得ることに関し
ては、未だ報告はみられない。

また、特開昭６１−１６２１９１においてもα−アミノ
ニトリル化合物からはＤＬ−アミノ酸が産生されること
が開示されているように、α−アミノニトリル化合物か
らし一α−アミノ酸を直接得た例は報告されていない。

■が解・　しようとする課 本発明は、特定な属から選択されるニトリルの加水分解
能を有する微生物を利用して、ＤＬ−α−アミノニトリ
ル類から直接Ｌ−α−アミノ酸頚を製造するための方法
を提供することを課題とする。

本発明は、ノカルデイア属、ミコバクテリウム属に属す
るニトリル加水分解能を有する微生物をｐＨ８〜１２の
条件下、主としてアムモニア系緩衝液中でＤＬ−α−ア
ミノニトリル類に作用させるとＬ−α−アミノ酸類を選
択的に産生ずることの知見に基いてなされたものである
。

以下本発明の詳細な説明する。

又肌■盪虞 本発明の構成上の特徴は、ノカルデイア属、ミコバクテ
リウム属に属する群から選択されるニトリル加水分解能
を有する微生物を、ｐＨ８〜１２の条件下、主としてア
ムモニア系緩衝液中でＤＬ−α−アミノニトリル化合物
に作用させてＬ−α−アミノ酸を選択的に生産させるこ
とにある。

課　を解・するための　ｒ 本発明において利用される微生物は、上述のごとく、ノ
カルデイア属、ミコバクテリウム属に属する群から選択
されるニトリルの加水分解能を有するものであって、下
記表１に示すものが例示し得る。

表　　１ これらの微生物は工業技術院微生物工業技術研究所に表
１に示した寄託受理番号で昭和６２年１１月５日付で寄
託されている。

次に、玉出の各微生物の菌学的性状を表２に示す。

表２にみられるとおり、本発明で利用される微生物はい
ずれもダラム陽性の好気性菌であって、嫌気状態では全
く生育しない。また、運動性を示さず、カフラーゼは陽
性であって、耐熱性の胞子を形成しない。また、多形性
を示し、培養初期には菌糸状細胞が多く、分岐した細胞
や球形の細胞も認められる。糖の利用性については、糖
からガスを生成せず、酸生成力は微弱でリドマスミルク
に培養するとアルカリ性を示してミルクを青変する。

上記各微生物のうち、ノカルデイアｓｐ、　Ｐ　Ｃ２９
は、肉汁寒天上ではやや乾いたシワ状の集落を作り、培
養初期には分岐の著しい菌糸状の生育を示し、５〜３２
℃で生育するが、３７℃では生育しない。

一方、ノカルデイアｓｐ、　Ｐ　Ａ−３４、ＡＢ−１６
並びにＢＡ−１は、５〜１０℃では生育しないが、３７
〜４２℃でも生育し、いずれも培養初期に菌糸状となり
、その後に多数の０ｉｄｉｏｓｐｏｒｅ（分裂子）様の
球状細胞を生ずる。

ミコバクテリウムｓｐ、　Ａ　Ｂ−４３は、抗酸性染色
（Ａｃｉｄ−ｆａｓｔｓｔａｉｎ）が陽性で４５℃では
生育せず、粘性の黄橙色の集落を作る。

上記微生物は、それらの表２及び上述した性状に鑑み、
パーシイ　マニュアルオブシステイマテイツクバクテリ
オロジイ（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆＳｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、１９８
４）に基いて同定した。

本発明において、上記各微生物を利用してＬ−α−アミ
ノ酸を生産するのに用いる基質であるＤ　Ｌ−α−アミ
ノニトリル化合物（以下原料ニトリルと略記する）は、
例えば〔［オルガニック　シンセシスコレクテイブボリ
ウム（Ｏｒｇ、Ｓｙｎ、Ｃｏ１．Ｖｏｌ、）　Ｉ　、ｐ
、２１、及びＩ［ｌ、ｐ、８４　Ｊ　）並びに（Ｙ、Ｆ
ｕｋｕｄａ　ｅｔ　ａｌ、、　ｒジャーナルオブフアー
メンテーションテクノロジイＪ　（Ｊ、ＦｅｒｍｅｎＬ
、Ｔｅｃｈｎｏｌ、、）旦、１０１１（１９７１））等
に記載された方法に従って容易に合成し得る。

