BR112020018306A2 - Processos para a produção de triptaminas - Google Patents

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BR112020018306A2
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indole
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Ryan Protzko
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New Atlas Biotechnologies Llc.
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Abstract

são descritos aqui microrganismos procarióticos e eucarióticos, incluindo e. coli e s. cerevisiae, geneticamente alterados para biossintetizar triptamina e derivados de triptamina. os microrganismos do relatório podem ser engenheirados para conter plasmídeos e integrações genéticas estáveis contendo informação genética suficiente para a conversão de um antranilato ou um indol a uma triptamina. a produção por fermentação de triptaminas substituídas em um biocatalisador de célula completa pode ser útil para a produção custo efetiva destes compostos para uso terapêutico.

Description

PROCESSOS PARA A PRODUÇÃO DE TRIPTAMINAS REFERÊNCIA CRUZADA
[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US nº 62/640.443, depositado em 8 de março de 2018, pedido este que é aqui incorporado como referência em sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi apresentada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada aqui como referência em sua totalidade. A dita cópia em ASCII, criada em 8 de março de 2019, está nomeada como 54033-701_601_SL.txt e apresenta 201114 bytes de tamanho.
ANTECEDENTES
[0003] A triptamina é um alcaloide monoamina. Contém uma estrutura de anel indol e é estruturalmente similar ao aminoácido triptofano, do qual seu nome é derivado. A triptamina é encontrada em quantidades traço nos cérebros de mamíferos e existe a hipótese de que represente um papel como um neuromodulador ou um neurotransmissor. A triptamina é o grupo funcional de um conjunto de compostos, chamados coletivamente de triptaminas substituídas. Este conjunto inclui muitos compostos biologicamente ativos, incluindo neurotransmissores e fármacos psicotrópicos.
SUMÁRIO
[0004] Em um aspecto, é provida uma célula microbiana que produz uma triptamina, a célula microbiana contendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um antranilato a uma triptamina.
[0005] Em um outro aspecto, é provida uma célula microbiana que produz uma triptamina, a célula microbiana contendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um indol a uma triptamina.
[0006] Em um outro aspecto, é provida uma célula microbiana que produz uma triptamina, a célula microbiana contendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptofano a uma triptamina.
[0007] Em alguns casos, o antranilato é um antranilato substituído. Em alguns casos, o antranilato é: onde: ̶ cada R é independentemente um hidrogênio, um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
[0008] Em alguns casos, o indol é um indol substituído. Em alguns casos, o indol é: onde: ̶ cada R é independentemente um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
[0009] Em alguns casos, a triptamina é uma triptamina substituída. Em alguns casos, a triptamina é:
onde: ̶ cada R é independentemente um hidrogênio, um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
[0010] Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem um ou mais de: trpD, trpB, trpC e trpA. Em alguns casos, a uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas compreendem um operon multicistrônico que codifica pelo menos duas de trpD, trpB, trpC e trpA. Em alguns casos, o operon multicistrônico apresenta uma sequência de ácidos nucleicos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Em alguns casos, a trpD compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-7. Em alguns casos, a trpC compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 8 e 9. Em alguns casos, a trpB compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 e 11. Em alguns casos, a trpA compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 12 e 13. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma descarboxilase. Em alguns casos, a descarboxilase é uma triptofano descarboxilase. Em alguns casos, a triptofano descarboxilase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 14-20. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma transferase.
Em alguns casos, a transferase é selecionada do grupo consistindo em: triptamina N-metiltransferase, triptamina benzoil transferase, serotonina N-acetiltransferase, dopamina N-acetiltransferase, arilalquilamina N-acetiltransferase e triptamina hidroxicinamoiltransferase.
Em alguns casos, a transferase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 21-31 ou 46. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem triptamina 4-hidroxilase.
Em alguns casos, a triptamina 4-hidroxilase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma P450 redutase.
Em alguns casos, a P450 redutase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-40. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma quinase.
Em alguns casos, a quinase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44. Em alguns casos, o antranilato é produzido por biossíntese pela célula microbiana.
Em alguns casos, o antranilato é alimentado à célula microbiana engenheirada.
Em alguns casos, o antranilato é 5-bromoantranilato, 6- hidroxiantranilato, 5-hidroxiantranilato, 6-cloroantranilato ou 5-cloroantranilato.
Em alguns casos, o indol é produzido por biossíntese pela célula microbiana.
Em alguns casos, o indol é alimentado à célula microbiana engenheirada.
Em alguns casos, o indol é selecionado do grupo consistindo em: 5-hidroxiindol, 4- hidroxiindol, 7-hidroxiindol e 4-cloroindol, 5-bromoindol ou 4-fluorindol.
Em alguns casos, a célula microbiana secreta a triptamina no caldo de cultura.
Em alguns casos, a triptamina é selecionada de qualquer triptamina descrita nas FIG.
4, FIG. 6 ou FIG. 8. Em alguns casos, a triptamina é selecionada do grupo consistindo em: triptamina, 5-hidroxitriptamina, 5-hidroximetiltriptamina, 5- hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 5-fosforiloximetiltriptamina, 5-fosforiloxi-N,N- dimetiltriptamina, 4-hidroxitriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 4- fosforiloxitriptamina, 4-fosforiloxi-N,N-triptamina, 7-hidroxitriptamina, 7- fosforiloximetiltriptamina, 7-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-cloro- triptamina, 4-cloro-N,N-dimetiltriptamina, 5-bromotriptamina, 5-bromo- metiltriptamina, 5-bromo-N-metiltriptamina, 5-bromo-N,N-dimetiltriptamina, N- acetil-triptamina, 4-hidroxi-N-acetil-triptamina.
Em alguns casos, a célula microbiana é uma célula eucariótica.
Em alguns casos, a célula microbiana é uma célula de levedura.
Em alguns casos, a célula de levedura é da espécie Saccharomyces cerevisiae.
Em alguns casos, a célula de levedura não expressa uma ou mais entre a aminotransferase aromática I (aro8) e fenilpiruvato descarboxilase (aro10). Em alguns casos, a célula de levedura supraexpressa uma ou mais entre fosforribosilantranilato isomerase (TRP1), antranilato sintase (TRP2), indol-3-glicerolfosfato sintase (TRP3), antranilato fosforribosil transferase (TRP4) e triptofano sintase (TRP5). Em alguns casos, a célula de levedura supraexpressa um mutante de uma ou mais entre fosforribosilantranilato isomerase (TRP1), antranilato sintase (TRP2), indol-3-glicerolfosfato sintase (TRP3), antranilato fosforribosil transferase (TRP4) e triptofano sintase (TRP5). Em alguns casos, a célula de levedura contém duas ou mais cópias de uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas e atuam sinergicamente.
Em alguns casos, a célula microbiana é um procarioto.
Em alguns casos, a célula microbiana é uma célula bacteriana.
Em alguns casos, a célula bacteriana é da espécie Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.
Em alguns casos, a célula bacteriana não expressa uma ou mais dos genes da triptofanase (tna), do elemento repressor de triptofano repressor (trpR) ou da antranilato sintase (trpE). Em alguns casos, pelo menos uma cópia de uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos heterólogas são integradas de forma estável no genoma da célula microbiana.
Em alguns casos, duas ou mais cópias de uma ou mais das sequências de ácidos nucleicos heterólogas são integradas de forma estável no genoma da célula microbiana. Em alguns casos, as duas ou mais cópias da uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas são derivadas da mesma sequência. Em alguns casos, as duas ou mais cópias da uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas são derivadas de sequência distintas.
[0011] Em um outro aspecto, é provido um método para a síntese de uma triptamina, o método compreendendo: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das precedentes na presença de antranilato, sintetizando assim a triptamina. Em alguns casos, o método compreendendo adicionalmente a alimentação do antranilato à célula microbiana. Em alguns casos, o antranilato é produzido por biossíntese pela célula microbiana. Em alguns casos, o antranilato é um antranilato substituído.
[0012] Em um outro aspecto, é provido um método para a síntese de uma triptamina, o método compreendendo: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das precedentes na presença de indol, sintetizando assim a triptamina. Em alguns casos, o método compreende adicionalmente a alimentação do indol à célula microbiana. Em alguns casos, o indol é produzido por biossíntese pela célula microbiana. Em alguns casos, o indol é um indol substituído.
[0013] Em um outro aspecto, é provido um método para a síntese de uma triptamina, o método compreendendo: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das precedentes na presença de triptofano, sintetizando assim a triptamina. Em alguns casos, o método compreende adicionalmente a alimentação do triptofano à célula microbiana. Em alguns casos, o triptofano é produzido por biossíntese pela célula microbiana.
[0014] Em alguns casos, qualquer método entre os precedentes compreende adicionalmente a purificação da triptamina a partir da cultura.
[0015] Em um outro aspecto, é provida uma célula microbiana contendo uma mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética para converter uma triptamina a um derivado de triptamina. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma triptamina 4-hidroxilase. Em alguns casos, a triptamina 4-hidroxilase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs:32-35. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma triptamina 5-hidroxilase. Em alguns casos, a triptamina 5-hidroxilase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência to SEQ ID NO:47. Em alguns casos, a uma ou mais enzimas compreendem uma 4- hidroxitriptamina quinase. Em alguns casos, a 4-hidroxitriptamina quinase compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs:41-
44. Em alguns casos, a triptamina é uma triptamina substituída. Em alguns casos, a triptamina é selecionada do grupo consistindo em: 5-metoxi-N,N-dimetil- triptamina, N,N-diisopropil-triptamina, N-metil-N-isopropiltriptamina, N,N- dimetiltriptamina, N,N-tetrametilenotriptamina, N,N-dipropiltriptamina, 4-hidroxi- N,N-dimetiltriptamina, triptamina, 4-hidroxitriptamina, 5-hidroxitriptamina, ibogamina, 4-hidroxiibogamina e 5-hidroxiibogamina. Em alguns casos, o derivado de triptamina é qualquer derivado de triptamina descrito na FIG. 16. Em alguns casos, o derivado de triptamina é selecionado do grupo consistindo em: 5- hidroxi-N,N-diisopropil-triptamina, 5-hidroxi-N-metil-N-isopropiltriptamina, 5- hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 5-hidroxi-N,N-tetrametileno triptamina, 5-hidroxi- N,N-dipropiltriptamina, 4,5-metoxi-N,N-dimetil-triptamina, 4-hidroxi-N,N- diisopropil-triptamina, 4-hidroxi-N-metil-N-isopropil triptamina, 4-hidroxi-N,N-
dimetiltriptamina, 4-hidroxi-N,N-tetrametilenotriptamina, 4-hidroxi-N,N-dipropil triptamina, 4-fosforiloxi-N,N-dipropiltriptamina, 4-hidroxitriptamina, 5-hidroxi triptamina, 4-metoxitriptamina, 5-metoxitriptamina, 4-fosforiloxitriptamina, 5- fosforiloxi triptamina, 4-hidroxiibogamina, 5-hidroxiibogamina, 4- fosforiloxiibogamina e 5-fosforiloxiibogamina.
[0016] Em um outro aspecto, é provido um método para a síntese de um derivado de triptamina a partir de uma triptamina, o método compreendendo: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das precedentes na presença de uma triptamina, sintetizando assim o derivado de triptamina. Em alguns casos, o método compreende adicionalmente a purificação do derivado de triptamina a partir da cultura.
[0017] Em ainda um outro aspecto, é provido um vetor compreendendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-
49.
[0018] Em ainda um outro aspecto, é provida uma célula microbiana contendo uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma enzima a partir de uma rota de síntese de triptamina ou um fragmento funcional desta compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-49.
[0019] Em um outro aspecto, é provido um método para a avaliação dos níveis de 4-hidroxitriptamina em qualquer célula microbiana das precedentes, o método compreendendo: a detecção de uma cor ou de um produto fluorescente da 4- hidroxitriptamina na célula microbiana. Em alguns casos, a 4-hidroxitriptamina é oxidada dentro da célula microbiana, produzindo, desta forma, uma 4- hidroxitriptamina oxidada. Em alguns casos, a 4-hidroxitriptamina oxidada é diretamente proporcional ao nível da 4-hidroxitriptamina sintetizada dentro da célula microbiana. Em alguns casos, uma oxidação da 4-hidroxitriptamina oxidada é catalisada por sulfato de ferro. Em alguns casos, uma oxidação da 4- hidroxitriptamina oxidada é catalisada por uma enzima expressa pela célula microbiana. Em alguns casos, a enzima compreende uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 45.
[0020] Em um outro aspecto, é provido um método para a conversão de um antranilato a uma triptamina, o método compreendendo a incubação do antranilato na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um antranilato a uma triptamina.
[0021] Em ainda um outro aspecto, é provido um método para a conversão de um indol a uma triptamina, o método compreendendo a incubação do indol na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um indol a uma triptamina.
[0022] Em ainda um outro aspecto, é provido um método para a conversão de triptofano a uma triptamina, o método compreendendo a incubação do triptofano na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptofano a uma triptamina.
[0023] Em ainda um outro aspecto, é provido um método para a conversão de uma triptamina a uma triptamina derivatizada, o método compreendendo a incubação da triptamina na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptamina a uma triptamina derivatizada.
[0024] Em alguns casos, os métodos precedentes é realizado na ausência de uma célula biológica. Em alguns casos, os métodos precedentes são realizados sob condições in vitro. Em alguns casos, os métodos precedentes são realizados sob condições livres de células. Em alguns casos, os métodos precedentes são realizados em um lisado celular.
INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA
[0025] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados neste relatório são aqui incorporados como referência na mesma extensão em que cada publicação, patente ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0026] Algumas das novas características da invenção são apresentadas nas reivindicações anexas. Uma melhor compreensão das características e vantagens da presente invenção será obtida por referência à descrição detalhada a seguir que apresenta realizações ilustrativas, nas quais os princípios da invenção são utilizados e nos desenhos anexos, nos quais:
[0027] A FIG. 1 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo adequado para a supraexpressão do operon de triptofano bacteriano em bactérias de acordo com realizações do relatório. O plasmídeo é de cópia média (p15a) e contém resistência à ampicilina. TrpD, trpC, trpB e trpA são expressas em um operon multicistrônico (por exemplo, SEQ ID NO: 1).
[0028] A FIG. 2 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo adequado para a supraexpressão da psilocibina sintase (por exemplo, SEQ ID NO: 21), triptofano descarboxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 14) e 4- hidroxitriptamina quinase (por exemplo, SEQ ID NO: 41) em bactérias de acordo com realizações do relatório.
[0029] A FIG. 3 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo adequado para a produção de derivados N-metil em bactérias pela supraexpressão da triptofano descarboxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 19) e etanolamina metiltransferase (por exemplo, SEQ ID NO: 25) de acordo com realizações do relatório.
[0030] A FIG. 4 mostra exemplos não limitantes de triptaminas substituídas produzidas por células bacterianas engenheiradas alimentadas com antranilato substituído ou indol de acordo com realizações do relatório.
[0031] A FIG. 5 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo adequado para a produção de derivado N-metil de triptaminas em levedura pela supraexpressão da triptofano descarboxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 19), 4- hidroxitriptamina quinase (por exemplo, SEQ ID NO: 41), psilocibina sintase (por exemplo, SEQ ID NO: 21) e triptamina 4-hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 33) de acordo com realizações do relatório.
[0032] A FIG. 6 mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de ácido antranílico presente no metabolismo de levedura a triptaminas por enzimas codificadas no pRJP1608 de acordo com realizações do relatório.
[0033] A FIG. 7 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo para a produção de derivado N-acetil de triptaminas em levedura pela supraexpressão da triptofano descarboxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 19), triptamina 4- hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 33) e N-acetiltransferase (por exemplo, SEQ ID NO: 28) de acordo com realizações do relatório.
[0034] A FIG. 8 mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de ácido antranílico presente no metabolismo de levedura a triptaminas por enzimas codificadas no pRJP1618 de acordo com realizações do relatório.
[0035] A FIG. 9 mostra um exemplo não limitante de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) da 4-hidroxi-N,N-dimetil-triptamina derivada de células de levedura engenheiradas de acordo com realizações do relatório.
