JP4461560B2 - 光学活性アミノ酸の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アミノ酸の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アミノ酸は、喘息薬、抗うつ薬または抗血栓薬等の医薬中間体、飼料添加物あるいは食品添加物等として有用な化合物であることが知られている。
光学活性アミノ酸の製造方法として、生化学的手法を用いる方法は、一般に有機化学的方法に比し、操作の簡便性、収率、用いられる材料のコスト、目的物の光学純度等の点で有利とされている。
上記の生化学的手法としては、ラセミ体のアミノ酸の片方の光学異性体を分解する方法、ラセミ体のアミノ酸のアミノアシル体を光学選択的に脱アシル化する方法、アミノ供与体共存下にケト酸からＬ体アミノ酸を生成させる方法、微生物の醗酵生産能を利用する方法等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微生物等の生物学的材料を用いるより効率的な光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは鋭意検討した結果、ある種のアミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づく一方の光学異性体を他方の光学異性体に変換する能力であって、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力を有する生物学的材料を見出すとともに、該生物学的材料を前記アミノ酸における光学活性体の製造に適用することにより、本発明を完成した。
【０００５】
即ち本発明は、
１．一般式（１）
Ｒ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ （１）
（式中、Ｒは置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されていてもよいＣ６〜Ｃ１４アリール基を表す。）で示されるアミノ酸において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記Ｄ体に作用させることを特徴とする前記Ｌ体の製造方法；
【０００７】
２．生物学的材料を作用させるＤ体がＬ体と交合された状態で存在している１．に記載の方法；
【００１０】
３．生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta）、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）に属する微生物由来であるである１．または２．のいずれかに記載の方法；
【００１１】
４．生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IFO12139株、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）JCM2952株、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）JCM7251株、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）JCM3208株、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）IFO3521株、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583株、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）IFO13593株、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460株、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）IFO14782株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis）JCM9109株、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）IFO12818株由来である１．〜３．のいずれかに記載の方法；
【００１２】
５．本アミノ酸（１）において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体を他方のＬ体に変換するアミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記一般式（１）で示されるアミノ酸に作用させることを特徴とする一般式（１）で示されるアミノ酸のＬ体の光学純度の向上方法；
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明方法を詳細に説明する。本発明において使用し得る生物学的材料は、本アミノ酸（１）において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体（光学異性体Ｉ）をＬ体（光学異性体II）に変換する能力であって、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力を有する生物学的材料（以下、本生物学的材料と記すことがある）である。ここで、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力とは、当該阻害剤の非存在下における前記変換能力を１００とした場合に、当該阻害剤の存在下における前記変換能力が７０以上の相対値であることを意味する。本生物学的材料としては、実質的に阻害を受けない能力（約９０％以上の相対値）を有していることが好ましい。
【００１５】
上記変換のための反応では、Ｄ体の消失に伴って生成物（Ｌ体）が作られ平衡状態に達するために、その反応速度は時間の経過とともに減少するが、一般に基質が充分存在する反応の初期段階では、生成物量は時間に対して直線的に増加するので、その条件下における特有な反応速度が得られる。このため、前記の変換能力の判定には本来、反応の初期段階での値が適するが、反応の初期段階では基質の種類もしくは量、または本生物学的材料の形態もしくは量の組み合わせによっては、反応が安定し難いこと、基質の減少量または生成物の生成量が少ないこと等に起因する値の振れを伴うことがあることから、必要に応じて反応が平衡状態に達した段階での値を用いてもよい。もちろん両者の値から総合的な判断を行ってもよい。
【００１６】
尚、β−クロロアラニンは、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.1）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.21）等の阻害剤として知られており、また、ガバクリン（gabaculine）はＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.21）、β−アラニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.18）、４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.19）等の阻害剤として知られている。
【００１７】
本生物学的材料としては、例えば、微生物の培養物、微生物の培養物から遠心分離によって得られる微生物菌体、またはそれらの処理物などの種々の形態で本発明方法に用いることができる。ここで処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物、無細胞抽出液、粗精製酵素、精製酵素等をあげることができ、さらに、これら種々の形態の本生物学的材料を、例えば、シリカゲル、セラミックス等の無機担体、ＤＥＡＤ−セルロース等の多糖類の誘導体、アンバーライトＩＲＡ９３５（商品名、ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化した固定化物を挙げることもできる。
【００１８】
