JP2857936B2 - 光学活性なα−メチルベンジルアミンの製造法 - Google Patents

光学活性なα−メチルベンジルアミンの製造法

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武男 吉岡
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は酵素法あるいは微生物法
によるα−メチルベンジルアミンの製造法に関する。更
に詳しくは酵素法あるいは微生物法による光学活性なα
−メチルベンジルアミンの製造法に関する。
【0002】
【従来の技術および課題】光学活性なα−メチルベンジ
ルアミンは、代表的な塩基性光学分割剤であり、エトミ
デート、ペプレオマイシン等の医薬品の中間体として重
要な化合物である。このα−メチルベンジルアミンは、
アセトフェノンを原料として還元アミノ化法により化学
合成されるラセミ体を光学分割する製造法が一般的であ
る。この方法はラセミ体を光学分割する操作が煩雑であ
る、収率が低い、生成物の光学純度が低い等の欠点を有
している。
【0003】
【課題を解決するための手段】本発明は、アセトフェノ
ンからR−(+)−α−メチルベンジルアミンまたはS
−(−)−α−メチルベンジルアミンを生成させる能力
を有する微生物の培養液、該培養液から採取した菌体、
または菌体の処理物をアセトフェノンに作用させ、生成
したR−(+)−α−メチルベンジルアミンまたはS−
(−)−α−メチルベンジルアミンを採取することから
なる製造法を提供する。本発明者らは、上記課題を解決
すべく鋭意研究を重ねた結果、シュードモナス属、コリ
ネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、サルシナ
属、ストレプトマイセス属、ストレプトバーチシリウム
属、ミクロモノスポラ属、アミコラータ属、アクチノマ
ズラ属およびトリコデルマ属に属する微生物が、特異的
にアセトフェノンを光学活性なα−メチルベンジルアミ
ンに転換せしめる能力があることを見いだし、この知見
に基づいて本発明を完成した。このような酵素法あるい
は微生物法によりアセトフェノンから直接光学活性なα
−メチルベンジルアミンを製造する方法は、従来全く知
られていなかった方法である。
【0004】本発明で用いうる微生物を具体的に例示す
れば次の通りである。シュードモナス・リボフラビナ
(Pseudomonas riboflavina)ATCC 9526、コリ
ネバクテリウム・ゼロシス(Corynebacterium xerosis)
AJ 1395(FERMP−11886)、ブレビバ
クテリウム・リネンス(Brevibacterium linens)ATC
C 8377、サルシナ・アルビダ(Sarcina albida)
IAM 1012、ストレプトマイセス・ラベンズラ
(Streptomyces lavendulae)ATCC 8664、スト
レプトマイセス・ロイデンシス(Streptomyces loidens
is)ATCC 11415、ストレプトマイセス・ベネ
ズエラ(Streptomyces venezulae)ATCC1543
9、ストレプトマイセス・グリゼウス・サブスピーシス
・フオルミカス(Streptomyces griseus subsp. formi
cus)ATCC 14811、ストレプトマイセス・リッ
プマニイ(Streptomyces lipmanii)ATCC 273
57、ストレプトバーチシリウム・アルダン(Streptve
rticillium ardum)IFO13430、ミクロモノスポ
ラ・カルケエ(Micromonospora chalcea)ATCC27
083、アミコラータ・オートトロフィカ(Amycolata
autotrophica)ATCC 19727、アクチノマズラ
・プシラ(Actinomadula pusilla)ATCC2729
6、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)AT
CC 8678等。
【0005】これらの微生物は、野生株、変異株、また
は細胞融合法もしくは遺伝子操作法等の遺伝的手法によ
り誘導される組換え株等、いずれの株であってもよい。
上記微生物のうちATCC番号で表示された株は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATC
C)発行のカタログ・オブ・バクテリア・アンド・バク
テリオファージ、第17版、1989またはカタログ・
オブ・ファージー/イースト、第17版、1987に記
載されており該ATCCから入手できる。IFO番号で
