JPH0231694A - 光学活性なα‐アミノ酸及び／又はα‐アミノアミドの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は光学活性なα−アミノ酸及び／又はαアミノア
ミドの製造法に関し、詳しくは特定の微生物を使用して
該α−アミノ酸及び／又はα−アミノアミドを効率よく
製造する方法に関する。

〔従来の技術、発明が解決しようとする課題〕Ｌ−アラ
ニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシンなどの天然アミノ
酸の需要は順調に伸びており、非天然型のし一アミノｊ
唆、Ｄ−アミノ酸についても医薬中間体、甘味剤原料等
としての利用が拡大されつつある。

ところで、光学活性なα−アミノ酸やα−アミノアミド
の製造は合成法のばか微生物を使用する方法によっても
行なわれている。たとえばＤ，Ｌα−アミノニトリルに
プレビハクテリウムコンカス（旧ｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）
またはハクテリジウム’　（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）
に属する微生物を作用させてＬα−アミノ酸とＤ−α−
アミノアミドを生成せしめ、後者についてはさらに微生
物を用いて相当するＤ−α−アミノ酸を変換させる方法
が提案されている（特表昭５６−５００３１９号公報）
。しかし、この方法は目的とするアミノ酸の生産速度が
遅く、効率的な方法とは云い難い。

また、ニトリル水和酵素を用いてＤ，Ｌ−αアミノニＩ
−ＩＩルから立体選択的に不斉加水分解によってＬ−α
−アミノアミドを得、次いでＬ〜αアミノ酸を生成する
方法も知られている（特表昭６３−５００００４号公報
）、シかしながら、この方法は最も光学純度のよい場合
でも４０％ｅｅであり、満足しうるちのではない、また
、原料のアミノニトリルは不安定であり、蒸留による分
離が困難であること、水溶性のため水？′８液から抽出
するのが容易でない等の問題点があった。

〔課題を解決するだめの手段〕

そこで、本発明者は光学活性α−アミノ酸及び／又はα
−アミノアミドを効率よく生産する方法を開発すべく研
究を重ねた結果、特定の微生物を用いてＩ）　＋’　Ｌ
−α−アミノニトリルを加水分解させることにより目的
物質を効率よく製造できることを見出し、かかる知見に
基いて本発明を完成したのである。

すなわち、本発明はＤ，Ｌ−アミノニトリルを加水分解
し、光学活性なα−アミノ酸及び／又は光学活性なα−
アミノアミドを生産する能力を有する微生物の１種また
は２種以上をＤ　、　Ｌ−αアミノニトリルに接触させ
ることを特徴とする光学活性なα−アミノ酸及び／又は
α〜ルアミノアミド製造法を提供するものである。

本発明に用いられるＤ，Ｌ−α−アミノニトリルとして
は特に制限はなく、各種のものを使用でき、たとえば下
記の一般式【、■で表わされる化合物を挙げることがで
きる。

（式中、ＸとＹは水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン
原子、ヒドロキシメチル基、低級アルキル基を示し、両
者は同じものであってもよく、異なるものであってもよ
い。Ｒ１は水素原子、低級アルキル基を示し、ｎはＯ〜
５の整数である。）ＮＨ。

Ｒ２−とＨＣＮ　　　　　・・・（ＩＩ）（式中、Ｒ２
は低級アルキル基１分子鎖アルキル基、ヒドロキシアル
キル基、アルコキシアルキル基、スルフヒドロキシアル
キル基、シクロアルキル基を示す。） 上記一般式１．ＩＩで表わされる化合物の具体例を示す
と、フェニルグリシノニトリル、ｐ−ヒドロキシフェニ
ルグリシノニトリル、０−ヒドロキシ−ｐ−ヒドロキシ
メチルフェニルグリシノニトリル、α−アミノ−β−フ
ェニルプロピオニトリル、α−アミノ−β−（ｐ−ヒド
ロキシフェニル）プロピオニトリル、α−アミノ−β−
（ｍ、　　ｐジヒドロキシフェニル）−プロピオニトリ
ルα−アミノ−γ−フェニルブチロニトリル、αアミノ
−δ−フェニルペンチルニトリル、α−アミノ−α−メ
チル−α−フェニル−アセトニトリル、α−アミノ−α
−メチル−α−（２−ナフチル）−アセトニトリル、α
−アミノ−α−メチル−β−フェニルプロピオニトリル
、α−アミノプロピオニトリル、α−アミノ−β−アル
コキシプロピオニトリル、α−アミノ−β−スルフィド
ロキシプロピオニトリル、α−アミノブチロニトリル、
α−アミノペンチルニトリル、α−アミノα−メチルプ
ロピオニトリル、α−アミノ−βメチルブチロニトリル
、α−アミノ−β−メチルペンチルニトリル、α−アミ
ノ−Ｔ−メチルメルカプチルブチロニトリル、α−アミ
ノ−γ−メチルペンチルニトリルなどがある。