[0036] A FIG. 10 mostra um exemplo não limitante de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) de psilocibina derivada de células de levedura engenheiradas de acordo com realizações do relatório.
[0037] A FIG. 11 mostra um exemplo não limitante de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) de N-acetiltriptamina derivada de células de levedura engenheiradas de acordo com realizações do relatório.
[0038] A FIG. 12 mostra um exemplo não limitante de espectrometria de massa em tandem (MS/MS) de 4-hidroxi-N-acetiltriptamina derivada de células de levedura engenheiradas de acordo com realizações do relatório.
[0039] A FIG. 13 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo para a supraexpressão d triptamina 4-hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 33) em levedura de acordo com realizações do relatório.
[0040] A FIG. 14 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo para a supraexpressão de triptamina 5-hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 47) em levedura de acordo com realizações do relatório.
[0041] A FIG. 15 mostra um exemplo não limitante do mapa de um plasmídeo para a supraexpressão de 4-hidroxitriptamina quinase (por exemplo, SEQ ID NO: 41) em levedura de acordo com realizações do relatório.
[0042] A FIG. 16 mostra um exemplo não limitante da produção de triptaminas substituídas a partir de triptaminas alimentadas em levedura engenheirada de acordo com realizações do relatório.
[0043] A FIG. 17 mostra um exemplo não limitante de um ensaio de varredura colorimétrica como um indicador da atividade de hidroxilase em levedura de acordo com realizações do relatório.
[0044] A FIG. 18A mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de triptamina a derivados de triptamina.
[0045] A FIG. 18B mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de ibogamina em derivados de ibogamina.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0046] O presente relatório refere-se a microrganismos contendo DNA heterólogo útil na produção de triptaminas com substituições 4-, 5-, 6- ou 7-indol e/ou substituições R1 ou R2 amina. Além disto, este relatório refere-se a processos para a otimização da produção, execução da produção e recuperação de tais triptaminas substituídas. O relatório provido aqui provê processos para a produção de vários compostos, tais como triptaminas. O relatório refere-se ainda a microrganismos procarióticos e eucarióticos, incluindo bactérias (por exemplo, Escherichia coli) e levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae), que podem ser geneticamente alterados para conter sequências heterólogas que codificam moléculas biológicas que podem prover a síntese de triptamina e/ou triptaminas substituídas in vivo. Em alguns aspectos, o relatório provê microrganismos que podem ser engenheirados para conter plasmídeos e integrações estáveis de genes contendo informação genética suficiente para a conversão de antranilato ou antranilatos substituídos e/ou indol ou indóis substituídos, a uma triptamina ou triptamina substituída rspectivas. A produção por fermentação de triptaminas substituídas em um biocatalisador de célula total pode ser útil para a produção custo efetiva destes compostos para uso terapêutico.
[0047] Triptaminas são alcaloides de monoamina de ocorrência natural derivados de triptofano, do qual seu nome é derivado. Análogos dentro da família das triptaminas contêm substituições na estrutura do anel indol e do grupo amino. Esta família de compostos contém membros de ação psicotrópica, incluindo N,N- dimetiltriptofano (DMT), 5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina (5-MeO-DMT), 4- hidroxi dimetil-triptofano (psilocina) e seu éster de 4-O-fosfato, psilocibina (Hofmann et al. 1959). A psilocina pode atuar como um agonista parcial dos receptores de 5HT1a, 5HT2a e 5HT2c (Hasler et al. 2004). Vários fungos basidiomicetos do gênero Psilocybe e outros gêneros produzim triptaminas substituídas por via biossintética, incluindo psilocibina, psilocina, norpsilocina, baeocistina, norbaeocistina e aeruginascina (Lenz, Wick e Hoffmeister 2017). O composto N,N-dimetiltriptamina é ubíquo por natureza e é produzido por muitas plantas e animais (Carbonaro e Gatch 2016). As triptaminas substituídas podem ser também derivadas sinteticamente, incluindo as triptanas (por exemplo, Zolmitriptana e Sumatriptana), que são quimicamente sintetizadas e utilizadas como medicamentos utilizados no tratamento de enxaquecas e dores de cabeça em salvas (Derry, Derry e Moore 2014).
[0048] As triptaminas, tais como a psilocina, podem causar alterações profundas na percepção e humor em indivíduos humanos. A foi determinado que a administração de psilocibina em alta dose induz de forma confiável experiências místicas levando a significantes e duráveis melhoramentos na qualidade de vida
(Griffiths et al. 2006). Concluiu-se que a administração de silocibina é segura e bem tolerada em 9 pacientes com distúrbio obsessivo compulsivo refratário grave e pode ser associada com “reduções agudas robustas” nos sintomas núcleos (Moreno et al. 2006).
[0049] Devido às suas estruturas complexas, as triptaminas e e seus respectivos análogos substituídos são difíceis de se obter comercialmente a preços economicamente factíveis, em larga escala. Existem vários métodos de química orgânica para a produção de triptaminas substituídas, incluindo a psilocibina. O Dr. Albert Hoffmann publicou originalmente a síntese orgânica de psilocibina em 1958 (Hofmann et al. 1958). No entanto, foi utilizado um reagente perigoso para fosforilar o fosfato na posição 4 do anel indol e posteriormente foram realizados aperfeiçoamentos para a síntese (Hofmann, A. & Troxler, F. 1963. “Esters of Indols” (patente US 3.075.992)., Basel, Suíça: Sandoz Ltd.). Este método de produção foi adotado pelo Dr. David E Nichols para testes clínicos iniciais, no entanto a um custo alto de produção (Nichols 2014).
[0050] A extração de triptaminas de tecido fúngico de basidiomiceto que produz naturalmente os compostos não é adequada para produção em larga escala. As concentrações reportadas de psilocibina em cogumelos Psilocybe cubensis são abaixo de 1% do peso seco de células (J. Gartz 1994), representando um desafio para a extração e purificação. Além disto, o cultivo de tal tecido fúngico requer escalas de tempo de duração em meses e causaria desafios de suprimento (Jochen Gartz, Allen e Merlin 1994). Além disto, o uso de tecido natural impede a possibilidade de se produzir compostos novos e não naturais de triptamina com propriedades terapêuticas.
[0051] O presente relatório provê métodos e matérias para produzir triptaminas substituídas em alto rendimento a partir de componentes não dispendiosos. Os métodos do relatório provêm a produção de derivados de triptamina não naturalmente encontrados na natureza ou derivados de triptamina que não são acessíveis por química sintética. Em alguns casos, os derivados de triptamina descritos podem apresentar efeitos farmacológicos favoráveis (por exemplo, meia- vida, indicações etc.). Vantagens adicionais dos métodos descritos aqui incluem o uso de um único biocatalisador para a produção de vários análogos de triptamina substituída e um catalisador de célula total que é robusto em fermentação e pode se regenerar para facilidade de uso durante as diversas produções.
[0052] Da mesma forma, o objetivo da presente invenção é o de prover novos processos para a produção biossintética de indol 4-, 5-, 6- ou 7-substituído e/ou triptaminas substituídas com R1 ou R2 amina.
[0053] Em alguns casos do presente relatório, indol 4-, 5-, 6- ou 7-substituído e/ou triptaminas substituídas com R1 ou R2 amina podem ser produzidos por biossíntese a partir das antranilatos e indois substituídos correspondentes por células microbianas engenheiradas. Antranilatos e indois substituídos são amplamente disponíveis, vastos em variedade e não dispendiosos em comparação com suas respectivas triptaminas substituídas.
[0054] Em outros aspectos do relatório, é provido um método de conversão de um antranilato a uma triptamina, o método compreendendo a incubação do antranilato na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um antranilato a uma triptamina. Em outros aspectos do relatório, é provido um método de conversão de um indol a uma triptamina, o método compreendendo a incubação do indol na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um indol a uma triptamina. Em outros aspectos do relatório, é provido um método de conversão de triptofano a uma triptamina, o método compreendendo a incubação de triptofano na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptofano a uma triptamina. Em outros aspectos do relatório, é provido um método de conversão de uma triptamina a uma triptamina derivatizada, o método compreendendo a incubação da triptamina na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptamina a uma triptamina derivatizada. Em alguns casos, os métodos podem ser realizados em uma célula biológica (por exemplo, por uma célula microbiana engenheirada como descrita aqui). Em outros casos, os métodos podem ser realizados na ausência de uma célula biológica. Em alguns casos, os métodos podem ser realizados sob condições in vitro. Em alguns casos, os métodos podem ser realizados sob condições livres de célula. Em alguns casos, os métodos pode ser realizados em um lisado celular.
[0055] Síntese de uma triptamina substituída a partir de um antranilato substituído em células microbianas engenheiradas.
[0056] Em um aspecto do relatório, os processos descritos aqui provêm a produção de triptaminas de indol 4-, 5-, 6- ou 7-substituído com substituições em R1 ou R2 na amina. Em alguns casos, o antranilato ou um antranilato substituído em 3-, 4-, 5- ou 6- pode ser utilizado para a obtenção de triptaminas de indol 4-, 5-, 6- ou 7- substituído com substituições em R1 ou R2. Em alguns casos, o processo pode ser conduzido em uma fermentação de célula microbiana total. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode ser cultivada na presença de antranilato ou de um antranilato substituído (por exemplo, o antranilato ou antranilato substituído pode ser alimentado ou de alguma outra forma incubado com a célula microbiana). Em outros casos, o antranilato ou antranilato substituído pode ser produzido por biossíntese pela célula microbiana. Por exemplo, uma célula microbiana pode produzir antranilato ou um antranilato substituído naturalmente (por exemplo, como parte de metabolismo central de carbono). Em outros casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para produzir antranilato ou um antranilato substituído (por exemplo, pela supraexpressão de enzimas para a produção de antranilato substituídos).
[0057] O Esquema 1 abaixo mostra um exemplo não limitante da síntese de uma triptamina substituída a partir de antranilato ou de um antranilato substituído em uma célula microbiana engenheirada. Esquema 1:
[0058] Em alguns aspectos, o relatório provê um método para a produção de triptaminas substituídas pelo cultivo de microrganismos engenheirados na presença de antranilato ou de um antranilato substituído,
onde -R é, mas não se limita a, um halogênio (-Br, -F, -Cl, -I etc), -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4. A triptamina substituída resultante,
pode ser recuperada a partir do caldo de cultura.
Em alguns casos, a triptamina resultante pode ser utilizada em um processo químico posterior, levando vantagem de grupos químicos de partida ou de grupos protetores incorporados no esqueleto da triptamina durante o processo biossintético fermentativo.
[0059] Em um outro aspecto do relatório, o indol ou indol substituído em 4-, 5-, 6- ou 7- pode ser utilizado para a obtenção de triptaminas de indol 4-, 5-, 6- ou 7- substituído com substituições em R1 ou R2. Em alguns casos, o processo pode ser conduzido em uma fermentação de célula microbiana total. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode ser cultivada na presença de indol ou de um indol substituído (por exemplo, o indol ou indol substituído pode ser alimentado ou de alguma outra forma incubado com a célula microbiana). Em outros casos, o indol ou indol substituído pode ser produzido por biossíntese pela célula microbiana. For exemplo, uma célula microbiana pode produzir o indol ou um indol substituído naturalmente. Em outros casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para produzir o indol ou um indol substituído (por exemplo, pela supraexpressão de enzimas para a produção de indois substituídos).
[0060] Síntese de uma triptamina substituída a partir de indol ou de um indol substituído em células microbianas engenheiradas.
[0061] O Esquema 2 mostra um exemplo não limitante de síntese de uma triptamina substituída a partir de indol ou de um indol substituído em uma célula microbiana engenheirada. Esquema 2
[0062] Em alguns aspectos, o relatório provê um método para a produção de triptaminas substituídas pelo cultivo de microrganismos engenheirados na presença de indol ou de um indol substituído,
onde -R é, mas não se limita a, um halogênio (-Br, -F, -Cl, -I etc.), -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4. A triptamina substituída resultante, pode ser recuperada a partir do caldo de cultura. Em alguns casos, a triptamina resultante pode ser utilizada em um processo químico posterior, levando vantagem de grupos químicos de partira ou grupos protetores incorporados no esqueleto da triptamina durante o processo biossintético fermentativo.
[0063] Síntese de uma triptamina substituída a partir de antranilato ou de um antranilato substituído em células microbianas engenheiradas. Esquema 3
[0064] Em alguns aspectos, os processos descritos aqui envolvem o uso de microrganismos engenheirados para a produção de triptaminas substituídas a partir de antranilato ou antranilato substituído.
O Esquema 3 mostra um exemplo não limitante da produção de uma triptamina substituída a partir de um antranilato substituído em uma célula microbiana engenheirada.
Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode ser uma célula bacteriana.
Em alguns casos, a bactéria pode ser Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.
Em alguns casos, a bactéria pode compreender genética de hospedeiro modificado, incluindo knockout de tna (triptofanase), trpR (elemento repressor de triptofano) e trpE (antranilato sintase). Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode ser uma célula de levedura.
Em alguns casos, a célula de levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
Em alguns casos, a célula microbiana pode ser adicionalmente modificada para expressar ou supraexpressar um ou mais genes.
Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para conter cópias extras de DNA por plasmídeo ou integração genômica de um operon trpDCBA endógeno ou heterólogo.
Em alguns casos, o operon trpDCBA pode compreender uma das SEQ ID NOs: 1-4. Em alguns casos, o operon trpDCBA pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4. Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode produzir uma ou mais enzimas apresentando uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-13 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-13. Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode produzir uma ou mais entre trpD, trpB, trpC ou trpA, onde a enzima foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0065] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser adicionalmente engenheirada para expressar ou supraexpressar um ou mais genes adicionais. Em alguns aspectos, tal célula microbiana pode expressar adicionalmente uma triptamina descarboxilase (ver Esquema 3, “descarboxilase”). Em alguns casos, a triptamina descarboxilase pode ser expressa por integração genômica do DNA ou expressão de um plasmídeo na célula microbiana. As triptamina descarboxilases podem ser independentes de piridoxal fosfato (PLP) ou podem ser dependentes de PLP. Em alguns casos, uma triptamina descarboxilase pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 14-20 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14-20. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma triptamina descarboxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0066] Em alguns casos, as posições de R1 e R2 amino da triptamina ou triptaminas substituídas derivadas de fermentação podem ser modificadas por uma transferase para produzir, em exemplo não limitante, grupos funcionais N-metil, N,N-dimetil, N-acetil ou N-hidroxicinamoil. Desta forma, em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar ou supraexpressar uma transferase (ver Esquema 3). Em alguns casos, uma transferase pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 21-31 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 21-31. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma transferase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0067] Em alguns casos, uma transferase adicional pode ser expressa, tal como, mas não se limitando a, uma fosfotransferase (quinase), acetil transferase, glucosil transferase ou sulfotransferase, de maneira a modificar adicionalmente grupos hidroxil no anel indol da triptamina. For exemplo, tal como quando células engenheiradas são cultivadas na presença de 6-hidroxiantranilato ou 4-hidroxi indol para produzir 4-hidroxi-N,N- dimetiltriptamina, uma quinase pode ser expressa produzindo o éster fosfato de 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, psilocibina. Quinases adequadas podem incluir, mas não se limitam a, uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44.
[0068] Em alguns casos, o antranilato substituído pode ser qualquer um entre 5- bromoantranilato, 6-hidroxiantranilato, 5-hidroxiantranilato, 6-cloroantranilato e 5-cloroantranilato. Em alguns casos, a triptamina pode ser qualquer uma entre triptamina, 5-hidroxitriptamina, 5-hidroximetiltriptamina, 5-hidroxi-N,N- dimetiltriptamina, 5-fosforiloximetiltriptamina, 5-fosforiloxi-N,N- dimetiltriptamina, 4-hidroxitriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 4- fosforiloxitriptamina, 4-fosforiloxi-N,N-triptamina, 7-hidroxitriptamina, 7- fosforiloximetiltriptamina, 7-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-clorotriptamina, 4-cloro-N,N-dimetiltriptamina, 5-bromotriptamina, 5-bromo-metiltriptamina, 5- bromo-N-metiltriptamina, 5-bromo-N,N-dimetiltriptamina, N-acetil-triptamina e 4-hidroxi-N-acetil-triptamina.
