JPS6129953B2 - - Google Patents

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JPS6129953B2
JPS6129953B2 JP53030062A JP3006278A JPS6129953B2 JP S6129953 B2 JPS6129953 B2 JP S6129953B2 JP 53030062 A JP53030062 A JP 53030062A JP 3006278 A JP3006278 A JP 3006278A JP S6129953 B2 JPS6129953 B2 JP S6129953B2
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thienylhydantoin
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microbial
carbamoyl
thienylglycine
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JP53030062A
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Hideaki Yamada
Satomi Takahashi
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Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
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Description

【発明の詳細な説明】
本発明は微生物の菌体内酵素を利用して、５―
チエニルヒダントインを生化学的に加水分解する
ことにより、Ｎ―カルバモイル―Ｄ―チエニルグ
リシンを製造する方法に関し、半合成ペニシリ
ン、半合成セフアロスポリン等の合成中間体とし
て有用なＤ―チエニルグリシンの前駆物質を有利
に製造することを目的としている。 本発明者らは、先に５―フエニルヒダントイン
または５―（置換フエニル）ヒダントイン類に微
生物酵素を作用させてＮ―カルバモイル―Ｄ―フ
エニルグリシンまたはその置換誘導体を製造する
方法を特願昭51―11575号、特願昭51―145748号
および特願昭52―48717号として出願し、天然ア
ミノ酸類またはそれらの置換誘導体に対応する５
―置換ヒダントイン類から同様にしてＮ―カルバ
モイル―Ｄ―α―アミノ酸類を製造する方法を特
願昭51―157713号として出願した。本発明は前記
技術の発展の一つとして５―チエニルヒダントイ
ンへの適用を確認したものである。 本発明の要点は次式で表わされる。 上記のように、本発明は５―チエニルヒダント
インに、ヒダントイン環を立体特異的に加水分解
してＮ―カルバモイル―Ｄ―チエニルグリシンを
生成させる能力を有する微生物の培養物、菌体ま
たは菌体処理物を、PH７〜10の水性媒体中で作用
させることを特徴とする。Ｎ―カルバモイル―Ｄ
―チエニルグリシンの製造法である。 本発明で使用する微生物の菌体内酵素は、５―
チエニルヒダントインのＤ体のみを選択的に加水
分解する。しかし光学活性の５―チエニルヒダン
トインはPH７〜10の水性媒体中で容易にラセミ化
する性質を有するために、反応によつてＤ体が消
費されても、残つたＬ体の迅速なラセミ化により
反応系には常にＤ体が補給される。従つて反応の
原料としてDL体、Ｄ体またはＬ体のいずれを用
いても実質的には同じであり、生成物としては常
にＤ体のＮ―カルバモイルチエニルグリシンを得
ることができる。 従来、Ｄ―チエニルグリシンを製造する方法と
しては、例えばチオフエンアルデヒドからストレ
ツカー法（Streker法）によりDL―チエニルグリ
シンを合成し、これらをＮ―クロロアセチル化し
た後、豚の腎臓から抽出したアシラーゼを用いて
Ｌ体のみを脱クロロアセチル化し、残つたＮ―ク
ロロアセチル―Ｄ―チエニルグリシンを加水分解
する方法が知られている（日本化学雑誌82巻、12
号、1688〜1691頁、1961年）。あるいはＮ―クロ
ロアセチル―DL―チエニルグリシンの光学分割
に微生物のアシラーゼを用いる方法もある（特開
