BRPI0711972A2 - métodos e sistemas para aumentar a produção de reações de equilìbrio - Google Patents

Abstract

MéTODOS E SISTEMAS PARA AUMENTAR A PRODUçãO DE REAçõES DE EQUILìBRIO. A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para aumentar a produção de reações de equilíbrio. Em algumas modalidades, um método compreende remover enzimas de uma mistura da reação uma vez que seja obtido equilíbrio, readicionando seletivamente enzimas e reagentes para impelir a reação formadora de produto para produto, e opcionalmente reciclar intermediários estabilizados, subprodutos e/ou co-produtos de volta para a mistura da reação. Em algumas modalidades, um método compreende purificar o produto desejado de uma mistura da reação e reciclar seletivamente um ou mais componentes da mistura da reação, tais como reagentes originais, intermediários, co-produtos ou subprodutos de volta para a mistura da reação conforme desejado para melhorar o título. Também são proporcionados sistemas para implementar os métodos. Em algumas modalidades os métodos e sistemas são implementados para aumentar a produção de monatina e derivados de monatina, produzidos em caminhos de equilíbrio multietapa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E SISTEMAS PARA AUMENTAR A PRODUÇÃO DE REAÇÕES DE EQUILÍBRIO".

Reivindicação de Prioridade

Este pedido reivindica prioridade para o Requerimento Provisório dos Estados Unidos Serial N9 60/803.105, arquivado em 24 de maio de 2006, cujo conteúdo integral é por este incorporado por meio de referência.

Antecedentes

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para aumentar a produção de um produto desejado de caminho de etapas multietapa envolvendo reações de equilíbrio. Em algumas modalidades, o produto desejado é o adoçante de elevada intensidade, monatina.

Antecedentes

Monatina é um adoçante de elevada intensidade tendo a fórmula química:

<formula>formula see original document page 2</formula>

Devido a varias convencoes de nomenclatura,monatina tamben é conhecida por uma série de nomes químicos alternativos, inclusive: ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-aminoglutárico; ácido 4-amino-2-hidróxi-2-(1 H- indol-3-ilmetil)-pentanodióico; ácido 4-hidróxi-4-(3-indolilmetil)glutâmico; e, 3- (1 -amino-1,3-dicarbóxi-3-hidróxi-but-4-il)indol.

Monatina inclui dois centros quirais levando a quatro configurações estereoisoméricas potenciais. A configuração R,R (o "R,R estereoisômero" ou "R,R monatina"); a configuração S1S (o "S,S estereoisômero" ou "S,S monatina"); a configuração R,S (o "R,S estereoisômero" ou "R,S monatina"); e a configuração S,R (o "S,R estereoisômero" ou "S,R monatina"). O Requerimento de patente internacional Nq WO 2003/091396 A2, o qual é por este incorporado por meio de referência, revela, entre outros, polipeptídeos, caminhos, e microorganismos para produção de monatina in vivo e in vitro. O Requerimento de patente internacional N9 WO 2003/091396 A2 (vide, por exemplo, as Figuras 1 a 3 e 11 a 13), e a Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2005/282260 descrevem a produção de monatina a partir de triptofano através de caminhos multietapa envolvendo conversões biológicas com polipeptídeos (proteínas) ou enzimas. Um caminho descrito envolve converter triptofano em indol-3-piruvato ("I-3-P") (reação (1)), converter indol-3-piruvato em 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto glutárico ácido (precursor de monatina, "MP") (reação (2)), e converter MP em monatina (reação (3)), biologicamente, por exemplo, com enzimas.

Algumas formas isoméricas de monatina podem ser encontradas na casca de raízes da planta Schlerochiton ilicifolius localizada na Região do Transvaal da África do Sul. No entanto, foi visto que a concentração da monatina presente na casca seca, expressada como o indol nesta forma ácida, é cerca de 0,007% por massa. Vide a Patente dos Estados Unidos N- 4.975.298. O método exato pelo qual monatina é produzida na planta atualmente é desconhecido.

No mínimo em parte devido a sua característica adoçante, é desejável ter uma fonte econômica de monatina. Portanto, existe uma necessidade contínua de aumentar a eficiência de caminhos sintéticos, tais como caminhos sintéticos de monatina, incluindo os caminhos multietapa biológicos descritos acima.

Sumário

São proporcionados métodos e sistemas para sintetizar um produto final definitivo desejado por um caminho sintético biológico. De acordo com uma modalidade, carbono capturado sob a forma de no mínimo um caminho intermediário que de outro modo seria perdido na conclusão do caminho sintético é recuperado e convertido no produto final desejado alterando o caminho original em uma maneira que converte o carbono referido no produto final definitivo desejado. Uma pessoa com conhecimento regular entenderia que o termo "carbono" é usado aqui, neste requerimento de patente, como abreviação para o composto relevante. Isto é, a declaração "carbono é convertido no produto desejado" significa que o composto contendo carbono é convertido no produto desejado.

Em uma modalidade, intermediários e componentes não reagidos são reciclados para reuso, reduzindo resíduo e aumentando a produção de carbono do produto. Isto é, esta remoção líquida de produto pode perturbar o equilíbrio e pode resultar em mais geração de produto para uma dada quantidade de reagentes originais do que sem remoção de produto. Isto pode melhorar a economia da produção.

Em outra modalidade da invenção, um ou mais componentes da mistura da reação podem ser reciclados para aumentar a produção acima da quantidade da produção de equilíbrio. Isto é, onde uma série de reações é realizada para produzir um produto desejado, também podem ocorrer reações colaterais indesejadas, algumas das quais podem ser irreversíveis, outras das quais podem ser reversíveis. Onde as reações colaterais são irreversíveis, ou essencialmente irreversíveis, o carbono utilizado nestas reações colaterais pode ser irrecuperável para o caminho desejado. Dito de outro modo, se as reações colaterais irreversíveis não são controladas, podem essencialemnte alcançar a velocidade das reações desejadas. Os intermediários e subprodutos mais lábeis, portanto, podem ser estabilizados para evitar degradação. Portanto, em uma modalidade da invenção, os intermediários e produtos colaterais lábeis ou instáveis são estabilizados por conversão para componentes mais estáveis que podem ser reciclados de volta para a mistura de reagentes originais. A conversão de intermediários instáveis para produto ou mais compostos estáveis pode resultar em conservação adicional de carbono e aumento das produções de produto.

Onde as reações colaterais são reversíveis, o produto das reações colaterais reversíveis pode ser reciclado de volta para a mistura de reagentes originais para prevenir ou aliviar reagentes originais adicionais contra serem perdidos para produção de subprodutos indesejados. Adicionando, por exemplo, quandidades de equilíbrio dos produtos colaterais indesejados com os reagentes originais, o resultado líquido é que as reações colaterais indesejadas não prosseguem para diante.

Em uma modalidade particular, monatina é produzida a partir de triptofano convertendo triptofano para indol-3-piruvato ("I3P"), reagindo I3P com piruvato para formar alfa-ceto ácido monatina ("MP"), e em seguida reagindo MP para formar monatina, em que cada uma das reações é facilitada por uma ou mais enzimas. Também podem ocorrer reações competitivas, além das reações ao longo do caminho de formação do produto. Por exemplo, no processo de produção de monatina identificado, piruvato também pode reagir com si próprio para formar 4-hidróxi-4-metil-2- oxoglutarato ("HMO"), e HMO pode ser convertido para 4-hidróxi-4-metil glutamato ("HMG") pelas mesmas enzimas que convertem triptofano para I3P. Portanto, um método para melhorar a economia envolve não somente reciclar compostos que estão diretamente envolvidos na produção de monatina, mas também reciclar subprodutos de reações colaterais. Os subprodutos reciclados referidos podem ser convertidos de volta para compostos úteis para produção de monatina.

Em uma modalidade, compostos menos estáveis são convertidos para compostos mais estáveis antes de separação e/ou reciclo. "Menos estáveis" e "mais estáveis" estão em referência à probabilidade para degradação do composto sob as condições escolhidas para separação e reciclo. Em algumas modalidades em que monatina é produzida, por exemplo, a partir de triptofano, os intermediários de alfa-ceto ácido são convertidos para aminoácidos correspondentes antes de separação e reciclo. Em uma modalidade particular, onde monatina é produzida pelo caminho descrito acima, conversão de compostos menos estáveis para mais estáveis pode ser obtida primeiro permitindo que a reação de produção de monatina prossiga para o equilíbrio, em seguida removendo enzimas envolvidas no caminho de produção de monatina, em seguida readicionando uma ou mais enzimas as quais facilitam a conversão de MP e a conversão de triptofano junto com alanina adicional. Adicionando seletivamente enzimas apropriadas mais carga de alanina pode fazer com que MP menos estáveis formem monatina adicional, mais estáveis, e o I3P menos estável ser convertido em triptofano mais estável, cujo triptofano pode ser então reciclado para produção de monatina adicional.

Por conseguinte, em uma modalidade, o método da invenção prossegue em vários estágios. No primeiro estágio, o caminho sintético engloba conversão de um substrato inicial X em um ou mais intermediários no caminho, (Y1-Yn; onde Y1 é convertido no intermediário Y2, o qual é convertido no intermediário Y3, e etc., até o último intermediário, intermediário Yn, ser produzido). O intermediário Yn é então convertido no produto Z. As conversões de X em Yl-Yn e em seguida em Z pode ocorrer, em uma única mistura ou composição, geralmente, no mínimo em parte, simultaneamente. No segundo estágio, em um momento desejado depois de iniciar o primeiro estágio, no mínimo uma, ou todas as entidades moleculares que facilitaram as reações enzimáticas ou químicas (isto é, que convertem X em Y1, Y1 em Y2, Y2 em Y3, e assim por diante até Y(n-1) ser convertido em Yn, e em seguida Yn em Z) no primeiro estágio são removidas da mistura da reação, ou são de modo diverso inibidas, degradadas ou inativadas, ou tornadas incapazes de funcionar. No terceiro estágio, no mínimo um intermediário Y que ainda está presente na mistura depois do estágio 2 é então convertido no produto Z pela adição ou readição de uma entidade molecular que é capaz de facilitar a conversão do intermediário Yn no produto Z.

Em uma modalidade adicional, no terceiro estágio, o intermediário Yn é convertido em produto Z.

Em uma modalidade adicional, é proporcionado um caminho sintético no qual o produto Z é monatina.

Em uma modalidade adicional, todas as entidades moleculares que são responsáveis para facilitar as reações do caminho são removidas da mistura da reação antes do estágio 3.

Em uma modalidade adicional, somente a entidade molecular que facilitou a reação da etapa intermediária que deve ser eliminada (por exemplo, a reação que converte Yn-1 para Yn) é removida da mistura da reação, ou é inibida, degradada ou inativada de modo diverso. Em uma modalidade adicional, mais de uma das entidades moleculares que são capazes de facilitar a uma ou mais reações nos caminhos são adicionadas de volta à mistura no estágio 3.

Em algumas modalidades, o uso do método proporcionado aqui, neste requerimento de patente, pode aumentar a quantidade total, ou título, do produto de um processo de equilíbrio multietapa em relação ao processo de equilíbrio somente. Por exemplo, a concentração, ou título, de um produto pode ser aumentada por 1,7 vezes, ou em alguns casos, a concentração, ou título, pode ser aumentada por 2 vezes. A produção molar do produto a partir de um dado substrato (mois de produto produzido dividido pelos mois de substrato inicial suprido) pode ser aumentada 1,7 vezes, ou em alguns casos, 2 vezes. A produção de carbono total (quantidade de carbono contida no produto dividida pela quantidade de carbono contido em substratos proporcionados) também pode ser aumentada em relação ao processo de equilíbrio somente, se substratos, particularmente os substratos adicionais adicionados no estágio 3, são reciclados.

A invenção engloba adicionalmente sistemas para a produção de monatina que utilizam os métodos da invenção, e um equipamento para similar produção. Em algumas modalidades, um método para fabricar monatina em um caminho multietapa envolve possibilitar que uma primeira composição compreendendo um ou mais reagentes e um ou mais facilitadores reaja para formar monatina e um ou mais intermediários no caminho de produção de monatina. A primeira composição é deixada para reagir por um período de tempo especificado, por exemplo, até ser atingido o equilíbrio. Depois do período de tempo especificado, um ou mais dos facilitadores é removido, inibido, inativado, ou degradado, por meio do qual a produção de monatina no caminho é aumentada adicionando então um facilitador à composição que está envolvida na etapa da reação produtora de monatina, ou desinibindo ou reativando o um ou mais facilitadores envolvidos na etapa da reação produtora de monatina. Em modalidades algumas, além de adicionar, desinibir, ou reativar os facilitadores apropriados, compostos adicionais são adicionados à composição que participam em impelir a etapa produtora de monatina em direção à produção de monatina.

Em algumas modalidades, o método para produzir monatina envolve produzir monatina em um caminho tendo no mínimo duas, ou no mínimo três etapas da reação, em que uma das etapas da reação produz monatina e outra das etapas da reação está limitando a quantidade de intermediário do caminho de monatina disponível para a etapa da reação produtora de monatina, comprometendo no mínimo a etapa Iimitante do caminho depois de um período de tempo desejado, por exemplo, depois do caminho atingir o equilíbrio, seguido por carregar um componente, por exemplo, um facilitador, um reagente, ou ambos, de volta para o caminho para empurrar a etapa produtora de monatina em direção à produção de monatina. "Comprometer uma reação" significa romper uma reação de modo que não pode ocorrer ou reduzir a eficiência da reação.

Não se pretende que este sumário aja como uma limitação sobre o âmbito das reivindicações anexadas.

Breve Descrição das Figuras

A figura 1 é um fluxograma do processo que exemplifica produção de monatina de acordo com uma modalidade da invenção.

A figura 2 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica produção de monatina de acordo com uma modalidade desta invenção.

A figura 3 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica a separação de vários componentes na produção de monatina de acordo com várias modalidades da invenção.

A figura 4 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica a separação de vários componentes na produção de monatina de acordo com várias modalidades da invenção.

A figura 5 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica a separação de vários componentes na produção de monatina de acordo com várias modalidades da invenção.

A figura 6 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica a separação de vários componentes na produção de monatina de acordo com várias modalidades da invenção.

A figura 7 é um diagrama de bloco esquemático de um sistema que exemplifica a separação de vários componentes na produção de monatina de acordo com várias modalidades da invenção.

Descrição

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "incluindo" significa "compreendendo", e "inclui" significa "inclui mas não está limitado a" a menos que de modo diverso claro a partir do contexto. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, as expressões "por exemplo" ou "tal como" são não-limitantes e significam "por exemplo, mas não limitado a" e "tal como mas não limitado a." Além das formas singulares de "um" ou "uma" ou "a" ou "o" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente prescreva de modo diverso. Por exemplo, referência a "compreendendo uma enzima" significa incluindo uma ou mais enzimas. O termo "cerca de" engloba a faixa de erro experimental que ocorre em qualquer medição. A menos que determinado de modo diverso, presume-se que todos os números de medição tenham a expressão "cerca de" na frente destes mesmo se a expressão "cerca de" não for expressamente usada.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos "separar" e "remover" são usados de modo intercambiável. Portanto, por exemplo, separar monatina de uma composição, é o mesmo que remover monatina de uma composição. Uma pessoa com conhecimento regular entenderia que separar e remover não requer separação e remoção completas, mas ao invés que, por exemplo, em algumas separações tais como com filtrações de membrana somente separações a grosso são obtidas porque pode haver alguma sangria através de componentes desejados para dentro de componentes indesejados. Portanto "separar" e "remover" significa somente que o componente desejado, quando separado, é mais puro do que antes da separação ou remoção.

Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, a menos que indicado de modo diverso, o termo "monatina," não está limitado a qualquer forma estereoisomérica específica de monatina.

Testar "monatina" engloba testar uma composição para a presença de monatina. A menos que indicado de modo diverso, a monatina em uma composição de monatina não está limitada a qualquer forma estereoisomérica específica. Portanto, uma composição que inclui "monatina," a menos que indicado de modo diverso, inclui e engloba composições que contêm qualquer um ou todos os quatro estereoisômeros de monatina, por exemplo, composições que contêm todos os quatro estereoisômeros de monatina, composições que contêm qualquer combinação de estereoisômeros de monatina, (por exemplo, uma composição incluindo somente os R1R e S,S estereoisômeros de monatina), e, composições que contêm somente uma única forma isomérica de monatina.

Sempre que nomes químicos são identificados na especificação e reivindicações (por exemplo, "monatina" ou "precursor de monatina"), o termo "e/ou" sais dos mesmos" deve ser entendido como sendo incluído a menos que indicado de modo diverso. Por exemplo, a expressão "indol-3- piruvato é convertido para precursor de monatina" deve ser entendido para ler "indol-3-piruvato e/ou sais dos mesmos é convertido para precursor de monatina e/ou sais dos mesmos." Uma pessoa de conhecimento regular rteconheceria que as várias condições de reação exemplificadas, os sais dos compostos nomeados, incluindo os reagentes, substratos, intermediários e produtos nomeados nas reações sintéticas de monatina, estão de fato presentes ou podem estar presentes.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados de modo intercambiável. O termo "polipeptídeo," a menos que claro a partir do contexto de modo diverso, não está limitado a uma única cadeia de polipeptídeo mas inclui multímeros de cadeias (por exemplo, dímeros homólogos ou heterólogos, trímeros, tetrâmeros, e etc.), se similares formas multiméricas são necessárias para facilitar, por exemplo, catalisar, uma reação na qual o polipeptídeo participa.

Uma "conversão biológica" é uma conversão de um composto (o substrato), para um composto diferente (o produto), que é facilitado por, por exemplo, alguns polipeptídeos e outros facilitadores descritos no parágrafo seguinte. Conversões biológicas incluem reações enzimáticas nas quais uma enzima facilita (catalisa) a conversão de um ou mais substratos em um ou mais produtos. Uma "síntese biológica" ou "biossíntese" é uma síntese envolvendo no mínimo uma conversão biológica.

A descrição aqui, neste requerimento de patente, exemplifica enzimas como exemplos de polipeptídeos que podem ser usados para facilitar reações em caminhos de síntese biológica, por exemplo, os caminhos de síntese exemplificados para síntese de monatina. No entanto, deve ser entendido que outras entidades moleculares podem ser usadas como facilitadores para realizar uma reação desejada, incluindo anticorpos catalíticos, e facilitadores tendo um componente de RNA, tal como, por exemplo, RNA catalítico, ou ribozimas. Um anticorpo catalítico tendo atividade de aldolase está disponível comercialmente (Aldolase antibody 38C2, catálogo Aldrich nos. 47.995-0 e 48.157-2). A preparação de anticorpos catalíticos tendo atividade de aldolase é descrita em Wagner, J. et ai, Science 15: 1797-1800 (1995) e Zhong, G. et ai, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 16: 3738-3741 (1999) e anticorpos catalíticos tendo atividade de transaminase são descritos em Gramatikova, S. I. et al., J. Bioi Chem. 271: 30583-30586 (1996). Adicionalmente o uso de anticorpos catalíticos para catalisar reações é discutido na Patente dos Estados Unidos N9 6.846.654.

Um caminho multietapa é uma série de reações que são ligadas umas às outras de tal modo que reações subsequentes utilizam no mínimo um produto de uma reação anterior. Por exemplo, em um caminho similar, o um ou mais substratos da primeira reação são convertidos em um ou mais produtos, e no mínimo um destes produtos pode ser utilizado como um ou mais substratos para a segunda reação. A segunda reação então também produz um ou mais produtos, e no mínimo um destes produtos pode ser utilizado como um ou mais substratos para uma terceira reação, e assim por diante. Em um caminho multietapa, uma, algumas ou todas as reações no caminho podem ser catalisadas enzimaticamente, ou facilitadas de modo diverso por uma entidade macromolecular tal como um anticorpo catalítico ou RNA catalítico. Uma, algumas ou todas as reações no caminho podem ser reversíveis. Uma síntese biológica é uma síntese envolvendo no mínimo uma etapa da reação que é catalisada enzimaticamente, ou facilitada de modo diverso por uma entidade macromolecular tal como um anticorpo catalítico ou RNA catalítico. Um caminho de equilíbrio multietapa is um caminho multietapa em que no mínimo um dos reações (isto é, etapas) no caminho é uma reação de equilíbrio ou reversível.

De acordo com modalidades da invenção, uma ou mais das reações em um caminho sintético, tal como um caminho sintético de monatina, são alteradas, depois do caminho sintético similar ter iniciado síntese do produto (exemplificado pelo produto, monatina). O caminho é alterado ou "quebrado" removendo no mínimo um dos facilitadores ou comprometendo o caminho de modo diverso, por exemplo, evitando que o facilitador funcione, ou reduzindo a capacidade do facilitador para realizar sua função. Por exemplo, o caminho pode ser alterado ou "quebrado" removendo, inibindo, ou destruindo uma enzima que facilita uma reação intermediária específica no caminho. Alteração do caminho também pode incluir alterar as condições da reação de modo que o que era previamente uma reação reversível se torna uma reação irreversível, ou no mínimo deslocando o equilíbrio de similar reação, por exemplo, para a direita, em direção à síntese de um produto desejado, por exemplo, em direção à síntese de monatina, mas preferencialmente em uma maneira que não resulta em recreação do caminho original. Conforme pode ser entendido a partir dos exemplos aqui, neste requerimento de patente, recriação do caminho original (ou termos similares tais como regeneração do caminho original) significa reativação de todas as etapas no caminho original.

Em uma modalidade, a alteração resulta em um caminho que tem uma capacidade extremamente reduzida para sintetizar, ou, não pode mais sintetizar, o produto final definitivo desejado, por exemplo, monatina, quando os únicos substratos supridos são aqueles para a primeira reação no caminho. A alteração preferencialmente reduz de modo detectável, ou interrompe, a síntese do produto final através do caminho completo. Como a alteração ocorre depois da síntese do produto ter sido iniciada, depois da alteração do caminho, a mistura na qual as reações originais foram realizadas contêm algumas quantidades dos vários produtos intermediários do caminho que estavam na mistura na hora que o caminho foi alterado, incluindo o um ou mais produtos da reação alterada, preferencialmente não- funcional.

De acordo com uma modalidade da invenção, no mínimo um intermediário produto é capturado e convertido no produto final definitivo desejado, por exemplo, monatina, readicionando um ou mais facilitadores apropriados, por exemplo, uma ou mais enzimas, à mistura da reação que facilitam a conversão de similar produto intermediário para o produto final desejado, por exemplo, monatina ou para um precursor do produto final desejado, por exemplo, para precursor de monatina (MP), mas sem regeneração, ou sob condições que não regeneram, o caminho original. Em uma modalidade, o produto da reação inativada é separado do facilitador (por exemplo, da enzima) que o produziu antes de adicionar os componentes de volta à mistura para facilitar a conversão deste produto intermediário para o produto final definitivo, tal como para monatina. Em uma modalidade, os substratos (por exemplo, reagentes, intermediários e produto) são separados das enzimas, os substratos formam uma segunda mistura da reação e as enzimas são recicladas de volta para uma primeira mistura da reação. No mínimo uma enzima capaz de facilitar a etapa a qual gera produto (tipicamente a última etapa do caminho multietapa) é adicionada ou reintroduzida na segunda mistura. Em uma modalidade adicional, outros componentes (por exemplo, reagentes) os quais fazem com que a etapa produtora de produto favoreça a produção de produto são adicionados à segunda mistura.

