JPH07289284A - 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法 - Google Patents
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法Info
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- JPH07289284A JPH07289284A JP6083065A JP8306594A JPH07289284A JP H07289284 A JPH07289284 A JP H07289284A JP 6083065 A JP6083065 A JP 6083065A JP 8306594 A JP8306594 A JP 8306594A JP H07289284 A JPH07289284 A JP H07289284A
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 工業的に有利に光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を製造する方法を提供する。 【構成】 ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸もしくは該生
体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリ
オキシル酸に作用させ、生成した光学活性４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光
学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法。
−ケトグルタル酸を製造する方法を提供する。 【構成】 ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸もしくは該生
体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリ
オキシル酸に作用させ、生成した光学活性４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光
学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ピルビン酸とグリオキ
シル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を生成する活性を有する生体触媒を用い、ピルビン酸
または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化
合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を製造する方法に関する。光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は医薬品の合成原料
として有用な化合物である。
シル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸を生成する活性を有する生体触媒を用い、ピルビン酸
または該生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化
合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を製造する方法に関する。光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸は医薬品の合成原料
として有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】従来の光学活性４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸の製造法としては、スレオまたはエリスロ
−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミ
ノし、Ｌ−またはＤ−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を各々得る方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J.B.C.), 238 ,3660(1963) 〕やオキザロ
酢酸とグリオキシル酸から合成したＤＬ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸からＤおよびＬ体を分離する方
法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methodsin Enz
ymology), 17 partB, 253 〕が知られている。また動
物や大腸菌に存在するケトヒドロキシグルタル酸アルド
ラーゼによって、ピルビン酸とグリオキシル酸から酵素
的に４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成するこ
とができるが、いずれの場合も得られる４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸はＤ体とＬ体の混合物であること
が知られている〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(M
ethods in Enzymology),41 partB ,115〕。
トグルタル酸の製造法としては、スレオまたはエリスロ
−４−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸を化学的に脱アミ
ノし、Ｌ−またはＤ−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を各々得る方法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー(J.B.C.), 238 ,3660(1963) 〕やオキザロ
酢酸とグリオキシル酸から合成したＤＬ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸からＤおよびＬ体を分離する方
法〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(Methodsin Enz
ymology), 17 partB, 253 〕が知られている。また動
物や大腸菌に存在するケトヒドロキシグルタル酸アルド
ラーゼによって、ピルビン酸とグリオキシル酸から酵素
的に４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成するこ
とができるが、いずれの場合も得られる４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸はＤ体とＬ体の混合物であること
が知られている〔メソッズ・イン・エンザイモロジー(M
ethods in Enzymology),41 partB ,115〕。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の製造法は、(1)
原料が高価である、(2) ＤＬ体の分離工程を要する、
(3) 収率が低い、などの点で、工業的な製法として必ず
しも満足できる方法ではなく、工業的に有利に光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法の
