JPS5922516B2 - Ｌ−フエニルアラニンの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＬ−フェニルアラニンの製造法に関し、更に詳
しくは微生物を用いて桂皮酸とアンモニアもしくはアン
モニア供与体からＬ−フェニルアラニンを製造する方法
に関する。

Ｌ−フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つであり、栄
養上あるいは医薬上重要な物質である。

従来、微生物を用いて桂皮酸からし一フェニルアラニン
を製造する方法としては、桂皮酸を添加した培地にアス
パルターゼ活けの強い細菌を培養して、培地中にＬ−フ
ェニルアラニンを生成蓄積させる方法が知られている（
特公昭４０−１５９５５号）。

しかしながら、この方法はＬ−フェニルアラニンの生成
蓄積量が極めて少なく工業的製造法としては満足すべき
ものではない。

本発明者らは微生物を用いてＬ−フェニルアラニンを製
造する方法について鋭意研究を重ねた結果、酵母の一種
であるスポロポロマイセス属に属する微生物が桂皮酸と
アンモニアからし一フェニルアラニンを生成する能力を
有していることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明はスポロポロマイセス属に属し、桂皮
酸とアンモニアからＬ−フェニルアラニンを生成せしめ
る能力を有する微生物の培養液、該培養液から採取した
菌体または該菌体の処理物を桂皮酸とアンモニアもしく
はアンモニア供与体に作用せしめ、生成したＬ−フェニ
ルアラニンを採取することを特徴とするし一フェニルア
ラニンの製造法である。

本発明において使用する微生物は、スポロボロイセス属
に属し、桂皮酸とアンモニアからＬ−フェニルアラニン
を生成する能力を有する微生物であり、その例としては
例えばスポロボロマイセス・ロゼウス２２１（微生物受
託番号 微工研菌寄第３８５３４）・スポロボロマイセ
ス・ロゼウス２２７（微生物受託番号 微工研菌寄第３
８５２号）などが挙げられる。

前記菌株の菌学的註伏は°ザ・イースト・ア・トキソノ
ミッタ・スタディ−ｐ Ｊ ｊロダー及びＮ、Ｊ 、Ｗ
、クレガー・パン・リッジ著、第２版、３４８〜３５２
頁（１９６７年）、ノース、オランダ、パブリッシング
、カンパニー、アムステルダム”に記載されている。

上記微生物を培養するための培地としては、炭素源、窒
素源、有機栄養源、無機塩類などを含む通常の栄養培地
が使用できる。

炭素源としては、例えばグルコース・シュクロース・デ
キストリン。

糖蜜等の糖類、フマール酸、クエン酸等の有機酸などが
使用できる。

窒素源としては、例えば塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、硝酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩が好
適に使用できる。

有機栄養源としては、例えば酵母エキス、ペプトン、肉
エキス、コーンスチープリカーなどが使用できる。

無機塩類としては、例えば硫酸第１鉄。硫酸マグネシウ
ム、硫酸マンガン、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリ
ウム、塩化ナトリウムなどが使用できる。

上記微生物の培養は常法によればよく、例えば培地のＰ
Ｈを５〜８とし、菌株を接種後」５〜３０℃にて１〜５
日間好気的に培養する。

尚、培養に当って、培地中に桂皮酸、Ｌ−フェニルアラ
ニン、Ｄ−フェニルアラニンまたはＤＬ−フェニルアラ
ニンの一種または数種を少量添加しておくことによって
、得られる培養物または菌体の桂皮酸とアンモニアから
のＬ−フェニルアラニン生成能を高めることができる。

かくして得られる培養液、該培養液から遠心分離等によ
り採取した菌体または該菌体の処理物（例えば洗浄菌体
、乾燥菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超
音波処理物、菌体を例えばアクリルアミドゲル法などに
より固定化したも））ヲ桂皮酸とアンモニアもしくはア
ンモニア供与体とに作用させることによりＬ−フェニル
アラニンを生成させることができる。

尚、培養途中、微生物の生育を阻害しない濃度に桂皮酸
を適宜分割添加していっても、培地中にＬ−フェニルア
ラニンの蓄積が見られるが、か５る方法は操作が繁雑で
あり、蓄積量も少ないので、微生物の培養と桂皮酸のし
一フェニルアラニンへの転換反応とは別々に行なうのが
工業的に有利である。

桂皮酸とアンモニアもしくはアンモニア供与体とからし
一フェニルアラニンを生成せしめる反応において、桂皮
酸の使用量は特に制限されないが、通常バッチ法で行な
う場合は０．０１〜０．５Ｍ、好ましくは０．１〜０．
２Ｍ程度であればよく、また固定化菌体などを用いるカ
ラム法による場合はバッチ法よりやＸ低い濃度が好まし
い。

他方の反応基質であるアンモニアもしくはアンモニア供
与体はアンモニア水、或いは酢酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩など
の形で供給するのが好ましく、その使用量は桂皮酸に対
して当モル以上、一般には大過剰を反応系に存在させる
のが好ましい。