Conforme seria entendido por uma pessoa com conhecimento regular da técnica, a separação de componentes (tal como a separação de um ou mais facilitadores de um ou mais reagentes) pode não ser completa e alguma porção do facilitador pode permanecer na mistura da reação. Similarmente, conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "purificação" ou termos similares (tais como "purificado") indica que contaminantes foram removidos da amostra de interesse mas não requer pureza absoluta. Ao contrário, "purificação" é pretendido como um termo relativo, a menos que indicado de modo diverso pelo contexto. Portanto, por exemplo, monatina é purificada a partir de uma composição contendo monatina onde a monatina purificada está em uma concentração maior em relação a contaminantes do que estava na composição contendo monatina.

Conforme exemplificado em uma modalidade da invenção, os materiais da reação para a produção de um produto final definitivo desejado, tal como monatina, são trazidos juntos para formar uma primeira mistura. Estes materiais da reação incluem o um ou mais substratos apropriados, co- fatores, enzimas, componentes tampão, e etc., geralmente, todos os componentes necessários para as reações do caminho para a síntese biológica do produto final definitivo desejado, aqui exemplificada pela síntese de monatina. No iníxio, no mínimo o um ou mais substratos para a primeira enzima no caminho está presente, embora outros substratos intermediários possam ser proporcionados caso desejado.

Nesta modalidade exemplificada, a produção do produto final definitivo (o produto final que se deseja que o caminho produza, por exemplo, monatina) é deixada para prosseguir por este caminho por um tempo desejado. O produto final definitivo, por exemplo, monatina, pode ser removido desta mistura conforme é produzido ou o produto final definitivo, pode ser deixado para acumular na primeira mistura, por exemplo, até ser atingido equilíbrio. Em um momento desejado, a síntese de produto final definitivo pelo caminho acima é comprometida, de tal modo que seja alterada ou completamente interrompida inibindo ou de modo diverso inativando, ou removendo, uma ou mais das enzimas ou facilitadores de uma ou mais das reações específicas. A remoção, inativação ou inibição é tal que síntese do produto final definitivo pelo caminho original não pode mais prosseguir, ou prossegue somente em uma taxa relativamente menor, devido a esta inibição, inativação ou remoção do um ou mais facilitadores. A reação realizada pelo um ou mais facilitadores que é removida, inibida ou inativada diz-se que está comprometida. Um exemplo não-limitante de comprometer uma reação inclui remover (ou separar, termo o qual é usado aqui, neste requerimento de patente, de modo intercambiável com remover) a enzima que facilita a reação da mistura da reação. Outro exemplo não- limitante de comprometer uma reação inclui remover um cofator necessário para ação enzimática da mistura da reação. Em uma modalidade, onde monatina é produzida em um caminho utilizando enzimas que têm cofatores de magnésio ou fosfato, reações podem ser comprometidas inativando enzimas através da remoção de magnésio ou fosfato, por exemplo, usando uma coluna de dessalgação.

Qualquer reação que produz um composto intermediário no caminho pode ser o alvo que deve ser comprometido. Em uma modalidade, uma reação reversível que produz um intermediário no caminho é comprometida. Em uma modalidade, no mínimo a reação com a menor ou com uma baixa constante de equilíbrio (por exemplo, cerca de 1 ou menos) é comprometida. Em uma modalidade, a reação que é comprometida é no mínimo a seguinte à última reação no caminho, no entanto, qualquer uma, qualquer subgrupo ou todas as reações que são capazes de proporcionar um ou mais produtos intermediários no caminho podem ser alteradas ou comprometidas. Em algumas modalidades, a reação é realizada em uma maneira que reduz a concentração de intermediários instáveis. Por exemplo, em alguns caminhos de produção de monatina, uma reação produzindo o ácido alfa-carbonil carboxilato 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico é interrompida para reduzir a concentração destes intermediários. Em alguns caminhos de produção de monatina, são realizadas reações de modo tal a converter os alfa-carbonil carboxilatos indol-3-piruvato, 4-hidróxi-4-metil-2- oxoglutarato ("HMO") e ácido 2-hidróxi-2-(indol-3-ilmetil)-4-cetoglutárico em seus aminoácidos correspondentes adicionando concentrações aumentadas de um doador de amino às reações.

Para alterar ou comprometer uma reação desejada, por exemplo, uma reação intermediária desejada, um ou mais dos facilitadores, por exemplo, uma ou mais enzimas que catalisam uma ou mais reações intermediárias reversíveis no caminho, podem ser removidos ou inibidos da composição. Isto resulta em uma composição que contém, entre outros, o um ou mais intermediários do caminho, mas não a uma ou mais enzimas necessárias para catalisar conversão dos intermediários no produto final definitivo, por exemplo, monatina.

Depois da uma ou mais reações desejadas estarem comprometidas, por exemplo, seu facilitador ser removido, inibido ou inativado, a mistura pode ser suplementada com um componente que converterá um ou mais dos intermediários da reação para o produto final definitivo, por exemplo, monatina. O componente suplementar é tal que a composição mantém o estado no qual a reação intermediária é comprometida, por exemplo, é perdida, inibida ou inativada de modo que o caminho inicial não seja simplesmente recriado sob a forma ativa original. Reestabelecendo uma reação no caminho "quebrado" que facilita a conversão do intermediário que foi o produto do facilitador que falta, por exemplo, o produto da enzima que falta para o produto final definitivo ou um precursor deste produto, carbono que foi capturado de modo diverso no estágio intermediário, ou a jusante do mesmo, é recuperado para o produto final definitivo. A conversão referida pode reestabelecer esta parte do caminho original deste produto intermediário para o produto final definitivo, ou pode estabelecer um ou mais caminhos de reação diferentes a partir do produto intermediário para o produto final definitivo. Portanto, a síntese de um produto final definitivo desejado, por exemplo, monatina é tornada mais eficiente, e com menos perda ou resíduo de intermediários no caminho. Se o um ou mais componentes reagentes adicionais adicionados são reciclados, isto resulta em uma produção mais econômica devido a aumento do rendimento.

A mistura da reação que resulta depois de conversão do intermediário para o produto final definitivo pode ser usada diretamente para qualquer fim desejado para o qual seja adequada. Alternativamente, composições ou preparações (líquidas ou sólidas) que contêm o produto final definitivo, por exemplo, monatina, podem ser adicionalmente processadas por extração, purificação ou isolamento do produto final definitivo, ou composições contendo o produto final referido, por exemplo, monatina, da primeira e/ou segunda misturas(s) da reação conforme desejado, usando métodos conhecidos na técnica.

Na discussão aqui, neste requerimento de patente, a menção de três estágios não pretende excluir a adição de outros estágios, mas é pretendida somente como uma ferramenta para facilitar a discussão dos aspectos temporais do método da invenção.

Portanto, em uma modalidade, a invenção pode ser descrita como um caminho para síntese de um composto, por exemplo, monatina, que prossegue em vários estágios. No primeiro estágio, o caminho engloba conversão de um substrato inicial X em um ou mais intermediários no caminho, (Y1-Yn; onde o intermediário Y1 é convertido no intermediário Y2, o qual é convertido no intermediário Y3, e etc., até o último intermediário, o intermediário Yn, ser produzido). O intermediário Yn é então convertido no produto Z, por exemplo, monatina. As conversões de X em Y1-Yn e em seguida em Z podem ocorrer, em uma única mistura ou composição, geralmente, no mínimo em parte, simultaneamente. No segundo estágio, em um tempo desejado depois de iniciar o primeiro estágio, as entidades moleculares que realizaram ou facilitaram as reações enzimáticas ou químicas (isto é, que convertem X em Y1, Y1 em Y2, Y2 em Y3, e assim por diante até Y(n-1) ser convertido em Yn, e em seguida Yn em Z) no primeiro estágio são removidas da mistura da reação, ou são inibidas, degradadas ou inativadas de modo diverso, ou comprometidas de modo diverso de modo que sejam incapazes de funcionar, ou seu funcionamento seja muito diminuído. No terceiro estágio, um ou mais dos intermediários, por exemplo, o intermediário Yn, qaue ainda está presente na mistura depois do estágio 2 são então convertidos em produto, por exemplo, monatina, ou em um intermediário que pode ser convertido no produto, por exemplo, monatina, pela adição ou readição de uma entidade molecular (ou entidades) que é capaz de facilitar a conversão de Yn em produto, por exemplo, monatina, ou em similar intermediário.

Em uma modalidade específica, por exemplo, em que monatina é produzida em uma reação biossintética multietapa a partir de triptofano, conforme descrito acima e alhures nesta especificação, o processo pode ter por alvo acumulação de precursor de monatina. Em uma modalidade, isto pode ser realizado isolando a reação formando MP a partir de I3P, por exemplo, removendo (inibindo ou inativando) enzimas facilitando outras reações no caminho, ou removendo, inibindo ou inativando todas as enzimas e em seguida readicionando, possibilitanto ou reativando a uma ou mais enzimas que facilitam a conversão de I3P para MP, e carregando a reação de formação de MP com um dos substratos da reação. Em uma modalidade, O MP resultante é purificado a partir da mistura da reação.

Portanto, em uma modalidade, a síntese de um produto final definitivo, por exemplo, monatina, ocorre em três estágios. Em um primeiro estágio, todos os componentes para o caminho sintético estão presentes em uma única mistura, e se deixa formar o produto final definitivo, por exemplo, monatina. EM um segundo estágio, todos ou alguns dos metabólitos, por exemplo, monatina e os intermediários químicos no caminho sintético da monatina, são separados dos facilitadores, as maiores macromoléculas tais como os polipeptídeos ou enzimas que facilitaram ou catalisaram as várias reações no caminho, ou a atividade de uma ou todas estas macromoléculas são de modo diverso comprometidas de modo a impedir o funcionamento de um ou todos os facilitadores referidos. Em um terceiro estágio, um ou mais novos facilitadores ou, um subgrupo dos facilitadores originais, por exemplo, um subgrupo das enzimas dos caminhos, no mínimo uma das quais pode facilitar somente determinada uma ou mais reações desejadas do caminho sintético são adicionadas ou adicionadas de volta à mistura de metabólitos. Os novos facilitadores ou este subgrupo preferencialmente contêm no mínimo um facilitador, por exemplo, uma enzima, que facilita a síntese do produto final definitivo, por exemplo, a própria monatina. No entanto, os novos facilitadores, ou este subgrupo, carecem de um ou mais dos facilitadores (por exemplo, carecem de uma ou mais enzimas) que facilitam no mínimo uma etapa anterior no caminho sintético para o produto definitivo, por exemplo, monatina. A adição ou readição do novo facilitador, por exemplo, a enzima final no caminho, na ausência de um facilitador anterior, que pode utilizar este carbono que tinha estado presente na mistura como um intermediário e converter o carbono referido para o produto definitivo, por exemplo, em monatina, portanto aumenta a produção global do caminho de conversão.

Os métodos da invenção em algumas modalidades são especialmente úteis para caminhos sintéticos tais como caminhos sintéticos de monatina que utilizam caminhos reversíveis. Os caminhos reversíveis referidos podem resultar em ciclos ineficazes nos quais carbono pretendido para formação de produto é ao invés desviado para a reação reversa. Deste modo, quando são usadas reações reversíveis, ao invés de impelir a conversão do substrato para o produto até o completamento, uma certa quantidade do produto pode ser reconvertida em substrato.

Os métodos da invenção em algumas modalidades minimizam a perda de carbono referida convertendo, no estágio 3, precursor que de modo diverso teria sido descartado com outros componentes da reação, ou os quais se teriam decomposto no reciclo tentado, para o produto final definitivo, por exemplo, monatina. Em uma modalidade altamente preferencial, é adicionada uma enzima no estágio 3 que pode catalisar a conversão do precursor imediato do produto final para o produto final definitivo, por exemplo, que converte precursor de monatina para monatina.

Em outra modalidade, pode ser adicionada uma enzima no estágio 3 que converte quaisquer dos intermediários do caminho para o produto final, por exemplo, monatina, ou para um caminho que leva ao produto final, por exemplo, monatina, mas que não recria o caminho original. Assim, por exemplo, uma enzima pode ser adicionada para converter o intermediário Y1 para um intermediário a jusante que desvia do bloqueio no caminho, ou que converte o intermediário para o produto final definitivo (por exemplo, MP para monatina), mas não permite a conversão de Y1 para Y2.

Um ou mais co-substratos ou cofatores podem ser adicionados quando o facilitador final, tal como a enzima final, é adicionado, de modo a adicionalmente ajudar a impelir a reação final na direção da síntese do produto final definitivo, por exemplo, monatina. Além disso, um ou mais de um facilitador, tal como uma ou mais de uma enzima que pode ser usada para facilitar, isto é, catalisar, cada reação no estágio 1 e/ou no estágio 3, conforme desejado, incluindo diferentes enzimas da mesma classe, ou diferentes classes de enzimas. Múltiplos facilitadores, por exemplo, múltiplas enzimas que facilitam a mesma reação, podem ser adicionados separadamente, ou, juntos, por exemplo, como uma "mistura" (por exemplo, uma "mistura de enzimas"), ou grupo, que contém todos ou um subgrupo dos facilitadores ou enzimas desejados.

Os facilitadores, tais como as enzimas, que facilitam as reações no caminho da invenção podem estar em solução, junto na mistura da reação. Facilitadores de proteína tais como enzimas em solução podem ser facilmente removidos da mistura do caminho por filtração, especialmente ultrafiltração, usando uma membrana que retém substâncias tendo pesos moleculares no mínimo tão elevados quanto a proteína na mistura da reação que se deseja separar da mistura da reação, mas que permite que substâncias de menor peso molecular (entre outras, os substratos, os produtos e intermediários no caminho) passem através da membrana.

Facilitadores de proteína, por exemplo, enzimas em solução, também podem ser facilmente separados dos substratos, produtos e intermediários de menor peso molecular que estão na mistura da reação por cromatografia, por exemplo, cromatografia de coluna, por exemplo, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de permuta iônica ou cromatografia por afinidade, onde o agente de afinidade liga seletivamente um ou mais dos facilitadores, tais como uma enzima, conforme desejado, para remover a proteína referida, ou todos os facilitadores da mistura.

Alternativamente, um ou mais facilitadores, tal como uma ou mais enzimas, podem ser ligados a suportes sólidos, conforme desejado. Facilitatores proporcionados sobre um suporte sólido podem ser facilmente removidos da mistura do caminho, por exemplo, separando os suportes sólidos do resto da mistura. Vide, por exemplo, o Exemplo 10, 13, e 16.

Alternativamente, um ou mais facilitadores, tal como uma ou mais enzimas podem ser proporcionados uma maneira contida, por exemplo, contida dentro de uma membrana semipermeável que retém o facilitador (por exemplo, retém a uma ou mais enzimas) mas permite o livre fluxo de moléculas de baixo peso molecular tais como os substratos, intermediários e o produto final definitivo e outros componentes da reação. Facilitadores, por exemplo, enzimas proporcionadas em uma maneira contida, por exemplo, dentro de uma membrana, podem ser facilmente removidos da mistura do caminho, por exemplo, removendo a membrana do resto da mistura.

Em uma modalidade, somente o facilitador, especialmente, somente uma enzima, que catalisa a etapa intermediária no caminho que deve estar faltando ou ser grandemente deprimido no estágio 3 é proporcionado no estágio 1 em uma maneira ligada ou contida similar.

Em outro exemplo, o facilitador, especialmente, uma enzima, que catalisa a etapa intermediária no caminho que deve estar faltando ou ser deprimido no estágio três pode ser proporcionado como uma proteína de fusão na qual o parceiro de fusão confere uma propriedade que confere uma capacidade para remover, inativar ou inibir a proteína de fusão em uma maneira que atinge o resultado de prevenir ou deprimir muito a conversão do intermediário Yn para o produto final definitivo, por exemplo, monatina, no estágio 3. Por exemplo, o parceiro de fusão pode conferir a capacidade para remover a proteína de fusão por um procedimento que depende de uma reação de afinidade entre o parceiro de fusão e uma substância com a qual apresenta afinidade.

Adicionalmente, no caminho, a uma ou mais reações que devem ser comprometidas podem ser comprometidas inibindo seletivamente o um ou mais facilitadores, por exemplo, a uma ou mais enzimas que facilitam as reações referidas. A inibição pode ser reversível ou irreversível.

Preferencialmente, o inibidor é um inibidor seletivo no sentido que, nas condições de reação desejadas, o agente que é responsável pela inibição inibe um ou mais dos facilitadores, ou enzimas que estão presentes preferencialmente em relação a outros facilitadores ou enzimas que também podem estar presentes. Adicionalmente, o inibidor pode ser um que seja capaz de ser removido da mistura da reação, por exemplo, ou por degradação ou por inativação do inibidor, por exemplo, com um comprimento de onda de luz específico, ou removendo fisicamente o inibidor, incluindo, por exemplo, removendo o inibidor por diálise ou filtração, incluindo ultrafiltração. Por exemplo, aldolases classe Il podem ser inibidas por agentes quelantes de metal, por exemplo, EDTA (ácido tetraacético de diamina de etileno).

Em um exemplo de uma modalidade da invenção, um caminho para a síntese de monatina usando conversões biológicas é exemplificado por um caminho que inclui, no mínimo, as três reações de equilíbrio reversíveis seguintes:

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Em que a reação de triptofano pode incluir opcionalmente uma enzima adicional, uma racemase, por exemplo, onde se deseja usar L- triptofano como um reagente de partida, mas essencialmente usar D- triptofano (produzido a partir de L-triptofano usando uma racemase) para produzir R,R monatina.

Neste caminho, na reação 1, triptofano e piruvato são convertidos enzimaticamente para indol-3-piruvato (I-3-P) e alanina em uma reação reversível. Conforme exemplificado acima, uma enzima, aqui uma aminotransferase, é usada para facilitar (catalisar) esta reação. Na reação (1), triptofano doa seu grupamento amino (para piruvato) e se torna I-3-P. Na reação (1), o aceitador de grupamento amino é piruvato, o qual então se torna alanina como um resultado da ação da aminotransferase. O aceitador de grupamento amino preferencial para a reação (1) é piruvato; o doador de grupamento amino preferencial para a reação (3) é alanina. A formação de indol-3-piruvato na reação (1) também pode ser realizada por uma enzima que utiliza outros α-ceto ácidos como aceitadores de grupamento amino, tais como ácido oxaloacético e ácido α-ceto-glutárico. Similarmente, a formação de monatina a partir de MP (reação 3) pode ser realizada por uma enzima que utiliza aminoácidos diferentes de alanina como o doador de grupamento amino. Estes incluem, mas não estão limitados a, ácido aspártico, ácido glutâmico, e triptofano.

Algumas das enzimas úteis em conexão com reação (1) também são úteis em conexão com a reação (3). Nas reações típicas acima, aminotransferase é mencionada como útil para ambas estas reações (1) e (3). A constante de equilíbrio para a reação (2), a reação, mediada por aldolase, de indol-3-piruvato para formar MP é menos de um, isto é, a reação da aldolase favorece a reação de clivagem gerando indol-3-piruvato e piruvato ao invés da reação de adição que produz o alfa-ceto precursor para monatina (isto é, MP). As constantes de equilíbrio das reações, mediadas por aminotransferase, de triptofano para formar indol-3-piruvato (reação (1)) e de MP para formar monatina (reação (3)) são cada uma consideradas como sendo aproximadamente um. Consequentemente, de modo a aumentar a quantidade de monatina produzida, e reforçar a economia da produção de monatina, seria desejável remover um ou mais produtos e/ou aumentar a quantidade de substratos envolvidos em reações para fabricar monatina. Por exemplo, remover a monatina à medida que é formada permitirá a formação de mais monatina do que se as reações de aldolase e aminotransferase atingem equilíbrio; e/ou, por exemplo, um aumento na quantidade de um substrato para a reação (1) ou a reação (3) aumenta a conversão do segundo substrato da reação (1) ou da reação (3).

Em algumas modalidades, esta invenção proporciona uma nova abordagem que aumenta a concentração de produto (ou título) em um processo de equilíbrio, por exemplo, até 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, até 1,5 vezes, até 1,6 vezes, até 1,7 vezes, até 1,8 vezes, até 1,9 vezes, ou até 2 vezes a quantidade de equilíbrio. Em algumas modalidades, isto pode ser atingido impelindo uma ou mais das reações em um caminho multietapa em uma direção desejada. Em alguns casos, as reações são empurradas em direção à acumulação de mais produto, e em outras em direção à acumulação de mais substratos. De acordo com uma modalidade da invenção, os materiais da reação são trazidos juntos para formar uma primeira mistura. Para a reação (1), acima, estes reagentes incluem triptofano (os quais podem ser L-triptofano, D-triptofano ou uma combinação dos mesmos), piruvato, uma aminotransferase, e opcionalmente uma racemase, por exemplo, quando o triptofano é L-triptofano mas se deseja usar D-triptofano conforme listado acima para a primeira reação, e uma aldolase conforme listado para a reação (2). Alanina (a qual pode ser L- 15 alanina, D-alanina ou uma combinação das mesmas) formada na reação (1) pode reagir com MP formado na reação (2) para produzir monatina e piruvato na reação (3). No caminho acima, a reação 3 pode ser catalisada pela mesma aminotransferase que produz a primeira reação. A mistura pode ser deixada para atingir um estado de equilíbrio em cujo estado uma quantidade de equilíbrio de monatina será formada, contida dentro da primeira mistura. É possível remover a monatina desta mistura mas pode ser mais eficiente, e resultar em menos de uma perda ou resíduo de reagentes úteis de modo diverso (incluindo quaisuqer intermediários instáveis), se simplesmente se deixar a monatina permanecer na primeira mistura neste estágio. De acordo com esta modalidade da invenção, toda ou no mínimo parte da primeira mistura é ultrafiltrada para criar um retentado e um permeado. Com seleção apropriada do corte de peso molecular para o um ou mais filtros no processo de ultrafiltração, as enzimas, uma aminotransferase e uma aldolase, sendo de peso molecular relativamente grande comparadas com os outros constituintes da primeira mistura, não passam através do filtro, isto é, são rejeitadas pela membrana do filtro, e portanto permanecem em, e formam, o retentado. Os outros constituintes, por exemplo, triptofano, piruvato, alanina, MP e 1-3-P, têm pesos moleculares que permitem que passem através do filtro e formem o permeado.