本生物学的材料の好適な例としては、例えば、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来である材料が挙げられ、好ましくは、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta）、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）に属する微生物由来である材料が挙げられ、具体例としてアルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IFO12139株、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）JCM2952株、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）JCM7251株、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）JCM3208株、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）IFO3521株、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583株、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）IFO13593株、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460株、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）IFO14782株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis）JCM9109株、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）IFO12818株由来である材料があげられる。
【００１９】
本生物学的材料が微生物の場合、当該微生物は、前記の能力を有していれば、例えば、自然界から分離された微生物の野性株であっても、該野生株から薬剤や紫外線等によって誘導された変異株であってもよい。
【００２０】
このような微生物（以下、本微生物と記すことがある）は、以下のように培養することによって調製することができる。
本微生物を培養する為の培地組成は特に限定されず、微生物の培養において通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源またはアミノ酸等があげられる。このうち天然有機窒素源、アミノ酸などは、多くの場合、炭素源及び窒素源としても機能する。窒素源の添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。また無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。
【００２１】
本微生物の培養は、微生物の培養において通常使用される方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復式振盪培養、旋回式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培養、培養タンク等）のいずれも可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度、約６〜約８の培地ｐＨで培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１〜約１０日間程度が望ましい。
尚、本微生物は、例えば、ラセミ体のｐ−クロロフェニルアラニンを光学活性ｐ−クロロフェニルアラニンに変換する能力を指標にして選抜することができる。この際、得られる光学異性体の立体配置によって、選抜された微生物は目的とする本アミノ酸（１）のＬ体、Ｄ体いずれかの光学異性体製造に使用すればよい。
【００２２】
本アミノ酸（１）の置換基Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基、置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基または置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基を表す。ここでＣ１−Ｃ１２アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルエチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等を挙げることができ、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基としては、例えばシクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等を挙げることができ、Ｃ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基を挙げることができる。
【００２３】
置換基Ｒの置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基における置換されたとは、該アルキル基の水素原子の１個以上、通常は１〜５個が、例えばＣ４−Ｃ８シクロアルキル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子からなる群より選ばれる1種以上で置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基；Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基；メチレンジオキシ基；水酸基；シアノ基；カルボキシル基；Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基；アミノ基；モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ５）アルキルアミノ基；アミノカルボニル基；グアニジノ基；３−インドリル基；メルカプト基；フェニル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたフェニル基；フェノキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたフェノキシ基；ナフチル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたナフチル基；ベンジルオキシ基；およびハロゲン原子からなる群より選ばれる同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、シクロヘキシル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、エチルチオ基、アミノカルボニル基、グアニジノ基、３−インドリル基、メルカプト基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、ベンジルオキシ基、ジベンジルオキシフェニル基、メチレンジオキシフェニル基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子を挙げることができる
【００２４】
置換基Ｒの置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基における置換されたとは、該シクロアルキル基の水素原子の１個以上、通常は１〜３個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子からなる群より選ばれる同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。
【００２５】
置換基Ｒの置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基における置換されたとは、該アリール基の水素原子の１個以上、通常は１〜５個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基；Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基；Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基；メチレンジオキシ基；水酸基；シアノ基；カルボキシル基；Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基；アミノ基；モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ５）アルキルアミノ基；フェニル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基および水酸基から選ばれる1種以上で置換されたフェニル基：フェノキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基および水酸基から選ばれる1種以上で置換されたフェノキシ基；ベンジルオキシ基；およびハロゲン原子からなる群、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、ベンジルオキシ基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子からなる群より選択される同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。