上記Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリルは合成法によって製造
することができ、たとえば（ａ）アルデヒド類と（ｂ）
青酸もしくは青酸塩および（ｃ）アンモニアもしくはア
ンモニウム塩を水？８７夜中で反応させることにより合
成することができる。また別の合成法としてアルデヒド
類と青酸または青酸塩との反応により生じたシアノヒド
リン類にアンモニアまたはアンモニウム塩を作用させる
方法等もある。ここで、アルデヒド類としてはホルムア
ルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド。

ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、バレルアル
デヒド、イソバレルアルデヒド、カプロンアルデヒド、
グリオキサール、アクロレイン、プロピオールアルデヒ
ド、ベンズアルデヒド、サリチルアルデヒド、３−メチ
ルチオプロピオンアルデヒド、３−フェニルプロピオン
アルデヒドなどを用いることができる。

本発明に用いる原料のアミノニトリルは不安定である上
に水溶性であるため、分離、抽出が困難であるので、合
成法により生成したアミノニトリルを単離することなく
、微生物との反応に供することが好ましい。

上記Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリルを加水分解し、光学活
性なα−アミノ酸及び／又はα−アミノアミドを生産す
るために用いる微生物としては、シュードモナス属、ロ
ドコッカス属あるいはノカルデイア属に属し、Ｄ、Ｌ−
α−アミノニトリルを加水分解し、光学活性なα−アミ
ノ酸及び／又はα−アミノアミドを生産する能力を存す
るものであればよく、具体的にはシュードモナス・エス
ピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、）　ＭＹ−１（
ＦＥＲＭ　Ｐ−９１７４）＋　　ロドコッカス・エリス
ロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅ■ｔｈ覗赳旦旦
（旧名称二〕力ルディア・エリスロポリス（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ肛■紅翌虹亘）ＩＦｏ　１２３２０などがある。

前者、すなわちシュードモナスｓｐ　ＭＹ−１の菌学的
性質の詳細は特開昭６４−１０９９６号明細書に記載さ
れている。これら微生物から人工的変異手段によって誘
導される変異株であっても上記能力を有するものであれ
ば、本発明に使用することができる。

さらに、微生物は様々な形態で使用することができ、た
とえば増殖期の菌体、休止期の菌体、固定化菌体、破砕
菌体などや微生物の培養終了後の培養液自体も用いるこ
とができる。なお、微生物の固定化や破砕処理は常法に
より行なえばよい。

上記微生物を培養するために用いる培地としては、炭素
源、窒素源、無機塩類などを含むものを使用する。炭素
源としては特に制限はないが、グルコース、シュークロ
ース等の糖類；エタノール。

グリセリン等のアルコール類；アセトンなど供試菌が資
化できるものが用いられる。また、窒素源としては硝酸
塩、アンモニウム塩、酵母エキス。

コーン・ステイープ・リカーなどの通常用いられる窒素
源にアセトニトリル、アセトアミド３メタクリルアミド
、クロトンアミド等のニトリル水和酵素誘導窒素源を加
えるか、アセトニトリル、アセトアミド　メタクリルニ
トリル、メタクリルアミド、プロピオニトリル、プロピ
オアミド、りＵトンアミドなどを単独もしくは２種以上
混合して用いる。さらに、鉄塩を培地１ｉあたり１〜５
０Ｑ　ｍｇの割合で加え、必要に応して°？グネシウム
塩。