Em uma modalidade, uma aminotransferase e opcionalmente uma racemase (neste caso uma alanina racemase) é em seguida adicionada ao permeado da ultrafiltração junto com uma quantidade aumentada de alanina, criando uma segunda mistura. Pode ser desejável usar uma alanina racemase, por exemplo, onde D-triptofano é um material de partida, e são desejadas quantidades em excesso de D-alanina, as quais podem ser obtidas por adição de L-alanina e uma alanina racemase a qual facilita a conversão de L-alanina para D-alanina. Alanina deve ser adicionada de modo que esteja em excesso, ou no mínimo não limitante. Preferencialmente alanina é trazida a no mínimo uma concentração que permite que a transaminase atue em ou próxima a sua velocidade máxima, (Vmax), sob as condições desejadas. A Km da enzima pode ser usada para estimar a concentração de alanina que é necessária para assegurar que a concentração de alanina esteja saturando a enzima. Na presente modalidade, a enzima, uma aminotransferase, catalisa a reação (1) e a reação (3). No entanto, a ausência de uma aldolase ou um facilitador equivalente impede a reação (2) de ocorrer em uma taxa apreciável, ou no mínimo reduz a taxa da reação. Adicionalmente, a quantidade em excesso de alanina impele a reação (3) na direção preferencial, produzindo mais monatina. E, uma concentração aumentada de alanina também empurra a reação (1) na direção reversa produzindo triptofano e piruvato. Isto é útil, em parte, porque I-3-P é um reagente particularmente instável que pode se decompor em produtos da reação contaminantes. MP também é um constituinte relativamente instável na mistura. O resultado líquido é impelir a reação (3) para diante em direção à produção de monatina, impelir a reação (1) para trás para a produção de triptofano reagente inicial, e inibir seletivamente a reação (2) a qual de modo diverso permitiria que a seqüência de reação global prosseguisse para trás, convertendo indesejavelmente MP em I-3-P e piruvato. A monatina pode ser então removida da segunda mistura através de um processo de purificação.

Em uma seqüência preferencial adicional, o retentado, compreendendo as enzimas aminotransferase e aldolase, pode ser reciclado para a primeira mistura, ou o recipiente onde uma "nova" primeira mistura deve ser reagida ou está sendo reagida. Isto aumenta a eficiência do processo global, utilizando menores quantidades destas enzimas para uma dada produção de monatina.

Em uma seqüência preferencial adicional, o processo de purificação para remover monatina da segunda mistura utiliza métodos desenvolvidos para a purificação de outros aminoácidos. Como monatina é estruturalmente e quimicamente similar a ácido glutâmico, podem ser usados métodos conhecidos na técnica para purificação do aminoácido ácido glutâmico a partir de caldos de fermentação. Uma descrição do isolamento de monatina a partir de um meio biológico complexo é descrito na patente internacional Nq WO 2003/091396, Exemplo 6. Neste Exemplo, foram utilizadas duas etapas de cromatografia de permuta iônica. Primeira, uma forte cromatografia de permuta de cátions em um baixo pH, tal como a resina AG50WX-8 (forma H) disponível na Bio-Rad, separou os aminoácidos dos ácidos orgânicos. Membros do grupamento amino dos compostos aminoácidos, tais como monatina, são carregados e ligam à resina.

Quaisquer ácidos orgânicos contaminante não são ligados à resina e fluem através da resina em baixo pH. Os aminoácidos, depois de elutriação da resina de permuta de cátions, podem ser então separados uns dos outros, tal como separando triptofano, alanina e monatina, usando cromatografia de permuta de ânions, por exemplo, uma resina DEAE, em pH neutro. Os constituintes que permanecem na remoção de monatina podem ser reciclados de volta para a primeira mistura e a segunda mistura. Estes incluem, por exemplo, triptofano, piruvato, e quantidades reduzidas de MP e I-3-P para a primeira mistura, e alanina para a segunda mistura. Quantidades reduzidas se referem à circunstância que a reação (3) foi impelida para diante, e a reação (1) foi impelida para trás. A reciclagem destes reagentes aumenta adicionalmente a eficiência global do processo. Isto é mais evidente quando se observa que a purificação ou remoção de monatina da mistura da reação tipicamente ocorre em condições acidíferas. MP e 1-3-P se decompõem em um ambiente acidífero. Portanto, nesta modalidade, se monatina for removida da primeira mistura da reação, sem a ultrafiltração e formação da segunda mistura, estes reagentes são no mínimo parcialmente perdidos, reduzindo a eficiência da produção de monatina e criando desafios da purificação devido à formação de subprodutos da reação.

Estes benefícios podem ser realizados através dos processos desta invenção. A produção de monatina é aumentada para uma dada quantidade de matéria-prima, o reciclo de reagentes aumenta a eficiência do processo, e reagentes (por exemplo, α-carbonil carboxilatos) que são instáveis de modo diverso e podem produzir subprodutos da reação indesejáveis são removidos ou reciclados antes de sua decomposição prejudicial. No entanto, nem todas as modalidades da invenção precisam incluir todos os benefícios listados. Algumas modalidades podem incluir nenhum dos benefícios descritos aqui, neste requerimento de patente, e algumas modalidades podem incluir um ou mais dos benefícios descritos aqui, neste requerimento de patente.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, é proporcionado um processo para produzir monatina, o qual inclui produzir indol-3-piruvato a partir de triptofano, produzir ácido 2-hidróxi 2-(indol- 3ilmetil)-4-cetoglutárico ("precursor de monatina" ou "MP") a partir de indol- 3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP. Por exemplo, se L-triptofano (também denominado S-triptofano) for o substrato, a reação para produzir indol-3-piruvato pode ser facilitada por uma enzima tendo seletividade de substrato para S-aminoácidos. Se os 2S isômeros de monatina forem desejados, a reação de indol-3-piruvato com piruvato para formar o S- isômero de MP pode ser facilitada por uma enzima tendo atividade de aldolase S-seletiva. Similarmente, se os 4S isômeros de monatina forem desejados, a reação de MP para produzir monatina pode ser facilitada por uma enzima tendo seletividade para substratos de L-aminoácido. Similarmente, outros produtos isoméricos podem ser produzidos distintamente usando enzimas com diferentes seletividades de substrato. Por exemplo, em alguns casos o 2R ou o 4R isômero de monatina é o produto preferencial e o uso de uma enzima com uma estereosseletividade de substrato para R-substratos pdoe facilitar a formação do produto preferencial. O termo "estereosseletiva" significa que uma enzima tem maior especificidade, maior atividade, ou ambas para um estereoisômero. Pode ser usada uma enzima estereosseletiva tendo atividade limitada para um estereoisômero comparado com outro. Atividade "limitada" significa atividade que é mínima ou não perceptível, por exemplo, conforme determinado de acordo com experimentos.

Onde são feitas referências a uma série de reações tal como nos parágrafos precedentes, a invenção não requer que cada etapa seja explicitamente realizada; é suficiente que as etapas possam ser implicitamente realizadas. Em outras palavras, por exemplo, o processo para produzir monatina, o qual inclui produzir indol-3-piruvato a partir de triptofano, produzir ácido 2-hidróxi 2-(indol-3ilmetil)-4-cetoglutárico ("precursor de monatina" ou "MP") a partir de indol-3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP, em que cada reação é facilitada por uma enzima apropriada, pode ser realizado combinando triptofano com as enzimas e determinando condições de modo que as reações enumeradas possam ocorrer. Em um caso similar, triptofano pode reazir para produzir indol-3- piruvato, o indol-3-piruvato produzido a partir da reação de triptofano pode reagir para formar MP, e o MP produzido a partir da reação de indol-3- piruvato pode reagir para formar monatina. O processo também pode ser realizado, a título de exemplo, proporcionando um composto que pode produzir triptofano, sob condições adequadas para ocorrer produção de triptofano e combinando este composto com enzimas capazes de facilitar a série de reações determinadas sob condições as quais seriam adequadas para estas reações ocorrerem. Por exemplo, um microorganismo o qual produz naturalmente grandes quantidades de L-triptofano (ou D-triptofano) pode ser proporcionado como uma fonte do triptofano. Por exemplo, D- triptofano pode ser proporcionado proporcionando L-triptofano e uma enzima com atividade de racemase de ampla especificidade de aminoácido ou atividade de racemase de triptofano e condições as quais seriam adequadas para ocorrer a conversão de L para D triptofano.

Em algumas modalidades, permutações particulares podem ser designadas para tornar a produção de monatina (por exemplo, R1R monatina) mais econômica. Por exemplo, L-triptofano, ao contrário de D- triptofano ou combinações de L- e D-triptofano, pode agir como o material de partida. Apesar da escolha da forma específica de triptofano não impactar a quiralidade dos compostos de monatina finais na composição de monatina (porque a reação de triptofano forma indol-3-piruvato, o qual não tem quiralidade), alguns podem preferir utilizar L-triptofano como um material de partida no mínimo porque L-triptofano é atualmente mais econômico e mais facilmente obtenível do que D-triptofano.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um processo para produzir monatina que inclui produzir D-triptofano a partir de L-triptofano, produzir indol-3-piruvato a partir de D-triptofano, produzir R-MP a partir de indol-3-piruvato, e produzir R,R-monatina a partir de R-MP. A produção de D-triptofano a partir de L-triptofano pode ser facilitada por uma triptofano racemase e equivalentes funcionais da mesma. Similarmente, as reações de D-triptofano para formar indol-3-piruvato e de MP para formar monatina podem ser facilitadas pela mesma enzima. A reação de indol-3-piruvato pode ser facilitada por uma enzima tendo atividade de aldolase R-específica; e consequentemente se forma R-MP. As reações de D-triptofano para formar indol-3-piruvato e de R-MP para formar R.R-monatina podem ser facilitadas pela mesma enzima.

Em algumas modalidades, de acordo com a presente invenção, é proporcionado um processo para produzir monatina, o qual inclui produzir indol-3-piruvato a partir de L-triptofano, ácido produzir 2-hidróxi 2-(indol- 3ilmetil)-4-ceto glutárico ("precursor de monatina" ou "MP") a partir de indol- 3-piruvato, e produzir monatina a partir de MP. A reação de L-triptofano para produzir indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima tendo maior especificidade, maior atividade, ou ambas para L-triptofano como um substrato do que para R-MP, R1R monatina, ou ambas. Exemplos de enzimas tendo maior atividade e/ou maior especificidade para L-triptofano como um substrato do que para ou MP ou monatina incluem, mas não está limitados a L-triptofano aminotransferases, aminotransferases L-aromáticas, L-aspartato aminotransferases, e L-aminoácido oxidases. De acordo com algumas modalidades, a reação de indol-3-piruvato é facilitada por uma enzima tendo atividade de aldolase R-específica e consequentemente produz R-MP. De acordo com algumas modalidades, uma aminotransferase específica para D-aminoácidos (denominada uma D-aminotransferase) também tem maior especificidade, maior atividade, ou ambas para o R-MP como um substrato do que para indol-3-piruvato. Em algumas modalidades diferentes, a D-aminotransferase tem atividade limitada para o indol-3- piruvato como um substrato.

De acordo com algumas modalidades, é proporcionada uma enzima racemase que pode facilitar a epimerização do aminoácido que é formado como um subproduto da reação de transam inação L-triptofano (ou que é formada a partir de outro aminoácido que é um subproduto da reação de triptofano) de uma forma isomérica para outra forma isomérica. Exemplos não-limitantes de similares enzimas incluem racemases de glutamato (EC 5.1.1.3) ou equivalentes funcionais que podem facilitar a conversão de L- glutamato para D-glutamato, racemases de aspartato (EC 5.1.1.13) ou equivalentes funcionais que convertem L-aspartato para D-aspartato, racemases de alanina ou equivalentes funcionais que convertem L-alanina para D-alanina (EC 5.1.1.1).

Em outras modalidades de acordo com a invenção, é proporcionado um processo para produzir monatina, no qual um substrato a- ceto ácido forma um L-aminoácido quando L-triptofano é convertido para indol-3-piruvato, indol-3-piruvato reage formando precursor de monatina (o qual pode incluir tanto R-MP quanto S-MP embora preferencialmente inclua somente ou predominantemente R-MP), e o L-aminoácido reage regenerando (também referido como "reciclo") o substrato de α-ceto ácido quando R-MP é convertido para R1R monatina. A reação de R-MP e um L- aminoácido para formar R1R monatina é facilitada por uma aminotransferase estereoinversora. Deste modo, o produto L-aminoácido da reação de L- triptofano aminotransferase pode ser usado como um substrato para a transaminação de MP para monatina, e o produto (isto é, oxaloacetato, piruvato, e/ou α-KG) da reação acoplada à reação de precursor de monatina para monatina pode ser usado como um material de partida para a reação acoplada à reação de L-triptofano para indol-3-piruvato. Exemplos não- limitantes de aminotransferases estereoinversoras que podem ser usadas incluem mutantes derivados de D-fenilglicina aminotransferase (EC 2.6.1.72, também conhecida como D-4-hidroxifenilglicina aminotransferase), D- metionina aminotransferase (EC 2.6.1.41, também conhecida como D-met- aminotransferase e D-metionina-piruvato aminotransferase), e homólogos das mesmas.

Modalidades adicionais podem ser encontradas no requerimento de patente dos Estados Unidos Serial N5 11/714.279 arquivado em 6 de março de 2007 (vide, por exemplo, as figuras 1 e 3), o qual é aqui, a este requerimento de patente, incorporado por meio de referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, todo o caminho para produzir monatina pode envolver uma reação de triptofano para formar indol-3- piruvato, uma reação de indol-3-piruvato para produzir MP, e uma reação de MP para produzir monatina, incluindo R,R monatina. Embora, conforme seria evidente para uma pessoa com conhecimento regular da técnica, podem ser feitas várias permutações para este caminho sem se desviar do âmbito geral da descoberta.

Em uma modalidade similar, pode ser feita uma permutação para o caminho para aumentar a produção da forma R,R de monatina às custas das formas S,S, R,S, e S,R de monatina. Em particular, a enzima aminotransferase utilizada na reação de L-triptofano tem maior atividade e/ou especificidade para esta reação versus as reações de MP e 4S monatina ou a oxidase tem maior atividade e/ou especificidade para L- triptofano do que para 4R monatina; a enzima a qual facilita a reação de indol-3-piruvato é uma aldolase R-específica; e a enzima a qual facilita a reação de MP é uma D-enzima de ampla especificidade, preferencialmente desenvolvida para trabalhar mais eficazmente com o R isômero de MP. Em alguns casos, o indol-3-piruvato pode ser então produzido indiretamente, ao invés de diretamente a partir de L-triptofano. Mais especificamente, L- triptofano é convertido para D-triptofano, e D-triptofano é em seguida convertido para indol-3-piruvato.

Em uma modalidade específica, L-triptofano é convertido para D- triptofano usando uma triptofano racemase. D-triptofano então reage com piruvato através de uma D-aminotransferase de ampla especificidade para produzir indol-3-piruvato e D-alanina. lndol-3-piruvato em seguida reage com uma aldolase R-específica e piruvato para formar R-a-ceto ácido monatina (R-MP). R-MP então reage com uma D-aminotransferase de ampla especificidade e D-alanina para produzir R,R monatina e piruvato.

A conversão de L-triptofano para D-triptofano pode ser facilitada por uma triptofano racemase ou equivalente funcional da mesma. Tipos exemplares de enzimas com atividade de triptofano racemase incluem Racemases de ampla atividade das espécies Pseudomonas e Aeromonas (Kino, K. et ai, Applied Microbiology and Biotechnology (2007), 73(6), 1299- 1305; Inagaki, K. et al, Agricultural and Biological Chemistry (1987), 51(1), 173-80). Para exemplos adicionais de racemases, aldolases, e aminotransferases, vide, por exemplo, o requerimento de patente dos Estados Unidos Serial N9 11/714.279 arquivado em 6 de março de 2007.

O caminho discutido acima pode ter alguns benefícios, incluindo que mesmo quando R1R monatina é o produto desejado, a mesma enzima pode ser usada para a reação que produz indol-3-piruvato como para a reação que produz monatina como um produto. Por exemplo, em alfuns casos uma L-aminotransferase (ou L-enzima adequada) pode facilitar a reação para produzir indol-3-piruvato, mas uma D-aminotransferase facilita a reação para produzir monatina. Em contraste, uma determinada D- aminotransferase que facilita a reação para produzir indol-3-piruvato, também pode facilitar a reação para produzir monatina. Consequentemente, D-aminotransferases de ampla especificidade podem ser preferenciais quando se deseja usar a mesma enzima para a reação formando indol-3- piruvato que para a reação formando monatina. Em alguns casos, a produção de monatina pode ser mais eficiente quando é escolhida uma D- aminotransferase que tem atividade e/ou especificidade limitada para indol- 3-piruvato comparado com R-MP.

Um benefício adicional do caminho acima é que o produto de aminoácido da reação acoplada à reação para produzir indol-3-piruvato pode ser usado como um substrato na reação acoplada à reação para produzir monatina. Por exemplo, se L-triptofano reage produzindo indol-3-piruvato e ao mesmo tempo oxaloacetato, α-cetoglutarato, e/ou piruvato reage produzindo um L-aminoácido, e a reação de R-MP para formar monatina é acoplada com uma reação utilizando um D-aminoácido como um substrato, então o L-aminoácido da reação formando indol-3-piruvato não é, sob as condições descritas, reciclado para uso na reação acoplada à reação de R- MP. Em contraste, se a reação de D-triptofano para formar indol-3-piruvato for acoplada a uma reação formando um produto de D-aminoácido, então o D-aminoácido pode ser reciclado para uso na reação acoplada à reação de R-MP. Isto possibilita que se use quantidades não-estequiométricas de aceitador de amino na primeira etapa, e o doador de amino necessário para a terceira etapa é produzido na primeira. Em modalidades específicas, o D- aminoácido é D-alanina.

Uma pessoa versada na técnica entenderia a partir da presente descoberta como implementar a presente invenção para melhorar a produção de R,R monatina nos vários caminhos. Por exemplo, uma pessoa com conhecimento regular entenderia a partir da presente descoberta que uma modalidade da invenção, conforme aplicada à produção de R,R monatina, inclui proporcionar uma primeira mistura de reagentes e facilitadores sob condições apropriadsa para possibilitar que a primeira mistura produza R1R monatina; remover no mínimo a ou as enzimas que facilitam reações as quais competem com a etapa no caminho que produz diretamente monatina (geralmente a última etapa no caminho), ou no mínimo remover as enzimas em uma maneira que rompe reações resultando em reduzir a concentração de intermediários instáveis, ou remover todas as enzimas, depois da primeira reação ter prosseguido por um tempo desejado, por exemplo, até ser atingido o equilíbrio; seguida pela adição de no mínimo uma enzima a qual funciona na etapa produtora de monatina do caminho (geralmente a etapa final do caminho), e opcionalmente adicionar outros componentes cuja concentração aumentada ajuda o equilíbrio da etapa produtora de monatina a mover em direção à produção de monatina, deste modo aumentando a produção de R,R monatina. Vide, por exemplo, os

Exemplos 9 e 14.

Em uma modalidade similar, L-triptofano é convertido para D- triptofano usando uma triptofano racemase. D-triptofano em seguida reage com piruvato através de uma D-aminotransferase de ampla especificidade para produzir indol-3-piruvato e D-alanina. lndol-3-piruvato então reage com uma R-específica aldolase e piruvato para formar R-a-ceto ácido monatina (R-MP). R-MP então reage com uma D-aminotransferase de ampla especificidade e D-alanina para produzir R,R monatina e piruvato. Para aumentar a produção de R,R monatina, uma ou mais das enzimas é removida da reação (por exemplo, uma aldolase R-específica) para inibir ou retardar as reações as quais são competitivar com a produção de R1R monatina. Em algumas modalidades, a mistura da reação restante é suplementada com a enzima responsável pela produção de monatina (por exemplo, D-aminotransferase), e em casos específicos, um doador de amino (por exemplo, D-alanina) também é adicionado.

Uma planilha do fluxograma, de acordo com a invenção é mostrada na figura 1 e um diagrama de bloco de um sistema típico de acordo com a invenção é mostrado na figura 2. A figura 2 identifica caminhos para produzir monatina, mas não se pretende que seja limitada a qualquer método ou sistema em particular para praticar os caminhos. Por exemplo, quando praticadas in vitro, nenhuma das reações no caminho é realizada dentro de uma célula viva inteira. Alternativamente, os métodos podem ser praticados utilizando uma combinação de métodos in vitro e in vivo. Por exemplo, o aminoácido produzido na reação (1) pela desaminação de triptofano pode ser utilizado na reação (3) para produzir monatina a partir de MP1 e portanto não tem de ser explicitamente proporcionado pelo profissional. Além disso, a prática não requer que cada um dos componentes identificados (por exemplo, reagentes e enzimas) seja explicitamente proporcionado pelo profissional, na medida que componentes suficientes, ou fontes de componentes, e condições de reação sejam proporcionados ou estejam presentes de modo que o caminho possa potencialmente prosseguir. Por exemplo, é contemplado que a prática de um caminho que usa L-triptofano como um material de partida incluiria não somente modalidades nas quais L-triptofano é proporcionado, mas também modalidades nas quais é proporcionado um composto que pode produzir L- triptofano, sob condições adequadas para ocorrer produção de L-triptofano a partir daquele composto, e combinando este composto com enzimas capazes de facilitar a reação ou a série de reações para a referida conversão deste composto para L-triptofano. Portanto, por exemplo, para a modalidade exemplificada pelas reações (1), (2) e (3), acima, a mistura da reação não precisa conter exclusivamente somente os reagentes e produtos das três reações. Reações secundárias e/ou subprodutos, tais como uma adição, catalisada por aldolase, de uma molécula de piruvato com uma segunda molécula de piruvato, também pode estar presente (4-hidróxi-4- metil-2-oxoglutarato, ou "HMO"). O HMO também pode sofrer uma reação de transaminação para produzir 4-hidróxi-4-metil glutamato ("HMG"). O HMG pode ser reciclado para a mistura da reação uma para evitar perda adicional de grupamentos piruvato e amino que de modo diverso estariam disponíveis para as reações para produzir monatina.

Com referência agora à figura 1, conforme indicado no bloco 1, no mínimo um reagente e no mínimo uma enzima são adicionados a um primeiro vaso de reação. A figura 2 será referida como um sistema típico para realizar o processo resumido na figura 1. Conforme mostrado exemplarmente na figura 2, uma enzima aminotransferase é produzida e purificada, ou proporcionada de modo diverso em um subsistema 10, e uma enzima aldolase é produzida e purificada, ou proporcionada de modo diverso, em um subsistema 12. Estes catalisadores são transportáveis para um primeiro vaso de reação 14 através dos conduites 16, 18. Em uma modalidade alternativa as enzimas necessárias podem ser introduzidas a partir de uma única fonte e alimentadas para o primeiro vaso de reação através de um único conduite. A criação de material L-triptofano (ou alternativamente D-triptofano ou uma mistura de L- e D-triptofano) é transportável a partir de uma fonte de triptofano 20 através do conduite 22 para o primeiro vaso de reação 14 e a criação de material piruvato é transportável a partir de uma fonte de piruvato 24 através do conduite 26 para o primeiro vaso de reação 14. Caso desejado, a L-alanina do material original (ou alternativamente D-alanina ou uma mistura de L- e D-alanina) é transportável a partir de uma fonte de L-alanina 46 através do conduit 59 para o primeiro vaso de reação 14. Outros conduites 28, 30 estão disponíveis para transporte de reagentes ou composições adicional para o primeiro vaso de reação 14. Conforme indicado no bloco 2 da figura 1, o no mínimo um reagente e no mínimo uma enzima reagem para formar uma primeira mistura da reação.