【００２６】
好ましい置換基Ｒとして具体的に、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基または置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルエチル基、３−グアニジノプロピル基、３−インドリルメチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、メチルチオエチル基、エチルチオエチル基、４−アミノブチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、アミノカルボニルメチル基、アミノカルボニルエチル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシフェニルメチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、ｐ−フルオロフェニルメチル基、ｍ−シアノフェニルメチル基及びナフチルメチル基を挙げることができる。
【００２７】
Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基としては、例えばシクロヘキシル基、４−クロロシクロヘキシル基等を挙げることができ、Ｃ６−Ｃ１４アリール基または置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基及びナフチル基を挙げることができる。
【００２８】
本アミノ酸（１）として具体的には、例えば、アラニン、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、メチオニン、２−アミノ酪酸、２−アミノアジピン酸、セリン、Ｏ−メチルセリン、スレオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ナフチルグリシン、ナフチルアラニン等をあげることができる。
【００２９】
本発明方法において、例えば、目的とする本アミノ酸（１）がＬ体の場合には、本生物学的材料として本アミノ酸（１）のＤ体をＬ体に変換する能力を有する生物学的材料が用いられる。原料としては、本アミノ酸（１）のＤ体単独、あるいはＤ体とＬ体の混合物が用いられる。原料として本アミノ酸（１）のＤ体とＬ体の混合物を用いる場合には、その比率は特に制限ないが、概ね１：１のいわゆるラセミ体を用いることが工業的な生産を考慮すると好ましい。また、例えば、予め他の方法により目的とする異性体比率の比較的高い混合物を調製し、これを用いて本発明方法を実施することもできる。
【００３０】
本発明方法は通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、本発明方法における反応液中における本アミノ酸（１）の濃度は通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。本生物学的材料の量は、例えば反応時間や生成する本アミノ酸（１）のＬ体またはＤ体の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本アミノ酸（１）に対して通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、例えば所望とする異性体比率等により適宜設定することができる。通常は１６〜１２０時間程度であり、反応の終点を、例えば液体クロマトグラフィー等により適宜追跡しつつ決めることもできる。
【００３１】
さらに界面活性剤、補酵素、金属塩、微量栄養源あるいは有機溶媒等を補助剤として反応液に添加すると、反応時間の短縮や変換率の向上に有効な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は任意に組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル又は臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、補酵素として具体的には、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、アデノシン−５’−リン酸、フラビンモノヌクレオチド、ピリドキサルリン酸、コエンザイムＡ等を挙げることができる。金属塩として具体には、例えばリン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物、塩化コバルト６水和物等を挙げることができ、微量栄養源として具体的には、例えば酵母エキス等を挙げることができる。また、有機溶媒としては、例えばｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類、アセトン等のケトン類、オキサロ酢酸、ピルビン酸、α−ケトラク酸等のケト酸類、ピルビン酸ナトリウム等のケト酸類のアルカリ金属塩、ピルビン酸メチル等ケト酸類のアルキルエステル等を挙げることができる。
【００３２】
かくして生成される本アミノ酸（１）のＬ体は、公知の処理方法により、反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法により本生物学的材料を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去することにより得られ、必要によりクロマトグラフィー等により精製することもでき、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製することもできる。
【００３３】
さらに本発明によれば、本生物学的材料を本アミノ酸（１）に作用させることにより、本アミノ酸（１）のＬ体の光学純度を向上させることができる。当該方法は、前記本発明方法において記載された各種条件と同様な条件にて行うことができる。一般に反応時間を長くすれば、変換率の増大に伴って得られる本アミノ酸（１）のＬ体の光学純度は向上する。反応後に反応液中に残存するアミノ酸を公知の方法を適宜組み合わせて用いることにより、反応前の本アミノ酸（１）の両光学異性体の比率に比べてＬ体の比率が増加した本アミノ酸（１）を容易に回収することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Nocardia diaphanozonaria JCM3208株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら３日間培養した。この培養液から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、これに１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。こうして得られた湿菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体懸濁液とした。５０ｍｇのＤ−ｐ−クロロフェニルアラニンを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）４５ｍＬに溶解し、前記菌体懸濁液５ｍｌを加えて、マグネティックスターラーを用いて１０００ｒｐｍで攪拌回転させながら３０℃で７４時間保温した。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度１００％ｅ．ｅ．のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンが収率７９％で得られていることを確認した。
【００３５】
実施例２
実施例１において、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてラセミ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用い、保温時間を２４時間とした以外は全く同様にして反応を行った。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度７２％ｅ．ｅ．のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンが収率８２％で得られていた。