[0069] Síntese de uma triptamina substituída a partir de indol ou de um indol substituído em células microbianas engenheiradas. Esquema 4
[0070] Em alguns aspectos, os processos descritos aqui podem envolver o uso de microrganismos engenheirados para a produção de triptaminas substituídas a partir de indol ou de indol substituído. O Esquema 4 mostra um exemplo não limitante da produção de uma triptamina substituída a partir de um indol substituído em uma célula microbiana engenheirada. Em alguns casos, o microrganismo engenheirado pode ser uma célula bacteriana. Em alguns casos, a célula bacteriana pode ser da espécie Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum. Em alguns casos, a célula bacteriana pode incluir genética de hospedeiro modificado, incluindo knockout de tna (triptofanase), trpR (elemento repressor de triptofano) e trpE (antranilato sintase). Em alguns casos, a célula microbiana pode ser uma célula de levedura. Em alguns casos, a célula de levedura pode ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
[0071] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser adicionalmente modificada para expressar ou supraexpressar um ou mais genes. Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para conter cópias extras de DNA por plasmídeo ou integração genômica de trpB e trpA endógenas ou heterólogas (ver, por exemplo, Esquema 4). Em alguns casos, trpB e trpA podem compreender sequências de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs; 5-13 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos
90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 5-13. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar trpB e/ou trpA que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0072] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser adicionalmente engenheirada para expressar ou supraexpressar um ou mais genes adicionais. Em alguns aspectos, tal célula microbiana pode expressar adicionalmente uma triptamina descarboxilase (ver, por exemplo, Esquema 4, “descarboxilase”). Em alguns casos, a triptamina descarboxilase pode ser expressa por integração genômica do DNA ou expressão de um plasmídeo na célula microbiana. A triptamina descarboxilases pode ser independente de piridoxal fosfato (PLP) ou pode ser dependente de PLP. Em alguns casos, uma triptamina descarboxilase pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos de acordo com as SEQ ID NOs: 14-20 (ver Tabela 2) ou um sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14-20. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma triptamina descarboxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0073] Em alguns casos, as posições de R1 e R2 amino da triptamina ou triptaminas substituídas derivadas de fermentação podem ser modificadas por uma transferase para produzir, em exemplo não limitante, grupos funcionais N-metil, N,N-dimetil, N-acetil ou N-hidroxicinnamoil. Desta forma, em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar ou supraexpressar adicionalmente uma transferase (ver, por exemplo, Esquema 4). Em alguns casos, uma transferase pode compreender qualquer uma das sequências de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 21-31 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 21-31. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma transferase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade. Em alguns casos, uma transferase adicional pode ser expressa, tal como, mas não se limitando a, uma fosfotransferase (quinase), acetil transferase, glucosil transferase ou sulfotransferase, para modificar adicionalmente grupos hidroxil no anel indol da triptamina. Por exemplo, tal como quando células engenheiradas são cultivadas na presença de 6-hidroxiantranilato ou 4-hidroxi indol para produzir 4-hidroxi-N,N- dimetiltriptamina, uma quinase pode ser expressa produzindo o éster fosfato de 4- hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, psilocibina. Quinases adequadas podem incluir, mas não se limitam a, uma sequência de aminoácidos mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-
44.
[0074] Em alguns casos, o indol substituído pode ser qualquer um entre 5- hidroxiindol, 4-hidroxiindol, 7-hidroxiindol e 4-cloroindol, 5-bromoindol e 4- fluorindol. Em alguns casos, a triptamina pode ser qualquer uma entre triptamina, 5-hidroxitriptamina, 5-hidroximetiltriptamina, 5-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 5- fosforiloximetiltriptamina, 5-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina, 4- hidroxitriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-fosforiloxitriptamina, 4- fosforiloxi-N,N-triptamina, 7-hidroxitriptamina, 7-fosforiloximetiltriptamina, 7- fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-cloro-triptamina, 4-cloro-N,N- dimetiltriptamina, 5-bromotriptamina, 5-bromometiltriptamina, 5-bromo-N- metiltriptamina, 5-bromo-N,N-dimetiltriptamina, N-acetil-triptamina e 4-hidroxi- N-acetil-triptamina.
[0075] Síntese de triptaminas substituídas com 4-hidroxil substituído e/ou R1 ou R2 amina a partir de triptofano por células microbianas engenheiradas
Esquema 5
[0076] Em um outro aspecto, triptaminas substituídas com 4-hidroxil substituído e/ou R1 ou R2 amina podem ser produzidas por biossíntese a partir de triptofano por células microbianas engenheiradas, de acordo com o Esquema 5.
[0077] Em alguns casos, uma célula microbiana, pode conter DNA heterólogo em um plasmídeo ou por integração no genoma que expressa enzimas que convertem L-triptofano a triptamina (por exemplo, uma descarboxilase) e/ou que convertem triptamina a 4-hidroxitriptamina (por exemplo, uma triptofano 4-hidroxilase). As descarboxilases podem ser independentes de piridoxal fosfato (PLP) ou dependentes de PLP.
[0078] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma descarboxilase. Em alguns casos, a descarboxilase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14- 20 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 14-20. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma descarboxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0079] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma triptamina 4-hidroxilase. As triptamina 4-hidroxilases são enzimas P450 que requerem um par de P450 redutases para prover energia redutora por meio de transferência de elétrons de NADPH. Em alguns casos, a triptamina 4-hidroxilase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma triptamina 4-hidroxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0080] Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma P450 redutase. Em alguns casos, a P450 redutase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-40 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-40. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma P450 redutase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0081] Em alguns casos, uma transferase adicional pode ser expressa, tal como, mas não se limitando a, uma fosfotransferase (quinase), acetil transferase, glucosil transferase ou sulfotransferase de maneira a modificar adicionalmente grupos hidroxil no anel indol da triptamina. Quando o composto produzido de interesse é a 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, uma quinase pode ser expressa produzindo o éster fosfato de 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, psilocibina. Em alguns casos, a célula microbiana pode ser adicionalmente engenheirada para expressar ou supraexpressar uma quinase. Em alguns casos, a quinase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos
90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma quinase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0082] Síntese de derivados de triptamina a partir de triptaminas substituídas em células microbianas engenheiradas
[0083] Em um outro aspecto, derivados de triptamina podem ser produzidos por biossíntese a partir de triptaminas substituídas por células microbianas engenheiradas.
[0084] Em alguns casos, uma célula microbiana, pode conter DNA heterólogo em um plasmídeo ou por integração no genoma que expressa enzimas que convertem uma triptamina substituída a um derivado de triptamina. Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma triptamina 4-hidroxilase. Em alguns casos, a triptamina 4-hidroxilase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma triptamina 4-hidroxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade. Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma triptamina 5-hidroxilase. Em alguns casos, a triptamina 5-hidroxilase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 47 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO: 47. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma triptamina 5-hidroxilase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade. Em alguns casos, a célula microbiana pode ser engenheirada para expressar ou supraexpressar uma 4-hidroxitriptamina quinase. Em alguns casos, a 4-hidroxitriptamina quinase pode apresentar uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44 (ver Tabela 2) ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44. Em alguns casos, uma célula microbiana engenheirada pode expressar uma 4-hidroxitriptamina quinase que foi modificada ou mutada para exibir níveis mais altos de atividade.
[0085] A FIG. 18A mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de triptamina a derivados de triptamina. For exemplo, a triptamina pode ser convertida a 4-hidroxitriptamina por 4-hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NOs:32-35). A 4-hidroxitriptamina pode ser convertida a 4-metoxitriptamina por uma metil transferase (por exemplo, SEQ ID NOs: 48 ou 49) ou 4- fosforiloxitriptamina por uma quinase (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-44). Em um outro exemplo, a triptamina pode ser convertida a 5-hidroxitriptamina por 5- hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 47). A 5-hidroxitriptamina pode ser convertida a 5-metoxitriptamina por uma metil transferase (por exemplo, SEQ ID NOs: 48 ou 49) ou a 5-fosforiloxitriptamina por uma quinase (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-44).
[0086] A FIG. 18B mostra um exemplo não limitante de uma rota biossintética de conversão de ibogamina a derivados de ibogamina. For exemplo, a ibogamina pode ser convertida a 4-hidroxiibogamina por 4-hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NOs: 32-35). A 4-hidroxiibogamina pode ser convertida a 4-metoxiibogamina por uma metil transferase (por exemplo, SEQ ID NOs: 48 ou 49) ou a 4- fosforiloxiibogamina por uma quinase (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-44). Em um outro exemplo, a ibogamina pode ser convertida a 5-hidroxiibogamina por 5- hidroxilase (por exemplo, SEQ ID NO: 47). A 5-hidroxiibogamina pode ser convertida a 5-metoxiibogamina por uma metil transferase (por exemplo, SEQ ID NO: 48 ou 49) ou a 5-fosforiloxiibogamina por uma quinase (por exemplo, SEQ ID NOs: 41-44).
[0087] Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode ser cultivada na presença de uma ou mais triptaminas. Em alguns casos, a triptamina é selecionada do grupo consistindo em: 5-metoxi-N,N-dimetil-triptamina, N,N-diisopropil- triptamina, N-metil-N-isopropiltriptamina, N,N-dimetiltriptamina, N,N- tetrametilenotriptamina, N,N-dipropiltriptamina, ibogamina e 12- metoxiibogamina, triptamina, 4-hidroxitriptamina, 5-hidroxitriptamina, ibogamina, 4-hidroxiibogamina e 5-hidroxiibogamina.
[0088] Em alguns casos, a célula microbiana engenheirada pode converter uma triptamina a um derivado de triptamina. Em alguns casos, o derivado de triptamina é qualquer derivado de triptamina descrito na FIG 16. Em alguns casos, o derivado de triptamina é selecionada do grupo consistindo em: 5-hidroxi-N,N-diisopropil- triptamina, 5-hidroxi-N-metil-N-isopropiltriptamina, 5-hidroxi-N,N- dimetiltriptamina, 5-hidroxi-N,N-tetrametilenotriptamina, 5-hidroxi-N,N- dipropiltriptamina, 4,5-metoxi-N,N-dimetil-triptamina, 4-hidroxi-N,N-diisopropil- triptamina, 4-hidroxi-N-metil-N-isopropil triptamina, 4-hidroxi-N,N- dimetiltriptamina, 4-hidroxi-N,N-tetrametilenotriptamina, 4-hidroxi-N,N- dipropiltriptamina, 4-fosforiloxi-N,N-dipropiltriptamina, ibogamina, 12- metoxiibogamina, 4-hidroxitriptamina, 5-hidroxitriptamina, 4-metoxitriptamina, 5-metoxitriptamina, 4-fosforiloxitriptamina, 5-fosforiloxitriptamina, 4- hidroxiibogamina, 5-hidroxiibogamina, 4-fosforiloxiibogamina e 5- fosforiloxiibogamina.
[0089] Ensaio para a detecção dos níveis de 4-hidroxitriptamina em uma célula hospedeira Esquema 6
[0090] Em um outro aspecto, o relatório provê um método para a detecção dos níveis de 4-hidroxitriptamina em uma célula hospedeira. Em alguns casos, o método compreende a detecção, em uma célula hospedeira geneticamente modificada para produzir uma 4-hidroxitriptamina, de um produto colorido ou fluorescente da 4-hidroxitriptamina. Em alguns casos, o produto colorido ou fluorescente de 4-hidroxitriptamina pode ser produzido pela ação de um mecanismo de oxidação produzido na. Em alguns casos, o nível de 4- hidroxitriptamina produzida na célula pode ser diretamente proporcional ao nível de 4-hidroxitriptamina ou de um produto colorido da 4-hidroxitriptamina produzida na célula (ver, por exemplo, Esquema 6). Tais métodos de análise in vivo podem ser utilizados para selecionar rapidamente mutantes de triptamina 4-hidroxilase apresentando alta atividade na célula hospedeira engenheirada de produção (DeLoache et al. 2015).
[0091] O mecanismo de oxidação pode ser catalisado por sulfato de ferro ou por uma enzima expressa por uma célula hospedeira, incluindo, mas não se limitando a, a enzima multicobre oxidase (Blaschko e Levine 1960). Um exemplo não limitante de uma oxidase adequada é mostrado na SEQ ID NO: 45 (ver Tabela 2). Em alguns casos, uma célula geneticamente modificada compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma triptofano 4-hidroxilase variante que pode produzir um nível de 4-hidroxitriptamina ou de um seu produto colorido ou fluorescente, que é mais alto que o nível de 4-hidroxitriptamina ou um seu produto colorido ou fluorescente, em uma célula de controle não compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que codifica a triptamina 4-hidroxilase variante. Isto pode indicar que a enzima variante aumenta do fluxo através da rota biossintética, criando assim taxas títulos mais altos da produção de 4- hidroxitriptamina. A célula hospedeira geneticamente modificada apresentando uma produção mais alta de 4-hidroxitriptamina pode conter enzimas, tais como metil, sulfono, glucosil e/ou fosfo transferases para a posição 4-hidroxiindol position ou posição amino, tal como descrito aqui.
[0092] Em alguns casos, a célula hospedeira modificada pode ser modificada para aumentar o fluxo de triptofano e de maneira a aumentar a produção de triptofano. Isto pode ser obtido por knockout de aro8 e aro10 e supraexpressão de TRP1, TRP2, TRP3, TRP4 e TRP5. Adicionalmente, a inclusão do alelo mutante resistente a retroalimentação de TRP2 pode ser empregada.
[0093] Em um exemplo não limitante (ver Exemplo 1), l-triptofano pode ser convertido, célula hospedeira microbiana modificada expressando uma descarboxilase, hidroxilase, P450 redutase, metiltransferase e quinase, a O-fosforil- 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina.
[0094] Condições de Cultura e Produção de Produto
[0095] Em alguns casos, a célula hospedeira geneticamente modificada pode ser cultivada sob condições aeróbicas. Em alguns casos, a célula hospedeira geneticamente modificada pode ser cultivadas sob condições anaeróbicas.
[0096] Em alguns casos, o meio de cultura pode ser um meio mínimo, incluindo, mas não se limitando a, M9, MOPS, YNB, sais de amônio ou um meio complexo contendo, por exemplo, extrato de levedura, ácido casamino, peptona ou triptona. Em alguns casos, o meio de cultura pode ser tamponado, por exemplo, por sais fosfato, HEPES ou Tris. Em alguns casos, o meio de cultura pode conter um agente redutor, por exemplo, ácido L-ascórbico, ditiotreitol ou mercaptoetanol. Em alguns casos, o meio de cultura pode ser suplementado com aminoácidos adicionais, tais como L-metionina, Histidina, Arginina, Alanina, Isoleucina, Cisteína, Ácido Aspártico, Leucina, Glutamina, Asparagina, Lisina, Glicina, Ácido Glutâmico, Prolina, Serina, Fenilalanina, Tirosina, Selenocisteína, Treonina, Pirrolisina, Triptofano ou Valina. Em alguns casos, vitaminas adicionais e cofatores podem ser adicionados, por exemplo, ácido L-ascórbico, tiamina, piridoxal fosfato, niacina, piridoxina, biotina, ácido fólico, ácido tetrahidrofólico, riboflavina, ácido pantotênico, sais de cobre, sais de magnésio, sais de manganês, sais de molibdênio, sais de ferro, sais de zinco, sais de níquel, glutationa, ácido heme ou D- aminolevulínico.
[0097] Em alguns casos, a célula hospedeira geneticamente modificada pode ser alimentada com um antranilato substituído por adição única, alimentação em batelada ou diluição constante em cultura. Em alguns casos, a célula hospedeira geneticamente modificada pode ser alimentada com um indol substituído por adição única, alimentação em batelada ou diluição constante em cultura.