Conforme indicado no bloco 3 da figura 1, no mínimo uma enzima presente na primeira mistura da reação é inativada depois de um tempo predeterminado. A inativação da uma ou mais enzimas pode incluir inibir a uma ou mais enzimas ou remover / separar a uma ou mais enzimas da primeira mistura da reação. A figura 2. ilustra um sistema típico em que a uma ou mais enzimas são separadas da primeira mistura da reação através de ultrafiltração. Apesar de ser utilizada ultrafiltração nesta modalidade, outros sistemas e processos de separação de conhecimento daqueles versados na técnica podem ser utilizados para remover / separar uma ou mais enzimas da primeira mistura da reação, por exemplo, enzimas imobilizadas. O primeiro vaso de reação 14 é conectado a um sistema de ultrafiltração 32 através de um conduite 34. A primeira mistura da reação, contendo os constituintes das reações de equilíbrio (1), (2) e (3) é transportável através do conduite 34 para o sistema de ultrafiltração 32, em um momento desejado. O sistema de ultrafiltração separa a primeira mistura da reação para um retentado compreendendo as enzimas de maior peso molecular aminotransferase e aldolase, e um permeado compreendendo os outros constituintes na primeira mistura da reação. As enzimas são recicláveis, diretamente ou indiretamente, para o primeiro vaso de reação através do conduite 36. As enzimas podem ser, por exemplo, separadas umas das outras e recicladas ou usadas separadamente de modo diverso em quantidades apropriadas. O permeado é transportável através do conduite 38 para um segundo vaso de reação 40.

Conforme indicado no bloco 4, depois da inativação da no mínimo uma enzima a mistura inativada é alimentada para um segundo vaso de reação. Uma ou mais enzimas adicionais também são adicionadas ao segundo vaso de reação e os constituintes reagem para formar uma segunda mistura da reação, conforme indicado nos blocos 5 e 6, respectivamente. Conforme mostrado exemplarmente na figura 2, os constituintes transportados como o permeado para dentro do segundo vaso de reação 40 incluem triptofano, piruvato, alanina, MP, I-3-P e monatina. Os conduites de entrada 42, 44 transportam quantidades de reagente ou reagentes adicionais para dentro do segundo vaso de reação 40. Estes reagentes adicionais podem incluir, por exemplo, alanina a partir de uma fonte de alanina 46 conectada ao conduite de entrada 42, e aminotransferase ou outras enzimas a partir de uma fonte de aminotransferase 48 conectada ao conduite de entrada 44. Os reagentes que existem no segundo vaso de reação 40 formam uma segunda mistura da reação e são aqueles que se envolvem nas reações de equilíbrio (1) e (3), mas não na reação de equilíbrio (2) devido à ausência da enzima aldolase. A segunda mistura da reação é enriquecida em monatina comparada com a concentração de monatina na primeira mistura da reação.

A segunda mistura da reação é em seguida purificada para remover monatina, o produto desejado, conforme indicado no bloco 7. Conforme mostrado exemplarmente na figura 2, a segunda mistura da reação é transportável através de um conduite 50 para dentro de um subsistema de purificação de monatina 52. Outros constituintes são adicionados no sistema de purificação através de, por exemplo, um conduite 57 para formar uma mistura de purificação da reação no sistema de purificação. Subsistemas de purificação de monatina são de conhecimento geral, e tipicamente operam em um ambiente acidífero. Um sistema típico compreende cromatografia de permuta de cátions. A monatina é removível do sistema de purificação 52 através do conduite 54. Entre os outros constituintes, a alanina é removível através de um conduite 56. O conduit 56 pode ser usado para reciclar alanina para a fonte de alanina 46 e o segundo vaso de reação 40, (ou através de um conduite 58 para o primeiro vaso de reação 14). Outros constituintes, tais como triptofano e piruvato, podem ser reciclados para o primeiro vaso de reação 14. Triptofano é transportável através do conduite 60 para a fonte de triptofano 20, e piruvato é transportável através do conduite 62 para a fonte de piruvato 24.

Exemplos de vários métodos de purificação conforme mostrado na mistura de purificação da reação 52 da figura 2 podem ser encontrados nas Figuras 3 a 7. As Figuras se referem a vários procedimentos tais como ultrafiltração, cromatografia de permuta de cátions, cromatografia de permuta de ânions, cromatografia adsorvente sintética não-polar, e dessalgação. Em algumas modalidades de ultrafiltração, a membrana pode ter um corte eficaz de cerca de 10 kda, 20 kda, 30 kda, ou 50 kda. Em algumas modalidades, o material da membrana pode ser de celulose regenerada, éter de polissulfona, cerâmica, aço inoxidável, ou qualquer outro material adequado. Em algumas modalidades de cromatografia de permuta de cátions, a coluna de permuta de cátions é uma resina de permuta de cátions de ácido forte em forma de H+, tendo um copolímero de divinilbenzeno de estireno funcionalizado com ácido sulfônico e incluindo uma reticulação de a partir de cerca de 2 a 12%. EM algumas modalidades, elutriação é com solução cáustica tal como soluções de KOH, NaOH, NH4OH, ou combinações das mesmas, as quais são então neutralizadas com um ácido tal como HCI, ácido carbônico, sulfúrico, nítrico, fórmico, cítrico ou acético. Em algumas modalidades de cromatografia de permuta de ânions, a coluna de cromatografia de permuta de ânions é uma resina de permuta de ânions forte de, por exemplo, polímero de polimetacrilato para minimizar ligação não-específica em forma de hidróxido, acetato, ou carbonato. Em algumas modalidades, elutriação é com hidróxido de potássio, bicarbonato de amônio, acetato de potássio, acetato de sódio, hidróxido de sódio, bicarbonato de sódio, bicarbonato de potássio, acetato de amônio, hidróxido de amônio, ou combinações dos mesmos, os quais são então neutralizados com, por exemplo, HCI, ácido carbônico, sulfúrico, nítrico, fórmico, cítrico ou acético. Em algumas modalidades, a resina adsorvente sintética não-polar é um copolímero de divinilbenzeno de estireno tendo: uma área superficial específica de no mínimo 600 m2/g, ou ainda 1000m2/g, ou maior; um raio de poro de cerca de 150 Ângstroms ou menos. Em algumas modalidades, a coluna é lavada com água ou etanol aquoso de 15% v/v de concentração ou menos. Em algumas modalidades, dessalgação pode incluir evaporação se os sais são voláteis como com bicarbonato de amônio, ou pode ser feita passando através de uma coluna adsorvente não-polar sintética. Com referência à figura 3, a mistura da reação 2 é passada através de um sistema de ultrafiltração (vide, por exemplo, o Exemplo 17), produzindo um retentado incluindo as enzimas e um permeado incluindo os substratos, intermediários, e produtos e outras moléculas pequenas da primeira mistura da reação. O permeado de ultrafiltração é então passado através de uma coluna de permuta de cátions. Piruvato é separado e reciclado para dentro da primeira mistura da reação.

Depois de permuta de cátions, a mistura é dessalgada e passada através de uma coluna de permuta de ânions (vide, por exemplo, o Exemplo 18). A coluna de permuta de ânions é capaz de separar o produto desejado, monatina, dos reagentes triptofano e alanina. O produto, monatina, é adicionalmente purificado usando uma resina SDVB (vide, por exemplo, o Exemplo 20). Os reagentes triptofano e alanina também são purificados por meio de uma resina SDVB, e em seguida são reciclados para a mistura da reação 1 ou 2, respectivamente.

Com referência à figura 4, a mistura de purificação da reação pode ser purificada em uma modificação daquela mostrada na figura 3. Como na figura 3, a mistura da reação 2 é inicialmente purificada por ultrafiltração, mas neste caso, o permeado é primeiro purificado usando uma etapa de purificação de membrana característica (NP) (vide, por exemplo, o Exemplo 19), em que a membrana é designada para separar compostos pequenos de grandes. A NP pode separar triptofano e o produto desejado, monatina, da mistura da reação. A monatina e triptofano são separados um do outro por meio de uma resina SDVB. Os componentes restantes da separação NP são adicionalmente purificados por eletrodiálise (vide, por exemplo, o Exemplo 21). Este processo purifica e separa piruvato e alanina para reciclagem e uso adicional na mistura da reação 1 e 2, respectivamente.

A figura 5 ilustra outro método de purificação. Como com os exemplos acima, a primeira etapa na purificação da mistura da reação 2 é ultrafiltração. Depois de ultrafiltração, piruvato é removido do permeado através de cromatografia de permuta de cátions, a qual pode separar aminoácidos de ácidos orgânicos. Este reagente pode ser então reciclado de volta para a mistura da reação 1. A mistura da reação restante depois da permuta de cátions é processada através de uma membrana de NP para separar alanina da mistura da reação. Conforme descrito acima, a alanina pode ser reciclada de volta para a mistura da reação 2. A mistura da reação restante é processada através de uma resina SDVB para separar e purificar triptofano, e o produto desejado, monatina.

Outro exemplo da purificação da mistura da reação 2 pode ser encontrado na figura 6. Depois da ultrafiltração inicial da mistura da reação 2, piruvato é mais uma vez removido usando cromatografia de permuta de cátions para reciclagem para a mistura da reação 1. Depois de permuta de cátions, a mistura da reação restante é processada através de uma resina SDVB para separar e purificar alanina e triptofano para reciclagem, bem como o produto desejado, monatina. Dependendo da capacidade de carga da resina, uma pessoa com conhecimento regular entenderia que o processo (conforme exemplificado nesta figura ou em outras) pode requerer mais de uma resina SDVB e/ou mais de uma etapa de processamento de resina SDVB. Um exemplo da separação de alanina de monatina é mostrado no Exemplo 20.

Em um exemplo adicional, a figura 7 detalha outra permutação da purificação da mistura da reação 2. Depois de ultrafiltração, permuta de cátions é usada em combinação com uma etapa de gradiente de tampão de elutriação para separar três frações (vide, por exemplo, o Exemplo 22). Em uma das frações, piruvato é removido na água de enxágue. Em outra das frações, alanina e triptofano são removidos e adicionalmente processados por uma resina SDVB antes de reciclar os mesmos para as misturas da reação 1 e 2 conforme descrito acima. A fração final também é adicionalmente processada através de uma resina SDVB para separar tanto os sais da mistura da reação quanto o produto desejado, monatina.

Outro exemplo da purificação da mistura da reação 2 é utilizar cromatografia de permuta de ânions seguida por uma coluna de dessalgação. Depois da ultrafiltração inicial da mistura da reação 2, cromatografia de permuta de ânions é realizada sob condições nas quais alanina e triptofano não ligam, e podem ser reciclados para a mistura da reação 1. Os ácidos orgânicos e monatina da mistura da reação original 1 ligam e podem ser seletivamente eluídos usando um gradiente. Monatina pode ser dessalgada usando a resina SDVB conforme descrito acima.

O diagrama de bloco conforme mostrado na figura 2 pode ser modificado conforme necessário para substituir as enzimas e substratos com qualquer enzima ou combinação de enzimas, ou substrato ou combinação de substratos, úteis para as modalidades alternativas da invenção. Por exemplo, a enzima transferase exemplificada proporcionada pelo subsistema 10 e a enzima aldolase exemplificada proporcionada pelo subsistema 12, podem ser substituídas com qualquer enzima ou combinação útil para facilitar uma ou mais reações no caminho sintético. Em uma maneira similar, a fonte de L-triptofano 20 e a fonte de piruvato 24 ao invés proporcionariam os substratos apropriados para as enzimas proporcionadas nos subsistemas 10 e/ou 12. Por exemplo, "L-triptofano" pode ser "D-triptofano" ou uma fonte de D-triptofano, ou uma mistura de L- e D-triptofano. Como outro exemplo, "L-alanina" pode ser "D-alanina" ou uma mistura de L- e D-alanina, ou outro aminoácido, conforme apropriado para os vários caminhos de produção de monatina.

Enzimas típicas úteis nos métodos da invenção para converter triptofano para indol-3-piruvato (reação 1) incluem membros das classes enzimáticas (EC) 2.6.1.27, 1.4.1.19, 1.4.99.1, 2.6.1.28, 1.4.3.2, 1.4.3.3, 2.6.1.5, 2.6.1.-, 2.6.1.1, 2.6.1.21 e 3.5.1.-. Estas classes incluem polipeptídeos tais como: triptofano aminotransferase (vide, por exemplo, o Exemplo 7), a qual converte L-triptofano e α-KG (isto é, a-cetoglutarato, também denominado 2-oxoglutarato) para indol-3-piruvato e um aminoácido tal como L-glutamato; D-triptofano aminotransferase, a qual converte D- triptofano e um 2-oxo ácido para indol-3-piruvato e um aminoácido; triptofano deidrogenase, a qual converte L-triptofano e NAD(P) para indol-3-piruvato e NH3 e NAD(P)H; D-aminoácido deidrogenase, a qual converte D- aminoácidos e FAD para indol-3-piruvato e NH3 e FADH2; triptofano- fenilpiruvato transaminase, a qual converte L-triptofano e fenilpiruvato para indol-3-piruvato e L-fenilalanina; L-aminoácido oxidase, a qual converte um L-aminoácido e H2O e O2 para um 2-oxo ácido e NH3 e H2O2; D-aminoácido oxidase, a qual converte um D-aminoácido e H2O e O2 para um 2-oxo ácido e NH3 e H2O2; e triptofano oxidase, a qual converte L-triptofano e H2O e O2 para indol-3-piruvato e NH3 e H2O2. Estas classes também contêm tirosina (aromática) aminotransferase, aspartato aminotransferase, D-aminoácido (ou D-alanina) aminotransferase, e aminotransferases amplas (múltiplo substrato) as quais têm múltiplas atividades de aminotransferase, algumas das quais podem converter triptofano e um 2-oxo ácido para indol-3-piruvato e um aminoácido. Além disso, estas classes incluem fenilalanina deaminases, as quais podem convertem triptofano para indol-3-piruvato e amônio na presença de água.

Enzimas típicas úteis nos métodos da invenção para a conversão de indol-3-piruvato para MP (reação 2) incluem membros das classes enzimáticas 4.1.3.-, 4.1.3.16, 4.1.3.17, e 4.1.2.-. Estas classes incluem carbono-carbono sintases / liases, tais como aldolases (vide, por exemplo, o Exemplo 8, 11, e 12) que catalisam a condensação de dois substratos de ácido carboxílico. Peptídeo classe EC 4.1.3.- são sintases / liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos oxo-ácido (tais como indol-3-piruvato) como o eletrófilo, a passo que EC 4.1.2.- são sintases / liases que formam ligações carbono-carbono utilizando substratos aldeído (tais como benzaldeído) como o eletrófilo. Por exemplo, KHG [2- ceto-4-hidroxiglutarato] aldolase (EC 4.1.3.16) e ProA aldolase (EC 4.1.3.17), são conhecidas por converterem indol-3-piruvato e piruvato para MP. Embora se possa imaginar que a ProA aldolase identifique somente a 4- hidróxi-4-metil-2-oxoglutarato (HMG) aldolase derivada de Comamonas testosteroni, aqui, neste requerimento de patente, o termo ProA aldolase é usado para indicar qualquer polipeptídeo com atividade de 4-hidróxi-4-metil- 2-oxoglutarato aldolase a menos que determinado de modo diverso.

Exemplos adequados de Pro aldolases incluem ProA de Comamonas testosteroni (se correlacionando com a SEQ ID NO 65 (seqüência de ácido nucleico) na Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2005/0282260, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência, e a SEQ ID NO:66 (seqüência de aminoácido) também na Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2005/0282 e ProA de Sinorhizobium meliloti (HMG Aldolase) (NCBI Acesso NQ: CAC46344), ou enzimas que apresentam homologia com ProA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO 65 (seqüência de ácido nucléico) na Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2005/0282260, SEQ ID NO: 66 (seqüência de aminoácido) na Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2005/0282260 ) e/ou ProA de Sinorhizobium meliloti (HMG Aldolase) (NCBI Acesso N5: CAC46344), e/ou a aldolase codificada pela SEQ ID NO:1 (seqüência de ácido nucléico) ou pela SEQ ID NO:2 (seqüência de aminoácido), e/ou a aldolase descrita no Exemplo 8. Por exemplo, enzimas adequadas podem ter have no mínimo cerca de 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, e/ou 99% de identidade de seqüência de aminoácidos com ProA de Comamonas testosteroni (SEQ ID NO:66 da Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 2005/0282260) e/ou ProA Sinorhizobium meliloti (NCBI Accession N9: CAC46344) e/ou SEQ ID N0:2 e/ou a aldolase descrita no Exemplo 8. MP também pode ser produzido usando reações químicas, tais como as condensações de aldol.

Enzimas típicas úteis nos métodos da invenção para a conversão de MP para monatina (reação 3) incluem membros das classes enzimáticas: triptofano aminotransfe rases (2.6.1.27), triptofano deidrogenases (1.4.1.19), D-aminoácido deidrogenases (1.4.99.1), glutamato deidrogenases (1.4.1.2-4), fenilalanina deidrogenase (EC 1.4.1.20), triptofano-fenilpiruvato transaminases (2.6.1.28), ou de modo mais geral membros da família das aminotransferases (2.6.1.-) tais como aspartato aminotransferase (EC 2.6.1.1), tirosina (aromática) aminotransferase (2.6.1.5), D-triptofano aminotransferase, ou D-alanina (também conhecida como D-aspartato ou D-aminoácido) (2.6.1.21) aminotransferase (vide a Figura 2 do requerimento de patente internacional Nq WO 03/091396 A2).

Esta reação também pode ser realizada usando reações químicas. Aminação do ceto ácido (MP) é realizada por aminação redutiva usando amônia e cianoboridreto de sódio. As Figuras 11-13 do requerimento de patente internacional Nq WO 2003/091396 A2 mostram polipeptídeos adicionais que podem ser usados para converter MP para monatina, bem como proporcionar produções aumentadas de monatina a partir de indol-3- piruvato ou triptofano.

É proporcionado aqui, neste requerimento de patente, um método para aumentar as produções globais de um produto ou produtos em uma reação de equilíbrio multietapa além da produção que é obtida pelo processo de equilíbrio somente. Em algumas modalidades um método similar pode incluir possibilitar que os componentes de uma reação de equilíbrio (por exemplo, reagentes e facilitadores) prossigam por algum período de tempo (por exemplo, para atingir equilíbrio). Depois deste período de tempo, a reação pode ser alterada através da remoção de um ou mais facilitadores (por exemplo, enzimas). Os facilitadores referidos podem incluir aqueles os quais facilitam reações que são competitivas com a produção de produto. Por exemplo, as reações competitivas referidas podem incluir quaisquer reações reversas dentro do processo de equilíbrio. Em alguns casos somente as reações competitivas serão alteradas, ao passo que em outros todas as reações serão alteradas ou rompidas. Uma vez que estas reações tenham sido alteradas ou rompidas, a reação produzindo produto diretamente é reiniciada através da adição do um ou mais facilitadores responsáveis por produção do um ou mais produtos, por exemplo, geralmente os facilitadores envolvidos na última etapa do caminho multietapa são reintroduzidos à mistura para reiniciar a etapa final do caminho.

Uma pessoa tendo conhecimento regular da técnica, ao ler a presente descoberta, entenderia que os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente, podem ser adaptados para produzir derivados de monatina, uma vez que caminhos e enzimas análogos podem ser usados na produção dos derivados de monatina. Por exemplo, um derivado similar pode incluir o discutido no Requerimento de Patente dos Estados Unidos Nq 11/58.4016, arquivado em 20 de outubro de 2006, o qual é aqui, a este requerimento de patente, incorporado por meio de referência em sua totalidade. Este derivado pode ter a seguinte estrutura:

<formula>formula see original document page 45</formula>

em que Ra, Rb, Rc, Rd, e Re cada representam independentemente qualquer substituinte selecionado entre um átomo de hidrogênio, um grupamento oxidrila, um grupamento C1-C3 alquila, um grupamento C1-C3 alcóxi, um grupamento amino, ou um átomo de halogeno, tal como um átomo de iodo, átomo de bromo, átomo de cloro, ou átomo de flúor. No entanto, Ra, Rb, Rc, Rd, e Re não podem ser simultaneamente todos hidrogênio.

Alternativamente, Rb e Rc, e/ ou Rd e Re podem formar juntos um grupamento C1-C4 alquileno, respectivamente. Os sistemas descritos aqui, neste requerimento de patente, para os métodos da invenção podem ser automatizados, ou semiautomatizados. Adicionalmente, a invenção proporciona um equipamento que utiliza os métodos ou sistemas para produzir monatina conforme descrito aqui, neste requerimento de patente, e métodos para usar o equipamento referido. Um equipamento similar compreende: um primeiro vaso de reação, um vaso de separação e um segundo vaso de reação. O primeiro vaso de reação pode ter uma ou mais alimentações ou conduites que podem proporcionar os constituintes (uma ou mais enzimas e/ou um ou mais substratos ou outros componentes) de uma mistura que deve estar presente no primeiro vaso de reação. O vaso de separação contém a primeira mistura da reação em uma maneira que retém uma enzima desejada, proteína ou facilitador ao mesmo tempo que permitindo a transferência de componentes desejados do primeiro vaso de reação para um segundo vaso de reação. O segundo vaso de reação também pode ter uma ou mais alimentações ou conduites para proteína / enzima ou adições de componentes, e pode ter adicionalmente uma ou mais saídas para facilitar a reciclagem de alguns componentes da segunda mistura da reação de volta para o primeiro vaso de reação, e para facilitar a compilação do produto final desejado.

O vaso de separação pode ser parte do primeiro vaso de reação, ou parte do segundo vaso de reação, ou um vaso separado que é independente do primeiro e do segundo vaso de reação.

O equipamento pode compreender adicionalmente controles para liberação dos constituintes dentro e fora dos vasos, controles para regular a temperatura, o pH e outras condições físicas da reação, e um computador para controlar um ou mais aspectos do equipamento global.

Alguns processos da invenção são ilustrados nos seguintes exemplos. Apesar de múltiplas modalidades serem reveladas aqui, neste requerimento de patente, ainda outras modalidades da presente invenção podem se tornar evidentes para aqueles versados na técnica a partir de revisão da totalidade deste pedido de patente. Conforme deve ser compreendido a partir da descrição aqui, neste requerimento de patente, a invenção é capaz de modificações em vários aspectos, todos sem se afastar do espírito e do âmbito da presente invenção. Por conseguinte, o desenho e a totalidade da descrição devem ser considerados como de natureza ilustrativa e não em um sentido limitante.

Exemplo 1. Produção de HISg-HEXaspC aminotransferase em uma fermentação alimentada por lote

Materiais

Os componentes meio de crescimento bacteriano eram da Difco, Fisher Scientific, ou VWR; outros reagentes eram de grau analítico ou do maior grau comercialmente disponível. A fermentação foi realizada em um fermentador New Brunswick Scientific (Edison, NJ) BioFIo 3000®. Centrifugação foi realizada usando uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) Avanti® J-25I com um rotor JLA-16.250 ou JA-25.50.

A clonagem do gene codificando um derivado de aspC aminotransferase de E. coli contendo seis alterações na seqüência codificante (HEXaspC) é descrita na Publicação de Patente dos Estados Unidos Ng 2005/0282260, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. A enzima foi primeiro descrita por Onuffer e Kirsch et ai (Protein Science 4: 1750-1757 (1995)). As alterações de aminoácidos resultaram em uma enzima com especificidade de substrato mais ampla do que a enzima original, apresentando aumentada atividade para aminoácidos aromáticos.