表示された株は(財)醗酵研究所発行のリスト・オブ・
カルチャーズ、第8版、1988に記載されており、該
醗酵研究所から入手できる。IAM番号で表示された株
は、日本微生物株保存連盟発行のカタログ・オブ・カル
チャーズ、1966に記載されており、東京大学微生物
研究所から入手できる。
【0006】上記微生物中AJ 1395株は、コリネ
バクテリウム・ゼロシス(Corynebacterium xerosis
AJ 1395)として工業技術院微生物工業技術研究
所に平成2年12月3日付で微工研菌寄11886号
(FERM P−11886)として寄託されたもので
ある。次ぎに示すようにAJ 1395株の菌学的性質
は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマチック・
バクテリオロジー第2巻(Bergeys manual of systemat
ic bacteriology Vol.2)に示されるコリネバクテリウム
・ゼロシス(Corynebacterium xerosis)の菌学的性質
と同一であった。
【0007】 AJ 1395株の菌学的性質 形状 桿菌で細胞は多形成 糖資化性 胞子形成能 無芽胞 グルコース 陽性 グラム染色性 陽性 フルクトース 陽性 運動性 陰性 ガラクトース 陽性 通性好気性 マンノース 陽性 カタラーゼ活性 陽性 スクロース 陽性 ウレアーゼ活性 陰性 サリシン 陽性 ゲラチナーゼ活性 陰性 アラビノース 陰性 硝酸還元性 陽性 キシロース 陰性 ヒラジンアミダーゼ 活性 陽性 ラクトース 陰性 カゼイン分解活性 陰性 マルトース 陰性 トレハロース 陰性 ラフィノース 陰性 デキストリン 陰性 スターチ 陰性
【0008】上記微生物を培養する培地は特に限定され
ず、微生物の培養に用いうるものであればよい。例え
ば、炭素源としては、上記微生物の利用可能なものであ
ればいずれも使用でき、具体的には、グルコース、フル
クトース、シュクロース、デキストリン等の糖類、グリ
セロール、ソルビトール等の糖アルコール、フマル酸、
クエン酸等の有機酸を使用できる。これら炭素源の培地
への添加量は通常0.1〜10%程度とするのが好まし
い(以下添加量または濃度%はg/100mlを意味す
る)。窒素源としては、例えば塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム等の無機酸のアンモニウム塩、フマル酸
アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の有機酸のアン
モニウム塩、肉エキス、酵母エキス、コーンステイーブ
リカー、カゼイン加水分解物等の天然有機窒素源等を使
用することができ、このうち有機窒素源は多くの場合、
炭素源としても兼用できる。窒素源の添加量は通常0.
1〜10%の範囲が適当である。また無機塩類としては
例えばリン酸カリウム、リン酸ナトリウム等のリン酸ア
ルカリ金属、塩化カリウム、塩化ナトリウム等の塩化ア
ルカリ金属、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄等の硫酸金
属塩等が好適に使用でき、その使用量は通常0.001
〜1%の範囲が好適である。微生物の培養は20〜40
℃とりわけ30〜37℃、pH約5〜8とりわけpH約
6〜7で好気的条件下に実施するのが好ましい。
【0009】このようにして得られた培養液、該培養液
から採取した微生物菌体は、酵素源として好適に使用で
きる。さらに菌体処理物(例えば凍結乾燥菌体、アセト
ン乾燥菌体、洗浄菌体、菌体磨砕物、菌体の自己消化
物、菌体の超音波処理物、菌体抽出物等)を酵素源とし
て用いてもよい。また、菌体あるいは菌体処理物を、例
えばポリアクリルアミドゲル法、含硫多糖ゲル法(カラ
ギーナンゲル法等)、アルギン酸ゲル法、寒天ゲル法等
の公知方法により固定化して使用してもよい。さらに菌
体抽出物から公知の方法を組み合わせて精製取得した酵
素を使用してもよい。
【0010】反応は、培養液、菌体または菌体処理物と
基質であるアセトフェノンを混合することにより進めら
れる。培養後の菌体を含む培養液に基質を加えて反応さ
せてもよく、また該培養液から得られた菌体または菌体
処理物を基質の水溶液に加えて反応させてもよい。基質
の濃度は概ね0.01〜5%、とりわけ0.05〜1%が
好ましい。反応液のpHは、5〜10、とりわけ7〜9
が好ましい。反応温度は概ね10〜50℃、とりわけ2
5〜40℃が好ましい。
【0011】本反応はアミノ基供与体、界面活性剤、補
酵素等の存在下に実施すると、反応時間の短縮、あるい
は光学活性α−メチルベンジルアミンの蓄積量を増加で