開発が求められている。本発明の目的は工業的に有利に
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造す
る方法を提供することにある。
原料が高価である、(2) ＤＬ体の分離工程を要する、
(3) 収率が低い、などの点で、工業的な製法として必ず
しも満足できる方法ではなく、工業的に有利に光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する方法の
開発が求められている。本発明の目的は工業的に有利に
光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を製造す
る方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、ピルビ
ン酸とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、
水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピル
ビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用さ
せ、水性媒体中に生成した光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法を提供す
ることができる。
ン酸とグリオキシル酸から光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を生成する能力を有する生体触媒を、
水性媒体中でピルビン酸または該生体触媒によってピル
ビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸に作用さ
せ、水性媒体中に生成した光学活性４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を採取することを特徴とする光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の製造法を提供す
ることができる。
【０００５】なお、光学活性４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸とはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸〔(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕またはＬ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔(S)-4-hydroxy-
2-ketoglutaric acid 〕のことをいう。さらに詳しく
は、ピルビン酸とグリオキシル酸からＤ−またはＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体
触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオ
キシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＤ−または
Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取するこ
とを特徴とするＤ−またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸の製造法を提供することができる。
グルタル酸とはＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸〔(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕またはＬ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔(S)-4-hydroxy-
2-ketoglutaric acid 〕のことをいう。さらに詳しく
は、ピルビン酸とグリオキシル酸からＤ−またはＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体
触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオ
キシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＤ−または
Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取するこ
とを特徴とするＤ−またはＬ−４−ヒドロキシ−２−ケ
トグルタル酸の製造法を提供することができる。
【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。本発明で
用いられる生体触媒としては、微生物、該微生物の培養
物、菌体またはそれらの処理物があげられる。微生物と
しては、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸
に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有
する微生物であればいずれの微生物でも用いることがで
きる。具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、シュウ
ドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾ
ビウム属またはモルガネラ属に属する微生物があげられ
る。
用いられる生体触媒としては、微生物、該微生物の培養
物、菌体またはそれらの処理物があげられる。微生物と
しては、ピルビン酸または該微生物によってピルビン酸
に転換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を有
する微生物であればいずれの微生物でも用いることがで
きる。具体的にはセルビブリオ属、バチルス属、シュウ
ドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア属、リゾ
ビウム属またはモルガネラ属に属する微生物があげられ
る。
【０００７】Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチル
ス属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはセルビ
ブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸また
は該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物と
グリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を生成する能力を有する微生物が好ましい。
を製造する場合にはとくにセルビブリオ属またはバチル
ス属に属する微生物が好ましい。さらに詳しくはセルビ
ブリオ属またはバチルス属に属し、かつピルビン酸また
は該微生物によってピルビン酸に転換され得る化合物と
グリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸を生成する能力を有する微生物が好ましい。
【０００８】具体的にはセルビブリオ ギルバス（Cell
vibrio gilvus）ATCC13127 株、バチルス エスピー
（Bacillus sp.）OC187 株、バチルス エスピー（Baci