A aminotransferase HEXaspC carregando uma etiqueta de purificação marcada com HIS6 de terminal amino foi produzida em um fermentador na escala de 2,5 L, em um processo de alimentação por lote que atinge altas densidades celulares e altos níveis de expressão da proteína desejada. Os protocolo e resultados para crescimento de cepa de E.coli BL21 (DE3)::H£XaspCpET30(Xa/LIC) são descritos como se segue: Iniciando a partir de uma lâmina de cultura fresca (agar LB com 0,05 mg/mL de canamicina), as células foram cultivadas em 5 mL de caldo de Luria- Bertani (LB) com 0,05 mg/mL de canamicina, a 37° C e 225 rpm por 6 a 8 horas. Um mL da cultura foi transferido para cada uma de 2 alíquotas de 100 mL do mesmo meio e as células foram cultivadas a 37Q C e 225 rpm de um dia para o outro (16 a 18 h). Um fermentador com 2,5 litros de meio contendo (por litro): 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 8,0 g/L de K2HPO4; 2,0 g/L de NaCI; 1,0 g/L de Na3Citrato-2H20; 1,0 g/L de MgS04- 7H20; 0,025 g/L de CaCl2'2H20; 0,05 g/L de FeSO4 -7H20; 0,4 ml/L de micronutrientes Neidhardt, 2,0 g/L de glicose e 0,5 mg/mL de canamicina foi inoculado com 5% em v/v (volume por volume) da cultura de de um dia para o outro. Duas horas depois da inoculação, uma alimentação de glicose exponencial foi estabelecida usando uma solução de glicose a 60% em peso/v (peso por volume). A alimentação foi suprida na taxa requerida para suportar crescimento microbiano em uma taxa exponencial de 0,15 h-1. Quando a taxa de evolução de dióxido de carbono (CER) tinha atingido um valor de 100 mmols/LVh (cerca de 20 horas depois da inoculação, correspondente a uma biomassa celular de 15 a 16 g DCW/L), a expressão genética foi induzida com uma adição de bolus de 2 g/L de Iactose (alimentado como uma solução a 20%). A alimentação foi alterada de 60% em peso/vol de glicose para 50% em peso/vol de glicose + 10% em peso/vol de Iactose enquanto a taxa de alimentação foi fixada na taxa na hora de indução. A alimentação de "50% em peso/vol de glicose + 10% em peso/vol de lactose" foi mantida por 6 horas. Ao final da fermentação, a concentração celular foi 31 g DCW/L, com um nível de expressão de enzima estimado de 38% da proteína total conforme calculado a partir do software do sistema Bio-Rad (Hercules, CA) Experion™ (vide abaixo). As células foram colhidas por centrifugação a 5000 a 7000 χ g por 10 min. e congeladas como uma pasta celular a úmido a -80Q C.

Exemplo 2. Purificação de HISfi-HEXaspC aminotransferase

As células foram rompidas usando um homogenizador Microfluidics (Newton, MA). A expressão de proteína foi analisada usando um sistema Bio-Rad (Hercules, CA) Experion™ Pro260 ou usando géis de gradiente de 4 a 15% de SDS-poliacrilamida Bio-Rad rodado em um equipamento celular Mini PROTEAN® 3. A proteína foi visualizada nos géis usando pigmento Coomassie G-250 Bio-Rad Bio-Safe™ e descorada com água. A enzima com etiqueta de HIS6 foi purificada com resina Fast Flow Chelating Sepharose™ GE Healthcare (Piscataway, NJ). Colunas PD10 GE Healthcare foram usadas para permutar tampão em soluções de proteína. As soluções de proteína foram concentradas com dispositivos de filtro centrífugo Millipore/Amicon (Billerica, MA) Centricon® Plus-70 (MWCO (corte de peso molecular) de 10 kDa). As concentrações de proteína foram determinadas usando o kit de teste BCA™ da Pierce (Rockford, IL) com albumina sérica bovina como o padrão. Foi realizada centrifugação em uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) Avanti® J-25I com um rotor JLA-16.250 ou JA-25.50. Todos os reagentes foram de grau analítico ou do maior grau disponível comercialmente.

Para preparar extrato livre de células contendo a HIS6-HEXaspC aminotransferase, as células foram suspendidas em 3 a 4 volumes de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 0,05 mM de piridoxal fosfato (PLP) e em seguida rompidas usando um homogenizador Microfluidics (3 passagens a 137,9 MPa (20.000 psi), mantendo a temperatura da suspensão em menos de 15°C. Todas as etapas de purificação subsequentes foram realizadas a A- C. O extrato celular foi centrifugado por 20 minutos a 15.000 χ g para remover os debris celulares. Uma alíquota de 20 a 25 mL do extrato livre de células foi aplicada a uma coluna de 45 mL de resina Fast Flow Chelating Sepharose™ (forma de níquel(ll)) que tinha sido previamente equilibrada com fosfato de potássio a 100 mM contendo 200 mM de cloreto de sódio e 0,05 mM de PLP. Para gerar a forma de níquel da resina, a resina foi lavada com 150 mL de hexaidrato de sulfato níquel(ll) a 200 mM e em seguida com 150 mL de água destilada. Depois de carregar a amostra, a coluna foi lavada / eluída com 150 mL do tampão de equilibração contendo 25 mM de imidazol, 150 mL do tampão de equilibração contendo 50 mM de imidazol e 150 mL do tampão de equilibração contendo 500 mM de imidazol. A proteína HIS6-HEXaspC elutriou na última lavagem. A lavagem de 500 mM de imidazol foi concentrada com dispositivos de filtro centrífugo Centricon® Plus-70 (corte de peso molecular de 10 kDa) para 15 a 20 mL de acordo com as instruções do fabricante. O imidazol e cloreto de sódio foram removidos por passagem através de colunas PD10 descartáveis (amotra de 2,5 mL por coluna) previamente equilibradas com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. A aminotransferase purificada foi eluída com 3,5 mL por coluna do mesmo tampão. A concentração de proteína de cada fração foi determinada usando o kit de teste Pierce BCA™. A pureza de cada fração e o nível de expressão nas fração de extrato livre de células foram determinados usando um sistema de chip microcapilar Experion™ ou por SDS-PAGE com géis de gradiente de 4 a 15%. Tipicamente este procedimento produz -150 mg de enzima (a partir de 600 a 700 mg de proteína total) que é 85 a 90% pura conforme julgado pelo software Experion™. Alíquotas (1 a 5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80Q C até o uso.

Exemplo 3. Expressão e Purificação de proA aldolase de Comamonas testosteroni

Materiais

Crescimento celular e indução genética foram realizados usando Overnight Express™ System Il (EMD Biosciences/Novagen; Madison, Wl). Todos os outros materiais foram os mesmos que os usados na purificação de HIS6-HEXaspC aminotransferase.

A clonagem do gene codificando um derivado de proA aldolase de C. testosteroni é descrita na Publicação de Patente dos Estados Unidos N9 2004/0063175.

A proA aldolase com uma etiqueta de purificação de HIS6 terminal amino foi produzida usando Overnight Express™ System Il (soluções 1-6) contendo 0,05 mg/mL de canamicina em frascos de agitação. Este sistema de expressão induz a expressão de sistemas indutíveis com IPTG sem a necessidade de monitorar o crescimento celular. Depois de inoculação de alíquotas de 200 mL do meio (em frascos de 1 L) de ou culturas líquidas ou lâminas de BL21(DE3)::C. testosteroni proA pET30(Xa/LIC), as culturas foram incubadas a 30Q C de um dia para o outro com agitação a 225 rpm. Quando a OD6oo atingiu um mínimo de 6, as células foram colhidas por centrifugação conforme descrito acima. Extratos celulares com a proA aldolase expressada foram preparados conforme descrito acima usando fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 200 mM de NaCI como o tampão da suspensão. Em alguns casos 4 mM de MgCb também foi adicionado ao tampão. A proteína foi purificada conforme descrito acima, carregando extrato celular preparado a partir das células de 4 frascos sobre uma coluna de resina de 45 mL Chelating Sepharose™ Fast Flow (forma de níquel(II)) previamente equilibrada com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 200 mM de NaCl. A proteína elutriou na fração contendo 500 mM de imidazol no tampão de equilibração. Esta fração foi concentrada conforme descrito acima e o imidazol foi removido por passagem através de colunas PD10 equilibradas com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 com 200 mM de cloreto de sódio e 4 mM de MgCI2. A concentração de proteína de cada fração foi determinada usando a prova Pierce BCA™. A pureza de cada fração e o nível de expressão na fração de extrato livre de células foram determinados usando um sistema de chip microcapilar BioRad Experion™ ou por SDS-PAGE com géis de 4 a 15% de gradiente. Tipicamente este procedimento produz mais de 200 mg de enzima que é 85 a 90% pura conforme julgado pelo software Experion™. Alíquotas (1 a 5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80- C até o uso.

Exemplo 4. Produção biocatalítica em pequena escala de S,S-monatina a partir de triptofano e piruvato

Materiais

Todos os reagentes foram de grau analítico ou do maior grau disponível comercialmente. As enzimas usadas para catalisar a formação de S,S-monatina foram purificadas conforme descrito nos Exemplos 2 e 3.

Métodos e Resultados

Um protocolo em pequena escala foi desenvolvido para a produção biocatalítica de S,S-monatina a partir de L-triptofano e piruvato. As reações enzimáticas foram realizadas em tubos de plástico de tampa de rosca de 15 mL. Uma solução de 50 mM de L-triptofano, 200 mM de piruvato, 4 mM de MgCI2, 0,05 mM de PLP em fosfato de potássio, pH 7,8 foi usado no protocolo de rotina e os tubos contendo esta solução foram incubados em temperatura ambiente com suave agitação. Soluções enzimáticas foram adicionadas a uma concentração de 0,05 g/L para a proA aldolase de Comamonas testosteroni purificada e 0,5 g/L para a HIS6- HEXaspC aminotransferase para iniciar as reações (10 mL de volume final). A concentração final de fosfato de potássio foi 25 mM, incluindo a contribuição tampão das soluções enzimáticas. Adições dos detergentes Tween 80® e Triton® X-100 (0,01 a 1%) minimizaram a precipitação das enzimas. As reações prosseguiram rapidamente depois da adição de enzimas e as taxas diminuíram com o tempo. Em 3 a 5 horas, uma segunda alíquota de 50 mM de L-triptofano foi adicionada e as reações foram continuadas por até 24 horas. O progresso das reações foi seguido medindo as concentrações de L-triptofano, L-alanina, monatina, precursor de monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. As concentrações de monatina, triptofano, e alanina foram medidas usando o protocolo de derivação pós coluna de fluorescência descrito no Exemplo 6. Métodos analíticos de precursor de monatina e de piruvato são descritos no Exemplo 6. Resultados típicos dos experimentos na escala de 10 mL são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Produção em pequena escala de S.S-monatina

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Exemplo 5. Produção biocatalítica aprimorada de escala de bancada de S.S- monatina a partir de triptofano e piruvato

Materiais

Todos os reagentes foram de grau analítico ou do maior grau disponível comercialmente. As enzimas usadas para catalisar a formação de S,S-monatina foram purificadas conforme descrito nos Exemplos 2 e 3. As reações biocatalíticas em escala de bancada foram realizadas em biorreatores de 0,7 L INFORS (Bottmingen, Suíça). Proteína foi removida das misturas da reação usando uma célula agitada de ultrafiltração Amicon (Millipore; Billerica1 MA) (Modelo 8200) com uma membrana YM10 ou usando uma cápsula de ultrafiltração Millipore Pellicon® de 50 cm2 (corte de peso molecular 10.000).

Métodos e Resultados

As reações biocatalíticas em escala de bancada foram realizadas em biorreatores de 0,7 L com controle de temperatura, de pH, e de agitação. A degradação catalisada por oxigênio do intermediário indol-3- piruvato foi minimizada rodando as reações em uma atmosfera de nitrogênio.

Mistura 1 (Primeira Mistura da Reação): Soluções de 50 mM de L-triptofano, 200 mM de piruvato, 4 mM de MgCI2, e 0,05 mM de PLP em fosfato de potássio, pH 7,8 (300 mL) foram preparadas dentro dos reatores;

A temperatura foi controlada a 30° Cea taxa de agitação a 250 rpm. Nitrogênio foi suprido ou no espaço superior dos reatores ou foi aspergido no líquido para minimizar a concentração de oxigênio da solução da reação. O pH foi monitorado e variou de 7,5 a 7,8 durante o curso da reação. Em alguns experimentos, o detergente Tween® 80 foi adicionado para minimizar a precipitação das enzimas. Soluções enzimáticas foram adicionadas para uma concentração de 0,05 g/L para a proA aldolase de Comamonas testosteroni purificada e 0,5 g/L para a HIS6-HEXaspC aminotransferase paa iniciar as reações. A concentração final de fosfato de potássio foi 25 mM, incluindo a contribuição tampão das soluções enzimáticas. Em 3 a 5 h, uma segunda alíquota de 50 mM de L-triptofano foi adicionada aos reatores. O progresso das reações foi seguido medindo as concentrações de L- triptofano, L-alanina, monatina, precursor de monatina (ácido 2-hidróxi-2- (1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. Para triptofano, monatina, e alanina foi utilizado o de método derivação pós-coluna de fluorescência. A concentração de indol-3-piruvato foi analisada usando o método de espectrofotométrico de arsenato-borato. Este método não é quantitativo mas permite o monitoramento qualitativo da perda ou formação de indol-3-piruvato. Todos os métodos analíticos são descritos no Exemplo 6.

Ultrafiltração: Depois de incubação de um dia para o outro (18 a 24 horas) a proteína foi removida das misturas da reação por ultrafiltração. As misturas da reação foram transferidas anaerobicamente para uma célula agitada de ultrafiltração e a solução desproteinizada foi coletada dentro de um frasco fechado qaue tinha sido previamente purgado de oxigênio com nitrogênio. Uma manta de nitrogênio foi mantida dentro do frasco durante a etapa de ultrafiltração. Uma alíquota da solução da reação desproteinizada (200 mL) foi em seguida transferida anaerobicamente para um fermentador de 0,7 L. Alternativamente, uma cápsula de ultrafiltração Pellicon® foi usada para desproteinizar a mistura da reação por recirculação da mistura da reação através da cápsula e compilação do permeado em um segundo reator fechado de 0,7 L, purgado com nitrogênio.

Mistura 2 (Segunda Mistura da Reação): À solução desproteinizada foi adicionado um excesso de L-alanina (para trazer a concentração inicial de L-alanina para 0,5 M ou 1,5 M conforme mostrado na Tabela 2, abaixo) e 0,5 g/L de HIS6-HEXaspC aminotransferase purificada. A temperatura foi mantida a 30°C, o pH entre 7,5 e 7,8, e a taxa de agitação a 250 rpm. Nitrogênio foi suprido no espaço superior continuamente para manter um ambiente anaeróbico. O progresso da reação foi seguido medindo as concentrações de L-triptofano, L-alanina, monatina, precursor de monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. A perda de indol-3-piruvato foi analisada usando o método espectrofotométrico de arsenato-borato conforme descrito no Exemplo 6. Os resultados de reações típicas são mostrados na Tabela 2. Tabela 2

<table>table see original document page 55</column></row><table> Os resultados da Tabela 2 mostram que a formação de S,S- monatina pode ser aumentada até 1,7 vezes quando um excesso de um doador de grupamento amino (L-alanina) e a enzima aminotransferase são adicionados à mistura da reação despròteinizada 1. Grande quantidade do precursor de monatina presente nas misturas de reação 1 foi aminado para formar monatina sob estas condições enquanto o indol-3-piruvato foi convertido para o triptofano mais estável (conforme mostrado na Tabela 2 pelo aumento na concentração de triptofano). O aumento no título de monatina com o processo de escala de bancada comparado com a pequena escala para a reação 1 é no mínimo parcialmente devido à exclusão de oxigênio das misturas da reação e ao aumento na temperatura da reação.

Embora a adição de detergente minimize a precipitação das proteínas tanto nos processos em pequena escala quanto em escala de bancada, não houve o significativo aumento na concentração de produto nas maiores reações quando detergente estava presente conforme foi observado com o processo em pequena escala.

Exemplo 6. Detecção de Monatina. Precursor de Monatina. Triptofano. Alanina. Piruvato. HMO. HMG. e lndol-3-piruvato

Análise de Monitoramento da Reação Múltipla de LC/EM/EM (MRM) de Monatina e Triptofano

Análises de misturas para monatina e triptofano derivadas de reações bioquímicas foram realizadas usando um instrumento de cromatografia líquida-espectrometria de massa tandem (LC/EM/EM) Waters/Micromass® incluindo um cromatógrafo líquido Waters 2795 com um monitor da absorvência de Photo-Diode Array (PDA) Waters 996 disposto em série entre o cromatógrafo e um espectrômetro de massa triplo quádruplo Micromass® Quattro Ultima®. Foram feitas separações por LC usando uma coluna de cromatografia de fase reversa Xterra EM C8, 2,1 mm χ 250 mm a 40°C. A fase móvel da LC consistiu em A) água contendo ou (i) 0,05% (v/v) de ácido trifluoracético ou (ii) 0,3% ácido fórmico e 10 mM de formato de amônio e B) metanol contendo ou (i) 0,05% (v/v) de ácido trifluoracético ou (ii) 0,3% de ácido fórmico e 10 mM de formato de amônio. Se a fase móvel da LC consistiu de A) água contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoracético e B) metanol contendo 0,05% (v/v) de ácido trifluoracético, o gradiente de elutriação foi linear a partir de 5% de B até 35% B, 0 a 4 min., linear a partir de 35% de B até 60% de B, 4 a 6,5 min., linear a partir de 60% de B até 90% de B, 6,5 a 7 min., isocrático a 90% de B, 7 a 11 min., linear a partir de 90% de B até 95% de B, 11 a 12 min., linear a partir de 95% de B até 5% de B, 12 a 13 min., com um período de reequilibração de 2 min. entre as rodadas. A taxa de fluxo foi de 0,25 mL/min., e a absorvência de PDA foi monitorada de 200 nm a 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-EM foram otimizados e selecionados com base na geração de íons moleculares protonados ([M + H]+) dos analisados de interesse, e na produção de íons de fragmentos característicos. Os seguintes parâmetros instrumentais foram usados para análise por Monitoramento de Múltipla Reação LC/EM/EM (MRM) de monatina e triptofano: Capilar: 3,5 kV; Cone: 40 V; Hex 1: 20 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de origem: 100Q C; Temperatura de dessolvação: 350Q C; Gás de dessolvação: 500 Uh; Gás do cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 12,0; Alta resolução de massa (Q1): 12,0; Energia iônica: 0.2; Entrada: -5 V; Energia de Colisão: 8; Saída: 1 V; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resolução de massa (Q2): 15; Energia iônica (Q2): 3,5; Multiplicador: 650. Cinco transições de MRM de monatina-específicas de pai-para-filha são usadas para detectar especificamente monatina em reações in vitro. As transições monitoradas são de 293,1 para 158,3, 293,1 para 168,2, 293,1 para 211,2, 293,1 para 230,2, e 293,1 para 257,2. Triptofano é monitorado com a transição de MRM de 204,7 para 146,4. Quatro padrões internos de quantificação de monatina e triptofano, quatro padrões de calibração contendo quatro proporções diferentes de cada analisado para d5-triptofano e d5-monatina, são analisados. Estes dados são submetidos a uma análise de quadrados mínimos linear para formar uma curva de calibração para monatina e triptofano. A cada amostra é adicionada uma quantidade fixa de d5-triptofano e ds-monatina (d5-monatina foi sintetizada a partir de d5-triptofano de acordo com os métodos do requerimento de patente mundial N5 WO 2003/091396 A2), e as proporções de reação (monatina / d5-monatina; triptofano / d5-triptofano) usadas em combinação com as curvas de calibração descritas acima para calcular a quantidade de cada analisado nas misturas.

Se a fase móvel da LC foi A) água contendo 0,3% de ácido fórmico e 10 mM de formato de amônio e B) metanol contendo 0,3% de ácido fórmico e 10 mM de formato de amônio, o gradiente de elutriação foi linear a partir de 5% de B até 45% de B, 0 a 8,5 min., linear a partir de 45% de B até 90% de B, 8,5 a 9 min., isocrático a partir de 90% de B até 90% de B, 9 a 12,5 min., linear a partir de 95% de B até 5% de B, 12,5 a 13 min., com um período de reequilibração de 4 min. entre as rodadas. A taxa de fluxo foi de 0,27 mL/min., e a absorvência de PDA foi monitorada de 210 nm a 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-EM foram otimizados e selecionados com base na geração de íons moleculares protonados ([M + H]+) dos analisados de interesse, e na produção de íons de fragmentos característicos. Os parâmetros instrumentais usados para esta fase móvel secundária são os mesmos que acima. Quatro transições de monatina- específicas de pai-para-filha por MRM e uma transição de triptofano específica de pai-para-filha são usadas para detectar especificamente monatina e triptofano em reações in vitro e in vivo. As transições monitoradas são 293,1 para 158,0, 293,1 para 168,0, 293,1 para 211,5, e 293,1 para 257,0. Triptofano é monitorado com a transição de MRM 205,2 para 146,1. Para quantificação de padrão interno de monatina e triptofano, são analisados quatro padrões de calibração contendo quatro proporções diferentes de cada analisado para ds-triptofano e d5-monatina. Estes dados são submetidos a uma análise de quadrados mínimos linear para formar uma curva de calibração para monatina e triptofano. A cada amostra é acidionada uma quantidade fixa de d5-triptofano e d5-monatina (d5-monatina foi sintetizada a partir de d5-triptofano de acordo com os métodos do requerimento de patente internacional N9 WO 2003/091396 A2), e as proporções de resposta (monatina/d5-monatina; triptofano/d5-triptofano) em associação com as curvas de calibração descritas acima são usadas para calcular a quantidade de cada analisado nas misturas. Transições de massa de pai-para-filha monitoradas para d5-triptofano e d5-monatina são 210,2 para 151,1, e 298,1 para 172,0 respectivamente. Medições por LC Quiral/EM/EM (MRM) de Monatina

A determinação da distribuição de estereoisômeros de monatina em reações bioquímicas foi realizada por derivação com 1 -flúor-2-4- dinitrofenil-5-L-alanina amida (FDAA), seguida por medição MRM de fase reversa LC/EM/EM.

Derivação de Monatina com FDAA

A 50 μl de amostra ou padrão foi adicionado 200 μL de uma solução a 1% de FDAA em acetona. 40 μL de bicarbonato de sódio a 1,0 M foi adicionado, e a mistura foi incubada por 1 h a 40° C com ocasional misturação. A amostra foi removida e resfriada, e neutralizada com 20 μΙ_ de HCI a 2,0 M (mais HCI pode ser necessário para realizar neutralização de uma mistura biológica tamponada). Depois da degaseificação estar completa, as amostras estavam pronta para análise por LC/EM/EM.