昭53―6489号）。またチオフエンアルデヒドから
５―チエニルヒダントインを合成し、これを加水
分解してDL―チエニルグリシンとした後、ａ―
10―カンフアースルホン酸を用いて光学分割する
方法も知られている（米国特許3198804号）。しか
し、いずれにしろ光学分割法の場合には、必要で
ない一方の光学異性体の回収やそのラセミ化が必
要であり、工程が複雑になることは避けられな
い。 本発明の方法を利用すれば、安価な微生物酵素
源を用いてDL―５―チエニルヒダントインの全
量をほゞ定量的にＤ体のＮ―カルバモイルチエニ
ルグリシンに変換させることも可能である。Ｎ―
カルバモイル―Ｄ―チエニルグリシンは例えば亜
硝酸との反応によつて高収率でＤ―チエニルグリ
シンに変換されるので、本発明はＤ―チエニルグ
リシンの工業的製法として、極めて有利な手段を
提供するものである。以下に、本発明を詳細に説
明する。 本発明で原料として用いられる５―チエニルヒ
ダントインは、前にも述べたようにDL体、Ｄ体
またはＬ体のいずれであつても構わないが、通常
は化学合成で得られるDL体を使用するのが適当
である。５―チエニルヒダントインには５―（２
―チエニル）ヒダントインと５―（３―チエニ
ル）ヒダントインとがあるが、いずれも本発明に
使用し得る。DL―５―（２―または３―チエニ
ル）ヒダントインは、公知のヒダントイン法（別
名Bucherer―Berg法）を利用して、例えば２―
チオフエンアルデヒドまたは３―チオフエンアル
デヒドに青化ソーダと重炭酸アンモニウムを反応
させることによつて合成することができる。ま
た、DL―５―（２―チエニル）ヒダントインの
場合は、チオフエン、尿素およびグリオキシル酸
を反応させることによつて合成することも可能で
ある。 本発明で使用される微生物は、５―チエニルヒ
ダントインのヒダントイン環を立体特異的に加水
分解してＮ―カルバモイル―Ｄ―チエニルグリシ
ンを生成させる能力を有するもので、自然界に存
在する野生株、公的な微生物保存機関に保存され
ている菌株、あるいはそれらから人工的に変異誘
導した微生物などから、前記能力の有無を調べる
ことによつて選択されるものである。 この能力の検定方法としては、例えば次のよう
な方法が用いられる。先づ微生物の培養物２mlを
遠心分離して菌体を集め、それを２mlの0.9％食
塩水で洗滌後再び遠心分離して集菌する。この分
離した菌体（湿重量40〜200mg）を濃度0.5〜10％
のDL―５―チエニルヒダントイン水溶液あるい
は懸濁液２mlに加えて、PH７〜10、温度30〜40℃
に保つて、10〜40時間反応させる。反応後、ｐ―
ジメチルアミノベンズアルデヒドの濃塩酸溶液を
加えて発色させ、その液を遠心分離して菌体等の
不溶物を除き、次いで上澄液の吸光度を430nmで
測定して反応液中のＮ―カルバモイルチエニルグ
リシン生成量を求める。このようにして比較的高
い変換率を示した菌株については、実験規模を大
きくして再度５―チエニルヒダントインの加水分
解反応を行い、生成したＮ―カルバモイルチエニ
ルグリシンを単離して、それがＤ体であると認め
られた菌株を本発明に使用する微生物として採用
する。 本発明で使用する微生物は、細菌、放線菌、か
び、酵母および不完全菌の中から上記の検定に合
格するものが選ばれるが、本発明者らの研究によ
れば分類学的にみても極めて広範囲の種属の中に
見出すことができる。それらの菌株の具体的な例
示は既に特開昭51―11575号、特願昭51―145748
号、特願昭51―157713号および特願昭52―48717
号の明細書中に記載されているが、５―チエニル
ヒダントインに対して特に高活性を示す微生物で
細菌に属するものとしてはアエロバクター属、ア
グロバクテリウム属、バチルス属、ブレビバクテ
リウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテ
リウム属、シユードモナス属など、放線菌に属す
るものとしてはアクチノミセス属、ミコバクテリ
ウム属、ノカルデイア属、ストレプトミセス属な
どの中に見出されている。 本発明の方法は微生物の菌体またはその処理物
の形態で菌体内酵素の作用を利用するものである
が、この酵素は天然栄養源を含有する通常の培地
で微生物を培養することによつて菌体内に生成蓄
積させることができる。培養は通常液体培地で行