カルシウム塩、リン酸塩などの無機塩類等を培地に適宜
加えることができる。

本発明の原料である前記Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリルを
上記微生物と接触させ、光学活性なＩ５α−アミノ酸を
生産させるための反応は、温度０〜６０°Ｃ１好ましく
は５〜３０°Ｃ，ｐＨ４〜１１、好ましくは６〜９の条
件下、原料をｔ　ｇ７ｉ〜２００ｇ／ｊ２の濃度として
微生物と接触させることにより行なう。なお、原料の供
給は一度に添加することにより行なってもよいが、好ま
しくは低濃度に抑えられるように、連続的または数回に
分けて添加すべきである。

反応は目的とする光学活性なα−アミノ酸および／また
はα−アミノアミドが十分に生成するまで行ない、生成
物の分離、精製は活性炭、イオン交換樹脂などの通常用
いる手段を適用して行なうことができる。

本発明の方法により得られる光学活性なし一αアミノ酸
は上記一般式Ｉ又はＩＩで表されるアミノニトリルに対
応するアミノ酸があげられるが、具体例を示すと、フェ
ニルグリジン、Ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン、α−
アミノ−β−フェニルプロピオン酸、α−アミノ−Ｔ−
フェニル酪酸。

α−アミノ、α−メチル、α−フェニル醋酸、αアミノ
プロピオン酸、α−アミノ酪酸、α−アミノ、α−メチ
ルプロピオン酸、α−アミノ−βメチルペンタン酸など
がある。また、本発明で得られる光学活性なα−アミノ
アミドは、上記αアミノ酸に対応するものであり、これ
はさらに微生物と接触させるが、鉱酸または酸性上亜硝
酸などを用いる通常の有機化学的手法によって対応する
光学活性なα−アミノ酸に変換することができる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例により詳しく説明する。

実施例１ グリセリンＬｏｇ／ｌ、アセトニトリル５　ｇ／　１．
　。

ＫＨ，ＰＯ４０，５ｇ／ｆｆｉ、ＮａＨＰＯ，，１２Ｈ
ｚ０５ｇ１１．、Ｍｇ５Ｏ，・７ＨｚＯ０，３ｇ／ｌ、
ＣａＣ１！２゜２　Ｈ２Ｏ０，０１ｇ、ｌ、　　Ｆ　ｅ
　ＳＯ４，７Ｈ２Ｏ０，０１ｇ／Ｌ酵母エキス０．０５
ｇ＃！およびコーン・ステイープ・リカー０．０５ｇ＃
！を含む培地（ｐＨｓ、　Ｏ）１０ｍｌｌにシュードモ
ナスｓｐ　ＭＹ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１７４）を植菌
し、３０°Ｃで２４時間培養した。

培養終了後、集菌、洗浄した菌体を２ｇ＃！のＤＬ−フ
ェニルグリシノニトリルを含むｐＨ８のｌ／１５Ｍリン
酸バッファー２　ｍｌに懸濁し、１５°Ｃで３０分間反
応させた。反応液から除菌後、高速液体クロマトグラフ
ィー（ＣＲＯＷＮＰＡＫ　ＣＲ、？容媒１０−２Ｍ過塩
素酸）で分析を行なった。その結果、Ｌ−フェニルグリ
シン１．１ｇとＤ−フェニルグリシンアミド１．１ｇが
生成したことを確認した。

実施例２ グルコース５　ｇ／　ｌ　、　アセトニトリル３　ｇ／
　ｌ　。

ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ／ｊ２．Ｎａ　ＨＰＯ−１２Ｈ２
０１，５ｇ／ＣＭｇＳＯ４７ＨｚＯＯ，２ｇ／Ｌ　　Ｃ
ａ　Ｃ１ｚ・２　　Ｈ２Ｏ０，Ｏｌ　ｇ／ｌ、　　　Ｆ
　　ｅ　　ＳＯ４・　７　　ＨｚＯＯ，０１ｇｅ１．　
　コーン・ステイープ・リカー０．０５ｇ／ｆｆｉおよ
び酵母エキス０．０５ｇ＃！を含む培地（ｐＨ７，Ｏ）
１０ｍｌにノカルデイア・エリスロポリスＩｆ’０１２
３２０を植菌し、３０°Ｃで２４時間培養した。