Monitoramento de Múltipla Reação LC/EM/EM para a Determinação da Distribuição de Estereoisômeros de Monatina

As análises foram realizadas usando a instrumentação de LC/EM/EM descrita nas seções anteriores. As separações por LC capazes de separar todos os quatro estereoisômeros de monatina (especificamente FDAA-monatina) foram realizadas sobre uma coluna de cromatografia de fase reversa C18 Phenomenex Luna® de 2,0 χ 250 mm (3 μm) a 40° C. A fase móvel da LC consistiu de A) água contendo 0,05% (massa/volume) de acetato de amônio e B) acetonitrila. A elutriação foi isocrática a 13% B, 0 a 2 min., linear de 13% de B a 30% de B, 2 a 15 min., linear de 30% de B a 80% de B, 15 a 16 min., isocrática a 80% B, 16 a 21 min., e linear de 80% de B a 13% de B, 21 a 22 min., com um período de reequilibração de 8 min. entre as rodadas. A taxa de fluxo foi de 0,23 mL/min., e a absorvência de PDA foi monitorada de 200 nm a 400 nm. Todos os parâmetros da ESI-EM foram otimizados e selecionados com base na geração de íons moleculares protonados ([M - H]") de FDAA-monatina, e na produção de íons de fragmentos característicos.

Foram usados os seguintes parâmetros instrumentais para análise por LC/EM de monatina no modo de ESI/EM iônico negativo: Capilar: 2,0 kV; Cone: 25 V; Hex 1: 10 V; Abertura: 0 V; Hex 2: 0 V; Temperatura de origem: 100° C; Temperatura de dessolvação: 350°C; Gás de dessolvação: 500 Uh; Gás do cone: 50 L/h; Baixa resolução de massa (Q1): 12,0; Alta resolução de massa (Q1): 12,0; Energia iônica: 0,2; Entrada: -5 V; Energia de Colisão: 20; Saída: 1 V; Baixa resolução de massa (Q2): 12; Alta resolução de massa (Q2): 12; Energia iônica (Q2): 3,0; Multiplicador: 650. Três transições de FDAA-monatina-específicas de pai-para-filha foram usadas para detectar especificamente FDAA-monatina em reações in vitro e in vivo. As transições foram 543,6 para 268,2, 543,6 para 499,2, e 543,6 para 525,2. A identificação de estereoisômeros de FDAA-monatina foi baseada no tempo de retenção cromatográfica comparado com estereoisômeros de monatina purificada, e dados de espectrais de massa.

Cromatografia Líquida - Detecção de Fluorescência Pós Coluna de Aminoácidos, incluindo Triptofano, Monatina, Alanina, e HMG Procedimento para Triptofano, Monatina, e Alanina

Cromatografia líquida com detecção de fluorescência pós-coluna para a determinação de aminoácidos em reações bioquímicas foi realizada em um sistema Waters 2690 LC ou equivalente combinado com um detector de fluorescência de varredura Waters 474, e um módulo de reação pós- coluna Waters (método LC/OPA). As separações por LC foram realizadas sobre uma coluna de permuta iônica carregada de Interaction-Sodium a 60° C. A Fase móvel A foi tampão Pickering Na 328 (Pickering Laboratories, Inc.; Mountain View, CA). A Fase móvel B foi tampão Pickering Na 740. O gradiente de elutriação foi de 0% de B a 100% de B, 0 a 20 min., isocrático a 100% B, 20 a 30 min., e linear de 100% de B a 0% de B, 30 a 31 min., com um período de reequilibração de 20 min. entre as rodadas. A taxa de fluxo para a fase móvel foi de 0,5 mUmin.. A taxa de fluxo para a solução de derivação pós-coluna OPA foi 0,5 mL/min.. Os ajustes do detector de fluorescência foram EX 338 nm e Em 425 nm. Norleucina foi empregada como um padrão interno para a análise. A identificação de aminoácidos foi baseada em dados do tempo de retenção cromatográfica para padrões purificados.

Procedimento para HMG

Amostras de reações bioquímicas foram limpadas por cartuchos de extração de fase sólida (SPE) contendo C18 como o material de acondicionamento e 0,6% de ácido acético como o eluente. A fração coletada de SPE foi em seguida trazida até um volume conhecido e analisada usando derivação de O-Ftalaldeido (OPA) pós-coluna de HPLC com um detector de fluorescência. Foi tornada possível separação cromatográfica usando um sistema de cromatografia líquida Waters 2695 e duas colunas Phenomenex AquaCI 8 em série; uma coluna de 2,1 mm χ 250 mm com partículas de 5 pm, e uma coluna de 2,1 mm χ 150 mm com partículas de 3 pm. A temperatura da coluna foi de 40°C e a taxa de fluxo isocrático da coluna foi de 0,18 mL/min.. A fase móvel foi 0,6% de ácido acético. sistema de derivação pós-coluna OPA e detecção consiste em um Waters Reagent Manager (RMA), uma câmara da bobina de reação, um módulo de controle da temperatura para a câmara da bobina de reação, e um detector Waters 2847 Florescent. A taxa de fluxo OPA foi ajustada a 0,16 ml/min., e a câmara da bobina de reação foi ajustada para 80°C. O detector de fluorescência foi ajustado com um comprimento de onda de excitação de 348 nm e um comprimento de onda de emissão de 450 nm. Outros parâmetros controlando a sensibilidade do detector, tais como ganho de sinal e atenuação, foram ajustados para necessidades experimentais. Quantificação de HMG foi baseada na resposta molar de ácido glutâmico.

Detecção de Monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4- aminoqlutárico) and Triptofano por LC-UWVis

Separações por cromatografia líquida foram feitas usando sistema de cromatografia líquida Waters 2690 e uma coluna de cromatografia de fase reversa de 5,0 pm de 2,1 mm χ 150 mm Agilent Eclipse XDB- C18com taxa de fluxo a 0,22 ml/min. e condições de gradiente como se segue: <table>table see original document page 62</column></row><table>

A fase móvel A é 0,3% (v/v) de ácido fórmico com 10 mM de formato de amônio, e a fase móvel B é 0,3% (v/v) de ácido fórmico com 10 mM de formato de amônio em 50/50 (v/v) de metanol / acetonitrila. A temperatura da coluna foi 40°C. Foi realizada detecção usando um Photodiode Array Waters 996 (PDA) operando a 280 nm. Tipicamente se usa uma faixa de calibração de 10 a 500 ppm.

Detecção de Precursor de Monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol- 3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) por LC/EM

Separações por cromatografia líquida foram feitas usando sistema de cromatografia líquida Waters 2690 e uma coluna de cromatografia de fase reversa de 1,8 pm de 2,1 mm χ 50 mm Agilent Eclipse XDB- C18 com taxa de fluxo a 2,5 mL/min. e condições de gradientes como se segue:

<table>table see original document page 62</column></row><table>

A fase móvel A é 0,3% (v/v) de ácido fórmico com 10 mM de formato de amônio, e a fase móvel B é 0,3% de ácido fórmico em peso/ 10 mM de formato de amônio em 50:50 de metanol / acetonitrila. A temperatura da coluna foi de 40°C.

Parâmetros para o espectrômetro de massa quádrupolo Micromass ZQ operando em modo de ionização por eletrospray negativo (- ESI) foram determinados como se segue: Capilar: 2.2 kV; Cone: 35 V; Extrator: 4 V; lentes RF: 1 V; Temperatura de origem: 120°C; Temperatura de dessolvação: 380° C; Gás de dessolvação: 600 LVh; Gás do cone: Desligado; Baixa resolução de massa: 15,0; Alta resolução de massa: 15,0; Energia iônica: 0,2; Multiplicador: 650. Experimento de EM de monitoramento iônico único foi ajustado para permitir detecção seletivamente para m/z 290,3, 210,3, 184,3, e 208,4. A m/z 208,4 é o íon [Μ- Η]" molecular desprotonado do d5-triptofano padrão interno.

Detecção de Precursor de Monatina por LC/EM/EM

Foram feitas separações por LC usando o sistema de cromatografia líquida Waters HPLC e uma coluna de cromatografia de fase reversa de 1,8 μm de 2,1 mm χ 50 mm Agilent Eclipse XDB- C18 com taxa de fluxo a 0,25mL/min.e as condicoes de gradiente sao como seque:

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Fase móvel A é 0,3% (v/v) de ácido fórmico com 10 mM de formato de amônio, e B é 0,3% de ácido fórmico com 10 mM de formato de amônio em 50:50 de metanol / acetonitrila. A temperatura da coluna foi 40°C.

Parâmetros sobre o espectrômetro de massa triplo quádruplo Waters Premier XE para experimentos de Monitoramento de Múltipla Reação LC/EM/EM (MRM) operando em modo de ionização por eletrospray negativo (-ESI) foram ajustados como se segue; Capilar: 3,0 kV; Cone: 25 V; Extrator: 3 V; lentes RF: 0 V; Temperatura de origem: 120s C; Temperatura de dessolvação: 350g C; Gás de dessolvação: 650 L/hr; Gás do cone: 47 L/hr; Baixa resolução de massa (Q1): 13,5; Alta resolução de massa (Q1): °C13,5; Energia iônica (Q1): 0.5 V; Entrada: 1 V; Energia de Colisão: 18 V; Saída 1: 19; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resolução de massa (Q2): 15; Energia tônica (Q2): 2,0; Multiplicador: 650. Quatro transições de MRM pai-para-filha foram monitoradas para detectar seletivamente precursor de Monatina (MP) e d5-precursor de Monatina (d5-MP); d5-MP foi usado como um padrão interno (I.S.). As quatro transições de MRM foram 290,1 a 184,1, 290,1 a 210,1, 290,1 a 228,1, e 295,1 a 189,1. Duas destas transições, 290,1 a 184,1 para MP, e 295,1 a 189,1 para d5-MP, foram usadas para gerar curvas de calibração e para fins de quantificação. Transições de 290,1 a 210,1 e 290,1 a 228,1 foram usadas como confirmação secundária qualitativa de MP.

Determinação de ácido pirúvico por HPLC com detecção do índice refrativo

Ácido pirúvico e outros ácidos orgânicos, tais como ácido a- cetoglutárico, foram determinados usando um sistema de cromatografia líquida de alta performance (HPLC) com um detector de índice refrativo. O sistema consistiu de um Waters 2690 e um detector de índice refrativo Waters 2414.

Em alguns casos, foi feita separação dos compostos usando uma coluna de exclusão tônica Aminex® HPX-87H, de 300 χ 7,8 mm com elutriação isocrática a 35 a 60°C. O eluente foi 0,01 N de ácido sulfúrico em água e a taxa de fluxo foi de 0,5 a 0,6 mUmin.. Amostras a serem analisadas foram diluídas em fase móvel para garantir que os ácidos estavam em forma não dissociada. As amostras foram analisadas depois de filtração através de filtros de 0,2 μm. O volume de injeção foi 10 μl. Uma curva padrão com boa linearidade foi construído para concentrações de ácido pirúvico entre 0,6 e 5 g/L para cada ácido.

Nos Exemplos descrevendo os processos a jusante, foram feitas separações por cromatografia líquida usando sistema de cromatografia líquida Waters 2690 e duas colunas de cromatografia de fase reversa 4,6 mm χ 250 mm Restek Aqueous Allure - C18 5,0 μm com taxa de fluxo a 0,8 mL / min.. A fase móvel foi tampão de fosfato a 50 mM (pH 2,5 com ácido fosfórico) e foi realizada sob condições isocráticas. As colunas foram mantidas em uma temperatura de 50°C. O detector de Rl foi rodado a 50°C com um cenário de sensibilidade de 32. Foi usada uma curva padrão de 500 a 2500 ppm.

Detecção de Indol-3-piruvato usando tetraborato de sódio

Este protocolo mede o complexo de borato da forma enólica de indol-3-piruvato.

Soluções padrão ou amostras de misturas da reação contendo indol-3-piruvato (0,005 mL) foram cada adicionadas a 0,2 mL de 50 mM de tetraborato de sódio (pH 8.5) contendo 0,5 mM de EDTA e 0,5 mM de arsenato de sódio em lâminas de microtítulo de 96 cavidades. As lâminas de microtítulo são em seguida incubadas a 30°C e a absorvência a 327 nm foi medida. Como a cor produzida não é estável, todas as medições foram feitas exatamente 30 min. depois da adição das soluções de indol-3-piruvato. lndol-3-piruvato a partir de 0 até 10 mM dissolvido em 100% de etanol foi usado para a curva padrão. Estas soluções foram armazenadas a -20°C entre os testes.

Análise HMO Usando o Método de Derivação de Hidroxilamina e UPLC/EM

Foi conduzida análise HMO primeiro removendo uma alíquota de uma amostra de reação bioquímica pré-diluída, e em seguida por derivação subseqüentemente empregando cloridreto de p-nitrobenzil hidroxilamina (NBHA) (preparado em piridina) por 25 min. em um banho de água em temperatura ambiente sonicando. Depois do processo de derivação estar completo, a mistura da reação foi adicionalmente diluída com água para um volume conhecido e submetida a cromatografia líquida de ultraperformance / espectrometria de massa (UPLC/EM). Foi incluído no sistema UPLC/EM um detector de arranjo de fotodiodo (PDA), ajustado para monitorar a região de comprimento de onda de 260 nm a 499 nm. Foram feitas separações por LC usando o sistema de UPLC Waters supracitado e uma coluna de cromatografia de fase reversa de 1,8 μm de 2,1 mm χ 100 mm Agilent Eclipse XDB- C18 ajustada para uma taxa de fluxo de 0,24 ml/min. e empregando as condições de gradiente como se segue: <table>table see original document page 66</column></row><table>

*A fase móvel A foi 0,3% (v/v) de ácido fórmico w/ 10 mM de formato de amônio, e B foi 0,3 % de ácido fórmico w/10 mM de formato de amônio em 50:50 de MeOH / acetonitrila. A temperatura da coluna foi 45°C.

Parâmetros sobre o espectrômetro de massa triplo quádruplo Waters Premier XE para experimento de modo de varredura de LC/EM operando em modo de ionização por eletrospray negativo (-ESI) foram ajustados como se segue: Capilar: 3,0 kV; Cone: 25 V; Extrator: 3 V; lentes RF: 0 V; Temperatura de origem: 120°C; Temperatura de dessolvação : 350°C; Gás de dessolvação: 650 UHr; Gás do cone: 47 L/Hr; Baixa resolução de massa (Q1): 13,5; Alta resolução de massa (Q1): 13,5; Energia iônica (Q1): 0,5 V; Entrada: 30 V; Energia de Colisão: 3 V; Saída 1: 30; Baixa resolução de massa (Q2): 15; Alta resolução de massa (Q2): 15; Energia iônica (Q2): 2,0; Multiplicador: 650. Foi usado um método de EM de faixa de varredura de massa de 120 m/z a 1000 m/z para identificação qualitativa de HMO-NBHA e derivados 2-oxoglutâmicos-NBHA. Quantificação de HMO- NBHA foi baseada na resposta molar de derivado 2-oxoglutâmico-NBHA medida em um comprimento de onda de 275 nm.

Exemplo 7. Expressão e Purificação de D-alanina aminotransferase de B. sphaericus

Crescimento celular e indução genérica foram realizados usando o sistema Overnight Express System Il (EMD Biosciences/Novagen; Madison, Wl). Todos os outros materiais foram os mesmos que aqueles usados na purificação de HIS6-HEXaspC aminotransferase. A clonagem do gene codificando D-alanina aminotransferase de B. sphaericus é descrita na Publicação de Patente dos Estados Unidos N- 2006/0252135, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência, no Exemplo 20.

A D-alanina aminotransferase de B. sphaericus com uma etiqueta de purificação de HIS6 de amino-terminal foi produzida usando o sistema Overnight Express System Il (soluções 1 a 6) contendo 50 pg/mL de canamicina em frascos de agitação. Este sistema de expressão induz a expressão de sistemas indutíveis por IPTG sem a necessidade de monitorar o crescimento celular. Depois de inoculação de alíquotas de 200 ml_ do meio (em frascos de 1 L) a partir de ou culturas líquidas ou estoques de glicerol de BL21(DE3):: B. sphaericus dat pET30a as culturas foram incubadas a 309 C de um dia para o outro com agitação a 225 rpm. Quando a OD6oo foi maior do que 6, as células foram colhidas por centrifugação em uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16.25 a 10.000 rpm por 10 minutos. O pélete celular foi lavado uma vez com tampão a frio e as células foram centrifugadas de novo. O pélete celular lavado foi colhido e usado imediatamente ou congelado a -80e C até necessário para purificação. Para preparar extrato livre de células contendo a proteína HIS6-D-alanina aminotransferase de B. sphaericus (HISe-BsphDAT), as células foram suspendidas em 3 a 4 volumes de fosfato de potássio a 50 mM, pH 7,8 contendo 50 μΜ de PLP, e em seguida rompidas usando um homogenizador Microfluidics (Newton, MA) (3 passagens a 137,9 MPa (20.000 psi)), mantendo a temperatura da suspensão abaixo de 15s C. Alternativamente, extratos celulares foram preparados usando o reagente de extração Novagen BugBuster (livre de amina primária) Extraction Reagent (EMD Bioscience; Madison, Wl) contendo 1 pL/mL de BenzonaseR Nuclease (EMD Bioscience), 5 pL/mL de Protease Inhibitor Cocktail Set Il (EMD Bioscience), e 0,33 pUrriL de rLysozyme™ (EMD Bioscience) seguindo o protocolo do fabricante. Em qualquer caso, os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação em uma centrífuga Beckman J25II com um rotor JS-25 a 15.000 rpm por 30 minutos, produzindo o extrato livre de células. Todas as etapas de purificação subsequentes da proteína com etiqueta de HIS6 foram realizadas a 4°C. O extrato livre de células de 600 mL de cultura Overnight Express II foi aplicado a 2 colunas de 40 a 45 mL contendo resina GE Healthcare (Piscataway, NJ) Chelating Sepharose™ Fast Flow (forma níquel(II)) que tinha sido previamente equilibrada com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 200 mM de cloreto de sódio e 50 μΜ de PLP. Depois de carregar a amostra, as colunas foram lavadas / eluídas sucessivamente com 3 a 5 volumes do tampão de equilibração, 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 25 mM de imidazol, 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 50 a 100 mM de imidazol e 3 a volumes do tampão de equilibração contendo 500 mM de imidazol. A proteína HIS6-BsphDAT elutriou na última lavagem. A lavagem de 500 mM de imidazol foi concentrada com um dispositivo de filtro centrífugo Amicon (Billerica, MA) Centricon-70 ou Ultra-15 (corte de peso molecular 10 kDa). O imidazol e cloreto de sódio foram removidos por passagem através de colunas de dessalgação GE Healthcare PD10 descartáveis previamente equilibradas com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 50 μΜ de PLP. A concentração de proteína da solução dessalgada foi determinada usando o kit de teste Pierce BCA (Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão na fração do extrato livre de células foram determinados usando um sistema de chip microcapilar Experion Pro260 Bio Rad (Hercules, CA) ou por SDS-PAGE com géis de gradiente de 4 a 15%. Tipicamente este procedimento produz mais de 300 mg de enzima (a partir de 600 mL de cultura Overnight Express II) que é -90% pura conforme julgado pelo software Experion. Alíquotas (de 1 a 5 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80°C até o uso.

Exemplo 8. Expressão e Purificação de aldolase

Materiais

Crescimento celular e indução genérica foram realizados usando o sistema Overnight Express System II (EMD Biosciences/Novagen; Madison, W1). Todos os outros materiais foram os mesmos que aqueles usados na purificação de HIS6-HEXaspC aminotransferase. A clonagem do gene codificando a aldolase é descrita na Publicação de Patente dos Estados Unidos Nq 2006/0252135 no Exemplo 3, a qual é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade (a aldolase conforme referido aqui, neste requerimento de patente, se correlaciona com a SEQ ID NO: 22 da referência).

A aldolase com uma etiqueta de purificação de HIS6 com amino- terminal foi produzida usando o sistema Overnight Express System Il (soluções 1 a 6) contendo 50 pg/mL de canamicina em frascos de agitação. Este sistema de expressão induz a expressão de sistemas indutíveis por IPTG sem a necessidade de monitorar o crescimento celular. Depois de inoculação de alíquotas de 200 mL do meio (em frascos de 1 L) a partir de ou culturas líquidas ou estoques de glicerol do constructo, as culturas foram incubadas a 30°C de um dia para o outro com agitação a 225 rpm. Quando a OD6OO foi maior do que 6, as células foram colhidas por centrifugação em uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16.25 a 10.000 rpm por 10 minutos. O pélete celular foi lavado uma vez com tampão a frio e as células foram centrifugadas de novo. O pélete celular lavado foi colhido e usado imediatamente ou congelado a -80°C até necessário para purificação. Extratos livres de células contendo a aldolase marcada com etiqueta de HIS6 foram preparados usando reagente de extração Novagen BugBuster (livre de amina primária) Extraction Reagent (EMD Bioscience; Madison, Wl) contendo 1 pL/mL de BenzonaseR Nuclease (EMD Bioscience), 5 pL/mL de Protease Inhibitor Cocktail Set Il (EMD Bioscience), de 0,33 pL/mL de rLysozyme™ (EMD Bioscience) seguindo o protocolo do fabricante. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação em uma centrífuga Beckman J25II com um rotor JS-25 a 15.000 rpm por 30 minutos, produzindo o extrato livre de células. Todas as etapas de purificação subsequentes da proteína com etiqueta de HIS6 foram realizadas a 4°C. O extrato livre de células de 800 mL de cultura Overnight Express Il foi aplicado a uma coluna de resina GE Healthcare (Piscataway, NJ) Chelating Sepharose™ Fast Flow (forma níquel(ll)) que tinha sido previamente equilibrada com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 200 mM de cloreto de sódio. Depois de carregar a amostra, a coluna foi lavada / eluída sucessivamente com 3 a 5 volumes do tampão de equilibração, 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 25 mM de imidazol, 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 50-100 mM de imidazol e 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 500 mM de imidazol. A aldolase com etiqueta de HIS6 elutriou na última lavagem. A lavagem de 500 mM de imidazol foi concentrada com um dispositivo de filtro centrífugo Amicon (Billerica, MA) Centricon-70 or Ultra-15 (corte de peso molecular 10 kDa). O imidazol e cloreto de sódio foram removidos por passagem através de colunas de dessalgação GE Healthcare PD10 descartáveis previamente equilibradas com fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 200 mM de cloreto de sódio e 4 mM de MgCI2. A concentração de proteína da solução dessalgada foi determinada usando o kit de teste Pierce BCA (Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão nas fração de extrato livre de células foram determinados usando um sistema de chip microcapilar Experion Pro260 Bio Rad (Hercules, CA) ou por SDS-PAGE com géis de gradiente de 4 a 15%. Tipicamente este procedimento de purificação produz 18 a 20 mg de enzima (a partir de 800 mL de cultura Overnight Express II) que é 85 a 90% puro conforme determinado pelo software Experion. Alíquotas (de 1 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80s C até o uso.