また、これら反応基質は反応の進行に伴って分割添加し
てもよい。

反応は通常、水性媒質中で温度２０〜６０℃、好ましく
は３０〜４０℃程度、ｐＨ７〜１１．好ましくは９ｍ１
０程度で行なうのが好ましい。

反応時間は静置、かく拌、流下等の手段、或いは菌体の
形態及び能力によって異なるので一様ではないが、バッ
チ法では通常１〜７２時間程度である。

尚、本反応において生菌体を用いる場合、界面活囲剤を
添加することにより反応時間を著しく短縮できる場合が
ある。

反応液中に生成蓄積したとＬ−フェニルアラニンの分離
精製は、通常のイオン交換樹脂法やその他の公知方法を
組み合せて容易に行なうことができる。

以下、実施例を挙げて本発明方法を具体的に説明するが
、該実施例中Ｌ−フェニルアラニンの確認及び定量は、
ペーパークロマトグラフィーによるニンヒドリン発色位
置、アミノ酸オートアナライザー及びロイコノストック
・メゼ゛ンテロイテ゛スｐ−６０によるバイオアッセイ
法により行なった。

実施例 １ スポロボロマイセス・ロゼウス２２１（微生物受託番号
微工研菌寄第３８５３号）を下記組成の培地（ｐＨ６
，８、１００ｍ１７５００ｍｌ容坂ロフラスコ）に−白
金耳接種し、２２℃にて２日間振とう培養した。

培地組成（１００ｍｌ中） グルコース ０．５ｇペプトン
ＩＩ 肉エキス １ｇ 食 塩 ０．５ｇＬ−フェニ
ルアラニン ０．０５．９かくして得られた培
養液１００ｍ１に桂皮酸１．５Ｉ及び塩化アンモニウム
１ｇを添加し、アンモニア水にてｐＨ１０に調整し、３
０℃にて２０時間振とうしながら反応させた。

その結果、反応液中ＥＬ−フェニルアラニンが０．９ｇ
生成蓄積した。

この反応液から遠心分離により菌体を除去し、上澄液を
酢酸にてｐＨ６，５に調整し、陽イオン交換樹脂アンバ
ーライ）ＩＲ−１２０カラムに吸着させ、次いで３係ア
ンモニア水で溶出し、溶出液を濃縮した。

析出した結晶を水で再結したのち乾燥することによりＬ
−フェニルアラニンの結晶０．７Ｉを得た。

実施例 ２ スポロボロマイセス・ロゼウス２２７（微生物受託番号
微工研菌寄第３８５２号）を実施例１と同一組成の培地
に同一条件で培養した。

得られた培養液１００ｍ１から遠心分離により菌体を集
め、これを桂皮酸３ｇ及び塩化アンモニウム２ｇを含有
する反応液（アンモニア水でｐＨ１０に調整）１００ｍ
ｌに添加し、３０°Ｃにて４４時間振とうしながら反応
させた。

その結果、反応液中にＬ−フェニルアラニンが１，６ｇ
生成蓄積した。

実施例 ３ スポロボロマイセス・ロゼウス２２１（微生物受託番号
微工研菌寄第３８５３号）を実施例１と同一組成の培
地に同一条件で培養した。

得られた培養液１００ｍ１から遠心分離により菌体を集
め、これを純水に懸濁して１０ｍ１とした。

これにアクリル酸アミド１．８８．９．Ｎ、Ｎ’−メチ
レン−ビスアクリル酸アミド０．１ｇ５％β−（ジメチ
ルアミノ）プロピオニトリル１．２５ＴＩＬｌ及び１係
過硫酸カリウム１．２５ｍ１を加え、室温にて１０分間
静置した。

次いで反応生成物を粉砕し、純水で洗浄することにより
固定化菌体１５ｇを得た。

この固定化菌体１５ｇを外とう管付きカラム（内径２．
０ ｃｍ 。

長さ２０Ｃ１ｒＬ）に充填し、３０℃にて桂皮酸１．５
Ｉ及び塩化アンモニウム１ｇを含む反応液（アンモニア
水でｐＨ１０ｉ！こ調整）１００ｍｌを１０ ｍｌ／ｈ
ｒの速度で流下した。

その結果、流出液中にＬ−フェニルアラニン０．７ｇが
生成蓄積した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ スポロポロマイセス属に属し、桂皮酸とアンモニア
   からし一フェニルアラニンを生成せしめる能力を有する
   微生物の培養液、該培養液から採取した菌体または該菌
   体の処理物を桂皮酸とアンモニアもしくはアンモニア供
   与体に作用せしめ、生成したＬ−フェニルアラニンを採
   取することを特徴とするし一フェニルアラニンの製造法
   。 ２ 微生物が桂皮酸とアンモニアからＬ−フェニルアラ
   ニンを生成せしめる能力を有するスポロボマイセス・ロ
   ゼウスである特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ アンモニア供与体が塩化アンモニウム、硫酸アンモ
   ニウムまたは酢酸アンモニウムである特許請求の範囲第
   １項記載の製造法。