[0098] Em alguns casos, pode ser produzido um produto a jusante. Em alguns casos, o produto a jusante pode ser purificada, por exemplo, isolado e purificado a partir do meio de cultura, a partir de um lisado celular ou ambos. Em alguns casos, o produto a jusante pode ser pelo menos ou cerca de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% ou 99% em peso, puro. A purificação pode ser conduzida por qualquer método conhecido ou combinação de métodos, métodos estes que incluem, por exemplo, cromatografia em coluna, separação de fase, precipitação, cristalização, decantação, retirada pro gás, separação melhoradas por membrana, fracionamento, adsorção/dessorção, pervaporação, dessorção térmica ou a vácuo a partir de uma fase sólida, extração do produto que é imobilizado ou absorvido em uma fase sólida com um solvente etc. A pureza pode ser avaliada por qualquer método apropriado, por exemplo, por análise de cromatografia em coluna, cromatografia líquida de alta performance (HPLC) ou análise de cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS).
[0099] Em alguns casos, as células na cultura podem converter mais de ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% do precursor alimentado mo meio de cultura celular no produto desejado. Em alguns casos, as células na cultura podem produzir pelo menos 2 g/L, pelo menos
3 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 5 g/L, pelo menos 7 g/L, pelo menos 10 g/L ou mais de 50 g/L do produto desejado no meio de cultura líquido.
[00100] Em alguns casos, as células podem converter mais de ou cerca de 0,0015, 0,002, 0,005, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,12, 0,14, 0,16, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0% do carbono no meio de cultura celular no produto desejado. Em alguns casos, as células podem produzir pelo menos 2 g/L, pelo menos 3 g/L, pelo menos 4 g/L, pelo menos 5 g/L, pelo menos 7 g/L, pelo menos 10 g/L ou mais de 50 g/L do produto desejado no meio de cultura líquido.
[00101] Células hospedeiras
[00102] Células hospedeiras adequadas incluem células que podem ser cultivadas em meio, por exemplo, como organismos unicelulares. As célula hospedeiras adequadas incluem células de levedura, células de fungos, células de insetos, células de mamíferos, células de algas e célula bacterianas. As célula hospedeiras adequadas podem adicionalmente incluir células de fungos filamentosos; células de fungos filamentosos adequadas incluem, por exemplo, Aspergillus, Neurospora e semelhantes.
[00103] A célula hospedeira pode ser uma célula procariótica. Células procarióticas adequadas incluem, mas não se limitam a, qualquer uma de uma variedade de cepas de laboratório de Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum, Lactobacillus sp., Salmonella sp., Shigella sp., Citrobacter, Enterobacter, Clostridium, Klebsiella, Aerobacter e semelhantes. Ver, por exemplo, Carrier et al. (1992) J. Immunol. 148:1176-1181; patente US 6.447.784; e Sizemore et al. (1995) Science 270:299-302. Exemplos de cepas de Salmonella que podem ser empregadas na presente invenção incluem, mas não se limitam a, Salmonella typhi e S. typhimurium. Cepas de Shigella adequadas incluem, mas não se limitam a, Shigella flexneri, Shigella sonnei e Shigella disenteriae. Tipicamente, a cepa de laboratório é uma que não é patogênica. Exemplo não limitantes de outras bactérias incluem, mas não se limitam a, Bacillus subtilis, Pseudomonas pudita,
Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas mevalonii, Rhodobacter sphaeroides, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum, Rhodococcus sp. e semelhantes. Em alguns casos, a célula hospedeira é Escherichia coli.
[00104] Exemplos não limitantes de células hospedeiras de levedura adequadas são cepas selecionadas de uma célula de uma espécies de Candida, Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Hansenula e Yarrowia. Em alguns casos, a célula hospedeira de levedura pode ser selecionada do grupo consistindo em: Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces oviformis, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces uvarum, Pichia kluyveri, Yarrowia lipolytica, Candida utilis, Candida cacaoi e Geotrichum fermentans. Outras células hospedeiras de levedura adequadas são Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica, Schizosaccharomyces pombe, Ustilgo mailis, Candida maltose, Pichia guillermondii e Pichia methanoliol. Células hospedeiras de levedura adequadas podem incluir, mas não se limitar a, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia koclamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia guercuum, Pichia pijperi, Pichia stiptis, Pichia methanolica, Pichia sp., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces sp., Hansenula polymorpha e semelhantes. Em alguns casos, uma célula hospedeira de levedura pode ser Saccharomyces cerevisiae; por exemplo, uma célula geneticamente modificada do presente relatório pode ser uma célula de Saccharomyces cerevisiae geneticamente modificada.
[00105] Os fungos filamentosos podem ser caracterizados por uma parede micelial composta de quitina, celulose, glucano, quitosana, manana e outros polissacarídeos complexos. O crescimento vegetativo pode ser por alongamento da hifa e o catabolismo de carbono obrigatoriamente aeróbico. Cepas de fungos filamentosos incluem, mas não se limitam a, cepas de Acremonium, Agaricus,
Aspergillus, Aureobasidium, Chrysosporium, Coprinus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Piromyces, Phanerochaete, Pleurotus, Schizophillum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium e Trichoderma. Exemplo não limitantes de células de fungos filamentosos incluem, por exemplo, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus sojae, Aspergillus fumigatus e Aspergillus oryzae. Um outro exemplo de célula de fungo adequada é uma célula de Neurospora crassa.
[00106] Expressão de Proteína Heteróloga em Células Hospedeiras Modificadas
[00107] Em alguns casos, uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo pode ser ligada operacionalmente a um elemento de controle de transcrição.
[00108] Promotores adequados para a expressão em bactérias podem incluir, mas não se limitar a, pT7, ptac, pLac, pLacUV5, pTet, pBAD e a série BBa constitutiva de promotores da biblioteca de promotores de Anderson (Kelly et al, “Measuring the activity of BioBrick promoters using an in vivo reference standard” Journal of Biological Engineering 2009 3:4). Promotores adequados para a expressão em levedura podem incluir, mas não se limitar a, TDH3, CCW12, CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO e TP1; e AOX1 (por exemplo, para uso em Pichia).
[00109] O vetor de expressão pode conter também um sítio de ligação a ribossômico para o início da tradução e um terminador de transcrição. O vetor de expressão pode incluir também sequências apropriadas para a amplificação da expression.
[00110] Em alguns casos, a expressão da sequência de aminoácidos pode ser otimizada para códon ou influenciada para aumentar a expressão da proteína in vivo. Isto pode ser obtido por vários algoritmos (Hanson e Coller, Nature Reviews
Molecular Cell Biology volume 19, páginas 20–30 (2018)), (Quax, et al Molecular Cell Review volume 59, julho 16, 2015). Em alguns casos, a sequência de aminoácidos nativa pode ser utilizada para codificar uma sequência de aminoácidos in vivo.
[00111] Em alguns casos, uma célula microbiana geneticamente modificada do relatório pode compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4 (ver Tabela 1) ou uma sequência de ácidos nucleicos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
[00112] Em alguns casos, uma célula microbiana geneticamente modificada do relatório pode expressar ou supraexpressar uma ou mais enzimas apresentando uma sequência de aminoácidos de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 5- 49 ou uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-
49.
[00113] Tabela 1: Sequências de DNA Sequências Origem do Sequência de Hospedeiro/ operon Sequência trpDCBA Procariótica/ atggctgacattctgctgctcgataatatcgactcttttacgtacaacctggca gatcagttgcgcagcaatgggcataacgtggtgatttaccgcaaccatattcc E. coli ggcgcaaaccttaattgaacgcctggcgaccatgagcaatccggtgctgat gctttctcctggccccggtgtgccgagcgaagccggttgtatgccggaactc ctcacccgcttgcgtggcaagctgcccattattggcatttgcctcggacatca ggcgattgtcgaagcttacgggggctatgtcggtcaggcgggcgaaattct ccacggtaaagcctccagcattgaacatgacggtcaggcgatgtttgccgg attaacaaacccgctgccggtggcgcgttatcactcgctggttggcagtaac attccggccggtttaaccatcaacgcccattttaatggcatggtgatggcagt acgtcacgatgcggatcgcgtttgtggattccagttccatccggaatccattct caccacccagggcgctcgcctgctggaacaaacgctggcctgggcgcag cagaaactagagccagccaacacgctgcaaccgattctggaaaaactgtat caggcgcagacgcttagccaacaagaaagccaccagctgttttcagcggtg gtgcgtggcgagctgaagccggaacaactggcggcggcgctggtgagca tgaaaattcgcggtgagcacccgaacgagatcgccggggcagcaaccgc gctactggaaaacgcagcgccgttcccgcgcccggattatctgtttgctgat 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cttacggtcgtggttacacctatttgctgtcacgagcaggcgtgaccggcgc agaaaaccgcgccgcgttacccctcaatcatctggttgcgaagctgaaaga gtacaacgctgcacctccattgcagggatttggtatttccgccccggatcag gtaaaagcagcgattgatgcaggagctgcgggcgcgatttctggttcggcc attgttaaaatcatcgagcaacatattaatgagccagagaaaatgctggcgg cactgaaagtttttgtacaaccgatgaaagcggcgacgcgcagttaa (SEQ ID NO: 1) trpDCBA Procariótica/ atgaacagatttctacaattgtgcgttgacggaaaaacccttactgccggtga ggctgaaacgctgatgaatatgatgatggcagcggaaatgactccttctgaa B. subtilis atgggggggatattgtcaattcttgctcatcggggggagacgccagaagag cttgcgggttttgtgaaggcaatgcgggcacacgctcttacagtcgatggac ttcctgatattgttgatacatgcggaacagggggagacggtatttccactttta atatctcaacggcctcggcaattgttgcctcggcagctggtgcgaaaatcgc taagcatggcaatcgctctgtctcttctaaaagcggaagcgctgatgttttaga ggagctagaggtttctattcaaaccactcccgaaaaggtcaaaagcagcatt gaaacaaacaacatgggatttctttttgcgccgctttaccattcgtctatgaaac atgtagcaggtactagaaaagagctaggtttcagaacggtatttaatctgcttg ggccgctcagcaatcctttacaggcgaagcgtcaggtgattggggtctattct