一方、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用いる以外は全く同様にして反応を行った。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて生成物を分析した結果、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンは全く生成していなかった。
【００３６】
実施例３
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）３ｍｌを入れた１０ｍＬ容試験管に、３０％（ｗ／ｖ）グリセロール水溶液として−８０℃で凍結保存していた表１記載の各微生物菌体を１白金耳植菌して、30℃で往復振盪しながら２日間培養した。この培養液の全量から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、３ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。これに、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニン０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表１記載の時間保温した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
【００３８】
一方、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用いる以外は全く同様にして反応を行った。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
【００４０】
実施例４
表３に記載した各ラセミ体のアミノ酸１０ｍｇを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）９ｍｌに溶解させた。これらのラセミ体のアミノ酸を含む水溶液２．７ｍｌに、実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表３記載の時間保温した。結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
実施例５
表４に記載したＤ体の各アミノ酸１０ｍｇを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）９ｍｌに溶解させた。これらのＤ体の各アミノ酸を含有する水溶液２．７ｍｌに、実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表４記載の時間保温した。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
一方、上記試験において、Ｄ体の各アミノ酸に代えてＬ体の各アミノ酸を用いる以外は全く同様にして反応を行った。結果を表５に示す。
【００４５】
【表５】
【００４６】
実施例６
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Nocardia diaphanozonaria JCM3208株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら２日間培養した。このようにして得られた培養液８０ｍｌから遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を８０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、湿菌体を得た。こうして得られた湿菌体を１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液とした。
菌体懸濁液０．２ｍｌに、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニン５．５ｍＭおよび表６に示すアミノ酸トランスフェラーゼ阻害剤１．１ｍＭを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．８ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら、３０℃で２時間保温した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応により生成したＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンの定量を行った。その結果を、前記アミノ酸トランスフェラーゼ阻害剤無添加時のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニン生成量を１００％とした相対値で表６に示す。
【００４７】
【表６】
【００４８】
実施例７
Nocardia diaphanozonaria JCM3208株に代えて表７に記載の各微生物菌体を用いた以外は実施例６と全く同様にして反応を行った。結果を表７に示す。
【００４９】
【表７】
【００５０】
実施例８
Nocardia diaphanozonaria JCM3208株に代えて表８に記載の各微生物菌体を用い、反応時間を２４時間とした以外は実施例６と全く同様にして反応を行った。結果を表８に示す。
【表８】
【００５１】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬中間体、飼料添加物あるいは食品添加物等として有用な光学活性アミノ酸（Ｌ体）を効率的に製造し得る。
【発明の属する技術分野】
本発明は、光学活性アミノ酸の製造方法等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
光学活性アミノ酸は、喘息薬、抗うつ薬または抗血栓薬等の医薬中間体、飼料添加物あるいは食品添加物等として有用な化合物であることが知られている。
光学活性アミノ酸の製造方法として、生化学的手法を用いる方法は、一般に有機化学的方法に比し、操作の簡便性、収率、用いられる材料のコスト、目的物の光学純度等の点で有利とされている。
上記の生化学的手法としては、ラセミ体のアミノ酸の片方の光学異性体を分解する方法、ラセミ体のアミノ酸のアミノアシル体を光学選択的に脱アシル化する方法、アミノ供与体共存下にケト酸からＬ体アミノ酸を生成させる方法、微生物の醗酵生産能を利用する方法等が知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、微生物等の生物学的材料を用いるより効率的な光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
このような状況下、本発明者らは鋭意検討した結果、ある種のアミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づく一方の光学異性体を他方の光学異性体に変換する能力であって、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力を有する生物学的材料を見出すとともに、該生物学的材料を前記アミノ酸における光学活性体の製造に適用することにより、本発明を完成した。
【０００５】
即ち本発明は、
１．一般式（１）
Ｒ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ （１）
（式中、Ｒは置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されていてもよいＣ６〜Ｃ１４アリール基を表す。）で示されるアミノ酸において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記Ｄ体に作用させることを特徴とする前記Ｌ体の製造方法；
【０００７】
２．生物学的材料を作用させるＤ体がＬ体と交合された状態で存在している１．に記載の方法；
【００１０】
３．生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta）、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）に属する微生物由来であるである１．または２．のいずれかに記載の方法；
【００１１】