Exemplo 9. Produção biocatalítica em pequena escala de R,R-monatina a partir de D-triptofano e piruvato usando 2 etapas da reação

Materiais

Todos os reagentes foram de grau analítico ou do maior grau disponível comercialmente. A D-alanina aminotransferase marcada com etiqueta de HIS6 de B. sphaericus e a aldolase marcada com etiqueta de HIS6 usadas para catalisar a formação de R,R-monatina foram purificadas conforme descrito nos Exemplos 7 e 8.

Métodos e Resultados

Foi desenvolvido um protocolo em pequena escala para a produção biocatalítica de R,R-monatina a partir de D-triptofano e piruvato que exclui oxigênio das misturas da reação para minimizar a degradação catalisada por oxigênio do indol-3-piruvato intermediário. As reações enzimáticas foram realizadas em frascos de soro de vidro de 10 mL com rolhas e selos de alumínio.

Reação 1: Uma solução de 200 mM de piruvato de sódio, 4 mM de MgCI2, e 50 μΜ de PLP em fosfato de potássio, pH 7,8 foi preparada em um frasco de soro de 100 mL. O frasco foi arrolhado e selado, e em seguida o líquido foi purgado com nitrogênio por vários minutos. Alíquotas desta solução foram transferidas anaerobicamente para frascos de soro de 10 mL contendo D-triptofano sólido. Estes frascos de 10 mL tinham sido previamente fechados com rolhas e selos de alumínio e em seguida purgados com nitrogênio. Soluções enzimáticas foram adicionadas para uma concentração de 0,05 g/L para a aldolase marcada com etiqueta de HIS6 purificada e 0,5 g/L para a D-alanina aminotransferase marcada com etiqueta de HIS6 para iniciar as reações (7 mL de volume final). A concentração final de fosfato de potássio foi de 25 mM, incluindo a contribuição de tampão das soluções enzimáticas. A concentração final de D-triptofano foi de 100 mM. Os frascos da reação foram incubados em temperatura ambiente com suave agitação, amostragem 5 h e 20 h depois da adição das enzimas. A eficácia da estabilização enzimática do detergente Tween-80 foi determinada adicionando este detergente a 0,1% e 0,01% a algumas das misturas da reação. O progresso das reações foi seguido medindo D-triptofano, D-alanina, R,R-monatina, precursor de R-monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. As concentrações de triptofano, alanina, e monatina foram medidas utilizando o método de derivação pós-coluna por fluorescência. Todos os métodos analíticos são descritos no Exemplo 6.

Depois de incubação de um dia para o outro a proteína foi removida das misturas da reação por ultrafiltração usando dispositivos de filtro de centrífuga Amicon Ultra-15 (ponto de corte molecular 10 kDa).

Reação 2: As soluções desproteinizadas foram adicionadas a frascos de soro de 10 mL contendo D-alanina sólida. Estes frascos de 10 mL tinham sido previamente fechados com rolhas e selos de alumínio e em seguida purgados com nitrogênio. A HIS6-D-alanina aminotransferase foi em seguida adicionada em uma concentração final de 0,5 mg/mL para iniciar as reações (5 mL de volume final). A concentração final de D-alanina foi 1500 mM. Os frascos da reação foram incubados em temperatura ambiente com suave agitação, amostragem 4 h e 20 h depois da adição da enzima. O progresso das reações foi seguido medindo D-triptofano, D-alanina, R,R- monatina, precursor de R-monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4- oxo-pentanodióico), e ácido pirúvico. As concentrações de triptofano, alanina, e monatina foram medidas utilizando o método de derivação pós- coluna por fluorescência. A concentração de piruvato foi determinada usando o método de LC-RI e uma coluna Aminex® para separação. Todos os métodos analíticos são descritos no Exemplo 6. Tabela 3

<table>table see original document page 73</column></row><table> Exemplo 10. !mobilização de D-alanina aminotransferase de B. sphaericus

A D-alanina aminotransferase de Bacillus sphaericus foi purificada como a proteína marcada com etiqueta HIS6 conforme descrito no Exemplo 7.

A enzima foi imobilizada sobre contas de resina Eupergit® C250L de acordo com o procedimento de Mateo et al (2002). A 48 mg da enzima purificada (5,2 mL a 9,3 mg/mL) foi adicionado fosfato de potássio para uma concentração final de 0,5 M e pH de 7.8, fosfato de piridoxal (PLP) para uma concentração final de 0,05 mM. A solução resultante foi misturada com 0,4 g de resina Eupergit® C 250L adquirida da Sigma-Alrich (St. Louis, MO). A suspensão de enzima-resina foi incubada em temperatura ambiente com suave agitação de um dia para o outro. As contas de resina foram separadas da solução enzimática por centrifugação a 4000 χ g por 5 min.. O sobrenadante foi removido e a resina foi lavada com 3 χ 5 mL de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. A mistura foi centrifugada a 4000 χ g por 5 min. entre as lavagens. A quantidade de proteína ligada à resina foi determinada medindo a quantidade de proteína em cada lavagem e subtraindo a soma da quantidade original de proteína a ser imobilizada. As concentrações de proteína foram medidas usando um kit de teste Pierce BCA™ Protein Assay Kit com albumina sérica bovinea como o padrão (Rockford, IL). As contas de enzima imobilizada foram finalmente suspendidas em 3 mL de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 0,05 mM de PLP. Os grupamentos epóxi não reagidos das contas de enzima imobilizada foram bloqueados por incubação com 1,4 M de glicina em temperatura ambiente com suave agitação. Depois de 24 h, as contas foram lavadas com 4 χ 10 mL de EPPS a 50 mM, pH 8,4 contendo 0,05 mM de PLP para remover o excesso de glicina e foram finalmente ressuspendidas em 5 mL de EPPS a 50 mM, pH 8,4 contendo 0,05 mM de PLP. A concentração final de enzima imobilizada foi 66 mg de proteína por g de conta de resina.

Referência: Mateo, C., Abain, O., Fernandez-Lorente, G., Pedroche, J., Fernandez-Lafuente, R., Guisan, J.M., Tam, A., e Daminati, M., Biotechnology Progress 18(3): 629-634 (2002).

Exemplo 11. Clonagem do gene de aldolase de SEQ ID NO:1 que codifica a Aldolase de SEQ ID NO:2

O gene codificando a aldolase de SEQ ID NO: 2 (a seqüência de DNA do gene é mostrada como SEQ ID NO: 1) foi subclonado no vetor de expressão pET28b (EMD Biosciences/Novagen, Madison, Wl) com uma etiqueta de His de N-terminal para permitir a purificação da enzima. O gene também foi clonado em pET30a (nenhuma etiqueta).

Os iniciadores usados para clonagem são mostrados abaixo: Si-ATAAGACATATGCCTATCGTTGTTACGAAG-S' (sítjo de

restrição Nde I) (SEQ ID NO:5) e

Si-Ataagaggatccttattcctcgggcagccgctc-S' (síti0

de restrição BamH I) (SEQ ID NO:6).

Um clone contendo SEQ ID NO: 1 foi recebido da Diversa Corporation, San Diego, CA, e usado como um modelo para PCR. No entanto, a SEQ ID NO: 1 pode ser reconstruída por outros métodos de conhecimento de uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, a SEQ ID NO:1 pode ser reconstruída utilizando métodos de PCR de montagem. A SEQ ID NO:1 foi amplificada por PCR, digerida com as enzimas de restrição Nde Ie BI, e purificada a partir de um gel agarose (QIAquick® Gelextraction Kit (Qiagen, Valencia, CA)). O digesto foi ligado em pET28b (EMD Biosciences/Novagen Madison, Wl) e pET30a que tinha sido digerido com Nde I e BamH I e purificado por gel. A ligação foi transformada em células TOPIO de E. coli (Invitrogen, Carlsbad, CA). Plasmídeo de DNA de colônias foi analisado para a presença de insertos por comparação de tamanho usando eletroforese por gel agarose. Isolados com um inserto do tamanho previsto foram submetidos a análise de seqüência de DNA (Agencourt, Beverly, MA).

A seqüência de DNA da SEQ ID NO: 1 do gene que codifica a aldolase de SEQ ID NO: 2 é mostrada abaixo: atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga aaggatcgcc gcctatggtg tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa ccgggttgat ggcgtccaat atgcgcccaa tctatcgccc tgcgcacatt gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg cctggcgaca attggatgat ccatgtcgcc gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg gtcgtggtac cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg gcgatctgct ggcgacctcg ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga tatcgcgaca ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt tcgcgcaagg aacggtcaag gagaccatcg ccagcgtcaa ígtgcccctc gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc gatctgatcg ttgccgacga cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg gtcctttcca gcgccgaggc ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa getggegage tgggcctcga cgtctacaac atgcgccagc gcctggccga caagggcttg cgctaígtcg agcggctgcc cgaggaatag (SEQID NO:.1).

A seqüência de proteína da aldolase de SEQ ID NO: 2 é como

se segue:

Met Pro Ile Yal Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val Glu Arg IIe Ala Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly Arg Thr Gly Leu Met Afa Ser Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala His IIe Ala Gly Pro Ala Val Thr Cys Leu Val Ala Pro Gly Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly Asp Val Leu Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Leu Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys Gly Leu Ile Ile Glu Ala Gly Val Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys Phe Pro Val Trp Ser Lys Ala Val Phe Ala Gln GIy Thr Val Lys Glu Thr Ile Ala Ser Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala GIy Ala Arg Ile Val Pro Gly Asp Leu IIe Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val Iie Pro Arg Arg Ser Val Pro Aia Val Leu Ser Ser Ala Glu Ala Arg Giu Glu Lys Glu Ala Arg Asn Arg Ala Arg Phe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val Tyr Asn Met Arg Gln Arg Leu Ala Asp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu Arg Leu Pro Glu Glu (SEQ ID N0:2).

Exemplo 12. Purificação de aldolase de SEQ ID N0:2

Crescimento celular e indução genética foram realizados usando o sistema Overnight Express System Il (EMD Biosciences/Novagen; Madison, Wl). Todos os outros materiais foram os mesmos que aqueles usados na purificação de HIS6-HEXaspC aminotransferase.

A clonagem do gene codificando a aldolase de SEQ ID NO: 2 é descrita no Exemplo 11.

A aldolase de SEQ ID NO: 2 com uma etiqueta de purificação de HIS6 de amino-terminal foi produzida usando Overnight Express System Il (soluções 1 a 6) contendo 50 pg/mL de canamicina em frascos de agitação.

Depois de inoculação de alíquotas de 200 ml_ do meio (em frascos de 1 L) ou de culturas líquidas ou de estoques de glicerol do constructo pET28b, as culturas foram incubadas a 30Q C de um dia para o outro com agitação a 225 rpm. Quando a OD6oo foi maior do que 6, as células foram colhidas por centrifugação em uma centrífuga Beckman (Fullerton, CA) J25II com um rotor JS-16.25 a 10.000 rpm por 10 minutos. O pélete celular foi lavado uma vez com tampão a frio e as células foram novamente centrifugadas. O pélete celular lavado foi colhido e usado imediatamente ou congelado a -80Q C até ser necessário para purificação. Extrato livre de células contendo a aldolase de SEQ ID NO: 2 com etiqueta de HIS6 foi preparado usando reagente de extração Novagen BugBuster (livre de amina primária) (Extraction Reagent, EMD Bioscience; Madison, Wl) contendo 1 pL/mL de Benzonase® Nuclease (EMD Bioscience), 5 pUmL de Protease Inhibitor Cocktail Set Il (EMD Bioscience), e 0,33 pL/mL de rLysozyme™ (EMD Bioscience) seguindo o protocolo do fabricante. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação em uma centrífuga Beckman J25II com um rotor JS-25 a 15.000 rpm por 30 minutos, produzindo o extrato livre de células. Todas as etapas de purificação subsequentes da proteína com etiqueta de HIS6 foram realizadas a 4e C. O extrato livre de células de 2 χ 200 mL de cultura Overnight Express Il foi aplicado a uma coluna de resina GE Healthcare (Piscataway, NJ) Chelating Sepharose™ Fast Flow (forma de níquel(ll)) que tinha sido previamente equilibrada com 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8, contendo 200 mM de cloreto de sódio. Depois de carregar a amostra, a coluna foi lavada / eluída sucessivamente com 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 25 mM de imidazol, 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 50 a 100 mM de imidazol e 3 a 5 volumes do tampão de equilibração contendo 500 mM de imidazol. A aldolase de SEQ ID NO:2 com etiqueta de HIS6 elutriou na última lavagem. A lavagem de 500 mM de imidazol foi concentrada com um Amicon (Billerica, MA) Centricon-70 ou dispositivos de filtro de centrífuga Ultra-15 (CORTE DE PESO MOLECULAR 10 kDa). O imidazol e o cloreto de sódio foram removidos por passagem através de colunas de dessalgação GE Healthcare PD10 descartável previamente equilibradas com 100 mM de fosfato de potássio, pH 7,8. A enzima foi menos solúvel (julgado pela turvação da solução de proteína) depois da etapa de dessalgação se 4 mM de MgCI2, 200 mM de NaCI, e/ou 0,01% de Tween-80 foram adicionados ao tampão de elutriação. A concentração de proteína da solução dessalgada foi determinada usando o kit de teste Pierce BCA (Rockford, IL). A pureza de cada fração e o nível de expressão na fração de extrato livre de células foram determinados usando um sistema de chip microcapilar Bio Rad (Hercules, CA) Experion Pro260 ou por SDS-PAGE com géis de gradiente de 4 a 15%. Tipicamente este procedimento de purificação produz cerca de 50 a 80 mg de enzima (a partir de 400 mL de cultura Overnight Express II) que é 85 a 90% pura conforme determinado pelo software Experion. Alíquotas (1 mL) da enzima purificada foram armazenadas a -80°C até o uso.

Exemplo 13. !mobilização de aldolase de SEQ ID NO:2

A aldolase de SEQ ID NO: 2 foi purificada como a proteína com etiqueta de HIS6 conforme descrito no Exemplo 12.

A enzima foi imobilizada sobre contas de resina Eupergit® C de acordo com o procedimento de Mateo et al. (2002). A 20,4 mg da enzima purificada (14,1 mL a 1,45 mg/mL) foi adicionado fosfato de potássio para uma concentração final de 0,5 M e pH de 7.8 e uma concentração final de MgCI2 de 1 mM. A solução resultante foi misturada com 0,2 g de resina Eupergit® C 250L adquirida da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). A suspensão de enzima-resina foi incubada em temperatura ambiente com suave misturação de um dia para o outro. As contas de resina foram separadas da solução de enzima por centrifugação a 4000 χ g por 5 min.. O sobrenadante foi removido e a resina foi lavada com 3 χ 5 mL de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 1 mM de MgCI2. A mistura foi centrifugada a 4000 χ g por 5 min. entre as lavagens. A quantidade de proteína ligada à resina foi determinada conforme descrito para a imobilização da aminotransferase de Bacillus sphaericus descrita no Exemplo 10. As contas de enzima imobilizada lavadas foram finalmente suspendidas em 3 mL de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8 contendo 1 mM de MgCI2. Os grupamentos epóxi não reagidos das contas de enzima imobilizada foram bloqueados por incubação com 1,4 M de glicina em temperatura ambiente com suave agitação. Depois de 24 h, as contas foram lavadas com 4 χ 10 mL de EPPS a 50 mM, pH 8,4 contendo 1 mM de MgCI2 para remover o excesso de glicina e foram finalmente ressuspendidas em 5 mL de EPPS a 50 mM, pH 8,4 contendo 1 mM de MgCI2. A concentração final de enzima imobilizada foi 90 mg de proteína por g de conta de resina.

Exemplo 14. Expressão de aldolase de SEQ ID NO:2 clonada sem uma etiqueta de purificação

O gene de SEQ ID NO: 1 foi subclonado usando procedimentos de biologia molecular rotina em um derivado do vetor pET23d (Novagen, Madison, Wl) contendo o gene metE de E. coli e promotor inserido no sítio de restrição NgoMWf e um segundo sítio de restrição ps/7 que foi adicionado para fácil remoção do gene beta lactamase (bla). A construção deste vetor contendo um inserto para um gene myo-inositol oxigenase é descrita na publicação de patente internacional N5 PCT WO 2006/066072 nos Exemplos 2 e 20. O inserto de aldolase foi confirmado por sequenciamento de DNA (Agencourt Bioscience Corporation; Beverly, MA) e o plasmídeo com a seqüência de inserto correto foi transformado no hospedeiro de expressão de E. coli BW30384(DE3)AompTAmetE. A construção deste hospedeiro de expressão e o protocolo de transformação também são descritos na publicação de patente internacional Nq PCT WO 2006/066072 (Exemplos 21 e 22). O gene aldolase foi expressado por indução com Iactose em um fermentador de 3 L. O protocolo para a indução é descrito no Exemplo 1. Para preparar extrato livre de células contendo a aldolase, as células foram suspendidas em 3 a 4 volumes de fosfato de potássio a 100 mM, pH 7,8, contendo 1 mM de MgCI2 e em seguida rompidas conforme descrito no Exemplo 2. Os fragmentos celulares foram removidos por centrifugação a 20.000 a 25.000 χ g por 30 minutos a 4°C. As proteínas solúveis nos extratos livres de células foram separadsa em uma estação de eletroforese automática Bio-Rad Laboratories Experion™ (Automated Electrophoresis Station, Bio-Rad, Hercules, CA) e analisadas para percentagem de expressão de proteínas solúveis usando o Software Experion ou por eletroforese por gel de poliacrilamida SDS usando géis de gradiente de 4 a 15%.

Exemplo 15. Produção biocatalítica de R,R-monatina a partir de D-triptofano e piruvato usando uma reação de 2 etapas em um pequeno fermentador

Materiais

Todos os reagentes foram de grau analítico ou o maior grau disponível comercialmente. A D-alanina aminotransferase usada na produção biocatalítica de R,R-monatina foi adquirida da Biocatalytics, Inc. (Pasadena, CA) (n° do catálogo AT-103) ao passo que a aldolase de SEQ ID NO:2 usada na produção foi preparada conforme descrito no Exemplo 14.

Métodos e Resultados

Uma reação de 2 etapas foi realizada a 250 mL em um biorreator de 0,7 L INFORS (Bottmingen, Suíça). A reação foi mantida a pH 8,4 e 25°C sob um espaço superior de nitrogênio.

Mistura 1 (Primeira Mistura de Reação): Uma solução de 25 mM de EPPS, pH 8,4, 1 mM de MgCI2, 5 mM de fosfato de potássio e 50 μΜ de piridoxal fosfato (PLP) foi preparado no fermentador. O líquido foi aspergido com nitrogênio por vários minutos antes das adições de 200 mM de piruvato de sódio e 100 mM de D-triptofano como sólidos. O pH foi ajustado para 8.4 com hidróxido de sódio depois da adição dos substratos e antes da adição das enzimas. A D-alanina aminotransferase foi adicionada como um sólido para uma concentração final de 2 mg/mL e a aldolase foi adicionada como um extrato livre de células para uma concentração final de 0,01 mg/mL (volume final de 250 mL depois da adição de enzimas e substratos). A mistura da reação foi incubada a 25°C com agitação a 250 rpm sob um espaço superior de nitrogênio. O progresso da reação foi seguido medindo D-triptofano, D-alanina, R,R-monatina, precursor de R-monatina (ácido 2- hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. As concentrações de triptofano e alanina foram medidas utilizando o método de derivação pós-coluna de fluorescência. Monatina foi quantificada usando o método de LC/EM/EM. Todos os métodos analíticos são descritos no

Exemplo 6.

Ultrafiltração: Depois de incubação de um dia para o outro a proteína foi removida da mistura da reação por ultrafiltração usando uma cápsula de ultrafiltração de 50 cm2 Millipore Pellicon® (corte de peso molecular 10.000) (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Oxigênio foi excluído durante o processo mantendo uma atmosfera de nitrogênio no fermentador original e em um segundo fermentador que recebeu o permeado.

Mistura 2 (Segunda Mistura da Reação): 2: À solução desproteinizada (cerca de 230 mL) foi adicionada D-alanina para uma concentração final de 1 Mea D-alanina aminotranferase para uma concentração final de 2 mg/ml_. A reação foi incubada a 25° C com agitação a 250 rpm sob um espaço superior de nitrogênio. O progresso da reação foi seguido conforme descrito acima para a Mistura 1.

Tabela 4: Produção de R.R-monatina usando uma reação de 3 etapas para aumentar o título de monatina em um pequeno fermentador

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Os resultados mostram que o processo de 2 etapas aumenta o título de monatina mais de 2 vezes quando o processo é realizado na escala de 250 mL.

Exemplo 16. Produção biocatalítica em pequena escala de R.R-monatina a partir de D-triptofano e piruvato usando 2 etapas da reação e enzimas imobilizadas

Materiais

A D-alanina aminotransferase marcada com etiqueta HIS6 de B. sphaericus e a aldolase SEQ ID NO:2 marcada com etiqueta HIS6 usadas para catalisar a formação de R,R-monatina foram imobilizadas conforme descrito nos Exemplos 10 e 13. As reações foram determinadas e realizadas em uma câmara anaeróbica Coy com uma atmosfera de 97 a 98% de nitrogênio e 2 a 3% de hidrogênio para minimizar a degradação catalisada por oxigênio dos intermediários da reação. Métodos e Resultados

Reação 1: Uma solução de 100 mM de piruvato de sódio, 1 mM de MgCI2, e 50 μΜ de PLP em 50 mM de EPPS, pH 8,4 foi preparada usando H2O degaseificada em uma câmara anaeróbica Coy. A esta solução foi adicionado D-triptofano sólido para uma concentração final de 50 mM. Soluções enzimáticas imobilizadas foram adicionadas às reações a 0,05 g/L para a aldolase de SEQ ID NO:2 imobilizada e 2 g/L para a aminotransferase imobilizada (4 mL de volume final). A mistura da reação foi incubada em temperatura ambiente com suave mistura. O progresso das reações foi seguido medindo as concentrações de D-triptofano, D-alanina, R1R- monatina, precursor de R-monatina (ácido 2-hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4- oxo-pentanodióico) e ácido pirúvico. Todos os métodos analíticos são descritos no Exemplo 6. Para monatina, foi utilizado o método de LC/EM/EM. Para triptofano e alanina, foi utilizado o método de derivação pós-coluna de fluorescência. Para análise de piruvato, a coluna Aminex®foi utilizada para a separação.

Depois da incubação de um dia para o outro, as enzimas imobilizadas foram removidas da mistura da reação por filtração através de um filtro de seringa de 0,45 mícron.

Reação 2: D-alanina sólida foi adicionada ao material filtrado para uma concentração final de 1 M e aminotransferase imobilizada para uma concentração de 2 g/L de proteína (volume final de 5,1 mL). A mistura da reação foi incubada em temperatura ambiente com suave mistura. O progresso das reações foi seguido por análises HPLC e/ou LC-EM, medindo D-triptofano, D-alanina, R,R-monatina, precursor de R-monatina (ácido 2- hidróxi-2-(1H-indol-3-ilmetil)-4-oxo-pentanodióico), e ácido pirúvico. Tabela 5: Produção em pequena escala de R,R-monatina usando 2 etapas da reação e enzimas imobilizadas

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Os resultados mostram um aumento de 2 vezes no título de monatina quando foi usado um processo de reação de 2 etapas. Pela adição de excesso de D-alanina e a presença de somente a enzima D- aminotransferase na segunda etapa, cerca de 5,3 mM de precursor de monatina foi convertido para monatina e cerca de 28 mM de indol-3-piruvato foi convertido para triptofano.