本発明のＤＬ−α−アミノニトリル化合物の一船式（１
）、（２）におけるＲには特に制限がないが、置換アル
キル基等のそれぞれに含まれる置換基は例えばヒドロキ
シ、メトキシ、メルカプト、メチルメルカプト、アミノ
、ハロゲン、カルボキシル、カルポクサミド、フェニル
、ヒドロキシフェニルあるいはグアニルなどである。

ＤＬ−α−アミノニトリル化合物としては、２−アミノ
プロパンニトリル、２−アミノブタンニトリル、２−ア
ミノ−３−メチルブタンニトリル、２−アミノ−４−メ
チルペンタンニトリル、２−アミノ−３−メチルペンタ
ンニトリル、２−アミノ−３−ヒドロキシプロパンニト
リル、２−アミノ−３−ヒドロキシブタンニトリル、２
−アミノ−５−グアニジノペンタンニトリル、２−アミ
ノ−３−メチルカプトプロパンニトリル、２．７−ジア
ミツー４．５−ジチアオクタンニ）・リル、２−アミノ
−４−メチルチオブタンニトリル、２−アミノ−３−フ
ェニルプロパンニトリル、３−（４−ヒドロキンフェニ
ル）プロパンニトリル、３−アミノ−３−シアノプロパ
ン酸、４−アミノ−４−シアノブタン酸、３−アミノ−
３−シアンプロパンアミド、４−アミノ−４−シアノブ
タンアミド、２．６−シアミツヘキサンニトリル、２．
６−ジアミツー５−ヒドロキシヘキサンニトリル、２−
アミノ−３−（３−インドリル）プロパンニトリル、２
−アミノ−３−（４−イミダゾイル）プロパンニトリル
、２−シアノピロリジン、２−シアノ−４−ヒドロキシ
ピロリジン、２−アミノ−２−フェニルエタンニトリル
等を例示し得る。

本発明において、上記各原料ニトリルに、ノカルデイア
属、ミコバクテリウム属に属するニトリルの加水分解活
性を有する前記の各微生物を作用させてＬ−α−アミノ
酸を生産するには、例えば下記（ａｌ乃至（Ｃ１のいず
れかの方法を適用するとよい。

すなわち、（ａ）　ｍ生物を、ニトリル化合物、例えば
プロピオニトリルを含む培地中で培養して増殖して得ら
れた菌体に、原料ニトリルを接触させて反応させる方法
、（ｂ１ｍ生物を予め培養し、増殖して得られた菌体を
ニトリル化合物、例えばプロピオニトリルに接触させた
後、該菌体に原料ニトリルを加えて反応させる方法、及
び（Ｃ１ｉ生物を予め培養し、増殖して得られた菌体に
原料ニトリルを直接接触させて反応させる方法を適用す
る。

これらの反応方法では、微生物として増殖後の菌体の破
砕物、乾燥菌体、あるいは分離精製されたニトリルの加
水分解酵素などの菌体処理物、あるいは常法に従って固
定化した菌体および菌体処理物を用いることもできる。

上記（ａｌ及び（ｂｌの方法で用いるニトリル化合物と
しては、プロピオニトリルのほかに、アセトニトリル、
ｎ−ブチロニトリル、ｎ−カプロニトリル、メタクリロ
ニトリル、イソブチロニトリル、ゲルタロニトリル、ト
リアクリロニトリル、クロトノニトリル、ラクトニトリ
ル、サクシノニトリル、アクリロニトリル、ベンゾニト
リル及びフェニルアセトニトリル等を例示し得る。

上記ｆａ）の方法では、ニトリル化合物のほかに、炭素
源としてグルコース、シュクロース、糖蜜、澱粉加水分
解物のような糖質、もしくは酢酸等のごとき菌体増殖作
用を有する物質を培地に添加し、更に、塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸アン
モニウム、尿素、アムモニア水、硝酸ナトリウム、アミ
ノ酸及びその他の資化性有機窒素化合物のような窒素源
、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン、硫酸第１鉄、塩化第２鉄、塩化カル
シウム、塩化マンガンのごとき無機塩類、及びホウ素、
銅、亜鉛などの塩、すなわち、いわゆる微量元素、更に
は必要に応じてビタミン類、酵母エキス、コーンステー
プリカーの如き成長促進物質を添加した培地に、上記各
微生物の種菌を接種し、好気的条件下で培養して菌体を
増殖させる。このようにして得られた菌体培養物、又は
該培養物から分離した菌体の懸濁液あるいは菌体処理物
に、原料ニトリルを供給して反応させる。