gttgaaaaagctggactgatggcaagcgcactggagacgtttcagccgaag cacgttatgtttgtatcaagccgtgacggtttagatgagctttcaattacagcac cgaccgacgtgattgaattaaaggacggagagcgccgggagtataccgttt cacccgaagatttcggtttcacaaatggcagacttgaagatttacaggtgcag tctccgaaagagagcgcttatctcattcagaatatttttgaaaataaaagcagc agttccgctttatctattacggcttttaatgcgggtgctgcgatttacacggcgg gaattaccgcctcactgaaggaaggaacggagctggcgttagagacgatta caagcggaggcgctgccgcgcagcttgaacgactaaagcagaaagagga agagatctatgcttgaaaaaatcatcaaacaaaagaaagaagaagtgaaaa cactggttctgccggtagagcagcctttcgagaaacgttcatttaaggaggc gctggcaagcccgaatcggtttatcgggttgattgccgaagtgaagaaagc atcgccgtcaaaagggcttattaaagaggattttgtacctgtgcagattgcaa aagactatgaggctgcgaaggcagatgcgatttccgttttaacagacacccc gttttttcaaggggaaaacagctatttatcagacgtaaagcgtgctgtttcgatt cctgtacttagaaaagattttattgattctcttcaagtagaggaatcaagaaga atcggagcggatgccatattgttaatcggcgaggtgcttgatcccttacacctt catgaattatatcttgaagcaggtgaaaaggggatggacgtgttagtggagg ttcatgatgcatcaacgctagaacaaatattgaaagtgttcacacccgacattc 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trpDCBA Procariótica/ atgaaaacaaggagtcatcaaatgaaaaatgaacttgaaaaagtgatgtcag gtcgtgacatgaccgaaaatgaaatgaatatgcttgctaattcaattatccaag L. lactis gtgaattaagcgaggtccaaattgccagctttttagtagcattaaaaatgaaa ggtgaagcagcaagcgaattgactggtttggctcgagctttacaaaaagca gcgattcccattccaacaaatttgacaaatgcgatggacaattgtggaacag gaggcgaccgctcattcagttttaatatttcaaccacagccgcttttgttttagc agctggtggagtcaatatggcaaaacacggaaatcgctccattaccagtaaa tctggctcggcagacgttcttgaggccttaggaatcaatctttatttaccagca gaaaagttagctcaagtttttgacaaagttggtttagttttcctttttgctcaaaat ctccacccagcgatgaaatacttcacgccagtccgcagacaactcgaaattc caacaattatgaacttgactgggccactaatcaatccaattccacttgatacgc aacttcttggtacctcacgtccagatttacttgaattaacagcaaatgttttgaa aggcttgggccgtaagcgagcattagtcatcacaggtgaaggcggaatgg acgaagcaactccctttggacttaatcattacgcacttttagaaaatgacaaag tgactttgcatgaatttagagcctcagaagttggtatttcagaagttcaactcaa tgatattcgtggaggtgaagccccagaaaatgctgaaattttaaaaaatgtcc ttgaaaatcaaccgtcagcctttttagaaacgaccgttttaaatgccggacttg 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ccaaaaaaatgggaaaaaataaagtcattgctgaaacaggtgcaggccaac acggtgtcgcaagcgcaaccgcggctgccctctttggcatggaatgtacga tttatatgggtgaagaagacgttaaaagacaatctctcaatgtctttcgcatgg aattactcggggcaaaagttcattcagtaactgatggttcacgcgtacttaaa gatgcggttaatgcagcacttagagcatgggttgctcaagttgaagatacgc attatgtaatgggctcagttcttggaccacatccatttccacaaattgtgcgtga ttatcaagctgttattggacaggaagcgcgtgcccaatttttagaaaaagaaa ataaacttccagatgctttagtagcttgtgtcggtggaggttcaaattctatggg acttttttatcccttcgttaatgatgaatcagttgccatgtatggtgttgaagccg ctggccttgggattgatacaccacatcatgcggcaacaattactaaaggccg ccccggtgttcttcacggaacactcatggatgtccttcaagatgaaaatggtc aaatgttagaagcctttagtatttcagccggtttagactatccaggaatcggac cagaacactcttatttcaatgctgttggacgagcaaaatatgttgatattacag atgaagaagcacttgaaggttttaaaatcttatctagaactgaaggaattatcc cagcactagaaagttctcatgctatcgcctatgcagtcaaattagcaaaagaa ttaggagcagataaatcaatgattgtttgtctttcaggacgtggagataaggat gtggttcaagttaaagaacgacttgaagcagaaaaagaggtgaaaaaatga aaactttacaaatgactttaagcaataaaaaaaataattttattccttatatcatg 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gcaggtccaggtctggcgcgcgatctcgatgtccagccccttgggggctga agtggcagctgcggtggagggtgacgtcgataagctaattcttgatgcccat gaaggtggcagcggggaagtattcgactgggctacggtgccggccgctgt gaaggcaaagtctttgctcgcgggaggcatctctccggacaacgctgcgca ggcactcgctgtgggctgcgcaggtttggacatcaactctggcgtggaatac cccgccggtgcaggcacgtgggctggggcgaaagacgccggcgcgctg ctgaaaattttcgcgaccatctccacattccattactaaaggtttaaataggatc atgactgaaaaagaaaacttgggcggctccacgctgctgcctgcatacttcg gtgaattcggcggccagttcgtcgcggaatccctcctgcctgctctcgacca gctggagaaggccttcgttgacgcgaccaacagcccagagttccgcgaag aactcggcggctacctccgcgattacctcggccgcccaaccccgctgacc gaatgctccaacctgccactcgcaggcgaaggcaaaggctttgcgcggat cttcctcaagcgcgaagacctcgtccacggcggtgcacacaaaactaacca ggtgatcggccaggtgctgcttgccaagcgcatgggcaaaacccgcatcat cgcagagaccggcgcaggccagcacggcaccgccaccgctctcgcatgt gcgctcatgggcctcgagtgcgttgtctacatgggcgccaaggacgttgcc cgccagcagcccaacgtctaccgcatgcagctgcacggcgcgaaggtcat ccccgtggaatctggttccggcaccctgaaggacgccgtgaatgaagcgct gcgcgattggaccgcaaccttccacgagtcccactaccttctcggcaccgc cgccggcccgcacccattcccaaccatcgtgcgtgaattccacaaggtgat ctctgaggaagccaaggcacagatgctagagcgcaccggcaagcttcccg acgttgtggtcgcctgtgtcggtggtggctccaacgccatcggcatgttcgc agacttcattgacgatgaaggtgtagagctcgtcggcgctgagccagccgg tgaaggcctcgactccggcaagcacggcgcaaccatcaccaacggtcaga tcggcatcctgcacggcacccgttcctacctgatgcgcaactccgacggcc aagtggaagagtcctactccatctccgccggacttgattacccaggcgtcgg cccacagcacgcacacctgcacgccaccggccgcgccacctacgttggta tcaccgacgccgaagccctccaagcattccagtacctcgcccgctacgaag gcatcatccccgcactggaatcctcacacgcgttcgcctacgcactcaagc gcgccaagaccgccgaagaggaaggccagaacttaaccatcctcgtctcc ctatccggccgtggcgacaaggacgttgaccacgtgcgccgcaccctcga agaaaatccagaactgatcctgaaggacaaccgatgagccgttacgacgat ctttttgcacgcctcgacacggcaggggagggcgcctttgttcccttcatcat gctgagcgacccttcaccagaggaggctttccagatcatctccacagcaatc gaagctggcgcagatgcactggaacttggcgtacctttctccgacccagttg ccgatggccccaccgtcgcggaatcccacctccgcgcactcgacggcgg cgccaccgtagacagcgcactcgagcagatcaagcgcgtgcgcgcagcc tacccagaggttcccatcggaatgctcatctacggcaacgttcctttcacccg tggcttggatcgcttctaccaagagttcgctgaagctggcgcagactccatc ctcctgccagacgtcccagtccgcgaaggcgcaccgttttctgcagcagct gcagcagccggaattgatcccatttacatcgctccggccaacgccagcgag aaaaccctcgagggtgtctccgccgcatcaaagggctacatctacgccatct cccgcgacggcgtcaccggcaccgaacgtgaatcatccaccgacggcct gtccgcagtggtggacaacatcaagaaatttgatggcgcacccatcctcttg ggcttcggcatctcatcccctcagcacgtggcagacgcgattgcagcgggt gcttccggtgcgatcacgggttccgcgatcaccaagatcattgcttcccactg cgaaggtgagcacccgaacccgtccaccattcgagatatggacggtttgaa gaaggatctcactgagttcatctctgcgatgaaggcagcgaccaagaaggtt tag (SEQ ID NO: 4)
[00114] Tabela 2: Enzimas Enzima/ genbank/ Sequência Organismo número Fonte uniprot trpD / P00904 MADILLLDNIDSFTYNLADQLRSNGHNVVIYRN E. coli HIPAQTLIERLATMSNPVLMLSPGPGVPSEAGCM
PELLTRLRGKLPIIGICLGHQAIVEAYGGYVGQA GEILHGKASSIEHDGQAMFAGLTNPLPVARYHSL VGSNIPAGLTINAHFNGMVMAVRHDADRVCGF QFHPESILTTQGARLLEQTLAWAQQKLEPANTL QPILEKLYQAQTLSQQESHQLFSAVVRGELKPEQ LAAALVSMKIRGEHPNEIAGAATALLENAAPFPR PDILFADIVGTGGDGSNSINISTASAFVAAACGLK VAKHGNRSVSSKSGSSDLLAAFGINLDMNADKS RQALDELGVCFLFAPKYHTGFRHAMPVRQQLK TRTLFNVLGPLINPAHPPLALIGVYSPELVLPIAET LRVLGYQRAAVVHSGGMDEVSLHAPTIVAELH DGEIKSYQLTAEDFGLTPYHQEQLAGGTPEENR DILTRLLQGKGDAAHEAAVAANVAMLMRLHG
HEDLQANAQTVLEVLRSGSAYDRVTALAARG (SEQ ID NO: 5) trpD / P06559 MTSPATLKVLNAILDNPTPTLEEAIEVFTPLTVGE C. glutamicum YDDVHIAALLATIRTRGEQFADIAGAAKAFLAA
ARPFPITGAGLLDSAGTGGDGANTINITTGASLIA ASGGVKLVKHGNRSVSSKSGSADVLEALNIPLG LDVDRAVKWFEASNFTFLFAPAYNPAIAHVQPV RQALKFPTIFNTLGPLLSPARPERQIMGVANANH GQLIAEVFRELGRTRALVVHGAGTDEIAVHGTT LVWELKEDGTIEHYTIEPEDLGLGRYTLEDLVGG LGTENAEAMRATFAGTGPDAHRDALAASAGAM
FILNGDVDSLKDGAQKALSLLADGTTQAWLAK HEEIDYSEKESSND (SEQ ID NO: 6) trpD* P06559* MTSPATLKVLNAILDNPTPTLEEAIEVFTPLTVGE resistentes a YDDVHIAALLATIRTRGEQFADIAGAAKAFLAA retro- ARPFPITGAGLLDSAGTGGDGANTINITTGASLIA alimentação ASGGVKLVKHGNRSVSSKSGSADVLEALNIPLG (S149F, LDVDRAVKWFEAFNFTFLFAPAYNPEIAHVQPV A161E)/C. RQALKFPTIFNTLGPLLSPARPERQIMGVANANH glutamicum GQLIAEVFRELGRTRALVVHGAGTDEIAVHGTT
LVWELKEDGTIEHYTIEPEDLGLGRYTLEDLVGG LGTENAEAMRATFAGTGPDAHRDALAASAGAM
FILNGDVDSLKDGAQKALSLLADGTTQAWLAK HEEIDYSEKESSND (SEQ ID NO: 7) trpC / P00909 MQTVLAKIVADKAIWVETRKEQQPLASFQNEVQ E. coli PSTRHFYDALQGARTAFILECKKASPSKGVIRDD
FDPARIAAIYKHYASAISVLTDEKYFQGSFDFLPI VSQIAPQPILCKDFIIDPYQIILARYYQADACLLM LSVLDDEQYRQLAAVAHSLEMGVLTEVSNEEEL ERAIALGAKVVGINNRDLRDLSIDLNRTRELAPK LGHNVTVISESGINTYAQVRELSHFANGFLIGSA LMAHDDLNAAVRRVLLGENKVCGLTRGQDAK AAYDAGAIYGGLIFVATSPRCVNVEQAQEVMA AAPLQYVGVFRNHDIADVADKAKVLSLAAVQL HGNEDQLYIDNLREALPAHVAIWKALSVGETLP ARDFQHIDKYVFDNGQGGSGQRFDWSLLNGQT
LGNVLLAGGLGADNCVEAAQTGCAGLDFNSAV ESQPGIKDARLLASVFQTLRAY (SEQ ID NO: 8) trpC / P06560 MTSNNLPTVLESIVEGRRGHLEEIRARIAHVDVD C. glutamicum ALPKSTRSLFDSLNQGRGGARFIMECKSASPSLG
MIREHYQPGEIARVYSRYASGISVLCEPDRFGGD YDHLATVAATSHLPVLCKDFIIDPVQVHAARYF GADAILLMLSVLDDEEYAALAAEAARFDLDILT EVIDEEEVARAIKLGAKIFGVNHRNLHDLSIDLD RSRRLSKLIPADAVLVSESGVRDTETVRQLGGHS NAFLVGSQLTSQENVDLAARELVYGPNKVCGLT SPSAAQTARAAGAVYGGLIFEEASPRNVSRETLQ KIIAAEPNLRYVAVSRRTSGYKDLLVDGIFAVQI HAPLQDSVEAEKALIAAVREEVGPQVQVWRAIS MSSPLGAEVAAAVEGDVDKLILDAHEGGSGEVF DWATVPAAVKAKSLLAGGISPDNAAQALAVGC
AGLDINSGVEYPAGAGTWAGAKDAGALLKIFAT ISTFHY (SEQ ID NO: 9) trpB / P0A879 MTTLLNPYFGEFGGMYVPQILMPALRQLEEAFV E. coli SAQKDPEFQAQFNDLLKNYAGRPTALTKCQNIT
AGTNTTLILKREDLLHGGAHKTNQVLGQALLAK RMGKTEIIAETGAGQHGVASALASALLGLKCRI YMGAKDVERQSPNVFRMRLMGAEVIPVHSGSA TLKDACNEALRDWSGSYETAHYMLGTAAGPHP YPTIVREFQRMIGEETKAQILEREGRLPDAVIACV GGGSNAIGMFADFINETNVGLIGVEPGGHGIETG EHGAPLKHGRVGIYFGMKAPMMQTEDGQIEES YSISAGLDFPSVGPQHAILNSTGRADYVSITDDE ALEAFKTLCLHEGIIPALESSHALAHALKMMREN
PDKEQLLVVNLSGRGDKDIFTVHDILKARGEI (SEQ ID NO: 10) trpB / P06561 MTEKENLGGSTLLPAYFGEFGGQFVAESLLPAL C. glutamicum DQLEKAFVDATNSPEFREELGGILRDILGRPTPLT
ECSNLPLAGEGKGFARIFLKREDLVHGGAHKTN QVIGQVLLAKRMGKTRIIAETGAGQHGTATALA CALMGLECVVYMGAKDVARQQPNVYRMQLHG AKVIPVESGSGTLKDAVNEALRDWTATFHESHIL LGTAAGPHPFPTIVREFHKVISEEAKAQMLERTG KLPDVVVACVGGGSNAIGMFADFIDDEGVELVG AEPAGEGLDSGKHGATITNGQIGILHGTRSILMR NSDGQVEESYSISAGLDYPGVGPQHAHLHATGR ATYVGITDAEALQAFQILARYEGIIPALESSHAFA
YALKRAKTAEEEGQNLTILVSLSGRGDKDVDHV RRTLEENPELILKDNR (SEQ ID NO: 11) trpA / P00895 MQTQKPTLELLTCEGAYRDNPTALFHQLCGDRP E. coli ATLLLESADIDSKDDLKSLLLVDSALRITALGDT
VTIQALSGNGEALLALLDNALPAGVESEQSPNCR VLRFPPVSPLLDEDARLCSLSVFDAFRLLQNLLN VPKEEREAMFFGGLFSYDLVAGFEDLPQLSAEN NCPDFCFILAETLMVIDHQKKSTRIQASLFAPNEE EKQRLTARLNELRQQLTEAAPPLPVVSVPHMRC ECNQSDEEFGGVVRLLQKAIRAGEIFQVVPSRRF SLPCPSPLAAYYVLKKSNPSPYMFFMQDNDFTLF GASPESSLKYDATSRQIEIYPIAGTRPRGRRADGS LDRDLDSRIELEMRTDHKELSEHLMLVDLARND LARICTPGSRYVADLTKVDRYSYVMHLVSRVVG ELRHDLDALHAYRACMNMGTLSGAPKVRAMQ LIAEAEGRRRGSYGGAVGYFTAHGDLDTCIVIRS
ALVENGIATVQAGAGVVLDSVPQSEADETRNKA RAVLRAIATAHHAQETF (SEQ ID NO: 12) trpA / P06562 MSRYDDLFARLDTAGEGAFVPFIMLSDPSPEEAF C. glutamicum QIISTAIEAGADALELGVPFSDPVADGPTVAESHL
RALDGGATVDSALEQIKRVRAAYPEVPIGMLIY GNVPFTRGLDRFYQEFAEAGADSILLPDVPVREG APFSAAAAAAGIDPIYIAPANASEKTLEGVSAAS KGYIYAISRDGVTGTERESSTDGLSAVVDNIKKF DGAPILLGFGISSPQHVADAIAAGASGAITGSAIT