きる点で好ましい。この目的に用いられるアミノ基供与
体としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウ
ム、ギ酸アンモニウム等のアンモニウム塩、およびL−
グルタミン酸、L−アスパラギン酸等のL−アミノ酸等
を例示できる。これらを基質に対し等モル以上の量で使
用するのが好ましい。界面活性剤としては、臭化セチル
ピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、ポ
リエチレングリコール、p−イソオクチルフェニルエー
テル(米国、ロームアンドハース社製、商品名:トリト
ンX−100)等を例示でき、これらを反応液に対し
0.0001〜0.1%程度使用するのが好ましい補酵素
としてはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(還元
型)を例示でき、これを概ね基質と等モル使用するのが
好ましい。
【0012】反応液中に蓄積したα−メチルベンジルア
ミンの分離精製は、通常の公知方法、例えば抽出カラム
クロマトグラフィー、蒸留等により実施すればよい。
【0013】以下、本発明を実施例に基づきより詳細に
説明する。例中添加量または濃度%は重量/容量(g/
100ml)を意味する。 実施例1 ブレインハート・インフェージョン(Difco製)液
体培地100ml(pH7.0)を500ml容振盪フ
ラスコに入れ、120℃で10分間滅菌した。この培地
にシュードモナス・リボフラビナATCC9526を1
白金耳接種し、33℃で18時間振盪培養した。得られ
た培養液のpHを1NHClで8.0に調整後、L−ア
スパラギン酸(最終濃度1mM)、L−グルタミン酸
(最終濃度1mM)、グルコース(最終濃度0.5%)
および0.5mlのアセトフェノンを添加し、33℃で
さらに2日間培養した。培養液のpHを1NNaOHで
10.0に調整し、40mlの酢酸ブチルで抽出した。
この酢酸ブチル層を20mlの0.1NHClで逆抽出
し、未反応のアセトフェノンを除去した。α−メチルベ
ンジルアミンをふくむ0.1NHCl層のpHを1NN
aOHで再度10.0に調整し、4mlの酢酸ブチルで
再抽出した。酢酸ブチル層を減圧濃縮した後、濃縮液
(0.5ml)をTLCプレート(art5715、メ
ルク社製)にスポットし、アセトンで展開した。標準品
のα−メチルベンジルアミンのRf値に対応するシリカ
ゲル部分をかき取り、1mlのアセトンで抽出した後、
70℃常圧でアセトンを留去し、液状のα−メチルベン
ジルアミン17.3mgを得た。光学純度は下記の高速
液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いて測定し
た。その結果R−体は検出されず、100%の光学純度
を示した。
【0014】 HPLCの測定条件 カラム:クラウンパックCR(+) 移動相:HClO4、pH1.5 流速 :0.8ml/分 検出 :UV200nm 温度 :25℃ 上記条件下でS−体の保持時間は10.8分、R−体の
保持時間は13.6分であった。
【0015】実施例2 グルコース1.5%、酵母エキス0.5%、ペプトン0.
5%、肉エキス0.5%、脱脂大豆粉1%およびグリセ
ロール1.5%を含むAK培地(pH7.2)100ml
を500ml容振盪フラスコに入れ、120℃で10分
間滅菌した。この培地にストレプトマイセス・ラベンズ
ラATCC8644を1白金耳接種し、28℃で66時
間振盪培養した。培養液から遠心分離で菌体を集め、L
−アスパラギン酸(1mM)、L−グルタミン酸(1m
M)、グルコース(0.5%)および0.5mlのアセト
フェノンを含む0.1Mリン酸緩衝液100mlに懸濁
した。この菌体懸濁液を500ml容振盪フラスコに入
れ、28℃で48時間反応させ、実施例1と同様に操作
してα−メチルベンジルアミン21.3mgを得た。光
学純度を実施例1と同じHPLC条件下にて測定したと
ころ、R−体は検出されず、100%の光学純度を示し
た。
【0016】実施例3〜14 第1表に記載した培地100mlを500ml容振盪フ
ラスコに入れ、120℃で15分間滅菌した。これらの
培地に第1表に記載した各微生物を接種し、28℃で培
養した後、実施例1と同様に操作してアセトフェノン
0.5mlを基質とする反応を第1表に記載した条件で
行い、その後も実施例1と同様に操作して光学純度と収
量を測定した。その結果を第1表に示す。