llus sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127 株およ
びOC187 株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を
施すことにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した
株は、セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピ
ルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され
得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通
常の変異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変
異処理により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸の生成能が失活した変異株を選択することに
よっても得ることができる。S16 株はOC187 株より変異
誘導され、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の
生成能を失活した変異株である。
vibrio gilvus）ATCC13127 株、バチルス エスピー
（Bacillus sp.）OC187 株、バチルス エスピー（Baci
llus sp.）S16 株などがあげられる。ATCC13127 株およ
びOC187 株は６０〜９０℃、１５分〜２時間の熱処理を
施すことにより、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の生成能を失活させることができる。また、Ｌ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の生成能を失活した
株は、セルビブリオ属またはバチルス属に属し、かつピ
ルビン酸または該微生物によってピルビン酸に転換され
得る化合物とグリオキシル酸からＤ−４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を生成する能力を有する微生物を通
常の変異処理手段、たとえば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニト
ロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）による通常の変
異処理により変異させ、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸の生成能が失活した変異株を選択することに
よっても得ることができる。S16 株はOC187 株より変異
誘導され、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸の
生成能を失活した変異株である。
【０００９】バチルス エスピー（Bacillus sp.）OC18
7 株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分
離された菌株であって、その菌学的性質を第１−１表〜
第１−６表に詳述する。 (A) 形態
7 株は、本発明者らによって町田市の土壌より新たに分
離された菌株であって、その菌学的性質を第１−１表〜
第１−６表に詳述する。 (A) 形態
【００１０】
【表１】
【００１１】(B) 培養学的性質
【００１２】
【表２】
【００１３】(C) 生理学的性質
【００１４】
【表３】
【００１５】
【表４】
【００１６】(D) その他の諸性質
【００１７】
【表５】
【００１８】(E) 化学分類学的性質
【００１９】
【表６】
【００２０】OC187 株は、陰性あるいは陽性のグラム染
色性を示す桿菌で、周毛による運動性を示し、楕円状の
内性胞子を有する通性嫌気性菌であった。O-F テストで
は発酵的に糖を分解して酸を生成し、カタラーゼ活性は
陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、硝酸塩を還元
しなかった。また、10％の塩化ナトリウム耐性で、55℃
で生育したが10℃および65℃では生育しなかった。
色性を示す桿菌で、周毛による運動性を示し、楕円状の
内性胞子を有する通性嫌気性菌であった。O-F テストで
は発酵的に糖を分解して酸を生成し、カタラーゼ活性は
陽性を、オキシダーゼ活性は陰性を示し、硝酸塩を還元
しなかった。また、10％の塩化ナトリウム耐性で、55℃
で生育したが10℃および65℃では生育しなかった。
【００２１】また、主要キノン型はMK-7で、細胞壁ペプ
チドグリカンジアミノ酸組成は、meso-A2pm を示し、DN
A のGC含量は45.9 mol% であった。以上の菌学的性質を
有する菌について、バージェイのマニュアル（Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology） Vol.2（1986
年）の記載と照合した結果、該菌株をバチルス属に属す
る細菌と同定し、OC187 株をバチルス エスピー（Baci
llus sp.）OC187 と命名した。
チドグリカンジアミノ酸組成は、meso-A2pm を示し、DN
A のGC含量は45.9 mol% であった。以上の菌学的性質を
有する菌について、バージェイのマニュアル（Bergey's
Manual of Systematic Bacteriology） Vol.2（1986
年）の記載と照合した結果、該菌株をバチルス属に属す
る細菌と同定し、OC187 株をバチルス エスピー（Baci
llus sp.）OC187 と命名した。
【００２２】バチルス エスピー OC187株および S16株
は、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に各々FERM BP-464
6、FERM BP-4647として寄託されている。Ｌ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくに
シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア
属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が
好ましい。さらに詳しくはシュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガ
ネラ属に属し、ピルビン酸または該微生物によってピル
ビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＬ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を
有する微生物であればよい。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸を実質的に生成しない微生物であればよ
り好ましい。
は、ブダペスト条約に基づいて平成６年４月１９日付で
工業技術院生命工学工業技術研究所に各々FERM BP-464
6、FERM BP-4647として寄託されている。Ｌ−４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸を製造する場合にはとくに
シュウドモナス属、パラコッカス属、プロビデンシア
属、リゾビウム属またはモルガネラ属に属する微生物が
好ましい。さらに詳しくはシュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガ
ネラ属に属し、ピルビン酸または該微生物によってピル
ビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＬ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を
有する微生物であればよい。Ｄ−４−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸を実質的に生成しない微生物であればよ
り好ましい。
【００２３】具体的にはシュウドモナス プチダ（Pseu
domonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 4359 株、シュウドモナス
サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC
9114 株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains
(1993) 〕、シュウドモナス ボレオポリス（Pseudomon
as boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス タエ
トロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、
シュウドモナス オレオボランス（Pseudomonas oleovor
ans）ATCC 8062 株、パラコッカス デニトリフィカン
ス（Paracoccusdenitrificans）ATCC 19367株、プロビ
デンシア ルスチギアニ（Providencia rustigianii）A
TCC 13159株、リゾビウム メリロッティ（Rhizobium m
eliloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ
モルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などが
あげられる。
domonas putida）ATCC 795株、シュウドモナス プチダ
（Pseudomonas putida）ATCC 4359 株、シュウドモナス
サッカロフィラ（Pseudomonas saccharophila）ATCC
9114 株〔＝ATCC 15946株；IAM Catalogue of Strains
(1993) 〕、シュウドモナス ボレオポリス（Pseudomon
as boreopolis）ATCC 15452株、シュウドモナス タエ
トロレンス（Pseudomonas taetrolens）ATCC 17466株、
シュウドモナス オレオボランス（Pseudomonas oleovor
ans）ATCC 8062 株、パラコッカス デニトリフィカン
ス（Paracoccusdenitrificans）ATCC 19367株、プロビ
デンシア ルスチギアニ（Providencia rustigianii）A
TCC 13159株、リゾビウム メリロッティ（Rhizobium m
eliloti）RCR 2001株（FERM BP-4582）、モルガネラ
モルガニ（Morganella morganii）ATCC 25830株などが
あげられる。
【００２４】リゾビウム メリロッティ（Rhizobium me
liloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成
６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-4582として寄託されている。本発明に用いら
れる微生物の培養は、通常用いられる合成ないし天然培
地を用いて行うことができる。培地中の炭素源として
は、セルビブリオ属またはビブリオ属細菌を用いてＤ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する場合に
はＤ−ガラクトン酸が使用可能である。その他の微生物
を用いてＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合
成する場合には、用いる微生物が資化しうるかぎり、グ
ルコース、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、
乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノールな
どのアルコールなどが使用可能である。
liloti）RCR 2001株は、ブダペスト条約に基づいて平成
６年２月２４日付で工業技術院生命工学工業技術研究所
にFERM BP-4582として寄託されている。本発明に用いら
れる微生物の培養は、通常用いられる合成ないし天然培
地を用いて行うことができる。培地中の炭素源として
は、セルビブリオ属またはビブリオ属細菌を用いてＤ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する場合に
はＤ−ガラクトン酸が使用可能である。その他の微生物
を用いてＬ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を合
成する場合には、用いる微生物が資化しうるかぎり、グ
ルコース、フラクトース、シュークロース、マルトー
ス、澱粉、澱粉加水分解物、糖蜜などの糖類や、酢酸、
乳酸、グルコン酸などの有機酸、あるいはエタノールな
どのアルコールなどが使用可能である。
【００２５】窒素源としては、用いる微生物が資化しう
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や尿
素、硝酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン・スチープリカーなどの各種の窒素含有有機物が
使用可能である。無機塩としては、用いる微生物が利用
しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどが使用できる。他に微量
元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、
モリブデンなどの塩類を加えてもよい。
るかぎり、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモ
ニウム、酢酸アンモニウムなどのアンモニウム塩や尿
素、硝酸塩ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン・スチープリカーなどの各種の窒素含有有機物が
使用可能である。無機塩としては、用いる微生物が利用
しうるかぎり、リン酸カリウム、硫酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、
硫酸第一鉄、硫酸マンガンなどが使用できる。他に微量
元素としてカルシウム、亜鉛、ほう素、銅、コバルト、
モリブデンなどの塩類を加えてもよい。
【００２６】また必要に応じてチアミン、ビオチンのよ
うなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のような
アミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質な
どを添加してもよい。ピルビン酸またはピルビン酸に転
換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する方法は、微生
物の培養中に基質を添加する方法を用いてもよいし、培