４．生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IFO12139株、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）JCM2952株、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）JCM7251株、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）JCM3208株、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）IFO3521株、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583株、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）IFO13593株、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460株、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）IFO14782株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis）JCM9109株、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）IFO12818株由来である１．〜３．のいずれかに記載の方法；
【００１２】
５．本アミノ酸（１）において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体を他方のＬ体に変換するアミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記一般式（１）で示されるアミノ酸に作用させることを特徴とする一般式（１）で示されるアミノ酸のＬ体の光学純度の向上方法；
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明方法を詳細に説明する。本発明において使用し得る生物学的材料は、本アミノ酸（１）において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体（光学異性体Ｉ）をＬ体（光学異性体II）に変換する能力であって、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力を有する生物学的材料（以下、本生物学的材料と記すことがある）である。ここで、当該能力がアミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンによる重大な阻害を受けない能力とは、当該阻害剤の非存在下における前記変換能力を１００とした場合に、当該阻害剤の存在下における前記変換能力が７０以上の相対値であることを意味する。本生物学的材料としては、実質的に阻害を受けない能力（約９０％以上の相対値）を有していることが好ましい。
【００１５】
上記変換のための反応では、Ｄ体の消失に伴って生成物（Ｌ体）が作られ平衡状態に達するために、その反応速度は時間の経過とともに減少するが、一般に基質が充分存在する反応の初期段階では、生成物量は時間に対して直線的に増加するので、その条件下における特有な反応速度が得られる。このため、前記の変換能力の判定には本来、反応の初期段階での値が適するが、反応の初期段階では基質の種類もしくは量、または本生物学的材料の形態もしくは量の組み合わせによっては、反応が安定し難いこと、基質の減少量または生成物の生成量が少ないこと等に起因する値の振れを伴うことがあることから、必要に応じて反応が平衡状態に達した段階での値を用いてもよい。もちろん両者の値から総合的な判断を行ってもよい。
【００１６】
尚、β−クロロアラニンは、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.1）、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.21）等の阻害剤として知られており、また、ガバクリン（gabaculine）はＤ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.21）、β−アラニン−ピルベートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.18）、４−アミノブチレートアミノトランスフェラーゼ（E.C.2.6.1.19）等の阻害剤として知られている。
【００１７】
本生物学的材料としては、例えば、微生物の培養物、微生物の培養物から遠心分離によって得られる微生物菌体、またはそれらの処理物などの種々の形態で本発明方法に用いることができる。ここで処理物としては、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体摩砕物、菌体自己消化物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物、菌体のアルカリ処理物、菌体の有機溶媒処理物、無細胞抽出液、粗精製酵素、精製酵素等をあげることができ、さらに、これら種々の形態の本生物学的材料を、例えば、シリカゲル、セラミックス等の無機担体、ＤＥＡＤ−セルロース等の多糖類の誘導体、アンバーライトＩＲＡ９３５（商品名、ローム・アンド・ハース社製）等の合成高分子等へ吸着させる担体結合法や、ポリアクリルアミド、含硫多糖ゲル（例えばカラギーナンゲル）、アルギン酸ゲル、寒天ゲル等の高分子の網目構造の中に閉じ込める包括法などの公知の方法に準じて固定化した固定化物を挙げることもできる。
【００１８】
本生物学的材料の好適な例としては、例えば、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来である材料が挙げられ、好ましくは、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta）、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）に属する微生物由来である材料が挙げられ、具体例としてアルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IFO12139株、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）JCM2952株、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）JCM7251株、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）JCM3208株、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）IFO3521株、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583株、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）IFO13593株、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460株、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）IFO14782株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis）JCM9109株、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）IFO12818株由来である材料があげられる。
【００１９】
本生物学的材料が微生物の場合、当該微生物は、前記の能力を有していれば、例えば、自然界から分離された微生物の野性株であっても、該野生株から薬剤や紫外線等によって誘導された変異株であってもよい。
【００２０】
このような微生物（以下、本微生物と記すことがある）は、以下のように培養することによって調製することができる。