培養終了後、実施例１と同様にして菌体をＤ，Ｌフェニ
ルグリシノニトリル２　ｇ／　Ｑと反応させた。

その結果、Ｌ−フェニルグリシン１．１８とＤ−フェニ
ルグリシンアミド１．１　ｇが生成したことを確認した
。

実施例３ グリセリンＬｏｇ／ｆｆ、メタクリルアミド５　ｇ／　
ｌ　。

ＫＨ２ＰＯ４０，５ｇ、’Ｆ！、ＮａｚＨＰＯ４−１２
Ｈ，０５ｇ／ｌ、Ｍｇ５Ｏ，・７ＨｚＯＯ，２ｇ／１．
ＣａＣｌ２−２Ｈ２０，０，０１ｇ／Ｉ！、、　　Ｆ　
ｅ　ＳＯ４・７　ＨｚＯＯ，０１ｇ／２．酵母エキス０
．０５ｇ＃！およびコーン・ステイープ・リカー０．０
５　ｇ／−１を含む培地（ｐＨ８）１００ｍｆｆｉにシ
ュードモナス・エスピー１’１Ｙ−１（ＦＥＲＭＰ−９
１７４）を植菌し、３０°Ｃで２４時間培養した。

培養終了後、集菌、洗浄した菌体を２　ｇ／　ｌのり。

Ｌ−ハリノニトリルを含むｐ１１８の１　／　１５　Ｍ
リン酸ハソファ−１０ｍ１に懸濁し、１５°Ｃで３０分
間反応させた。反応液から除菌後、高速液体クロマトグ
ラフィー（ＣＩＩｒＲＡＬ　ＣＥＬ　ＷＨ，溶媒：０．
２５ｍＭ硫酸銅）で分析を行なった。その結果、９８％
ｅｅ以上のし一バリン１ｇ／２が得られたことを確認し
た。

実施例４ 実施例３において、Ｄ、Ｌ−ハリノニトリルの代わりに
Ｄ，Ｌ−アラニノニトリルを用いたことおよび反応生成
物の分析を陰イオン交換樹脂アンバーライｌ−４００Ｂ
を用いてアミノ酸画分およびアミド画分に分けた後、高
速液体クロマトグラフィー（ＣＲＯＷＮＰＡＫ　ＣＲ，
溶媒；ｐＨ２の過塩素酸）で行なったこと以外は実施例
３と同様の操作を行なった。その結果、９８％ｅｅのＤ
−アラニン１８／Ｉ！、と９８％ｅｅのＬ−アラニンア
ミド１　ｇ／　ｌが生成したことを確認した。

実施例５ 実施例３において、Ｄ、Ｌ−バリノニトリルの代わりに
Ｄ，Ｌ−ノルロイジノニトリルを用いたことおよび反応
生成物の分析を高速液体クロマトグラフィー（ＣＲＯＷ
ＮＰＡＫ　ＣＲ，溶媒：ｐＨ２の過塩素酸）で行なった
こと以外は実施例３と同様の操作を行なった。その結果
、８０％ｅｅのＬ−ノルロイシン１３ｇ／ｌと７６％ｅ
ｅのＤ−ノルロイシンアミド０．８ｇ＃！が生成したご
とを確認した。

実施例６ 塩化アンモニウム９０ｍｇおよびシアン化カリウム１０
０　ｍｇを水０．６ｍｌに溶かした溶液をナス型フラス
コにとり、２８％アンモニア水溶液０．２４ｍｌを加え
た後、冷水中で冷やしながらイソブチルアルデヒドを０
．１４ｍ１に滴下した。次いで、２時間攪拌を続けてＤ
，Ｌ−バリンニトリルを得た。