養して得られた微生物の培養物、菌体もしくはそれらの
処理物を、基質に作用させて光学活性４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を生成させる方法を用いてもよい。
うなビタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸のような
アミノ酸、アデニン、グアニンのような核酸関連物質な
どを添加してもよい。ピルビン酸またはピルビン酸に転
換され得る化合物とグリオキシル酸から光学活性４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を合成する方法は、微生
物の培養中に基質を添加する方法を用いてもよいし、培
養して得られた微生物の培養物、菌体もしくはそれらの
処理物を、基質に作用させて光学活性４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を生成させる方法を用いてもよい。
【００２７】処理物としては菌体の乾燥物、凍結乾燥
物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機
械的磨砕処理物、溶媒処理物などの菌体処理物、菌体の
蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物などがあ
げられる。前者の方法を用いる場合には、ピルビン酸ま
たはピルビン酸に転換され得る化合物およびグリオキシ
ル酸は各々１〜２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/
lの濃度範囲で培養の初発もしくは途中に添加する。培
養時間は用いる微生物によって異なり、１０〜１００時
間程度である。
物、界面活性剤処理物、酵素処理物、超音波処理物、機
械的磨砕処理物、溶媒処理物などの菌体処理物、菌体の
蛋白分画物、菌体および菌体処理物の固定化物などがあ
げられる。前者の方法を用いる場合には、ピルビン酸ま
たはピルビン酸に転換され得る化合物およびグリオキシ
ル酸は各々１〜２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/
lの濃度範囲で培養の初発もしくは途中に添加する。培
養時間は用いる微生物によって異なり、１０〜１００時
間程度である。
【００２８】後者の方法を用いる場合には、ピルビン酸
またはピルビン酸に転換され得る化合物１〜２００g/l
、好ましくは２０〜２００g/l 、グリオキシル酸１〜
２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/l 、微生物の菌
体またはその処理物０. １〜２００g/l 、好ましくは５
〜１００g/l （微生物菌体換算）を含む水性媒体中、温
度１５〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃、pH３〜１
１、好ましくは５〜９の条件で行う。反応時間は３０分
〜８０時間程度である。
またはピルビン酸に転換され得る化合物１〜２００g/l
、好ましくは２０〜２００g/l 、グリオキシル酸１〜
２００g/l 、好ましくは２０〜２００g/l 、微生物の菌
体またはその処理物０. １〜２００g/l 、好ましくは５
〜１００g/l （微生物菌体換算）を含む水性媒体中、温
度１５〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃、pH３〜１
１、好ましくは５〜９の条件で行う。反応時間は３０分
〜８０時間程度である。
【００２９】水性媒体としては、例えばリン酸緩衝液や
生理食塩水などが使用できる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やナイミーン（日
本油脂社製）などの界面活性剤や少量のトルエンやキシ
レンなどの有機溶媒を0.1 〜20g/l 添加してもよい。ピ
ルビン酸に転換され得る化合物としては、菌体あるいは
その処理物によってピルビン酸に変換され得る化合物で
あれば如何なる物でも使用できるが、通常グルコース、
フラクトース、マルトース等の糖類あるいはグリセロー
ル、乳酸などを使用する。
生理食塩水などが使用できる。また必要に応じてトリト
ンＸ−１００（ナカライテスク社製）やナイミーン（日
本油脂社製）などの界面活性剤や少量のトルエンやキシ
レンなどの有機溶媒を0.1 〜20g/l 添加してもよい。ピ
ルビン酸に転換され得る化合物としては、菌体あるいは
その処理物によってピルビン酸に変換され得る化合物で
あれば如何なる物でも使用できるが、通常グルコース、
フラクトース、マルトース等の糖類あるいはグリセロー
ル、乳酸などを使用する。
【００３０】水性媒体からの光学活性４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸の採取は、通常水性媒体から有機酸
採取に用いられる方法に従って実施することができる。
例えば、遠心分離により菌体もしくはそれらの処理物を
除いた反応上清から、イオン交換樹脂あるいは膜処理法
などの操作を組み合わせて、光学活性４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を単離することができる。
２−ケトグルタル酸の採取は、通常水性媒体から有機酸
採取に用いられる方法に従って実施することができる。
例えば、遠心分離により菌体もしくはそれらの処理物を
除いた反応上清から、イオン交換樹脂あるいは膜処理法
などの操作を組み合わせて、光学活性４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸を単離することができる。
【００３１】本発明で得られる光学活性４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸は医薬品合成原料として有用であ
り、たとえば４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸から
４−ヒドロキシプロリンを経て、カルバペネム系抗生物
質を合成することができる。４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸から４−ヒドロキシプロリンへの変換は、特
開平３−２６６９９５に記載の方法に準じておこなうこ
とができる。カルバペネム系抗生物質は４−ヒドロキシ
プロリンからヘテロサイクルズ（Heterocycles）, 24,
p1331 (1986)に記載の方法に準じてＮ−ｐ−ニトロベン
ジルオキシカルボニル−３−メルカプトピロリジンを合
成し、さらに特開昭５８−３２８７９に記載の方法に準
じて得ることができる。
−２−ケトグルタル酸は医薬品合成原料として有用であ
り、たとえば４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸から
４−ヒドロキシプロリンを経て、カルバペネム系抗生物
質を合成することができる。４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸から４−ヒドロキシプロリンへの変換は、特
開平３−２６６９９５に記載の方法に準じておこなうこ
とができる。カルバペネム系抗生物質は４−ヒドロキシ
プロリンからヘテロサイクルズ（Heterocycles）, 24,
p1331 (1986)に記載の方法に準じてＮ−ｐ−ニトロベン
ジルオキシカルボニル−３−メルカプトピロリジンを合
成し、さらに特開昭５８−３２８７９に記載の方法に準
じて得ることができる。
【００３２】以下に本発明の実施例を示す。