KIIASHCEGEHPNPSTIRDMDGLKKDLTEFISAM KAATKKV (SEQ ID NO: 13) Triptofano P0DPA6 MQVIPACNSAAIRSLCPTPESFRNMGWLSVSDA Des- VYSEFIGELATRASNRNYSNEFGLMQPIQEFKAFI carboxilase/P. ESDPVVHQEFIDMFEGIQDSPRNYQELCNMFNDI cubensis FRKAPVYGDLGPPVYMIMAKLMNTRAGFSAFT
RQRLNLHFKKLFDTWGLFLSSKDSRNVLVADQF DDRHCGWLNERALSAMVKHYNGRAFDEVFLC DKNAPYYGFNSYDDFFNRRFRNRDIDRPVVGGV NNTTLISAACESLSYNVSYDVQSLDTLVFKGETY SLKHLLNNDPFTPQFEHGSILQGFLNVTAYHRW HAPVNGTIVKIINVPGTYFAQAPSTIGDPIPDNDY DPPPILKSLVYFSNIAARQIMFIEADNKEIGLIFLV FIGMTEISTCEATVSEGQHVNRGDDLGMFHFGG
SSFALGLRKDCRAEIVEKFTEPGTVIRINEVVAAL KA (SEQ ID NO: 14) Triptofano ASU62242 MQVLPACQSSALKTLCPSPEAFRKLGWLPTSDE Des- VYNEFIDDLTGRTCNEKYSSQVTLLKPIQDFKTFI carboxilase/P. ENDPIVYQEFISMFEGIEQSPTNYHELCNMFNDIF cyanescens RKAPLYGDLGPPVYMIMARIMNTQAGFSAFTKE
SLNFHFKKLFDTWGLFLSSKNSRNVLVADQFDD KHYGWFSERAKTAMMINYPGRTFEKVFICDEHV PYHGFTSYDDFFNRRFRDKDTDRPVVGGVTDTT LIGAACESLSYNVSHNVQSLDTLVIKGEAYSLKH LLHNDPFTPQFEHGSIIQGFLNVTAYHRWHSPVN GTIVKIVNVPGTYFAQAPYTIGSPIPDNDRDPPPIL KSLVYFSNIAARQIMFIEADNKDIGLIFLVFIGMT EISTCEATVCEGQHVNRGDDLGMFHFGGSSFAL
GLRKDSKAKILEKFAKPGTVIRINELVASVRK (SEQ ID NO: 15) Triptofano PPQ80975 MQVLTACYTSTLKSLLPSFDAFRSMGWLPVSDK Des- TYNEWIGDLRSRASDKNYTSQVGLIQPIKDFKAF carboxilase/P. IESDPVVHQEFITMFEGIEESPRNYEELCHMFNDI cyanescens FRKAPVYGDLGPPVYMVMARIMNTQAGFSAFT
KQSLNSHFKRLFDTWGVFLSSKESRYVLVTDQF DDNHYGWLSDRAKSAMVKHYYGRTFEQVFICD EHAPYHGFQSYDDFFNRRFRDRDIDRPVVGGIEN TTLISAACESLSYNVCHDLQSLDTLFVKGESYSL KHLLNDDPFARQFEHGSILQGFLNVTAYHRWHA PVNGTILKIINVPGTYFAQAPHTIGDSLDSDHPPIL KSLAYFSNIAARQIMFIEADNKDIGLIFLVFIGMT EISTCEATVSEGQHVNRGDDLGMFHFGGSSFAL
GLRKDCKAEIFERFAEQGTVIKINEVVAAVKD (SEQ ID NO: 16) Triptofano PPQ70875 MAKTLRPTAQAFRELGWLPASDGVYNKFMKDL Des- TNRASNENHLCHVALLQPIQDFKTFIENDPVVYQ carboxilase/G. EFVCMFEGIEESPRNYHELCNMFNEIFRRAPYYG dilepis DLGPPVYMAMAKIMNTRAGFSAFTRESLNFHFK
RLFDTWGLFLSSPASRDVLVADKFDSKHYGWFS EPAKAAMMAQYDGRTFEQVFICDETAPYHGFKS YDDFFNRKFRAMDIDRPVVGGIANTTLIGSPCEA LSYNVSDDVHSLETLYFKGEGYSLRHLLHDDPS TEQFEHGSIIQGFLNITGYHRWHAPVSGTIMKIV DVPGTYFAQAPSTIGDPFPVNDYDPQAPILRSLA YFSNIAARQIIFIQADNEDIGLIILILIGMTEVSTCE
ALVCPGQHVERGDDLGMFHFGGSSFALGLRKNS KAAILEELKTQGTVIKVNDVIAAVQA (SEQ ID NO: 17) Triptofano P20711 MNASEFRRRGKEMVDYMANYMEGIEGRQVYP Des- DVEPGILRPLIPAAAPQEPDTFEDIINDVEKIIMPG carboxilase/H. VTHWHSPYFFAYFPTASSYPAMLADMLCGAIGC sapiens IGFSWAASPACTELETVMMDWLGKMLELPKAF
LNEKAGEGGGVIQGSASEATLVALLAARTKVIH RLQAASPELTQAAIMEKLVAYSSDQAHSSVERA GLIGGVKLKAIPSDGNFAMRASALQEALERDKA AGLIPFFMVATLGTTTCCSFDNLLEVGPICNKEDI WLHVDAAYAGSAFICPEFRHLLNGVEFADSFNF NPHKWLLVNFDCSAMWVKKRTDLTGAFRLDPT ILKHSHQDSGLITDYRHWQIPLGRRFRSLKMWF VFRMYGVKGLQAYIRKHVQLSHEFESLVRQDPR FEICVEVILGLVCFRLKGSNKVNEALLQRINSAK
KIHLVPCHLRDKFVLRFAICSRTVESAHVQRAW EHIKELAADVLRAERE (SEQ ID NO: 18) Triptofano I0DFJ0 MSENLQLSAEEMRQLGYQAVDLIIDHMNHLKSK Des- PVSETIDSDILRNKLTESIPENGSDPKELLHFLNR carboxilase/B. NVFNQITHVDHPHFLAFVPGPNNYVGVVADFLA atrophaeus SGFNVFPTAWIAGAGAEQIELTTINWLKSMLGFP
DSAEGLFVSGGSMANLTALTVARQAKLNNDIEN AVVYFSDQTHFSVDRALKVLGFKHHQICRIETDE HLRISVSALKKQIKEDRTKGKKPFCVIANAGTTN CGAVDSLNELADLCNDEDVWLHADGSYGAPAI LSEKGSAMLQGIHRADSLTLDPHKWLFQPYDVG CVLIRNSQILSKTFRMMPEYIKDSETNVEGEINFG ECGIELSRRFRALKVWLSFKVFGVAAFRQAIDH GIMLAEQVEAFLGKAKDWEVVTPAQLGIVTFRY IPSELASTDTINEINKKLVKEITHRGFAMLSTTEL
KEKVVIRLCSINPRTTTEEMLQIMMKIKALAEEV SISYPCVAE (SEQ ID NO: 19) Triptofano P17770 MGSIDSTNVAMSNSPVGEFKPLEAEEFRKQAHR Des- MVDFIADYYKNVETYPVLSEVEPGILRKRIPETA carboxilase/C. PILPEPLDDIMKDIQKDIIPGMTNWMSPNFYAFFP roseus ATVSSAAFLGEMLSTALNSVGFTWVSSPAATEL
EMIVMDWLAQILKLPKSFMFSGTGGGVIQNTTS ESILCTIIAARERALEKLGPDSIGKLVCYGSDQTH TMFPKTCKLAGIYPNNIRLIPTTVETDFGISPQVL RKMVEDDVAAGYVPLFLCATLGTTSTTATDPVD SLSEIANEFGIWIHVDAAYAGSACICPEFRHILDG IERVDSLSLSPHKWLLAILDCTCLWVKQPHLLLR ALTTNPEILKNKQSDLDKVVDFKNWQIATGRKF RSLKLWLILRSYGVVNLQSHIRSDVAMGKMFEE WVRSDSRFEIVVPRNFSLVCFRLKPDVSSLHVEE
VNKKLLDMLNSTGRVYMTHTIVGGIYMLRLAV GSSLTEEHHVRRVWDLIQKLTDDLLKEA (SEQ ID NO: 20) Triptamina n- ASU62238 MHIRNPYRTPIDYQALSEAFPPLKPFVSVNADGT metil- .1 SSVDLTIPEAQRAFTAALLHRDFGLTMTIPEDRL
CPTVPNRLNYVLWIEDIFNYTNKTLGLSDDRPIK transferase/P. GVDIGTGASAIYPMLACARFKAWSMVGTEVER cubensis KCIDTARLNVVANNLQDRLSILETSIDGPILVPIFE
ATEEYEYEFTMCNPPFYDGAADMQTSDAAKGF GFGVGAPHSGTVIEMSTEGGESAFVAQMVRESL KLRTRCRWYTSNLGKLKSLKEIVGLLKELEISNY
AINEYVQGSTRRYAVAWSFTDIQLPEELSRPSNP ELSSLF (SEQ ID NO: 21) Triptamina n- PPQ83230. MHIRNPYRSPIDYQALVEAFPPLRPYVTVNQDNT metil- 1 TSIDLTVPEVQRLYTAALLHRDFGLVIDLPEDRL transferase/P. CPTLLTRTPRLNYVLWVEDILKVTNTALGLSEDR cyanescens PVKGIDIGTGAAAIYPMLACARFKTWSMIGTEID
RKCIDTARVNVLTNNLQDRLSIIETSIDGPILVPIF EATTDYEYDFTMCNPPFYDGAADMQTSDAAKG FGFGVNAPHSGTVIEMSTEGGESAFVAQMVRES LDHRTRCRWFTSNLGKLKSLHEIVGLLREHQISN
YAINEYVQGTTRRYAIAWSFTNIRLPEDLTRPSN PELSSLF (SEQ ID NO: 22) Triptamina n- PPQ80976. MHNRNPYRDVIDYQALAEAYPPLKPHVTVNAD metil- 1 NTASIDLTIPEVQRQYTAALLHRDFGLTITLPEDR transferase/P. LCPTVPNRLNYVLWIEDIFQCTNKALGLSDDRPV cyanescens KGVDIGTGASAIYPMLACARFKQWSMIATEVER
KCIDTARLNVLANNLQDRLSILEVSVDGPILVPIF DTFERATSDYEFEFTMCNPPFYDGAADMQTSDA AKGFGFGVNAPHSGTVIEMATEGGEAAFVAQM VRESMKLQTRCRWFTSNLGKLKSLHEIVALLRE
SQITNYAINEYVQGTTRRYALAWSFTDIKLTEEL YRPSNPELGPLCSTFV (SEQ ID NO: 23) Triptamina n- PPQ70884. MHIRNPILTPPDYEALAEAFPALKPYVTVNPDKT metil- 1 TTIDFAIPEAQRLYTAALLYRDFGLTITLPPDRLC transferase/G. PTVPNRLNYVLWIQDILQITSAALGLPEARQVKG dilepis VDIGTGAAAIYPILGCSLAKNWSMVGTEVEQKCI
DIARQNVISNGLQDRITITANTIDAPILLPLFEGDS NFEWEFTMCNPPFYDGAADMETSQDAKGFGFG VNAPHTGTVVEMATDGGEAAFVSQMVRESLHL KTRCRWFTSNLGKLKSLHEIVGLLREHQITNYAI
NEYVQGTTRRYAIAWSFTDLRLSDHLPRPPNPDL SALF (SEQ ID NO: 24) Triptamina n- O95050 MKGGFTGGDEYQKHFLPRDILATYYSFDGSPSPE metil- AEMLKFNLECLHKTFGPGGLQGDTLIDIGSGPTI transferase/H. YQVLAACDSFQDITLSDFTDRNREELEKWLKKE sapiens PGAYDWTPAVKFACELEGNSGRWEEKEEKLRA
AVKRVLKCDVHLGNPLAPAVLPLADCVLTLLA MECACCSLDAYRAALCNLASLLKPGGHLVTTVT LRLPSYMVGKREFSCVALEKEEVEQAVLDAGFD
IEQLLHSPQSYSVTNAANNGVCFIVARKKPGP (SEQ ID NO: 25)
Triptamina n- WP_08616 MIYKFYQQHIFPHLLNQVMQTPSLMDQRRQLLL metil- 4675.1 PIAGDVLEIGFGTGVNLPFYQNVETLYALEPNAD transferase/A. LYQLAAKRIHESTIHVQHIQAYAEKLPFADASLD sp. ANC 4654 HIVSTWTLCSIENLAQALIEMYRVLKPNGTLHLV
EHVQYQDNAKLQHLQNLLTPIQKRLADGCHLN
RNIEQALRDAHFDFTEQHYFAAQGIPKLAQRMF FARAQKQPE (SEQ ID NO: 26) Triptamina A0A1L2E MEITSSAMLKTTTTPPHPLAGEKVPLSAFDRAAF benzoil H62 DVFVPLVFAYRAPAPSSEAVKEGLRVAVAAYPL transferase/O. VSGRIAVDGQGRRRRRRVLHVNNEGVLVLDAT sativa subsp. VEVDLDAVLAANVATDLYPALPEHSFGAALLQ japonica VQLTRFGCGGLVVGLIGHHHVFDGHSMSTFCAT
WARAVRDSEAFIVPSPSLDRAITGVPRSPPAPVF DHRSIEFKVGNKSSDSSGAAAAAAVEKIANIGVR FTAKFVAELKARVGGRCSTFECVLAHAWKKITA ARGLKPEEFTRVRVAVNCRRRANPPAPADLFGN MVLWAFPRLQVRRLLSSSYRDVVGAIRAAVAR VDAEYIQSFVDYVEVADARGEELAATAAEPGET LCPDLEVDSWLGFRFHEMDLGTGPPAAVLSPDL
PIEGLMILVPVGGDGGGVDLFVALADDHAQAFE QICYSLEEHAMIHSHL (SEQ ID NO: 27) Serotonin N- Q16613 MSTQSTHPLKPEAPRLPPGIPESPSCQRRHTLPAS acetil- EFRCLTPEDAVSAFEIEREAFISVLGVCPLILDEIR transferase/H. HFLTLCPELSLGWFEEGCLVAFIIGSLWDKERLM sapiens QESLTLHRSGGHIAHLHVLAVHRAFRQQGRGPIL
LWRILHHLGSQPAVRRAALMCEDALVPFYERFS
FHAVGPCAITVGSLTFMELHCSLRGHPFLRRNSG C (SEQ ID NO: 28) Dopamina N- Q94521 MEVQKLPDQSLISSMMLDSRCGLNDLYPIARLT acetil- QKMEDALTVSGKPAACPVDQDCPYTIELIQPED transferase/D. GEAVIAMLKTFFFKDEPLNTFLDLGECKELEKYS melanogaster LKPLPDNCSYKAVNKKGEIIGVFLNGLMRRPSPD
DVPEKAADSCEHPKFKKILSLMDHVEEQFNIFDV YPDEELILDGKILSVDTNYRGLGIAGRLTERAYE YMRENGINVYHVLCSSHYSARVMEKLGFHEVF
RMQFADYKPQGEVVFKPAAPHVGIQVMAKEVG PAKAAQTKL (SEQ ID NO: 29) Arilalquil- Q9PVD7 MMAPQVVSSPFLKPFFLKTPISVSSPRRQRRHTLP amina N- ASEFRNLTPQDAISVFEIEREAFISVSGECPLTLDE acetil- VLVFLGQCPELSMGWFEEGQLVAFIIGSGWDKE transferase/D. KLEQEAMSTHVPDSPTVHIHVLSVHRHCRQQGK rerio GSILLWRILQILRCLPGLRRALLVCEEFLVPFYQK
AGFKEKGPSAISVAALTFTEMEYQLGGLAYARR NSGC (SEQ ID NO: 30) Triptamina Q338X7 MAAVTVEITRSEVLRPSPASAGGGEMVPLTVFD hidroxi- RAATDGYIPTMFAWDAAAAAALSNDAIKDGLA cinamoil AVLSRFPHLAGRFAVDERGRKCFRLNNAGARVL transferase/O. EASAAGDLADALAHDVAAHVNQLYPQADKDR sativa VDEPLLQVQLTRYTCGGLVIGAVSHHQVADGQS
MSVFFTEWAAAVRTAGAALPTPFLDRSAVAAPR IPPAPAFDHRNVEFRGEGSRSHSYGALPLERMRN LAVHFPPEFVAGLKARVGGARCSTFQCLLAHA WKKITAARDLSPKEYTQVRVAVNCRGRAGPAV PTDYFGNMVLWAFPRMQVRDLLSASYAAVVGV IRDAVARVDERYIQSFVDFGEVAAGDELAPTAA EPGTAFCPDLEVDSWIGFRFHDLDFGGGPPCAFL
PPDVPIDGLLIFVPSCAAKGGVEMFMALDDQHV EALRQICYSMD (SEQ ID NO: 31) Triptamina 4- P0DPA7.1 MIAVLFSFVIAGCIYYIVSRRVRRSRLPPGPPGIPI hidroxilase/P. PFIGNMFDMPEESPWLTFLQWGRDYNTDILYVD cubensis AGGTEMVILNTLETITDLLEKRGSIYSGRLESTM
VNELMGWEFDLGFITYGDRWREERRMFAKEFS EKGIKQFRHAQVKAAHQLVQQLTKTPDRWAQH IRHQIAAMSLDIGYGIDLAEDDPWLEATHLANEG LAIASVPGKFWVDSFPSLKILPAWFPGAVFKRKA KVWREAADHMVDMPYETMRKLAPQGLTRPSY ASARLQAMDLNGDLEHQEHVIKNTAAEVNVGG GDTTVSAMSAFILAMVKYPEVQRKVQAELDAL TNNGQIPDYDEEDDSLPILTACIKELFRWNQIAPL AIPHKLMKDDVYRGILIPKNTLVFANTWAVLND PEVYPDPSVFRPERILGPDGKPDNTVRDPRKAAF GYGRRNCPGIHLAQSTVWIAGATLLSAFNIERPV
DQNGKPIDIPADFTTGFFRHPVPFQCRFVPRTEQ VSQSVSGP (SEQ ID NO: 32) Triptamina 4- ASU62250 MIVLLVSLVLAGCIYYANARRVRRSRLPPGPPGI hidroxilase/P. .1 PLPFIGNMFDMPSESPWLRFLQWGRDYHTDILIL cyanescens NAGGTEIIILNTLDAITDLLEKRGSMYSGRLESTM
VNELMGWEFDLGFITYGERWREERRMFAKEFSE KNIRQFRHAQIKAANQLVRQLIKTPDRWSQHIRH QIAAMSLDIGYGIDLAEDDPWIAATQLANEGLA EASVPGSFWVDSFPALQUILPSWLPGAGFKRKA KVWKEGADHMVNMPYETMKKLTVQGLARPSY ASARLQAMDPDGDLEHQEHVIRNTATEVNVGG GDTTVSAVSAFILAMVKYPEVQRQVQAELDALT SKGVVPNYDEEDDSLPILTACVKEIFRWNQIAPL AIPHRLIKDDVYRGILIPKNALVYANSWAVLNDP EEYPNPSEFRPERILSSDGKPDPTVRDPRKAAFG YGRRNCPGIHLAQSTVWIAGATLLSVFNIERPVD
GNGKPIDIPATFTTGFFRHPEPFQCRFVPRTQEIL KSVSG (SEQ ID NO: 33) Triptamina 4- PPQ98746. MINLPLSLVLVGCVYYIVSRRIRRSRLPPGPPGIPI hidroxilase/P. 1 PFVGNMYDMPSESPWLTFLQWGREYNDRGLTTI cyanescens FRVESTMVNKLMGWEFDLGFITYGDRWREERR
MFSKEFSEKAIKQFRHSQVKAAHRFVQQLAANG EPSRLPHYIRHQIAAMSLDIGYGVDLAQDDPWL EAAHLANEGLATASVPGTFWIDSFPALQUILPSW FPGAGFKRQAKIWKEAADHMVNMPYERMKKL APQGLARPSYASARLQAMDPNGDLEYQEQVIKN TASQVNVGGGDTTVSAVSAFILAMVIYPEVQRK VQAELDAVLSNGRIPDYDEENDSMPILTACVKE LFRWNQIAPLAIPHKLVKDDIYRGILIPKNTLVFA NSWAVLNDPEVYPDPSVFRPERILGPDGKPNDT VRDPRKAAFGYGRRNCPGIHLALSTVWITAATL
LSVFDIERPVDHKGNPIDIPAAFTKGFFRHPEPFQ CRFVPRNEDSLKSLSGL (SEQ ID NO: 34) Triptamina 4- PPQ70878. MQGNPAVLLLLLTLTLCVYYAHSRRARRARLPP hidroxilase/G. 1 GPPGIPLPFVGNLFDMPSNSPWLTILQWGETYQT dilepis DIIILNAGGTEMVILNTLEAITDLLEKRGSIYSGRF