その後、減圧下に過剰のアンモニアを留去し、ｐＨを８
に調整した。このＤ　、　１．、−バリンニトリル水溶
液に実施例３と同様の方法で培養、集菌、洗浄したシュ
ードモナス・エスピーＭＹ−１（ＦＩＲＭ　Ｐ−９１７
４）を加え、液量が８６ｍ１、菌濃度がＯＤ６１０　；
　１０となるようにした。１５°Ｃで３０分間反応させ
た後、実施例３と同様にして反応生成物の分析を行なっ
た。その結果、９７％ｅｅのＬ−バリンが０．７ｇ／ｊ
２生成したことを確認した。

実施例７〜１０ 実施例６において、イソブチルアルデヒドの代わりにプ
ロピオンアルデヒド、イソバレロアルデヒド、３−メチ
ルチオプロピオンアルデヒド、３フエニルプロピオンア
ルデヒドをそれぞれ用いて２−アミノブチロニトリル、
ロイジノニトリル。

メチオニノニトリル、ホモフェニルアラニノニトリルを
合成した。その後、減圧下に過剰のアンモニアを留去し
、ｐ＋＋を８に調整した。次いで、このアミノニトリル
水溶液に実施例３と同様の方法で培養、集菌、洗浄した
シュードモナス・エスピー門Ｙ−１（ＦＥＲＭ　Ｐ−９
１７４）を加え、菌濃度が０Ｄ６Ｉ０；１０、液量を合
成したそれぞれのアミノニトリル濃度が２ｇ／！となる
ように調整した（理論量のアミノニトリルが得られると
仮定した。）。１５°Ｃで３０分間反応させた後、実施
例３と同様にして反応生成物の分析を行なった。その結
果を第１表に示す。

実施例１１ 実施例３において、シュードモナス・エスピーＭＹ−１
（ＦＥＲＭ　Ｐ−９１７４）の代わりにロドコッカス・
エリスロポリスＩＰＯＬ２３２０を用いたことおよび培
地の窒素源としてアセトニトリルを用いたこと以外は実
施例３と同様の操作を行なった。その結果、９８％ｅｅ
のＬ−バリンが０．１ｇ、ｌ生成したことを確認した。

実施例１２ イソブチルアルデヒドシアンヒドリン９９ｍｇを濃アン
モニア水０．６ｍｌと３０°Ｃで反応させた後、減圧下
アンモニアを留去し、Ｄ、Ｌ−バリンニトリル水溶液を
得た。ｐｌ＋を８に調整した後、実施例３と同じように
調製した菌体懸濁液９　ｍｌを加え、１５°Ｃで２時間
振とうした。反応液を遠心分離で除菌した後、高速液体
クロマトグラフィーで分析した結果、光学純度９８％ｅ
ｅのＬ−バリンを３．２ｇ／ｌ得た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、Ｄ　、　Ｌ−α−アミノニトリルから
光学活性なα−アミノ酸やα−アミノアミドを効率よく
製造することができる。また、非天然型アミノ酸も効率
よく生産することが可能であるので、多くの種類のアミ
ノ酸を生産することができる。

本発明により得られたアミノ酸は食品、飼料等へ添加し
て使用されるほか化学品、医薬品、農薬などの中間体止
して利用される。

＋＝’４’ｌ−：＋ｌ”：

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリルを加水分解し、光学
   活性なα−アミノ酸及び／又は光学活性なα−アミノア
   ミドを生産する能力を有する微生物の１種または２種以
   上をＤ，Ｌ−α−アミノニトリルに接触させることを特
   徴とする光学活性なα−アミノ酸及び／又はα−アミノ
   アミドの製造法。
2. （２）アルデヒド類と青酸もしくは青酸塩およびアンモ
   ニアもしくはアンモニウム塩とを反応させることにより
   、またはシアノヒドリン類とアンモニアもしくはアンモ
   ニウム塩とを反応させることによりＤ，Ｌ−α−アミノ
   ニトリル水溶液を得、Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリルを加
   水分解し、光学活性なα−アミノ酸及び／又は光学活性
   なα−アミノアミドを生産する能力を有する微生物の１
   種または２種以上を該Ｄ，Ｌ−α−アミノニトリル水溶
   液に接触させることを特徴とする光学活性なα−アミノ
   酸及び／又はα−アミノアミドの製造法。