われるが、固体表面培養によつても行うことがで
きる。培地には通常、資化し得る炭素源、窒素源
および各微生物の生育に必要な無機塩ならびに栄
養素とを含有させるが、更に各種のピリミジン系
核酸塩基類またはそれらの誘導体、或いは各種の
ヒダントイン類を0.05〜0.3％添加して、所望の
酵素を適応的に増強させることが望ましい。酵素
誘導効果の高いピリミジン系核酸塩基類としては
ウラシル、シトシンおよびチミンがあり、それら
の誘導体としてはジヒドロウラシル、ジヒドロチ
ミンなどがある。またヒダントイン類の中ではヒ
ダントイン、DL―５―メチルヒダントインなど
が比較的好ましい。しかし多くの微生物に共通し
て、実用的に最も好ましい酵素誘導基質はウラシ
ルである。 培養条件は、使用する微生物の至適生育条件に
応じて温度20〜85℃、PH４〜11の範囲が用いられ
るが、一般的には温度20〜40℃、PH５〜９におい
て10〜75時間培養する。培養中には通気、撹拌を
行つて微生物の生育を促進させることもできる。 ５―チエニルヒダントインの加水分解反応に
は、前記のようにして培養した微生物を培養物、
菌体または菌体処理物の形態で使用する。通常微
生物の培養物をそのまゝ反応に使用することがで
きるが、培養物中の成分が障害になる場合や酵素
量を多く用いたい場合には、培養物から分離した
菌体を使用すればよい。菌体は生菌体のまゝで充
分に使用目的を達するが、貯蔵あるいは取扱いの
便宜から、凍結乾燥菌体やアセトン乾燥菌体のよ
うな乾燥菌体として用いることもできる。また菌
体そのものでなく、菌体破砕物や菌体抽出物のよ
うな菌体処理物の状態で使用することも可能であ
る。更に上記の菌体または菌体処理物を、公知の
方法で固定化したものも使用することができる。 ５―チエニルヒダントインに微生物の培養物、
菌体または菌体処理物を作用させるには、通常水
性媒体中で両者を混合する方法が用いられる。５
―チエニルヒダントインの反応液中での濃度は、
５〜30％程度の高濃度で用いることができる。こ
のような高濃度では完全に溶解しないことが多い
が、反応の進行に伴つて５―チエニルヒダントイ
ンが水性媒体中に逐次溶解していくので、何ら支
障にはならない。 本発明において用いられる微生物酵素の真の基
質はＤ体であり、Ｄ体のみが選択的に加水分解さ
れてＮ―カルバモイル―Ｄ―チエニルグリシンに
変換される。しかし５―チエニルヒダントインは
反応系中でラセミ平衡が存在するため、加水分解
されないＬ体はＤ体の消費に伴つてDL体に変換
され、反応系には常にＤ体が供給される。このよ
うにラセミ化反応が酵素反応と併行して進むとい
うことから、Ｌ体も間接的な基質とみなすことが
できる。従つて原料の５―チエニルヒダントイン
はDL体、Ｄ体、Ｌ体のいずれであつても、実際
的な効果には殆んど差がないことになる。 水性媒体中で５―チエニルヒダントインの立体
特異的加水分解反応を行う際に、実用上好ましい
PHの範囲は７〜10であり、特に好ましいのは８〜
９である。活性の高い微生物を使用して、このよ
うな条件で反応を行えば、非常に高収率で目的物
を得ることができる。PH７末満では反応速度は極
めて小さく、PH10を超えると好ましくない副反応
を生じるので、いずれも実用性には乏しい。PH７
〜10が好ましい理由としては、本発明で利用され
る微生物酵素の至適PHが８〜９附近にあること、
PHが増すにつれて基質の溶解度が増すこと、なら
びにヒダントイン環のラセミ化反応がアルカリ性
において効果的に促進されることなどによつて、
結果的に５―チエニルヒダントインからＮ―カル
バモイル―Ｄ―チエニルグリシンへの変換速度が
増大することにある。反応の進行に伴つて媒体の
PHが低下するので、反応中、継続的に中和剤を添
加して至適PHに保持することが望ましい。中和剤
としては、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ、
炭酸ソーダなどが適当である。 その他、目的に応じて水性媒体に有機溶媒や界
面活性剤を添加して、反応を行わせることもでき
る。 反応温度は使用する微生物の酵素に適した温度
が採用されるが、通常20〜85℃の範囲内にある。 加水分解反応によつて生成したＮ―カルバモイ
ル―Ｄ―チエニルグリシンは、通常単離しないで
Ｄ―チエニルグリシンに変換する反応に使用し得