反応は、ｐ（１８〜１２の範囲で１〜６日間行う。この
範囲外のｐＨでもＬ一体に富んだα−アミノ酸が生成す
るが、光学純度が低く実用的でない。反応には種々の緩
衝液を用い得るが、アンモニウムの緩衝液がよく、アム
モニア水と塩化アンモニウム水溶液の混合物、アムモニ
ア水と硫酸アンモニウム水ｉ８　’ｔ＆の混合物、アム
モニア水と酢酸アンモニウム水溶液との混合物、アムモ
ニア水と燐酸アンモニウム水ｉ８　？１１との混合物等
が好ましい。また、ｐｌ＋調節剤として用いるアルカリ
としてはアムモニア水が好ましい。

反応温度は２０〜７０℃の範囲が好ましく、また、反応
中に菌体増殖に用いた上記炭素源、窒素源、その他の成
分を適宜添加して菌体濃度や菌体のニトリル加水分解能
を維持し、かつ高めることができる。

また、原料ニトリルの供給方法としては、反応の開始時
に添加する方法および連続的に添加する方法のいずれを
も用いることができる。

上記反応により生成したし一α−アミノ酸は、相分離、
濾過、抽出、カラムクロマトグラフィー等の公知の手段
を適用して分離、採取する。

次に、前記ｔｂ＋の方法では、上記（ａｌの方法におけ
る菌体の培養増殖時にニトリル化合物を加えずに、菌体
の増殖後にニトリル化合物を加えて該菌体微生物のニト
リル加水分解能を活性化した後、原料ニトリルに反応さ
せてＬ−α−アミノ酸を生産させる。

また、前記（Ｃ１の方法は、上記［ｂｌの方法における
菌体の増殖後に直ちに原料ニトリルを加えて反応させて
Ｌ−α−アミノ酸を生産させるものである。

なお、上記（ｂｌ及び（Ｃ１のいずれの方法においても
、培養条件、反応条件及び生成したし一α−アミノ酸の
分離、採取には、前記ｆａｔの方法におけるものを適用
し得る。

上述のごとくして本発明に従って得られるし一α〜アミ
ノ酸は、食品、飼料、医薬及び化粧品等の種々の分野に
おいて利用される。

光夙■四果 以上述べたとおり、本発明によると、微生物を利用して
ＤＬ−α−アミノニトリル化合物から直接Ｌ−α−アミ
ノ酸類を選択的に製造し得るので、上記様々の分野にお
いて利用されるし一α−アミノ酸の製造上有益である。

以下実施例により本発明を具体的に説明する。

実施例　１ ■培地の調製 下記組成の培地１００＋＊　ｊ！を、５００ｍ　ｌ容フ
ラスコに収容して１２０℃で２０分間オートクレーブで
殺菌した後、０．２μのミリポアフィルタ−で除菌した
プロピオニトリル１ｍｌを加えて菌体調製用培地とした
。

培地組成ニ ゲルコース　　Ｍｎｊ！　　　　１０　　　ｇ／ｌ酵母
エキス　　　　　　　０．１　　ｇｅｅＮａＨＰＯ（１
２１１２０２，５ｇ／　ＩＫＨｇＰＯ＊　　　　　　　
　　　２．Ｏｇ／　ｌＭｇ５Ｏ，・７Ｈ２００，５ｇ／
ｊ！ Ｆｅ５Ｏｓ’７ＨｚＯＯ，０３ｇ／ｌ ＣａＣ１ｚ’２ＨｚＯＯ，０６ｇ／ｌ ｐＨ７，２ 使用菌株： 璽−抹一各　　　　　　　　　　　ＦＥＲＭ−ＢＰＩｌ
ｈ）力ルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、）　Ｐ　Ｃ
−２９１５６１ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ
、）　Ｐ　Ａ　−３４１５５９ノカルデイア（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ　ｓｐ、）　Ａ　Ｂ　　１６　　　　　　　１
５５５ノカルデイア（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｓｐ、）　Ｂ
　Ａ　　１　　　　　　　１５５７ミコバクテリウム（
門ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、）　Ａ　Ｂ−４３
１５５６■菌体の培養増殖 上記培地に下記の７種の菌株の３白金耳をそれぞれ接種
し、３０℃の温度に、１４０ｒｐｍで４８時間振とう培
養を行った。