本微生物を培養する為の培地組成は特に限定されず、微生物の培養において通常使用される炭素源や窒素源、有機ないし無機塩等を適宜含む各種の培地を用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、フルクトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリセロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、クエン酸、ピルビン酸等の有機酸等があげられる。これら炭素源の培地への添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。窒素源としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸アンモニム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアンモニウム塩、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、コーンステイープリカー、綿実粉、乾燥酵母、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源またはアミノ酸等があげられる。このうち天然有機窒素源、アミノ酸などは、多くの場合、炭素源及び窒素源としても機能する。窒素源の添加量は通常０．１〜１０％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。また無機塩類としては、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム等のリン酸塩、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト６水和物等の塩化物塩、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物等の硫酸金属塩等をあげることができ、その添加量は通常０．０００１％（ｗ／ｖ）〜１％（ｗ／ｖ）程度とするとよい。
【００２１】
本微生物の培養は、微生物の培養において通常使用される方法に準じて行い、固体培養、液体培養（試験管振盪式培養、往復式振盪培養、旋回式振盪培養、ジャーファーメンター(Jar Fermenter)培養、培養タンク等）のいずれも可能である。特に、ジャーファーメンターを用いる場合、ジャーファーメンター内に無菌空気を導入する必要があり、通常、培養液量の約０．１〜約２倍／分の通気条件を用いる。培養温度は、微生物が生育する範囲で適宜変更できるが、例えば、約１５℃〜約４０℃の範囲の培養温度、約６〜約８の培地ｐＨで培養することが好ましい。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通常約１〜約１０日間程度が望ましい。
尚、本微生物は、例えば、ラセミ体のｐ−クロロフェニルアラニンを光学活性ｐ−クロロフェニルアラニンに変換する能力を指標にして選抜することができる。この際、得られる光学異性体の立体配置によって、選抜された微生物は目的とする本アミノ酸（１）のＬ体、Ｄ体いずれかの光学異性体製造に使用すればよい。
【００２２】
本アミノ酸（１）の置換基Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基、置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基、Ｃ６−Ｃ１４アリール基または置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基を表す。ここでＣ１−Ｃ１２アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルエチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基等を挙げることができ、Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基としては、例えばシクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基等を挙げることができ、Ｃ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ナフチル基を挙げることができる。
【００２３】
置換基Ｒの置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基における置換されたとは、該アルキル基の水素原子の１個以上、通常は１〜５個が、例えばＣ４−Ｃ８シクロアルキル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子からなる群より選ばれる1種以上で置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基；Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基；Ｃ１−Ｃ２アルキルチオ基；メチレンジオキシ基；水酸基；シアノ基；カルボキシル基；Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基；アミノ基；モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ５）アルキルアミノ基；アミノカルボニル基；グアニジノ基；３−インドリル基；メルカプト基；フェニル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたフェニル基；フェノキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたフェノキシ基；ナフチル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、ベンジルオキシ基、水酸基およびハロゲン原子から選ばれる1種以上で置換されたナフチル基；ベンジルオキシ基；およびハロゲン原子からなる群より選ばれる同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。該置換基の好ましい例としては、メチル基、エチル基、シクロヘキシル基、メトキシ基、エトキシ基、メチルチオ基、エチルチオ基、アミノカルボニル基、グアニジノ基、３−インドリル基、メルカプト基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、ベンジルオキシ基、ジベンジルオキシフェニル基、メチレンジオキシフェニル基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子を挙げることができる
【００２４】
置換基Ｒの置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基における置換されたとは、該シクロアルキル基の水素原子の１個以上、通常は１〜３個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基、アミノ基、シアノ基、水酸基およびハロゲン原子からなる群より選ばれる同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。
【００２５】
置換基Ｒの置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基における置換されたとは、該アリール基の水素原子の１個以上、通常は１〜５個が、例えばＣ１−Ｃ３アルキル基；Ｃ１−Ｃ２ハロゲン化アルキル基；Ｃ１−Ｃ２アルコキシ基；メチレンジオキシ基；水酸基；シアノ基；カルボキシル基；Ｃ２−Ｃ５アルキルオキシカルボニル基；アミノ基；モノまたはジ（Ｃ１−Ｃ５）アルキルアミノ基；フェニル基；Ｃ１−Ｃ３アルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基および水酸基から選ばれる1種以上で置換されたフェニル基：フェノキシ基；Ｃ１−Ｃ３アルコキシ基および水酸基から選ばれる1種以上で置換されたフェノキシ基；ベンジルオキシ基；およびハロゲン原子からなる群、好ましくは、メチル基、エチル基、モノクロロメチル基、トリフルオロメチル基、メトキシ基、メチレンジオキシ基、水酸基、シアノ基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、ベンジルオキシ基、フッ素原子、塩素原子および臭素原子からなる群より選択される同一または相異なる置換基で置換されていることを意味する。
【００２６】
好ましい置換基Ｒとして具体的に、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基または置換されたＣ１−Ｃ１２アルキル基としては、例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、１−メチルエチル基、２−メチルプロピル基、１−メチルプロピル基、１，１−ジメチルエチル基、３−グアニジノプロピル基、３−インドリルメチル基、ヒドロキシメチル基、１−ヒドロキシエチル基、２−ヒドロキシエチル基、メチルチオエチル基、エチルチオエチル基、４−アミノブチル基、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、アミノカルボニルメチル基、アミノカルボニルエチル基、ベンジル基、ｐ−ヒドロキシフェニルメチル基、ｐ−クロロフェニルメチル基、ｐ−フルオロフェニルメチル基、ｍ−シアノフェニルメチル基及びナフチルメチル基を挙げることができる。
【００２７】