Exemplo 17. Ultrafiltração

Materiais

Quantidades de três litros de mistura da reação foram preparadas sob condições anaeróbicas em 5 L de fermentadores Biostat B da Sartorius BBI Systems (Bethlehem, PA). A reação padrão continha 25 mM de fosfato de potássio (pH 7,8), 4 mM de cloreto de magnésio, 0,05 mM de PLP1 0,01% de Tween 80, 200 mM de piruvato de sódio e 100 mM de L- triptofano. À solução acima foi adicionada aminotransferase HEXaspC não purificada e proA aldolase de Comamonas testosteroni purificada a 0,5 e 0,05 g/L, respectivamente. As reações foram realizadas sob um espaço superior de nitrogênio a 30 0C e 250 rpm a pH 7,8. Depois de 3 a 5 horas foram acrescentados um adicional de 100 mM de piruvato de sódio e 50 mM de L-triptofano. As reações foram interrompidas depois de 18 a 24 horas e mantidas anaerobicamente a 4 0C antes de ultrafiltração. A ultrafiltração foi operada sobre um unidade de membrana de chapa plana de fluxo cruzado SEPA CFII fabricada pela GE Osmonics. Um exemplo dos tipos de membranas testados foi uma chapa plana de corte de peso molecular de 30 kDa Nadir C30 com uma área superficial de 150 cm2 (Microdyn-Nadir Gmbh1 Wiesbaden, Alemanha). Os reciepientes foram desenhados para facilitar jateamento e bloqueio de nitrogênio para minimizar a decomposição de intermediários sensíveis a oxigênio.

Métodos e Resultados

Foi conduzida análise de monatina, alanina, triptofano, piruvato, I3P, e MP antes e depois da operação UF. As concentrações de monatina e triptofano foram medidas usando o método LC-UV/Vis descrito no Exemplo 6. A análise de MP foi semiquantitativa, usando o mesmo método LC-UV/vis e uma curva padrão. Alanina foi quantificada usando o método de derivação pós-coluna à base de fluorescência descrito no Exemplo 6. A análise de indol-3-piruvato foi qualitativa, com base na área de pico de indol-3-piruvato comparado com triptofano no Exemplo 6. A taxa de fluxo para a operação UF foi determinada em aproximadamente 0,6 gpm. Retropressão sobre o fluxo de retorno foi continuamente ajustado para permanecer na faixa de 0,34 a 1,30 MPa (50 a 150 psi). As concentrações dos analisados estão listadas na Tabela 6. A corrente de concentrado foi rediluída com água para enxaguar o sistema e permitir análise mais precisa.

Tabela 6: Concentração de analisados

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A ração foi concentrada 8 vezes e as recuperações de todos os componentes foram excelentes. Análise SDS-PAGE do permeado demonstrou remoção completa de componentes de proteína.

Exemplo 18. Permuta aniônica

Materiais

Um volume embalado de 43 mL de resina ZGA313 originada da Itochu Chemicals America, Inc. na forma de acetato foi usado para purificação por permuta aniônica de monatina. Uma pseudo solução contendo triptofano, alanina, e monatina, em proporções similares às observadas depois de tratamento de permuta catiônica da bioreação, foi usada como a matéria-prima. Acetato de potássio de grau reagente foi usado como um eluente em uma solução a 3 M.

Métodos e Resultados

A solução foi carregada, e enxaguada com água deionizada a 2,5 mL/min. antes de elutriar na mesma taxa. Os resultados estão listados na Tabela 7. Uma capacidade de carga de único lote conservativo foi calculada como sendo 0,1 g de monatina por mL de resina embalada. Foi observada excelente pureza e recuperação de monatina. Uma pequena quantidade de monatina lavada completamente sem ligação e uma fração de alanina não foi completamente enxaguada da coluna antes da elutriação começar. Os analisados foram medidos conforme descrito no Exemplo 17.

Tabela 7: Resultados

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Exemplo 19. Purificação de membrana característica

Materiais

Três L de permeado de ultrafiltração livre de proteína foram usados como matéria-prima. O pH foi ajustado para 7,36 com HCI. A membrana foi operada sobre uma unidade de membrana de chapa plana de fluxo cruzado SEPA CFII fabricada pela GE Osmonics. Um exemplo dos tipos de membranas testados foi denominado NP fabricado pela ITT Aquios- PCI Membrane Systems, Inc. (Basingstoke, Reino Unido). Foi testado como uma chapa plana com uma área superficial de 150 cm2. Foram designados recipientes para facilitar jateamento de nitrogênio e bloqueio para minimizar a decomposição de oxigênio.

Métodos e Resultados

Análise de monatina, alanina, triptofano, piruvato, I3P, e MP foi conduzida em cada etapa da operação de membrana usando os métodos descritos no Exemplo 17. Três diafiltrações foram realizadas depois da concentração inicial. A taxa de fluxo para a operação de membrana foi ajustada em aproximadamente 0,4 gpm. A retropressão sobre o fluxo de retorno foi ajustada continuamente para permanecer na faixa de 0,7 a 2,75 MPa (100 a 400 psi). As concentrações dos analisados estão listadas na Tabela 8. Os fluxos de concentrado foram rediluídos com água para enxaguar o sistema e permitir análise mais acurada.

Tabela 8: Concentração de analisados

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A membrana NP apresentou forte rejeição de monatina e rápido desgaste das moléculas menores como alanina e piruvato. Isto a torna um bom candidato para reduzir significativamente a carga de alanina sobre opções de purificação a jusante. Além disso, as condições brandas são ideais para reciclagem dos vários componentes enquanto evitando decomposição. Outras opções de membrana promissoras incluem NF270 (FilmtecTM, the Dow Chemical Company, Midland, Michigan) e NFB (ITT Aquios-PCI Membrane Systems, Inc. (Basingstoke, Reino Unido).

Exemplo 20. Separação de SDVB

Materiais

O material de alimentação consistiu em uma pseudo solução de monatina, triptofano, alanina, e piruvato com concentrações listadas na Tabela 9. Uma resina adsorvente de SDVB sintética HP21 fabricada pela Mitsubishi foi usada para purificar monatina a partir da mistura. Etanol de grau reagente e água deionizada foram usados como eluentes. O volume embalado da coluna foi 98,7 ml com dimensões de 1,5 cm de diâmetro por 55,9 cm de altura.

Métodos e Resultados:

Absorvência a 280 nm foi usada para rastrear as frações de elutriação e seleção. A taxa de fluxo foi ajustada a 2,5 ml/min.. A resina foi equilibrada com água ajustada para pH 8,5 com hidróxido de sódio. Quatro frações foram coletadas para análise e são listadas na Tabela 9. A coluna foi lavada com água deionizada através das três primeiras frações. A fração final, contendo essencialmente triptofano, foi eluída com etanol aquoso a 10%.

Tabela 9: Concentração de analisados

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O desafio primário é a separação de monatina de alanina neste cenário, particularmente dado um esquema de duas reações onde o excesso de alanina é usado para impelir adicionalmente a reação. O dimensionamento de coluna apropriado será crucial para esta separação. É possível que outro tipo similar de resina de SDVB venha a oferecer melhores capacidades e aumento da separação. Possibilidades incluem SP70 ou SP850 ambas da Mitsubishi, ou outras ainda a serem testadas. O uso de 10% de etanol acelera a elutriação de triptofano. Pode ser possível carregar permeado UF diretamente sobre uma coluna de SDVB eliminando outras etapas de purificação, mas a capacidade relativa da coluna será sacrificada.

Comparativamente, o uso de uma resina SDVB para dessalgar o eluente da resina aniônica possibilita taxas de carga muito elevadas conforme pode ser visto na Tabela 10. Tabela 10: Resultados de dessalqacão

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Para o uso de dessalgação, resina SP70 da Mitsubishi foi embalada em uma coluna de 103 mL com dimensões de 1,5 cm por 58,4 cm. Foram observadas excelentes recuperações e capacidades. A fração final foi eluída com etanol aquoso a 50% para reduzir o arrastamento do pico. Boa separação do sal permitiu que fosse coletada e recuperada uma fração muito pura de monatina.

Exemplo 21. Eletrodiálise

Materiais

Uma unidade de eletrodiálise em escala laboratorial foi utilizada para este teste. Todos os produtos químicos foram de grau de reagente. Anólito e católito foram soluções a 1 M de bicarbonato de sódio. A solução do concentrado foi uma solução de cloreto de sódio a 0,1%. As membranas usadas foram AMX e CMX. As membranas de eletrodos foram membranas Nafion. A pressão da alimentação foi ajustada para menos de 6,9 kPa (1 psi). A operação durou 80 minutos e foi interrompida quando a voltagem começou a subir rapidamente. A corrente foi reduzida para reduzir o potencial duas vezes durante a operação. O pH da alimentação foi ajustado para 7,4 e aumentou ligeiramente para 7,7 enquanto o pH do concentrado acabou em 7,2. As concentrações dos quatro analisados usados para a alimentação estão listadas na Tabela 11 (medidas conforme descrito no Exemplo 17).

Métodos e Resultados

Análise final do restante da massa mostrou que piruvato foi a única molécula transportada a qualquer grau significativo. Os outros três analisados foram adsorvidos à membrana durante a operação e foram lixiviados livres durante a fase de experimentação da eficiência. Presumiu-se que apesar de experimentação com as membranas de maior difusividade disponíveis, a maioria das moléculas eram grandes demais para serem transportadas através da membrana, monatina em particular. Vários outros pH's e membranas foram testados com resultados similares. Não obstante, a capacidade para separar seletivamente concentrações significativas de piruvato torna isto uma opção interessante ao planejar um método de processamento a jusante. Como a alanina é de tamanho muito similar ao piruvato, espera-se que se possa achar uma membrane a qual permitiria a difusão de alanina através da membrana sob as condições apropriadas.

Tabela 11

<table>table see original document page 89</column></row><table>

Exemplo 22. Permuta de Cátions

Pode-se imaginar um método permitindo a purificação de monatina a partir dos outros componentes da reação, inclusive outros aminoácidos, usando uma resina de permuta de cátions forte em uma única etapa. Uma resina de permuta de cátions ácidos forte sob a forma de ácido é a resina preferencial. Mistura da reação desproteinizada é carregada e os compostos de ácido orgânico são lavados, deixando somente os aminoácidos ligados à coluna. Um gradiente de etapas é usado para elutriar os aminoácidos separadamente com base na diferença nos pontos isoelétricos. O gradiente de etapas pode consistir de um tampão cítrico ou tampão de fosfato, com etapas em pH 2,5, 3, 3,1, e 4. Como o pl de monatina é aproximadamente 3.9 enquanto que triptofano e alanina têm um pl que é mais próximo de 6, monatina deve elutriar primeiro. Por exemplo, vide MCI GEL® Technical Information 2004-2005, Mitsubishi Chemical Corporation, página 7.

Exemplo 23. Permuta de Cátions

Materiais: Coluna de 7,5 cm de diâmetro foi embalada com 950 ml de volume embalado de resina de permuta de cátions AG50Wx8 sob a forma de prótons. AG50Wx8 é fabricada pela Rohm and Haas (Philadelphia, PA) e foi originada da Bio-Rad (Hercules, CA). Um litro de uma biomistura da reação ultrafiltrada foi introduzida na coluna em uma taxa de fluxo de 140 mL/min.. Água deionizada foi usada como uma lavagem. A coluna foi eluída usando 1 M de hidróxido de potássio.

Métodos e Resultados: Depois da etapa de carga de um litro de alimentação, 44,6 litros de água foram usados para lavar a coluna até a absorvência a 280 nm ser suficientemente reduzida. Em seguida, a coluna foi eluída com 1 M de KOH para um volume coletado total de 14,7 litros. A análise dos vários analisados é listada na Tabela 12.

Tabela 12

<table>table see original document page 90</column></row><table> Etapas adicionais podem adicionalmente purificar componentes do eluído. Exemplo 24. Permuta de Ânions

Monatina é purificada a partir de uma mistura da reação, por exemplo, a descrita no Exemplo 17 para S,S-monatina, usando uma resina de permuta aniônica forte em uma única etapa. Uma resina de permuta aniônica forte, tal como ZGA313 (Itochu Chemicals America, Inc) sob a forma de bicarbonato, é a resina preferencial. Mistura da reação desproteinizada é carregada sobre uma coluna de tamanho apropriado em pH 7-8. Os aminoácidos não carregados, tais como alanina e triptofano, não ligam e são lavados com água. As moléculas com uma carga negativa em pH 7-8 são retidas sobre a coluna. Estas incluem monatina, ácido 4-hidróxi- 4-metil glutâmico, ácido 4-hidróxi-4-metil-oxoglutárico, ácido pirúvico, ácido indol-3-pirúvico, e precursor de monatina. Em pH 7-8, usando um gradiente salino linear (tal como bicarbonato de amônio a partir de 0 a 2 M), se esperaria que monatina elutriasse antes dos ácidos orgânicos (por exemplo, ácido pirúvico, ácido 4-hidróxi-4-metil oxoglutárico, precursor de monatina e ácido indol-3-pirúvico). Interações hidrofóbicas entre a porção indol de monatina e a espinha dorsal da resina, devem retardar a elutriação de monatina e permitir separação seletiva de monatina a partir de ácido 4- hidróxi-4-metil glutâmico. As frações de cromatografia podem ser analisadas usando os métodos descritos no Exemplo 6.

Modificações adicionais para a invenção descrita serão evidentes para os versados na técnica sem se afastar do espírito e do âmbito da invenção. Por exemplo, embora ultrafiltração seja indicada como uma etapa preferencial no processo, também são possíveis outros processos de filtração que separam as enzimas de maior peso molecular do restante dos constituintes da reação, tais como filtração por gel ou cromatografia de exclusão de tamanho. E, a seleção de enzimas específicas e constituintes específicos pode ser variada entre aqueles identificados aqui, neste requerimento de patente. As quantidades específicas de reagentes podem ser variadas, assim como as quantidades recicladas e o número de reciclos para melhorar a eficiência do processo global.

Claims (40)

1. Método, compreendendo: a) possibilitar que uma primeira composição compreendendo um ou mais reagentes e um ou mais primeiros facilitadores reaja para formar uma quantidade de monatina e uma quantidade de um ou mais intermediários em um caminho de equilíbrio multietapa, em que o caminho compreende uma reação produtora de monatina e uma reação Iimitante que limita a quantidade de no mínimo um dos um ou mais intermediários disponíveis para a reação produtora de monatina; b) remover, inibir, inativar, ou degradar o um ou mais facilitadores depois de um período de tempo desejado formando uma segunda composição; e, c) produzir uma quantidade adicional de monatina: adicionando um segundo facilitador à segunda composição, em que o facilitador da segunda composição pode ser o mesmo que no mínimo um dos primeiros facilitadores; ou desinibir ou reativar um ou mais dos primeiros facilitadores envolvidos na reação produtora de monatina; ou combinações dos mesmos; e adicionar um componente na segunda composição para impelir a reação produtora de monatina para diante.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o período de tempo desejado é o tempo necessário para atingir o equilíbrio em a).

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido componente pode ser o mesmo que no mínimo um dos um ou mais reagentes de a) ou pode ser o mesmo que um composto produzido na etapa a).

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido método adicionalmente compreende: purificar a referida monatina da referida segunda composição e formar uma mistura de purificação da reação.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida remoção, inibição, inativação, ou degradação compreende remover tudo do um ou mais facilitadores.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida remoção é selecionada entre um ou mais de filtração, cromatografia, e extração.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a referida filtração é ultrafiltração.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a referida cromatografia é selecionada entre cromatografia de exclusão de tamanho, de permuta iônica, e de afinidade.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que no mínimo um dos um ou mais reagentes é um aminoácido e no mínimo um dos um ou mais reagentes é um aceitador de grupamento amino, e o referido um ou mais primeiros facilitadores compreende dois ou mais facilitadores.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido aminoácido é L-triptofano, D-triptofano, ou misturas dos mesmos.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, em que um dos dois ou mais facilitadores é o segundo facilitador.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido aceitador de grupamento amino é piruvato, oxaloacetato, alfa-cetoglutarato, ou misturas dos mesmos.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o referido aceitador de grupamento amino reaje produzindo um doador de grupamento amino escolhido entre alanina, aspartato, e glutamato.

14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido um ou mais primeiros facilitadores é escolhido entre enzimas, catalisadores inorgânicos, e RNA.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que as referidas enzimas são escolhidas entre aminotransferases, racemases, e aldolases.

16. Método de acordo com a reivindicação 4, em que o referido aceitador de grupamento amino é piruvato, o aceitador de grupamento amino reaje produzindo alanina, o componente em c) também é alanina, e o método adicionalmente compreende reciclar alanina da mistura de purificação da reação para a segunda composição, e opcionalmente para a primeira composição.

17. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o componente é alanina.

18. Método de acordo com a reivindicação 4, adicionalmente compreendendo separar no mínimo uma porção da alanina da segunda composição depois de um período de tempo desejado e reciclar a alanina separada para a primeira composição.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido facilitador da etapa c) é uma aminotransferase.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referida monatina é R1R monatina, S1S monatina, R1S monatina, S1R monatina, ou misturas das mesmas.

21. Método de acordo com a reivindicação 20, em que a referida monatina é R,R monatina.

22. Método para fabricar monatina em um caminho de equilíbrio multietapa, o referido método compreendendo: a) produzir monatina em uma mistura da reação através de um caminho envolvendo no mínimo duas etapas da reação facilitadas por enzimas, em que no mínimo uma das no mínimo duas etapas é uma etapa produtora de monatina e no mínimo uma das no mínimo duas etapas tem um equilíbrio desfavorável; b) comprometer no mínimo a reação tendo o equilíbrio desfavorável para formar uma composição comprometida; c) carregar a composição comprometida com no mínimo um componente para impelir a etapa produtora de monatina em direção à produção de monatina.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, em que o caminho envolve no mínimo três etapas da reação.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, adicionalmente compreendendo comprometer todas das no mínimo três etapas separando os facilitadores ou co-fatores dos facilitadores ou uma combinação dos mesmos da mistura da reação, e em que o no mínimo um componente é no mínimo um primeiro componente e um segundo componentee, o primeiro componente sendo uma enzima que facilita a etapa produtora de monatina e o segundo componente sendo um reagente envolvido na etapa produtora de monatina, e em que a enzima que facilita a etapa produtora de monatina também facilita a conversão de um componente menos estável no caminho para um componente mais estável no caminho.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, em que o componente menos estável é indol-3-piruvato e o componente mais estável é triptofano.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, adicionalmente compreendendo reciclar as enzimas separadas e triptofano para a mistura da reação.

27. Método de acordo com a reivindicação 24, adicionalmente compreendendo reciclar subprodutos, co-produtos, ou combinações dos mesmos para a primeira composição, a composição comprometida, ou combinações dos mesmos.

28. Método de acordo com a reivindicação 22, adicionalmente compreendendo proporcionar uma série de componentes iniciais que produzem ácido 2-hidróxi 2-(indol-3-ilmetil)-4-ceto glutárico (precursor de monatina ou "PM") na mistura da reação, em que cerca de 90% do precursor de monatina é convertido em monatina.

29. Método de acordo com a reivindicação 28, em que cerca de 95% do precursor de monatina é convertido em monatina.

30. Método de acordo com a reivindicação 28, em que cerca de 100% do precursor de monatina é convertido em monatina.

31. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a concentração de monatina produzida é cerca de 1,5 vezes maior do que seria produzida em um caminho de equilíbrio imperturbado.

32. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a concentração de monatina produzida é cerca de 1,7 vezes maior do que seria produzida em um caminho de equilíbrio imperturbado.

33. Método de acordo com a reivindicação 28, em que a concentração de monatina produzida é cerca de 2,0 vezes maior do que seria produzida em um caminho de equilíbrio imperturbado.

34. Método de acordo com a reivindicação 4, em que monatina é purificada usando cromotagrafia de permuta de ânions, cromatografia de coluna de SDVB, ou cromotagrafia de permuta de cátions.

35. Método para preparar um produto em um caminho de equilíbrio multietapa, o referido método compreendendo: a) possibilitar que uma primeira composição compreendendo uma série de reagentes e uma série de facilitadores reaja para formar uma segunda composição compreendendo o referido produto e um ou mais intermediários no referido caminho; b) remover, inibir, inativar, ou degradar o facilitadores para inativar ou retardar o caminho multietapa; c) reativar ou aumentar a velocidade de no mínimo uma reação produtora de produto, ao mesmo tempo que mantendo reações competitivas para a etapa produtora de produto em um estado inativo ou retardado, e opcionalmente adicionar no mínimo um componente envolvido na etapa produtora de produto em uma quantidade suficiente para impelir a etapa produtora de produto em direção à produção de produto; e, d) purificar o produto da segunda composição.

36. Sistema para fabricar um produto em um caminho de equilíbrio multietapa, o referido sistema compreendendo: a) um primeiro receptáculo para receber e encerrar componentes de uma primeira mistura compreendendo um ou mais reagentes e um ou mais facilitadores, cujos componentes podem reagir para produzir um produto desejado e intermediários; b) um primeiro equipamento em comunicação com o receptáculo para separar os reagentes, produto, e intermediários, dos facilitadores; c) meios para reciclar os facilitadores de volta para o receptáculo; d) um segundo receptáculo em comunicação com o primeiro equipamento referido para receber os reagentes, o produto desejado, e intermediários do primeiro equipamento, o segundo receptáculo também adaptado para receber facilitadores úteis para ativar uma reação para produzir o produto desejado envolvendo no mínimo um dos reagentes e intermediários e adaptado para receber componentes úteis para impelir a reação produtora de produto para formar o produto desejado; e) meios para purificar o produto desejado em comunicação com o segundo receptáculo; f) meios para reciclar reagentes e opcionalmente intermediários dos meios para purificar para o primeiro receptáculo; e, opcionalmente, g) meios para reciclar componentes dos meios para purificar para o segundo receptáculo.

37. Método, compreendendo: purificar monatina de uma mistura da reação original deixando uma nova mistura, reciclando seletivamente no mínimo um componente da mistura da reação original para a nova mistura da reação, e produzindo uma quantidade de monatina a partir de uma quantidade de reagentes originais que é maior do que uma quantidade de monatina que seria produzida pelo processo de equilíbrio somente, em que purificar compreende no mínimo uma etapa de ultrafiltração e no mínimo uma etapa de cromotagrafia.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a no mínimo uma etapa de cromatografia compreende uma etapa de cromatografia de permuta de cátions e cromatografia sobre uma resina absorvente não-polar.

39. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o método adicionalmente compreende uma etapa de dessalgação, e a no mínimo uma etapa de cromatografia compreende uma etapa de cromatografia de permuta de cátions, uma etapa de cromatografia de permuta de ânions e uma cromatografia sobre uma resina absorvente não-polar.

40. Método de acordo com a reivindicação 37, em que a no mínimo uma etapa de cromatografia compreende cromatografia com uma resina absorvente sintética não-polar.