上記培養により得られた菌体を遠心分離で分離し、Ｎｔ
１４Ｃ１−ＮＨｓの０．１Ｍ緩衝？＆（ｐＨ１０）で１
回洗浄後、光学的濃度（ＯＤ）が４０にとなるようにＮ
ｉｌ、Ｃｌ−Ｎ１１１の０．１？Ｉ緩衝液に再懸濁した
。

■反応 上述のようにして得られる各菌体懸濁液５ＩＩ＋１を、
φ２４ｍｍの試験管に収容し、これにＤＬ−２−アミノ
−２−フェニルエタンニトリル５０ｍｇを加えて密栓し
、３０℃の温度に、３０Ｏｒｐｍで４８時間振とう培養
を行った。

反応終了後、反応液をヘキサン５ｍｌを用いて２回抽出
し、得られた水相を高速液体クロマトグラフィーで分析
した。

生成したし一フェニルグリシン定量はアミノ酸分析計（
ベックマン社製７３００型）を用いて行い、その絶対配
置と光学純度の決定はＣ）ＩＩｌ？ＡＬＰＡＫ　ＷＭ（
ダイセル化学工業社製）をカラムとする高速液体クロマ
トグラフィーを用いて行った。結果は表３に示すとおり
である。

実施例　２ ノカルデイアｓｐ、ＰＡ−３４を用い、実施例１に記載
したと同様の手順で菌懸濁液を調製した。

調製した菌懸濁液５００ｍ　Ｉｌを１．２　ｆｆの発酵
槽に収容し、これにＤＬ−２−アミノ−３−メチルブタ
ンニトリル４　、９ｇ　（５０＋ｍｍｏ　Ｉ　）を加え
、ＰＨを４規定のアンモニア水で１０．０±０．１に保
ちながら、反応温度３０’Ｃ，Ｂ！拌回転数７０Ｏｒｐ
ｍで、４８時間反応させた。

反応終了後、反応液を遠心分離して得られる上清を０，
４５μのミリポアフィルタ−で濾過し、得られた水層を
高速液体クロマトグラフィーで分析した。

Ｌ−バリンの菌濃度は０．５ｍｇ／ｍ　１、光学純度は
６７％ｅ、ｅ、であった。なお、このＬ−バリンの定量
は、カラム充填剤として、Ａｓａｈｉｐａｋイナートシ
ルＯＤＳ　（旭化成工業製）を用いて行い、その絶対配
置と光学純度の決定には同じ＜　ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ　
ｌｌ１）ｌ　（ダイセル化学工業製）を用いて行った。

次に、対照として比較例を示す。

比較例　ｌ ＰＨを４規定のアンモニア水及び１規定のＨＣＩで７．
０　±０．１に調節する以外は実施例２６ご記載した方
法で反応させ、分析した。Ｌ−バリンの菌濃度は３．５
ｍｇ／ｍ　ｆ、光学純度は３２％ｅ、ｅ、たった。

比較例　２ 実施例１に記載したと同様の手順で培養して得られた菌
体を遠心分離した後、０．１ＭのＮａＪＰＯ，、−Ｋｌ
ｌ！ＰＯ，緩衝液（ＰＨ７，０）で２回洗浄した後、光
学的濃度（ＯＤ）が４０となるように、０．１ＭのＮａ
ｚｌｌＰＯ４−Ｋｌｌ□ｐｏ、緩衝液に再懸濁した。得
られた菌懸′／ｒｊＪ液を用い、比較例１に記載したと
同様の手順で反応を行った。Ｌ−バリンの菌濃度は４．
３ｍｇ／ｍ　Ｉｌ、光学純度は１７％ｅ、ｅ、だった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（１）及び（２） ▲数式、化学式、表等があります▼（１）▲数式、化学
   式、表等があります▼（２） （ただし、式中Ｒはアルキル基、置換アルキル基、フェ
   ニル基、置換フェニル基、イミダゾリル基、置換イミダ
   ゾリル基、インドリル基、置換インドリル基、フリル基
   、置換フリル基、ピリジル基、置換ピリジル基、チアゾ
   リル基、置換チアゾリル基を示す） で表わされるニトリル化合物に、ノカルデイア属、ミコ
   バクテリウム属に属し、ニトリル加水分解活性を有する
   微生物をｐＨ８〜１２の範囲内で作用せしめることを特
   徴とするＬ−α−アミノ酸類の製造方法。