る。しかし単離することを望むならば、陰イオン
交換樹脂を利用するなど通常の方法を適用すれば
よい。 本発明の方法によつて得られるＮ―カルバモイ
ル―Ｄ―チエニルグリシンは、例えば亜硝酸と反
応させることによりＤ―チエニルグリシンに変換
される。Ｄ―チエニルグリシン特にＤ―（２―チ
エニル）グリシンは半合成ペニシリンおよび半合
成セフアロスポリン等の製造中間体として重要な
化合物であるが、本発明による新規な方法を用い
ることにより、その製造を工業的に有利に行うこ
とができるのである。 以下実施例によつて本発明を具体的に説明する
が、本発明はこれらの例のみに限定されるもので
はない。なお本明細書中に記載されている％は、
特にことわらない限り重量％である。 実施例 １ 下記の組成からなる栄養液体培地を調製し、綿
栓をした大型試験管に10mlづつ分注して、120℃
で15分間蒸気殺菌を行なつた。 培地組成： 肉エキス 0.5％ 酵母エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ Nacl 0.15％ ウラシル 0.1％ PH 7.0 予め、ブイヨン寒天スラントで30℃24時間培養
した表―１に示す微生物を上記栄養液体培地に一
白金耳接種して、33℃で16時間振盪下に培養を行
なつた。 これらの培養液の４mlを用い、遠心分離して得
た生菌体を更に同量の0.9％食塩水で洗浄したの
ち、再び遠心分離して集菌し、下記の反応液成分
として使用した。 反応液組成： (1) Ｌ―５―（２―チエニル）ヒダントインを
0.05M NaHCO3―Na2CO3 緩衝液に溶解し、
PH8.5に調整した濃度54.9mM〔1.0％（Ｗ／
Ｖ）〕の基質水溶液……4.0ml (2) 前記、4.0ml培養液より遠心分離、洗浄した
生菌体。 上記(1)と(2)を混合し、よく菌体を懸濁した反応
液を夫々共栓付小型試験管に入れ、緩く振盪しな
がら37℃で5.0時間反応させた後、氷水中につけ
て反応を停止した。次いで、この反応液を純水
で、10倍に希釈した後、希釈液40mlに対して20％
トリクロル酢酸2.0ml、10％ｐ―ジメチルアミノ
ベンズアルデヒドの12N塩酸溶液1.0mlを加えて
混合した。この黄色に発色した液を遠心分離して
不溶物を除き430nmの吸光度を測定して、Ｎ―カ
ルバモイル―２―（２―チエニル）グリシンを比
色定量した。その結果、反応液中に生成したＮ―
カルバモイル―２―（２―チエニル）グリシンの
量とDL―５―（２―チエニル）ヒダントインか
らの変換率は、各微生物について夫々表―１に示
す通りであつた。
【表】
【表】 実施例 ２ 下記の組成からなる液体栄養培地を調製し、綿
栓付大型試験管に10mlづつ分注して120℃で20分
間蒸気殺菌を行なつた。 培地組成： グルコース 2.0％ ソイビーン・ミール 1.0％ 酵母エキス 0.25％ （NH4）2SO4 0.10％ CaCO3 0.5％ K2HPO4 0.4％ ５―（２―メチルチオエチル）ヒダントイン
0.1％ PH 7.0 予め、ベネツト寒天スラントで28℃、72時間培
養した表―２に示す微生物を上記栄養液体培地に
接種して28℃で44時間振盪下に培養を行なつた。
この培養液40mlから菌体を遠心分離し、以下実施
例１と同様の処理を行なつて洗浄生菌体を得た。
そして、この生菌体を用いて実施例１と同様の反
応液組成で、37℃で20時間緩やかな振盪下に反応
を行なつた。反応後も実施例１と同様に分析を行
ない、反応液中に生成したＮ―カルバモイル―２
―（２―チエニル）グリシン量を定量した。その
結果とDL―５―（２―チエニル）ヒダントイン
からの変換率は、各微生物について夫々表―２に
示すようであつた。
【表】 実施例 ３ 表―３に示す５種の微生物を使用し、DL―５
―（２―チエニル）ヒダントインの加水分解反応
を行なつた。 微生物の培養は次のように行なつた。即ち、下
記の組成からなる液体培地２種類を調製し、２
容肩付振盪フラスコに300mlづつ分注して120℃で
15分間蒸気殺菌を行なつた。 培地組成 〔Ａ〕 肉エキス 2.0％ グリセリン 0.6％ ウラシル 0.1％ PH 6.5 培地組成 〔Ｂ〕 肉エキス 0.5％ 酵母エキス 0.5％ ポリペプトン 1.0％ NaCl 0.15％ ウラシル 0.1％ PH 7.0 予め、ブイヨン寒天スラントで30℃、24時間培