Ｃ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されたＣ４−Ｃ８シクロアルキル基としては、例えばシクロヘキシル基、４−クロロシクロヘキシル基等を挙げることができ、Ｃ６−Ｃ１４アリール基または置換されたＣ６−Ｃ１４アリール基としては、例えばフェニル基、ｐ−ヒドロキシフェニル基、ｐ−クロロフェニル基及びナフチル基を挙げることができる。
【００２８】
本アミノ酸（１）として具体的には、例えば、アラニン、ノルバリン、ｔｅｒｔ−ロイシン、メチオニン、２−アミノ酪酸、２−アミノアジピン酸、セリン、Ｏ−メチルセリン、スレオニン、フェニルグリシン、フェニルアラニン、ｐ−クロロフェニルアラニン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、ナフチルグリシン、ナフチルアラニン等をあげることができる。
【００２９】
本発明方法において、例えば、目的とする本アミノ酸（１）がＬ体の場合には、本生物学的材料として本アミノ酸（１）のＤ体をＬ体に変換する能力を有する生物学的材料が用いられる。原料としては、本アミノ酸（１）のＤ体単独、あるいはＤ体とＬ体の混合物が用いられる。原料として本アミノ酸（１）のＤ体とＬ体の混合物を用いる場合には、その比率は特に制限ないが、概ね１：１のいわゆるラセミ体を用いることが工業的な生産を考慮すると好ましい。また、例えば、予め他の方法により目的とする異性体比率の比較的高い混合物を調製し、これを用いて本発明方法を実施することもできる。
【００３０】
本発明方法は通常、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等のリン酸アルカリ金属塩などの無機酸塩、酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の酢酸アルカリ金属塩などの有機酸塩等を含む水性バッファー液中で行われ、本発明方法における反応液中における本アミノ酸（１）の濃度は通常３０％（ｗ／ｖ）程度以下が適しており、好ましくは０．０１〜２０％（ｗ／ｖ）程度である。本生物学的材料の量は、例えば反応時間や生成する本アミノ酸（１）のＬ体またはＤ体の選択性等を考慮して適宜決めることができる。例えば本アミノ酸（１）に対して通常は０．０１〜２００重量倍、好ましくは０．１〜５０重量倍である。反応温度は通常１０〜７０℃程度が適しており、好ましくは２０〜６０℃程度である。反応液のｐＨは通常４〜１２程度が適しており、好ましくは５〜１１程度である。反応時間は、例えば所望とする異性体比率等により適宜設定することができる。通常は１６〜１２０時間程度であり、反応の終点を、例えば液体クロマトグラフィー等により適宜追跡しつつ決めることもできる。
【００３１】
さらに界面活性剤、補酵素、金属塩、微量栄養源あるいは有機溶媒等を補助剤として反応液に添加すると、反応時間の短縮や変換率の向上に有効な場合があり、必要に応じてこれらの補助剤を単独又は任意に組み合わせて反応液に添加することもできる。使用し得る界面活性剤として具体的には、例えばドデシル硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコールモノ−ｐ−イソオクチルフェニルエーテル又は臭化セチルピリジウム等を挙げることができ、補酵素として具体的には、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、アデノシン−５’−リン酸、フラビンモノヌクレオチド、ピリドキサルリン酸、コエンザイムＡ等を挙げることができる。金属塩として具体には、例えばリン酸二水素一カリウム、リン酸一水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム７水和物、硫酸第一鉄７水和物、硫酸亜鉛７水和物、硫酸マンガン３水和物、塩化コバルト６水和物等を挙げることができ、微量栄養源として具体的には、例えば酵母エキス等を挙げることができる。また、有機溶媒としては、例えばｎ−ヘプタン、シクロヘキサン、イソオクタン等のアルカン類、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル等のエーテル類、メタノール、イソプロパノール、ｎ−オクタノール等のアルコール類、ＤＭＳＯ等のスルホキシド類、アセトン等のケトン類、オキサロ酢酸、ピルビン酸、α−ケトラク酸等のケト酸類、ピルビン酸ナトリウム等のケト酸類のアルカリ金属塩、ピルビン酸メチル等ケト酸類のアルキルエステル等を挙げることができる。
【００３２】
かくして生成される本アミノ酸（１）のＬ体は、公知の処理方法により、反応液から回収することができる。例えば、反応液から遠心分離等の方法により本生物学的材料を分離後、上清液を酸性に調整し、ジエチルエーテルやトルエン等の有機溶媒で抽出・分液して有機層を除き、次いで水層を塩基性として同様な有機溶媒で抽出・分液し水層を除いた後、該溶媒を減圧留去することにより得られ、必要によりクロマトグラフィー等により精製することもでき、あるいは前記上清液をイオン交換クロマトグラフィー等の手法により精製することもできる。
【００３３】
さらに本発明によれば、本生物学的材料を本アミノ酸（１）に作用させることにより、本アミノ酸（１）のＬ体の光学純度を向上させることができる。当該方法は、前記本発明方法において記載された各種条件と同様な条件にて行うことができる。一般に反応時間を長くすれば、変換率の増大に伴って得られる本アミノ酸（１）のＬ体の光学純度は向上する。反応後に反応液中に残存するアミノ酸を公知の方法を適宜組み合わせて用いることにより、反応前の本アミノ酸（１）の両光学異性体の比率に比べてＬ体の比率が増加した本アミノ酸（１）を容易に回収することができる。
【００３４】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Nocardia diaphanozonaria JCM3208株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら３日間培養した。この培養液から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、これに１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。こうして得られた湿菌体を１０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）に懸濁し、菌体懸濁液とした。５０ｍｇのＤ−ｐ−クロロフェニルアラニンを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）４５ｍＬに溶解し、前記菌体懸濁液５ｍｌを加えて、マグネティックスターラーを用いて１０００ｒｐｍで攪拌回転させながら３０℃で７４時間保温した。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度１００％ｅ．ｅ．のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンが収率７９％で得られていることを確認した。
【００３５】
実施例２
実施例１において、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてラセミ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用い、保温時間を２４時間とした以外は全く同様にして反応を行った。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて分析することにより、光学純度７２％ｅ．ｅ．のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンが収率８２％で得られていた。
一方、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用いる以外は全く同様にして反応を行った。その後、反応液の一部を取り、遠心分離により菌体を除去した上清液を液体クロマトグラフィーにて生成物を分析した結果、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンは全く生成していなかった。
【００３６】
実施例３
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）３ｍｌを入れた１０ｍＬ容試験管に、３０％（ｗ／ｖ）グリセロール水溶液として−８０℃で凍結保存していた表１記載の各微生物菌体を１白金耳植菌して、30℃で往復振盪しながら２日間培養した。この培養液の全量から遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、３ｍＬの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）を加えて再度懸濁し、遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め湿菌体を得た。これに、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニン０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表１記載の時間保温した。結果を表１に示す。