【００３３】
【００３４】実施例１ セルビブリオ ギルバスATCC13127 株を3ml のＬ培地
（バクトペプトン10g 、酵母エキス5gおよびNaCl 10gを
水１リットルに含みpH7.0 に調整した培地）に接種し、
３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液２ｍｌを
下記第２表の組成からなるＧＮＭＳ培地２０ｍｌに接種
した。
（バクトペプトン10g 、酵母エキス5gおよびNaCl 10gを
水１リットルに含みpH7.0 に調整した培地）に接種し、
３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液２ｍｌを
下記第２表の組成からなるＧＮＭＳ培地２０ｍｌに接種
した。
【００３５】
【表７】
【００３６】これを１０mlづつ２本の試験管に分注し２
０時間培養した。培養終了後、１本の試験管には80℃で
１時間加温する熱処理を施し、もう一本は３０℃に保っ
た。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した１
mlの反応液(a) 〔KH2PO4 3g、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、M
gSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸
ナトリウム100mmol およびグリオキシル酸100mmol を純
水１リットルに含みNaOHでpH７. ０に調整した反応液〕
に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で３７℃で振
とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作に
よって菌体を除き、上清中に生成した４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友
化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量した。測定結果を第
３表に示す。なお、ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸の標準化合物は各々、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 237,476(19
62) および同, 238, 3660(1963) に記載の方法によって
調製した。
０時間培養した。培養終了後、１本の試験管には80℃で
１時間加温する熱処理を施し、もう一本は３０℃に保っ
た。ついで遠心分離操作で各々菌体を集め、滅菌した１
mlの反応液(a) 〔KH2PO4 3g、NaH2PO4 6g、NH4Cl 1g、M
gSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 11mg、ピルビン酸
ナトリウム100mmol およびグリオキシル酸100mmol を純
水１リットルに含みNaOHでpH７. ０に調整した反応液〕
に懸濁し、ファルコン社製2059チューブ中で３７℃で振
とうし５時間反応させた。反応終了後、遠心分離操作に
よって菌体を除き、上清中に生成した４−ヒドロキシ−
２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL OA-5000カラム（住友
化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量した。測定結果を第
３表に示す。なお、ＤおよびＬ−４−ヒドロキシ−２−
ケトグルタル酸の標準化合物は各々、ジャーナル・オブ
・バイオロジカル・ケミストリー(J.B.C.), 237,476(19
62) および同, 238, 3660(1963) に記載の方法によって
調製した。
【００３７】
【表８】
【００３８】実施例２ Ｌ培地３ｍｌを試験管に分注し、滅菌後、第５表に示し
た微生物を各々接種し、３０℃で１６時間振とう培養し
た。この培養液１ｍｌを下記第４表の組成からなるＧＭ
Ｓ培地１０ｍｌに接種し試験管で２０時間培養した。
た微生物を各々接種し、３０℃で１６時間振とう培養し
た。この培養液１ｍｌを下記第４表の組成からなるＧＭ
Ｓ培地１０ｍｌに接種し試験管で２０時間培養した。
【００３９】
【表９】
【００４０】培養終了後、遠心分離操作で各々菌体を集
め、滅菌した１mlの反応液(b) 〔KH 2PO4 3g 、NaH2PO4
6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 1
1mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol 、グリオキシル酸1
00mmol および亜ひ酸10mmolを純水１リットルに含みNaO
HでpH７. ０に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン
社製2059チューブ中で３０℃で振とうし５時間反応させ
た。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上
清中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
SUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨ
ＰＬＣで定量した。結果を第５表に示す。
め、滅菌した１mlの反応液(b) 〔KH 2PO4 3g 、NaH2PO4
6g、NH4Cl 1g、MgSO4・7H2O 0.16g、NaCl 5g 、CaCl2 1
1mg、ピルビン酸ナトリウム100mmol 、グリオキシル酸1
00mmol および亜ひ酸10mmolを純水１リットルに含みNaO
HでpH７. ０に調整した反応液〕に懸濁し、ファルコン
社製2059チューブ中で３０℃で振とうし５時間反応させ
た。反応終了後、遠心分離操作によって菌体を除き、上
清中に生成した４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を
SUMICHIRAL OA-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨ
ＰＬＣで定量した。結果を第５表に示す。
【００４１】
【表１０】
【００４２】実施例３ 実施例１で用いた反応液(a) 中のピルビン酸ナトリウム
100mmol の代わりにグルコース20g 、グリセロール20g
または乳酸アンモニウム20g を含む反応液を各々調製し
た。この反応液にシュウドモナス プチダ ATCC795株を
実施例２と同様に培養して得た菌体を懸濁し、実施例２
と同様に３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成し
た４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL O
A-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量
した。結果を第６表に示す。
100mmol の代わりにグルコース20g 、グリセロール20g
または乳酸アンモニウム20g を含む反応液を各々調製し
た。この反応液にシュウドモナス プチダ ATCC795株を
実施例２と同様に培養して得た菌体を懸濁し、実施例２
と同様に３０℃で振とうし５時間反応させた。反応終了
後、遠心分離操作によって菌体を除き、上清中に生成し