養した表―３に示す各微生物を、それぞれ殺菌済
の0.9％食塩水10mlに懸濁させて上記液体培地に
全量接種して、33℃で18時間振盪培養した。これ
らの培養液から菌体を遠心分離し、150mlの0.9％
食塩水で洗浄した後再び遠心分離して集菌し、次
いで100mlの0.9％食塩水に懸濁させて夫々下記の
反応液成分として使用した。 反応液組成 (1) DL―５―（２―チエニル）ヒダントインを
15％含有しPH8.5に調整した基質懸濁液 100ml (2) 前記殺菌体懸濁液 50ml 上記(1)、(2)を混合して300ml容四ツ口丸底フラ
スコに入れ、N2通気下、撹拌しながら37℃で18
時間反応させた。反応中2.5N―NaOH溶液を用い
て反応系のPHを8.5に継続的に調節した。反応
後、液のPHを5.0に調整して遠心分離を行ない、
未反応基質や菌体等の不溶物を除去した。こうし
て得られた上澄液の一部をとり、実施例１と同様
に分析を行ない生成したＮ―カルバモイル―２―
（２―チエニル）グリシン量を定量した。更に上
澄液のPHを濃塩酸で1.5〜２に調整するとＮ―カ
ルバモイル―２―（２―チエニル）グリシンが沈
澱をして析出した。この沈澱を取し、更にエタ
ノール・水系で再結晶して高純度のＮ―カルバモ
イル―２―（２―チエニル）グリシンを得た。以
上のようにして得たＮ―カルバモイル―２―（２
―チエニル）グリシンの結晶取得量および比旋光
度の測定結果を、反応系に生成したＮ―カルバモ
イル２―（２―チエニル）グリシンの生成量及び
DL―５―（２―チエニル）ヒダントインからの
変換率とともに使用微生物毎に表―３に示す。 比旋光度の測定結果からＮ―カルバモイル―２
―（２―チエニル）グリシンはすべてＤ体である
ことが確認された。また、これらの元素分析値を
赤外吸収スペクトルは理論的に妥当なものであ
り、シリカゲル薄層クロマトグラム（展開溶媒は
ｎ―ブタノール：酢酸：水＝４：１：１）からも
純度の高いものであることが推定された。 更に、こうして得られたカルバモイル体を用
い、それぞれ亜硝酸による脱カルバモイル反応を
行ない２―（２―チエニル）グリシンを得た。そ
のものの旋光度の測定結果は、〔α〕２５ Ｄ―73.0〜−
74.2（Ｃ＝1H2O）であつた。これらの分析結果
から、いずれについても、高純度のＤ―２―（２
―チエニル）グリシンであることが確認された。
【表】

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ ５―チエニルヒダントインに、アエロバクタ
    ー属、アグロバクテリウム属、バチルス属、ブレ
    ビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミク
    ロバクテリウム属、シユードモナス属、アクチノ
    ミセス属、ミコバクテリウム属、ノカルデイア属
    またはストレプトミセス属に属し、ヒダントイン
    環を立体特異的に加水分解してＮ―カルバモイル
    ―Ｄ―チエニルグリシンを生成させる能力を有す
    る微生物の培養物、菌体または菌体処理物を、PH
    ７〜10の水性媒体中で作用させることを特徴とす
    る、Ｎ―カルバモイル―Ｄ―チエニルグリシンの
    製造法。 ２ 微生物の菌体として、生菌体または乾燥菌体
    を使用する特許請求の範囲第１項記載の製造法。 ３ 微生物の菌体処理物として、菌体破砕物また
    は菌体抽出物を使用する特許請求の範囲第１項記
    載の製造法。 ４ 微生物の菌体または菌体処理物を使用する形
    態として、菌体または菌体処理物の固定化物を用
    いる特許請求の範囲第１項、第２項または第３項
    記載の製造法。 ５ 培地にピリミジン系核酸塩基類またはそれら
    の誘導体を添加して培養し、ヒダントイン環を立
    体特異的に加水分解する能力を増強させた微生物
    を使用する特許請求の範囲第１項、第２項、第３
    項または第４項記載の製造法。 ６ ５―チエニルヒダントインがDL体である特
    許請求の範囲第１項記載の製造法。 ７ ５―チエニルヒダントインが５―（２―チエ
    ニル）ヒダントインである特許請求の範囲第１項
    または第６項記載の製造法。
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