JPS6243679B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は微生物のペニシリンアシラーゼを利用
するβ−ラクタム抗生物質の製造法に関する。さ
らに詳しくは、本発明はシユードモナス属または
キサントモナス属に属し、ペニシリンアシラーゼ
活性を有し、かつβ−ラクタマーゼ活性を欠損し
た微生物を用いるβ−ラクタム抗生物質の製造法
に関する。 β−ラクタム環化合物とα−アミノ酸またはそ
の反応性誘導体とを微生物酵素の存在下に水性溶
媒中で反応させて、対応するβ−ラクタム抗生物
質を製造する方法に関しては、既に多数の報告が
ある。特公昭48−24272号公報、アグリカルチユ
ラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー
（Agr.Biol.Chem.）37巻、335頁（1973）などは
その一例である。 本発明者らは、β−ラクタム抗生物質の生産性
向上について種々研究した結果、β−ラクタマー
ゼ活性を欠損した菌株を用いて酵素反応を行なわ
せればβ−ラクタム抗生物質を高収率で得ること
ができることを見出し本発明を完成した。以下本
発明を詳細に説明する。 本発明によれば、６−アミノペニシラン酸、７
−アミノセフアロスポラン酸、７−アミノアセト
キシセフアロスポラン酸などのβ−ラクタム環化
合物と、Ｄ−フエニルグリシン、Ｄ−ｐ−ヒドロ
キシフエニルグリシンなどのα−アミノ酸または
その反応性誘導体とをペニシリンアシラーゼ活性
を有し、かつβ−ラクタマーゼ活性を欠損した菌
株の培養物、菌体またはそれらの処理物の存在下
に反応させることによりアンピシリン、アモキサ
シリン、セフアログリシン、セフアレキシン、セ
フアドロキシルなどのβ−ラクタム抗生物質を製
造することができる。 本発明に用いる微生物としては、ペニシリンア
シラーゼ活性を有し、β−ラクタマーゼ活性を欠
損した菌株ならばいかなる菌株も用いることがで
きる。好適な菌株の一例としては、シユードモナ
ス・マルトフイリアＭ−14（シユードモナス・マ
ルトフイリアIFO12020から誘導された変異株）
およびキサントモナス・シトリＣ−23（キサント
モナス・シトリIFO12213から誘導された変異
株）があげられる。 シユードモナス・マルトフイリア
（Pseudomonas maltophilia）およびキサントモ
ナス・シトリ（Xanthomonas citri）の菌学的記
載については、バージーズ・マニユアル・オブ・
デターミナテイブ・バクテリオロジー第８版235
〜６頁および246頁に記載がある。 上記変異株の具体的取得法を、キサントモナ
ス・シトリＣ−23を例として示す。 キサントモナス・シトリIFO12213（親株）を
ペプトン1.0ｇ／dl、肉エキス0.5ｇ／dl、
NaCl0.25ｇ／dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、グルタ
ミン酸ソーダ0.5ｇ／dlの組成を有しPH7.0に調整
した培地（以下Ｐ培地という）に30℃、24時間培
養する。培養物から菌体を得、これを1/10Ｍトリ
ス−塩酸バツフアー（PH7.2）で洗浄後、200μ
ｇ／mlのＮ−メチル−N′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンを含有する1/10Ｍトリス−塩酸バツ
フアー（PH7.2）の等量に懸濁する。この懸濁液
を１時間室温に放置後、同上バツフアーで２回洗
浄し、生理食塩水で希釈してＰ培地寒天プレート
上に塗り、30℃で１日静置培養する。生じたコロ
ニーをＰ培地寒天プレートおよびアモキサシリン
（25μｇ／ml）含有同プレート上にレプリカす
る。アモキサシリン含有培地には生育できず、Ｐ
培地で生育できる菌株の中からβ−ラクタマーゼ
活性が欠損した菌株を変異株として得た。Ｃ−23
菌株はこのようにして得られた菌株の一例であ
る。上記のごとき変異処理では、死滅率99％の変
異条件下において約1200コロニー中、９菌株の変
異株が得られた。 シユードモナス・マルトフイリアＭ−14株も上
記と同様の方法で変異処理をして親株シユードモ