た４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸をSUMICHIRAL O
A-5000カラム（住友化学社製）を用いたＨＰＬＣで定量
した。結果を第６表に示す。
【００４３】
【表１１】
【００４４】実施例４ セルビブリオ ギルバスATCC13127 株をＬ培地９ｍｌに
接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全
量を300ml のＧＮＭＳ培地に接種し２リットル容の三角
フラスコで３０℃で２０時間振とう培養した。この培養
液を８０℃で１時間加熱処理した後、遠心分離によって
菌体を分離し、反応液(a) 60mlに懸濁し、300ml 容ビー
カー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に保って反応
を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２
Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml を
添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離によって反
応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量した。Ｌ−体
は検出されず、125mM のＤ−４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸が検出された。
接種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全
量を300ml のＧＮＭＳ培地に接種し２リットル容の三角
フラスコで３０℃で２０時間振とう培養した。この培養
液を８０℃で１時間加熱処理した後、遠心分離によって
菌体を分離し、反応液(a) 60mlに懸濁し、300ml 容ビー
カー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に保って反応
を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナトリウム２
Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ溶液3ml を
添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離によって反
応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量した。Ｌ−体
は検出されず、125mM のＤ−４−ヒドロキシ−２−ケト
グルタル酸が検出された。
【００４５】ダイヤイオンPA416 （三菱化成社製）を充
填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ
蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カ
ラム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶
液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加
し、Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシ
ウム塩を晶出させた。このようにしてＤ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.5gを得た。
填したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ
蟻酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カ
ラム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶
液を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加
し、Ｄ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシ
ウム塩を晶出させた。このようにしてＤ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.5gを得た。
【００４６】実施例５ シュウドモナス プチダATCC795 株をＬ培地９ｍｌに接
種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量
を300ml のＧＭＳ培地に接種し２リットル容の三角フラ
スコで３０℃で２０時間振とう培養した。得られた培養
液から菌体を遠心分離し、反応液(b)60ml に懸濁し、30
0ml 容ビーカー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に
保って反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナ
トリウム２Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ
溶液3ml を添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離
によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量し
た。Ｄ−体は検出されず、150mM のＬ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸が検出された。
種し３０℃で１６時間振とう培養した。この培養液全量
を300ml のＧＭＳ培地に接種し２リットル容の三角フラ
スコで３０℃で２０時間振とう培養した。得られた培養
液から菌体を遠心分離し、反応液(b)60ml に懸濁し、30
0ml 容ビーカー中で撹拌しつつ１規定硫酸でpHを6.5 に
保って反応を行った。反応開始６時間後にピルビン酸ナ
トリウム２Ｍ溶液3ml とグリオキシル酸ナトリウム２Ｍ
溶液3ml を添加した。反応開始後２４時間目で遠心分離
によって反応液から菌体を除き、遠心上清中の４−ヒド
ロキシ−２−ケトグルタル酸をＨＰＬＣによって定量し
た。Ｄ−体は検出されず、150mM のＬ−４−ヒドロキシ
−２−ケトグルタル酸が検出された。
【００４７】ダイヤイオンPA416 （三菱化成社製）充填
したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ蟻
酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カラ
ム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液
を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加
し、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシ
ウム塩を晶出させた。このようにしてＬ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.7gを得た。
したカラムに上記上清のうち50mlを通塔し、０〜６Ｍ蟻
酸の指数的グラジエントによって溶出した。６〜８カラ
ム容量に溶出される４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル
酸の溶出画分を減圧濃縮した後、0.01M のCa(OH)2 溶液