ESTMVNELMGWDFDLGFITYGERWREERRMFS KEFNEKNIKQFRHAQIRAANLLVGQLTKTPERW HQLIRHQIAAMSLDIGYGIDLLEGDPWLEATQLA NEGLAIASVPGSFWVDSLPILKYMPSWFPGAEFK RKAKVWRESTDHMINMPYEKMKKLMVQDLVR PSYASARLQEMDPNGDLQHQEHVIRNTAMEVN VGGADTTVSAVAAFILAMVKYPDVQRKVQAEL DAVGCRDELPEFDEDNDALPILTACVKEIFRWN QVAPLAIPHRLDKDDHYRGYIIPKNALVFANTW AVLNDPSVYPDPSEFRPERILGPDGKPDPRIRDPR KAAFGYGRRACPGIHLAQSTVWIVGATLLSVFDI ERPMDANGKPIDIPAAFTTGFFRYSIHDCLVVET
MHPANTVCVDIPNPSDADSFLVPKRLSNPHPIIDL PSRNPACQEDGVVALSNAWRSTLPVQDV (SEQ ID NO: 35) P450 redutase/ NP_01190 MPFGIDNTDFTVLAGLVLAVLLYVKRNSIKELL S. cerevisiae 8.1 MSDDGDITAVSSGNRDIAQVVTENNKNILVLYA
SQTGTAEDYAKKFSKELVAKFNLNVMCADVEN YDFESLNDVPVIVSIFISTYGEGDFPDGAVNFEDF ICNAEAGALSNLRYNMFGLGNSTYEFFNGAAKK AEKHLSAAGAIRLGKLGEADDGAGTTDEDYMA WKDSILEVLKDELHLDEQEAKFTSQFQYTVLNEI TDSMSLGEPSAHILPSHQLNRNADGIQLGPFDLS QPYIAPIVKSRELFSSNDRNCIHSEFDLSGSNIKYS TGDHLAVWPSNPLEKVEQFLSIFNLDPETIFDLKP LDPTVKVPFPTPTTIGAAIKHILEITGPVSRQLFSS LIQFAPNADVKEKLTLLSKDKDQFAVEITSKYFN IADALQUILSDGAKWDTVPMQFLVESVPQMTPR YYSISSSSLSEKQTVHVTSIVENFPNPELPDAPPV VGVTTNLLRNIQLAQNNVNIAETNLPVHYDLNG PRKLFANYKLPVHVRRSNFRLPSNPSTPVIMIGP GTGVAPFRGFIRERVAFLESQKKGGNNVSLGKHI LFYGSRNTDDFLYQDEWPEYAKKLDGSFEMVV AHSRLPNTKKVYVQDKLKDYEDQVFEMINNGA
FIYVCGDAKGMAKGVSTALVGILSRGKSITTDEA TELIKMLKTSGRYQEDVW (SEQ ID NO: 36) P450 redutase/ GAQ4194 MAQLDTLDLVVLAVLLVGSVAYFTKGTYWAV A. niger 8.1 AKDPYASTGPAMNGAAKAGKTRNIIEKMEETG
KNCVIFYGSQTGTAEDYASRLAKEGSQRFGLKT MVADLEEYDYENLDQFPEDKVAVFVLATYGEG EPTDNAVEFYQFFTGDDVAFESGASADEKPLSK LKYVAFGLGNNTYEHYNAMVRQVDAAFQKLG AQRIGSAGEGDDGAGTMEEDFLAWKEPMWAA LSESMDLQEREAVYEPVFCVTENESLSPEDESVI LGEPTQSHLQGTPKGPYSAHNPFIAPIAESRELFT VKDRNCLHMEISIAGSNLSYQTGDHIAVWPTNA GAEVDRFLQVFGLEGKRDSVINIKGIDVTAKVPI PTPTTYDAAVRYYMEVCAPVSRQFVATLAAFAP DEESKAEIVRLGSDKDYFHEKVTNQCFNIAQAL QSITSKPFSAVPFSLLIEGITKLQPRYYSISSSSLVQ KDKISITAVVESVRLPGASHMVKGVTTNILLALK QKQNGDPSPDPHGLTYSITGPRNKYDGIHVPVH VRHSNFKLPSDPSRPIIMVGPGTGVAPFRGFIQER AALAAKGEKVGPTVLFFGCRKSDEDFLYKDEW KTYQDQLGDNLKIITAFSREGPQKVYVQHRLRE HSELVSDLLKQKATFYVCGDAANMAREVNLVL
GQIIAAQRGLPAEKGEEMVKHMRSSGSYQEDV WS (SEQ ID NO: 37) P450 redutase/ PPQ81263. MTDPNRTTFSSALHPLAVVSMASSSSDVFVLGL P. cyanescens 1 GVVLAALYIFRDQLFAASKPKVAPVSTTKPANG
SANPRDFIAKMKQGKKRIVIFYGSQTGTAEEYAI RLAKEAKQKFGLASLVCDPEEYDFEKLDQLPED SIAFFVVATYGEGEPTDNAVQLLQNLQDDSFEFS NGERKLSGLKYVVFGLGNKTYEHYNLIGRTVDA QLAKMGAVRVGERGEGDDDKSMEEDILEWKD GMWDAFAAAMGVEEGQGGDSADFVVSELESHP PEKVILGEYSARALTKTKGIHDAKNPLAAPITVA RELFQSVVDRNCVHVEFNIEGSGITYQHGDHVG LWPLNPDVEVERLLCVLGLTEKRDAVISIESLDP ALAKVPFPVPTTYAAVLRHYIDVSAVAGRQILG TLSKFAPTPEAEAFLKNLNTNKEEYHNVVANGC LKLGEILQVATGNDITVAPTPGNTTKWPIPFDIIV SAIPRLQPRYYSISSSPKVHPNTIHATVVVLKYEN VPTDPIPRKWVYGVGSNFLLNLKHAINKEPVPFI TQNGEQRVGVPEILIAGPRGSYKTESHFKAPIHV RRSTFRLPTNPKSPVIMIGPGTGVAPFRGFVQER VALARRSVEKNGPESLNDWGRISLFYGCRRSDE DFLYKDEWPQYQEELKGKFKLHCAFSRENYKP DGSKIYVQDLIWEDREHIADAILNGKGYVYICGE AKSMSKQVEEVLARILGEAKGGSGAVEGVAEIK LLKERSRLMLDYELAFRKFSQLQFARVATFAML RSSFSLQRLFSTSSALRNVQRPIRDHLQKQDAPW EPRVAESAQSVSEEILKAQTPLQVPTNAKATTSD SRTDSREPLTAYDLQLVKKRVREWSEQAMIALR NRADDFTAHTKTTFSQLGLQLNRVTGYEEIEAL KRGVVEQEERINVARQAARKAKVAYEEAVVQR SNSQREVNDLLQRKSSWMDSDVGRFTTLVRQD HLYEQEEARAKAAVEETEEAVDREFSKLLRTILA RYHEEQVWSDKIRSASTYGSLAALGLNMLVFIM AIVVVEPWKRRRLAQTFERKIEELSEENGIKLDA TMLSIAQQIEQQVNLIGSLKDDISRNAPVIPEPAQ EVRAETEIEEETSPFVSLEFLPLSRRQLEVAAVGA GAFASNLWFGFGDDALELLMLSTRANKVPPRNL SRIHMTSFIIKAHEDRPTNSTWKQDLECAFCRIIR GELPASKVYENDKVIAILDIMPLRKGHTLVIPKA HISRLSELPSELASSVGEAVCKVAHALTQALDNT GLNVVCNQEYAQAVPHVHYHVIPAPKFGYPGH
GVESTNGVVGGKAPLTHREMHQKEFEAREELD DDDAKVLLKSIRARL (SEQ ID NO: 38) P450 redutase/ PPQ83917. MSVSEDDHRGLLIVYATETGNAQDAADYIARQC P. cyanescens 1 RRIAFQCRVVNIDSFLLPDLLSETIVIFVVSTTGSG
VEPRSMTPLWTSLLRGDLPTDTFEDLYFSVFGLG DTAYEKFCWAAKKLSRRLESIGGIEFYMRGEGD EQHPLGIDGALQPWTDGLINKLLEVAPLPPGEEI KPINDVPLPRVLLKDTSKTALNHSADPLKSDLQY HKAIVKKNDRITAADWYQDVRHLVFDFQDNIQ YSPGDVAVIHPVALEHDVDAFLVTMSWQNIADE PFEIEQAMYDQSLPDHLPPITTLRTLFTRFLDFNA VPRRSFFQILRYFTSDEREQEKLDEFLSAAGADE LYEYCYRVRRTIHEVLSEFRHVKIPKGYIFDVFPP LRPREFSIASSIKTHLHQIHLCVAIVKYRTKLKIPR KGVCTYILSILKPGDTLLVGIRRGLLRLPGKNDTP VIFIGPGTGIAPMRSAIEQRIANGCHENTLYFGCR SASKDQHYGSEWQAYAANQELKYRSAFSRDGV EGEARVYVQDLIRQDSERIWDLVGHHKAWVLV
SGSSNKMPAAVKDAVAYAVEKYGGLSAEEAKE YVHLMVKEGRLIEECWS (SEQ ID NO: 39) P450 redutase/ PPQ77370. MSLNGSGLLTPSSEVTLSSPSTPVLIYTFPQSNGT P. cyanescens 1 RPKSPVYIHIDDPGVQVSTLVEYISSQPENSSSVYI
YDVAEQVGFGTSTKQWAKQGLDISPVVDLQTR AGAGLSLVGRLSQGTSIDAVKGTVLTAYTTPSG LALMAPSFAILPVPSSTTRLIIQVPTVTPVGETLTL SPTLSPLASVWSILPENVAVLLSSSPQQTVDFATL AYKVIDSHIVHLFDHHSSAREIGRTFTPLTTIGKS GLTLQEAVKQAGYEPLEYHGDPEAKTIVVLLNS SLALSLKAAVSVGTSGLGVVVVNVLRPWDEAAI QTIIPSSATIVHVLDDVPNAVTQGSLYVDVFSAL WSTTPKRSVHSHRITPSQTQKFIAAGGEFLRFVE EVTHIAVSEPSVASIKKTLFFSVPDSPLALLSRFV QELFLTKRTISSRHLTDYDVYSKPGGISAQRLLIS RDKSTDNVPVQAILPLDPNSVGHSDFLGVLDHN LLKTHSLLKHAKKGSIVVVASPWTPDEFSANITY EVAEVITSRQLSVYTIDVKSIANDLELFIQEQKIE KGEAQVLLFEFVFLRFILGAAATEQAIIQLMSVLF DDIDLTKFSAAAWLGLKPVVVALPEVTPSDSPTL KEFEANAIAVETSEGQTVVNGARLSTWHDAAK HLLFPSAFSPPTDPDSLSNPALRPEVPDTTFLVTC TVNKRLTPLEYDRNVFHLEFDTSGTGLKYAIGE ALGVHGWNDEQEVLDFCEWYGVDPDRLITIPVI GSDDGKMHTRTVLQALQQQIDLFGRPPKSFYTD LAEYATVDVDRYALRFIGSPEGVSTFKKMSEKD TVSFGDVLKKYKSARPGIERLCELIGDIKPRHYSI ASAQSVVGDRVDLLVVTVDWLTPEGSPRYGQC TRILAGLKIGQKVTVSIKPSVMKLPPNLKQPLIM AGLGTGAAPFRAFLQHLAWLASKGEEIGPVFYY FGSRYQAAEILYGEEIEAFILGGVITRAGLAFSRD GPKKVYIQHKMLEDSETLAKMLHDDDGVFILCG
PTWPVPDVYEALVNALVKYKGSDPVKAGEILES LKEEERYVLEVY (SEQ ID NO: 40) 4-hidroxi- P0DPA8 MAFDLKTEDGLITILTKHLSLDVDTSGVKRLSGG triptamina FVNVTWRIKLNAPYQGHTSIILKHAQPHMSTDE quinase/P. DFKIGVERSVYEYQAIKLMMANREVLGGVDGIV cubensis SVPEGLNYDLENNALIMQDVGKMKTLLDYVTA
KPPLATDIARLVGTEIGGFVARLHNIGRERRDDP EFKFFSGNIVGRTTSDQLYQTIIPNAAKYGVDDP LLPTVVKDLVDDVMHSEETLVMADLWSGNILL QLEEGNPSKLQKIYILDWELCKYGPASLDLGYFL GDCILISRFQDEQVGTTMRQAILQSYARTSKHSI NYAKVTAGIAAHIVMWTDFMQWGSEEERINFV
KKGVAAFHDARGNNDNGEITSTLLKESSTA (SEQ ID NO: 41) 4-hidroxi- PPQ83229. MAFDLKTPEGLLLILTRHLSLDVDPSGVKRLSGG triptamina 1 FVNVTWRIRLNAPYQGHTSIILKHAQPHLSSDED quinase/P. FKIGVERSAYEYQALKVMSANQEVLGGDDSRVS cyanescens VPEGLHYDVENNALIMQDVGTMKTLLDYATAK
PPLSTEIASLVGTEIGAFIARLHNLGRKRRDQPAF KFFSGNIVGRTTADQLYQTIIPNAAKYGINDPLLP TVVKDLVGEVMNSEETLIMADLWSGNILLEFVE GNPSELKKIWLVDWELCKYGPASLDMGYFLGD CILIARFQDELVGTTMRKAILKGYARTAKGTINY
SKVTASIGAHLVMWTDFMKWGNYEEREEFVKK GVEALHDAWEDNNDGEITSVLVNEASST (SEQ ID NO: 42)
4-hidroxi- PPQ98758. MAFDLKTVEGLIVILTKCLSLEVDSSGVKRLSGG triptamina 1 FVNVTWRIRLNAPYQGHTSIILKHAQPHMSTDK quinase/P. DFKIGVERSVYEYQALKVISANREALGGIDSRVS cyanescens APEGLHYDVENNALIMQDVGTLKTLMDYVIEKP
AISTEMARLIGTEIGDFVARLHSIGRQKRDQPDF KFFSGNIVGRTTADQLYQTILPNTAKYGIDDPLL PTVVKDLVDEAMQSEETLIMADLWTGNILVEFE EGNLSVLKKIWLVDWELCKYGPVRLDMGYFLG DCFLISRFKNEQVAKAMRQAFLQRYNRVSDTPI NYSVATTGIAAHIVMWTDFMNWGTEEERKEYV
KKGVAGIHDGRNHNVDGEITSILMQEASTA (SEQ ID NO: 43) 4-hidroxi- PPQ70874. MTFDLKTEEGLLVILTQHLSLDVDLDGLKRLSG triptamina 1 GFVNITWRIRLNAPFKGYTNIILKHAQPHLSSDE quinase/G. NFKIGVERSAYEYRALKIVSESPILSGDDNLVFVP dilepis QSLHYDVVHNALIVQDVGSLKTLMDYVTARPSL
SSEMAKLVGGQIGAFIARLHNIGRENKDHPEFNF FSGNIVGRTTAVQLYETIVPNATKYDIDDPIIPVV VQELIEEVKGSDETLIMADLWGGNILLEFGKDSS DLGKIWVVDWELCKYGPPSLDMGYFLGDCFLL AQFQDEKVATAMRRAILENYAKIAKVPMDYDR
STTGIGAHLVMWTDFMNWGSDEERKTSVEKGV RAFHDAKRDNKEGEIPSILLRESSRT (SEQ ID NO: 44) Multicobre NP_11661 MLFYSFVWSVLAASVALAKTHKLNYTASWVTA oxidase/S. 2.1 NPDGLHEKRMIGFNGEWPLPDIHVEKGDRVELIL cerevisiae TNGFQDNTATSLHFHGLFQNTSLGNQLQMDGPS
MVTQCPIVPGQTILYNFTVPEQVGTFWYHAHMG AQYGDGMRGAFIIHDPEEPFEYDHERVITLSDHY HENYKTVTKEFLSRYNPTGAEPIPQNILFNNTMN VTLDFTPGETILFRFLNVGLFVSQYIILEDHEMSI VEVDGVYVKPNFTDSIILSAGQRMSVLIKAKDK MPTRNYAMMQIMDETMLDVVPPELQLNQTIQM RYGHSLPEARALNIEDCDLDRATNDFILEPLIERD LLAHYDHQIVMDVRMVNLGDGVKYAFFNNITY VTPKVPTLTTLLTSGKLASDPRIYGDNINAQLLK HNDIIEVVLNNYDSGRHPFHLHGHNFQIVQKSPG FHVDEAYDESEQDEMTVPYNESAPLQPFPERPM VRDTVVLEPSGHVVLRFRADNPGVWYFHCHVD WHLQQGLASVFIEAPVLLQEREKLNENILDICKA ADIPVVGNAAGHSNDWFDLKGLPRQPEPLPKGF
TTEGILALIISTIIGVWGLYSIAQYGIGEVIPNDEK VYHTLREILAENEIEVSRG* (SEQ ID NO: 45) aralquilamina O02785 MSTPSIHCLKPSPLHLPSGIPGSPGRQRRHTLPAN N-acetil- EFRCLTPKDAAGVFEIEREAFISVSGNCPLNLDEV transferase/ RHFLTLCPELSLGWFVEGRLVAFIIGSLWDEERL Bos taurus TQESLTLHRPGGRTAHLHALAVHHSFRQQGKGS
VLLWRILQHAGGQPAVRRAVLMCEDALVPFYQ
RFGFHPAGPCAVVVGSLTFTEMHCSLRGHAALR RNSDR (SEQ ID NO: 46) Triptamina 5- O96370 MISTESDLRRQLDENVRSEADESTKEECPYINAV hidroxilase/ QSHHQNVQEMSIIISLVKNMNDMKSIISIFTDRNI Schistosoma NILHIESRLGRLNMKKHTEKSEFEPLELLVHVEV mansoni PCIEVERLLEELKSFSSYRIVQNPLMNLPEAKNPT
LDDKVPWFPRHISDLDKVSNSVLMYGKELDAD HPGFKDKEYRKRRMMFADIALNYKWGQQIPIVE YTEIEKTTWGRIYRELTRLYKTSACHEFQKNLGL LQDKAGYNEFDLPQLQVVSDFLKARTGFCLRPV AGILSARDFLSGLAFRVFYCTQYIRHQADPFYTP EPDCCHELLGHVPMLADPKFARFSQEIGLASLGT SDEEIKKLATCYFFTIEFGLCRQDNQLKAYGAGL LSSVAELQHALSDKAVIKPFIPMKVINEECLVTTF QNGYFETSSFEDATRQMREFVRTIKRPFDVHYNP
YTQSIEIIKTPKSVAKLVQDLQFELTAINESLLKM NKEIRSQQFTTNKIVTENRSSGS* (SEQ ID NO: 47) Acetil- P46597 MGSSEDQAYRLLNDYANGFMVSQVLFAACELG serotonin O- VFDLLAEAPGPLDVAAVAAGVRASAHGTELLLD metil- ICVSLKLLKVETRGGKAFYRNTELSSDILTTVSPT transferase/ SQCSMLKYMGRTSYRCWGHLADAVREGRNQIL Homo sapiens ETFGVPAEELFTAIYRSEGERLQFMQALQEVWS
VNGRSVLTAFDLSVFPLMCDLGGGAGALAKEC MSLYPGCKITVFDIPEVVWTAKQHFSFQEEEQID FQEGDFFKDPLPEADLYILARVLHDWADGKCSH LLERIYHTCKPGGGILVIESLLDEDRRGPLLTQLY
SLNMLVQTEGQERTPTHYHMLLSSAGFRDFQFK KTGAIYDAILARK (SEQ ID NO: 48) Noribogaina A0A2Z5P0 DAMKSAELFKAQAHIFKQVFCFTNGASLKCAVQ 10-O-metil- W7 LGIPDAIDNHGKAMTLSELTDALPINPSKAPHIHR transferase / LMRILVTAGFFVEERLGNGKEEKANGYALTPSS Tabernanthe RLLLKNKPLSLRASALTMLDPVTVKTWNALSE iboga WFQNEDQTAFETAHGKNMWDFFAEDPGLSKKF
NESMASDSQLVTEVLVTKCKFVFEGLTSMVDVG GGTGTVAGAIAKTFPSLRCTVFDLPHVVANLEPT ENLDFVAGDMFGKIPPANAIFLKWVLHDWNDE DCVKILKNCKRAIPGKEKGGKVIIVDIIMETEKH
DIDEFDYAKMCMDMEMLVLCNSKERTEKELAM LVSEAGFSGYKIFPVLGIRSLIEVYP (SEQ ID NO: 49)
EXEMPLOS
[00115] Estes exemplos são providos apenas com propósitos ilustrativos e não limitam o escopo das reivindicações providas aqui.
[00116] Exemplo 1: Detecção de 4-hidroxitriptamina em células engenheiradas
[00117] A 4-hidroxitriptamina pode ser oxidada a um produto azul para determinar alto fluxo biossintético através da rota a montante (caixa azul). Alternativamente, a 4-hidroxitriptamina pode ser empregada para a conversão a O- fosforil-4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina ou psilocibina, pela expressão da metiltransferase ou quinase.