【００３７】
【表１】
一方、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニンに代えてＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンを用いる以外は全く同様にして反応を行った。結果を表２に示す。
【００３９】
【表２】
実施例４
表３に記載した各ラセミ体のアミノ酸１０ｍｇを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）９ｍｌに溶解させた。これらのラセミ体のアミノ酸を含む水溶液２．７ｍｌに、実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表３記載の時間保温した。結果を表３に示す。
【００４１】
【表３】
実施例５
表４に記載したＤ体の各アミノ酸１０ｍｇを、リン酸二水素一カリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、リン酸一水素二ナトリウム０．１５％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０２％（ｗ／ｖ）、硫酸第一鉄７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸亜鉛７水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、硫酸マンガン３水和物０．００１％（ｗ／ｖ）、塩化コバルト６水和物０．００１％（ｗ／ｖ）および酵母エキス０．０００５％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する水溶液（ｐＨ７．０）９ｍｌに溶解させた。これらのＤ体の各アミノ酸を含有する水溶液２．７ｍｌに、実施例１と同様にして調製した菌体懸濁液０．３ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら３０℃で表４記載の時間保温した。結果を表４に示す。
【００４３】
【表４】
一方、上記試験において、Ｄ体の各アミノ酸に代えてＬ体の各アミノ酸を用いる以外は全く同様にして反応を行った。結果を表５に示す。
【００４５】
【表５】
実施例６
グリセロール１．０％（ｗ／ｖ）、ポリペプトン（日本製薬製）０．２％（ｗ／ｖ）、肉エキス粉末（極東製薬製）０．３％（ｗ／ｖ）、酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．３％（ｗ／ｖ）、リン酸二カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、リン酸一カリウム０．１％（ｗ／ｖ）、硫酸マグネシウム７水和物０．０３％（ｗ／ｖ）をそれぞれ含有する滅菌培地（ｐＨ７．０）１００ｍｌを入れた５００ｍＬ容坂口フラスコに、予め同じ組成の培地にて培養された Nocardia diaphanozonaria JCM3208株の培養液を１ｍＬ植菌して、30℃で往復振盪しながら２日間培養した。このようにして得られた培養液８０ｍｌから遠心分離(１００００×ｇ、１０分間)によって菌体を集め、得られた湿菌体を８０ｍｌの１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、湿菌体を得た。こうして得られた湿菌体を１００ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）４ｍｌに懸濁し、菌体懸濁液とした。
菌体懸濁液０．２ｍｌに、Ｄ−ｐ−クロロフェニルアラニン５．５ｍＭおよび表６に示すアミノ酸トランスフェラーゼ阻害剤１．１ｍＭを含むリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．８ｍｌを加えて、２５０回／分で往復振とうさせながら、３０℃で２時間保温した。反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析し、反応により生成したＬ−ｐ−クロロフェニルアラニンの定量を行った。その結果を、前記アミノ酸トランスフェラーゼ阻害剤無添加時のＬ−ｐ−クロロフェニルアラニン生成量を１００％とした相対値で表６に示す。
【００４７】
【表６】
実施例７
Nocardia diaphanozonaria JCM3208株に代えて表７に記載の各微生物菌体を用いた以外は実施例６と全く同様にして反応を行った。結果を表７に示す。
【００４９】
【表７】
実施例８
Nocardia diaphanozonaria JCM3208株に代えて表８に記載の各微生物菌体を用い、反応時間を２４時間とした以外は実施例６と全く同様にして反応を行った。結果を表８に示す。
【表８】
【発明の効果】
本発明によれば、医薬中間体、飼料添加物あるいは食品添加物等として有用な光学活性アミノ酸（Ｌ体）を効率的に製造し得る。
Claims (5)
- 一般式（１）
Ｒ−ＣＨ（ＮＨ2）−ＣＯＯＨ （１）
（式中、Ｒは置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されていてもよいＣ６〜Ｃ１４アリール基を表す。）で示されるアミノ酸において、アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記Ｄ体に作用させることを特徴とする前記Ｌ体の製造方法。 - 生物学的材料を作用させるＤ体がＬ体と混合された状態で存在している請求項１に記載の方法。
- 生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta）、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）に属する微生物由来である請求項１または２に記載の方法。
- 生物学的材料が、アルスロバクター・パセンス（Arthrobacter pascens）IFO12139株、フラビモナス・オリジハビタンス（Flavimonas oryzihabitans）JCM2952株、クレブシエラ・プランチコラ（Klebsiella planticola）JCM7251株、ノカルディア・ディアファノゾナリア（Nocardia diaphanozonaria）JCM3208株、シュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）IFO3521株、シュードモナス・オレオボランス（Pseudomonas oleovorans）IFO13583株、シュードモナス・オキザラチカス（Pseudomonas oxalaticus）IFO13593株、シュードモナス・タエトロレンス（Pseudomonas taetrolens）IFO3460株、リゾビウム・メリロチ（Rhizobium meliloti）IFO14782株、サッカロポリスポラ・ヒルスタ（Saccharopolyspora hirsuta subsp.kobensis）JCM9109株、ストレプトミセス・ロセウス（Streptomyces roseus）IFO12818株由来である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
- 一般式（１）
Ｒ−ＣＨ（ＮＨ 2 ）−ＣＯＯＨ （１）
（式中、Ｒは置換されていてもよいＣ１−Ｃ１２アルキル基、置換されていてもよいＣ４−Ｃ８シクロアルキル基または置換されていてもよいＣ６〜Ｃ１４アリール基を表す。）で示されるアミノ酸において、
アミノ基及びカルボキシル基の両者が結合する不斉炭素原子に基づくＤ体をＬ体に変換する能力が、アミノトランスフェラーゼ阻害剤であるβ−クロロ−Ｄ−アラニン、β−クロロ−Ｌ−アラニンまたはガバクリンの非存在下の場合を１００としたときに、当該アミノトランスフェラーゼ阻害剤の存在下の場合の能力が７０以上の相対値となり、アルスロバクター属、フラビモナス属、クレブシエラ属、ノカルディア属、シュードモナス属、リゾビウム属、サッカロポリスポラ属またはストレプトミセス属に属する微生物由来の生物学的材料を、前記一般式（１）で示されるアミノ酸に作用させることを特徴とする一般式（１）で示されるアミノ酸のＬ体の光学純度の向上方法。
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