ナス・マルトフイリアIFO12020から得られた。 かくして得られた変異株のアモキサシリン分解
活性、アモキサシリン合成活性およびアモキサシ
リンに対する最小阻止濃度（MIC）を親株ととも
に調べた結果を第１表に示す。この実験において
は、菌株をペプトン1.0ｇ／dl、肉エキス0.5ｇ／
dl、酵母エキス1.0ｇ／dl、グルタミン酸モノナ
トリウム0.5ｇ／dl、食塩0.25ｇ／dlの組成を有
する培地（PH7.0）に20時間振盪培養した培養物
から得られる菌体を用いた。 アモキサシリンの分解活性測定法： 洗浄菌体10mg（乾燥菌体として）およびアモキ
サシリン４mgを含む１mlの1/30Ｍリン酸バツフア
ー（PH6.0）を30℃にて１時間反応させる。５分
間煮沸して反応を停止させ、反応液中の残存アモ
キサシリン量をμBondapack C₁₈−７％メタノー
ル・0.2M KH₂PO₄を用いた高速液体カラムクロ
マト法にて定量する。 アモキサシリンの合成活性測定法： 洗浄菌体20mg（乾燥菌体として）、６−アミノ
ペニシラン酸10mgおよびＤ−ｐ−ヒドロキシフエ
ニルグリシンメチルエステル20mgを含む１mlの1/
３０Ｍリン酸バツフアー（PH6.0）を30℃にて３時
間反応させる。５分間煮沸して反応を停止させ、
反応液中の生成アモキサシリン量をμ
Bondapack C₁₈−７％メタノール・0.2M
KH₂PO₄を用いた高速液体カラムクロマト法にて
定量する。 最小阻止濃度（MIC）は寒天希釈法（PH7.0）
にて測定した。

【表】

【表】 この結果、シユードモナス・マルトフイリアＭ
−14およびキサントモナス・シトリＣ−23は各々
親株に比べMICが小さく、β−ラクタマーゼ活性
が弱まり、その結果アモキサシリンの合成活性が
顕著に増加していることがわかる。 本発明におけるβ−ラクタマーゼ活性欠損は親
株が持つているβ−ラクタマーゼ活性を完全に欠
失している場合および親株のβ−ラクタマーゼ活
性に比べ変異株の活性が減少している場合のいず
れをも意味する。 本発明において、菌体を取得するための培地と
しては、炭素源、窒素源、無機物その他の栄養物
を程よく含有する培地ならば合成培地、天然培地
のいずれも使用可能である。 炭素源としては、グルコース、シユクロース、
マルトース、糖蜜、ソルビツト、有機窒素源を含
有するような天然物（例えば、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカーな
ど）を用いる。窒素源としては、尿素、アンモニ
ア、硫安などの無機窒素源、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、コーン・スチーブ・リカーなど
の天然窒素源を用いる。無機物としては、燐酸第
１カリ、燐酸第２カリなどの燐酸塩、硫酸マグネ
シウムなどのマグネシウム塩、鉄、マンガン、亜
鉛、カルシウムなどの金属塩、さらに微生物の生
育に必要な物質が用いられる。 倍養は振盪培養、通気撹拌深部培養などの好気
的条件で、培養温度20〜40℃、PH5.0〜9.0で通常
１〜３日行う。 本発明の反応においては、上記のごとくして培
養した培養物、該培養物から得られる菌体、該菌
体を例えばアセトン等の有機溶媒を用いて乾燥し
たもの、該菌体を超音波処理がダイノーミル（シ
ンマルエンタープライズ社製）にかけて得られる
無細胞抽出液、該抽出液を硫安による塩析、アセ
トンやエタノール添加による沈殿、カラムクロマ
トグラフイーなどの精製処理をして得られる酵素
液、さらには菌体またはこれら処理物の固定化物
が酵素試料として用いられる。 反応に使用する基質としては、６−アミノペニ
シラン酸、７−アミノセフアロスポラン酸、７−
アミノデアセトキシセフアロスポラン酸などのβ
−ラクタム化合物またはそれらの塩およびＤ−フ
エニルグリシン、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフエニルグ
リシンなどのα−アミノ酸またはそれらの反応性
誘導体（以下側鎖化合物と総称する）が用いられ
る。該反応性誘導体としては、水性媒体中で酵素
の作用によつて加水分解されてＤ−フエニルグリ
シンやＤ−ｐ−ヒドロキシフエニルグリシンなど
を与えるものをいい、例えばメチルエステル、エ