【0017】 第1表 使用菌株 使用菌の培養条件 反応時間 培地 培養時間 コリネバクテリウム・ゼロシス No.1 18時間 24時間 AJ 1395(FERM−P11886) ブレビバクテリウム・リネンス No.1 18時間 24時間 ATCC 8377 ザルシナ・アルビダ No.1 18時間 24時間 IAM1012 ストレプトマイセス・ロイデンシス No.2 66時間 48時間 ATCC 11415 ストレプトマイセス・ベネズエラ No.2 66時間 48時間 ATCC 15439 ストレプトマイセス・グリゼウス・ サブスピーシス・フォルミカス No.2 66時間 48時間 ATCC 14811 ストレプトマイセス・リップマニイ No.2 66時間 48時間 ATCC 27357 ストレプトバーチシリウム・アルダン No.2 66時間 48時間 ATCC 13430 ミクロモノスポラ・カルケェ No.2 66時間 48時間 ATCC 27083 アミコラータ・オートトロフイカ No.2 66時間 48時間 ATCC 19727 アクチノマズラ・プシラ No.2 66時間 48時間 ATCC 27296 トリコデルマ・ビリデ No.3 66時間 48時間 ATCC 8678
【0018】 第1表(続) 使用菌株 α−メチルベンジル 光学純度(%) アミン、 収量(mg) S−体 R−体 コリネバクテリウム・ゼロシス 14.5 100 0 AJ 1395(FERM P−11886) ブレビバクテリウム・リネンス 9.3 95 5 ATCC 8377 ザルシナ・アルビダ 4.2 14 86 IAM 1012 ストレプトマイセス・ロイデンシス 11.9 82 18 ATCC 11415 ストレプトマイセス・ベネズエラ 10.8 89 11 ATCC 15439 ストレプトマイセス・グリゼウス・ サブスピーシス・フォルミカス 8.5 92 8 ATCC 14811 ストレプトマイセス・リップマニイ 7.9 75 25 ATCC 27357 ストレプトバーチシリウム・アルダン 13.5 81 19 ATCC 13430 ミクロモノスポラ・カルケェ 4.7 61 39 ATCC 27083 アミコラータ・オートトロフイカ 9.1 94 6 ATCC 19727 アクチノマズラ・プシラ 3.9 69 31 ATCC 27296 トリコデルマ・ビリデ 2.7 47 53 ATCC 8678 注: No.1;ブレインハート・インフュージョン(D
ifco社製)液体培地 No.2;AK培地 No.3;ポテトスターチ2%、脱脂大豆2%、KH2
40.1%、MgSO4・7H2O0.05%、グルコー
ス1%を含む培地。
【0019】
【発明の効果】本発明によれば、工業的安価なアセトフ
ェノンから酵素法により医薬化合物原料として重要なα
−メチルベンジルアミンを製造する方法が提供される。
本発明によれば、微生物など酵素反応条件を適宜選択す
ることにより、光学純度100%のα−メチルベンジル
アミンを製造する方法が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12P 13/00 C12R 1:13) (C12P 13/00 C12R 1:465) (C12P 13/00 C12R 1:61) (C12P 13/00 C12R 1:545) (C12P 13/00 C12R 1:625) (C12P 13/00 C12R 1:30) (C12P 13/00 C12R 1:03) (C12P 13/00 C12R 1:885) (72)発明者 岡本 六郎 神奈川県藤沢市花の木2−18 (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) C12P 13/00 - 13/24

Claims (1)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 アセトフェノンからR−(+)−α−メ
    チルベンジルアミンまたはS−(−)−α−メチルベン
    ジルアミンを生成する能力を有する下記微生物から選ば
    れた少なくとも一種の培養液、該培養液から採取した菌
    体、または菌体の処理物をアセトフェノンに作用させ、
    生成したR−(+)−α−メチルベンジルアミンおよび
    /またはS−(−)−α−メチルベンジルアミンを採取
    することを特徴とするα−メチルベンジルアミンの製造
    法、 微生物:シュードモナス属、コリネバクテリウム属、ブ
    レビバクテリウム属、サルシナ属、ストレプトマイセス
    属、ストレプトバーチシリウム属、ミクロモノスポラ
    属、アミコラータ属、アクチノマズラ属およびトリコデ
    ルマ属。
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