を加えpH7.5 に調整した。この溶液にアセトンを添加
し、Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸のカルシ
ウム塩を晶出させた。このようにしてＬ−４−ヒドロキ
シ−２−ケトグルタル酸のカルシウム塩0.7gを得た。
【００４８】実施例６ セルビブリオ ギルバス ATCC13127株のかわりにバチル
ス エスピー OC187株を用い、実施例１と同様に培養
し、同様に反応を行った。結果を第８表（実施例７参
照）に示す。
ス エスピー OC187株を用い、実施例１と同様に培養
し、同様に反応を行った。結果を第８表（実施例７参
照）に示す。
【００４９】実施例７ バチルス エスピー OC187株をＬ培地で30℃、6 時間培
養した菌体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液
（pH6.0 ）で洗浄後、菌体濃度が約109 細胞/mlになる
ように同緩衝液に懸濁し、これにNTG を終濃度が600mg/
l になるように加え、30℃、20分間保持して変異処理を
行った。この変異処理菌体を第７表の組成からなるＭＧ
寒天培地に塗布した。
養した菌体を集め、0.05M トリス−マレイン酸緩衝液
（pH6.0 ）で洗浄後、菌体濃度が約109 細胞/mlになる
ように同緩衝液に懸濁し、これにNTG を終濃度が600mg/
l になるように加え、30℃、20分間保持して変異処理を
行った。この変異処理菌体を第７表の組成からなるＭＧ
寒天培地に塗布した。
【００５０】
【表１２】
【００５１】生じたコロニーをＬ寒天培地（Ｌ培地に寒
天２％を加えたもの）に拾い、Ｄ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸の生産性を調べた。即ち、各株を実施
例１と同様に培養し、同様に反応を行った。ただしいず
れの株に対しても熱処理は行わなかった。反応終了後の
遠心上清中の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実
施例１と同様に分析した結果、Ｌ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を生成せず、Ｄ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸のみを生成する変異株S16 株を得た。
S16 株の反応上清の分析結果を第８表に示す。
天２％を加えたもの）に拾い、Ｄ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸の生産性を調べた。即ち、各株を実施
例１と同様に培養し、同様に反応を行った。ただしいず
れの株に対しても熱処理は行わなかった。反応終了後の
遠心上清中の４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を実
施例１と同様に分析した結果、Ｌ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸を生成せず、Ｄ−４−ヒドロキシ−２
−ケトグルタル酸のみを生成する変異株S16 株を得た。
S16 株の反応上清の分析結果を第８表に示す。
【００５２】
【表１３】
【００５３】
【発明の効果】医薬品の合成原料として有用な光学活性
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を工業的に有利に
得ることができる。
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を工業的に有利に
得ることができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:40） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 41/00 Ｃ１２Ｒ 1:41）
Claims (8)
- 【請求項１】 ピルビン酸とグリオキシル酸から光学活
性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性
を有する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該
生体触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグ
リオキシル酸に作用させ、水性媒体中に生成した光学活
性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取すること
を特徴とする光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグルタ
ル酸の製造法。 - 【請求項２】 光学活性４−ヒドロキシ−２−ケトグル
タル酸がＤ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸
〔(R)-4-hydroxy-2-ketoglutaric acid 〕またはＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸〔(S)-4-hydroxy-2-
ketoglutaric acid 〕である請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 ピルビン酸とグリオキシル酸からＤ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体
触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオ
キシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＤ−４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取する請求項１また
は２記載の製造法。 - 【請求項４】 生体触媒が、微生物、該微生物の培養
物、菌体またはそれらの処理物である請求項３記載の製
造法。 - 【請求項５】 微生物がセルビブリオ属またはバチルス
属に属し、かつピルビン酸または該微生物によってピル
ビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸からＤ−
４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能力を
有する微生物である請求項４記載の製造法。 - 【請求項６】 ピルビン酸とグリオキシル酸からＬ−４
−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する活性を有
する生体触媒を、水性媒体中でピルビン酸または該生体
触媒によってピルビン酸に転換され得る化合物とグリオ
キシル酸に作用させ、水性媒体中に生成したＬ−４−ヒ
ドロキシ−２−ケトグルタル酸を採取する請求項１また
は２記載の製造法。 - 【請求項７】 生体触媒が、微生物、該微生物の培養
物、菌体またはそれらの処理物である請求項６記載の製
造法。 - 【請求項８】 微生物が、シュウドモナス属、パラコッ
カス属、プロビデンシア属、リゾビウム属またはモルガ
ネラ属に属し、かつピルビン酸または該微生物によって
ピルビン酸に転換され得る化合物とグリオキシル酸から
Ｌ−４−ヒドロキシ−２−ケトグルタル酸を生成する能
力を有する微生物である請求項７記載の製造法。
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