チルエステルなどのアルキルエステル、チオグリ
コール酸エステルなどのチオエステルなどがあげ
られる。 反応はこれら２種の基質および適当量の酵素試
料を一定のバツフアー溶液中に加えた反応液中で
行なう。反応液中のβ−ラクタム化合物の濃度は
0.1〜30mg／ml、側鎖化合物の濃度は0.1〜40mg／
ml、酵素試料は、菌体の場合１〜100mg（乾燥重
量）／ml、その他の場合もこの菌体量に相当する
酵素活性を有する範囲で用いるのが適当である。 反応はPH３〜８、好ましくは5.5〜7.5、特に好
ましくは6.5〜7.3、温度５〜40℃で１〜24時間行
う。 反応液に１〜10％の低級アルコール類例えば、
メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イ
ソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノー
ル、sec−ブタノールなどを添加することにより
反応をより効果的に行うことができる。 反応終了後反応液からの目的物の単離精製は、
有機溶媒による転溶や沈殿法、等電点沈殿法、イ
オン交換樹脂法、カラムクロマトグラフイー法な
どを適当に組合せて行うことができる。 本発明方法は種々のβ−ラクタム抗生物質の酵
素的製造法に応用できるが、とくにアンピシリ
ン、アモキサシリン、セフアログリシン、セフア
レキシン、セフアドロキシルなどの製造に好まし
く応用できる。 以下に本発明の実施例を示す。 実施例 １ ペプトン１ｇ／dl、肉エキス0.5ｇ／dl、酵母
エキス１ｇ／dl、グルタミン酸モノナトリウム
0.5ｇ／dl、NaCl0.25ｇ／dlの組成を有し、PH7.0
に調整した培地10mlを含む70ml容量の試験管にシ
ユードモナス・マルトフイリアIFO12020、シユ
ードモナス・マルトフイリアＭ−14、キサントモ
ナス・シトリIFO12213、キサントモナス・シト
リＣ−23をそれぞれ接種し、30℃にて16時間振盪
培養する。次にこの培養物全量を上記と同様の培
地300mlを含む２容量バツフル付フラスコに植
菌し、30℃で24時間振盪培養する。培養終了後、
培養液を8000rpmで20分間遠心分離を行い集菌
し、この菌体を生理食塩水で２回洗浄後、凍結乾
燥する。この凍結乾燥菌体を乾燥菌体重量として
20mg／mlになるように1/30Ｍリン酸バツフアー
（PH6.0）に懸濁し、この懸濁液に６−アミノペニ
シラン酸、７−アミノセフアロスポラン酸、７−
アミノデアセトキシセフアロスポラン酸のいずれ
かを10mg／ml、およびＤ−フエニルグリシンメチ
ルエステル、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフエニルグリシ
ンメチルエステルのいずれかを20mg／mlになるよ
う添加して30℃で３時間反応させる。反応液中の
β−ラクタム抗生物質の生成量は第２表に示すと
おりである。

【表】 実施例 ２ 実施例１で得られた凍結乾燥菌体を乾燥菌体重
量として30mg／mlになるように1/30Ｍリン酸バツ
フアー（PH6.0）に懸濁し、懸濁液に６−アミノ
ペニシラン酸20mg／ml、Ｄ−ｐ−ヒドロキシフエ
ニルグリシンメチルエステル20mg／mlおよびsec
−ブチルアルコール５ml／dlを添加し、1Nカセ
イソーダ溶液でPH6.5に調整しながら20℃で16時
間反応を行つた。反応液中のアモキサシリンの生
成量は第３表に示すとおりである。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シユードモナス属またはキサントモナス属に
   属し、ペニシリンアシラーゼ活性およびβ−ラク
   タマーゼ活性を有する微生物に変異処理を施し、
   ペニシリンアシラーゼ活性を残したままβ−ラク
   タマーゼ活性を欠損させた変異株の培養物、菌
   体、またはそれらの処理物の存在下に６位または
   ７位にアミノ基に有するβ−ラクタム環化合物と
   α−アミノ酸またはその反応性誘導体とを反応さ
   せることにより、反応物中にβ−ラクタム抗生物
   質を生成させ、該反応物中から該β−ラクタム抗
   生物質を採取することからなるβ−ラクタム抗生
   物質の製造法。