[00118] Exemplo 2. Cepas de Levedura e Bacterianas e Condições de Crescimento
[00119] Plasmídeos de expressão de gene único foram transformados em E. coli TG1 quimicamente competentes e plasmídeos de genes múltiplos foram transformados em TransforMaxTM EPI300TM (Epicentre) E. coli eletrocompetentes. As cepas foram construídas pela utilização de competência química ou elétrica. As seleções foram realizadas em ampicilina (25 mg/L) e canamicina (25 mg/L) contendo LB como indicado. A cepa de fundo MG1655 com DE3 lambda (um fago construído que expressa RNA polimerase T7 sob o controle de um promotor lacUV5 promoter) foi utilizada como cepa hospedeira e propagada a 37°C. A cepa de S. cerevisiae BY4741 (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) foi utilizada para os experimentos neste estudo e propagada a 30°C.
[00120] As culturas de E. coli foram propagadas em caldo LB (1 litro de meio contendo 10 gramas de triptona, 5 gramas de extrato de levedura e 10 gramas de cloreto de sódio). As culturas de levedura foram crescidas em YPD (10 g/L de extrato de levedura Bacto; 20 g/L de peptona Bacto; 20 g/L D-glicose). O método de transformação com acetato de lítio foi utilizado para transformar a levedura com plasmídeos contendo os respectivos marcadores auxotróficos. A seleção foi realizada em meio dropout sintético (6,7 g/L nitrogênio de levedura base Difco sem aminoácidos; 2 g/L de mistura de aminoácidos definidos menos a respectiva autotrofia, sem nitrogênio de levedura base (US Biological); 20 g/L de D-glicose ou a respectiva fonte de corbono; 20 g/L de ágar BD Difco foram utilizados para as placas). O pH foi ajustado quando apropriado com NaOH ou HCl.
[00121] Plasmídeos e clonagem
[00122] Um esquema de clonagem Golden Gate hierárquico foi utilizado para a montagem dos plasmídeos parte da sequência de codificação, cassetes de expressão de proteína de levedura plasmídeos de genes múltiplos. Todas as sequências de codificação de proteína foram sintetizadas ou amplificadas por PCR para omitir os sítios internos de BsaI e BsmBI para uso na clonagem Golden Gate. As sequências de codificação de proteína para enzimas da rota fúngica foram otimizadas para códon para E. coli ou S. cerevisiae e sintetizadas por tecnologias de DNA integrado (Coralville, IA).
[00123] Exemplo 3. Produção de triptaminas substituídas por alimentação de indois e antranilatos substituídos
[00124] A cepa de fundo MG1655 com lambda DE3 é um construto de fago que expressa a RNA polimerase T7 sob o controle de um promotor lacUV5 e foi utilizada como cepa hospedeira. A cepa foi modificada para apresentar a rota biossintética (por exemplo, trpE, trpD, trpC, trpB e trpA) e a triptofano desaminase (tnaA) knocked out. Este material genético foi removido pelo sistema vermelho λ modificado como descrito por Datsenko e Wanner (2000). A cepa resultante foi denominada bNAB001.
[00125] A rota biossintética do triptofano, trpDCBA (SEQ ID NO: 1), foi clonada sob o controle do operon LacI em um plasmídeo de resistência a ampicilina com origem p15a que foi denominado pRJP1376 (FIG. 1). Este plasmídeo foi introduzido na bNAB001 e resultou na cepa bNAB002. Da mesma forma, a cepa bNAB002, por indução com isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG), permite a expressão do operon trpDCBA para a biossíntese de triptofano substituído pela adição de antranilato substituído e indol substituído. De maneira a converter adicionalmente os compostos triptofano substituídos resultantes nas triptaminas sequintes, foram clonados dois plasmídeos. As sequências de codificação para a triptofano descarboxilase de P. cubensis (psiD, SEQ ID NO: 14) para a conversão de triptofanos substituídos a triptaminas; 4-hidroxitriptamina quinase de P. cubensis (psiK, SEQ ID NO: 41); e triptamina N-metiltransferase de P. cubensis (psiM, SEQ ID NO: 21) foram clonadas em um plasmídeo contendo um gene de resistência a canamicina e origem BR322 de replicação e foi denominado pRJP1460 (FIG. 2). As sequências de codificação foram orientadas em um operon multicistrônico a jusante de uma sequência de promotor T7. Este plasmídeo foi transformado em bNAB002 e a cepa resultante foi denominada bNAB003. As sequências de codificação para a triptofano descarboxilase de B. atrophaeus (SEQ ID NO: 19) e etanolamina aromática metiltransferase de H. sapiens (SEQ ID NO: 25) foram clonadas a jusante do promotor e sequências de ligação ribossômicas com um gene de resistência a canamicina e sequências de origem BR322 de replicação de maneira a formar o plasmídeo pRJP1625 (FIG. 3).
O plasmídeo pRJP1625 foi transformado em bNAB002 e a cepa resultante foi denominada bNAB004.
[00126] Uma cultura de bNAB003 de uma noite foi utilizada para inocular 1 L de cultura LB (mais canamicina e ampicilina) a 0,1 OD600. A cultura foi crescida para OD600 de 0,5 e resfriada para 18ºC em gelo antes da indução com 0,5 mM de IPTG para a expressão da rota das proteínas trpDCBA e rota das proteínas psiMDK. A cultura foi transferida para um agitador a 18ºC a 200 RPM de agitação por 16 horas. As células foram colhidas, lavadas com água estéril e novamente suspendidas em meio M9 (0,2% de glicose, 40 mM de Na2HPO4, 20 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 0,1 de mM CaCl2, 0,5 mM de IPTG, com a adição de 100 mg/L de L-serina, 2 g/L de citrato de sódio e 2 g/L de extrato de levedura). A cultura foi dividida em culturas de 10 mL em tubos de cultura esterilizados. Foram adicionados 4 mM de 5-hidroxiindol, 4-hidroxiindol, 7-hidroxiindol e 4-cloroindol em tubos separados. Após 3 dias de incubação a 30ºC, os meios das culturas foram amostrados pela centrifugação de 1 mL de cultura a 18000 rpm e transferência dos meios clarificados para frascos de amostra. A análise foi realizada por cromatografia/espectrometria de massa (LCMS) com um sistema 1260 Infinity LC conectado a um espectrômetro de massa 6120 Quadrupole (Agilent Technologies). Uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 Guard (4,6 cm × 12,5 cm, 5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) foi conectada a uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 mm × 100 mm, 3.5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) a 20°C pela utilização de uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As fases móveis de água a e acetonitrila continham 0,1% de ácido fórmico como modificador de pH. O gradiente de eluição (proporção volumétrica de água:acetonitrila) foi como se segue: 98:2 (0–2 min), declive linear de 98:2 a 5:95 (2–17 min), 5:95 (17–22 min), declive linear de 5:95 a 98:2 (22–23 min) e 98:2 (23–28 min). A absorbância foi medida pela utilização de um detector de matriz de diodo para a análise UV–Vis. A MS foi conduzida em electrospray de ionização positiva a pressão atmosférica (API-ES positiva) modo de voltagem de fragmentador de 100-V com detecção iônica ajustada para ambos os modos de varredura completa (50–1200 m/z). A detecção das triptaminas foi conduzida por extração de massas iônicas da triptamina correspondente não encontrada na amostra de controle não alimentada. Na cultura alimentada com 5-hidroxiindol, foi detectada 5-hidroxitriptamina. Na cultura de 4-hidroxiindol, foram detectadas 4-hidroxitriptamina, 4- fosforiloxitriptamina e 4-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina. Na cultura alimentadas com 7-hidroxiindol, foram detectadas 7-hidroxitriptamina, 7- fosforiloxitriptamina e 7-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina. Na cultura alimentada com 4-cloroindol, foi detectadas 4-cloro-N,N-dimetiltriptamina (ver FIG. 4).
[00127] Uma cultura de bNAB004 de uma noite foi utilizada para inocular 1 L de meio de cultura LB (mais canamicina e ampicilina) a 0,1 de OD600. A cultura foi crescida para OD600 de 0.5 e resfriada para 18ºC em gelo antes da indução com 0,5 mM de IPTG para a expressão da rotas das proteínas trpDCBA e rota das proteínas psiMDK. A cultura foi transferida para um agitador a 18ºC com 200 RPM de agitação por 16 horas. As células foral colhidas, lavadas com água estéril e novamente suspendidas em meio M9 (0,2% de glicose, 40 mM de Na2HPO4, 20 mM de KH2PO4, 1 mM de MgSO4, 0,1 mM de CaCl2, 0,5 mM de IPTG, com a adição de 100 mg/L de L-serina, 2 g/L de citrato de sódio e 2 g/L de extrato de levedura). A cultura foi dividida em culturas de 10 mL em tubos de cultura esterilizados. Foram adicionados 4 mM de 5-hidroxiindol, 4-cloroindol e 5- bromoantranilato em tubos separados. Após 3 dias de incubação a 30ºC, os meios de cultura foram amostrados por centrifugação de 1 mL de cultura a 18000 rpm e transferência dos meios clarificados para frascos de amostra. A análise foi realizada por cromatografia/espectrometria de massa (LCMS) com u sistema 1260 Infinity LC conectado a um espectrômetro de massa 6120 Quadrupole (Agilent Technologies). Uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 Guard (4,6 cm × 12,5 cm, 5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) foi conectada a uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 mm × 100 mm, 3,5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) a 20°C pela utilização de uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As fases móveis de água e acetonitrila continham 0,1% de ácido fórmico como modificador de pH. O gradiente de eluição (proporção volumétrica água:acetonitrila) foi como se segue: 98:2 (0–2 min), declive linear de 98:2 a 5:95 (2–17 min), 5:95 (17–22 min), declive linear de 5:95 a 98:2 (22–23 min) e 98:2 (23–28 min). A absorbância foi medida pela utilização de um detector de matriz de diodo para a análise UV– Vis. A MS foi conduzida em electrospray de ionização positiva a pressão atmosférica (API-ES positiva) modo a voltagem de fragmentador de 100-V com detecção iônica ajustada para ambos os modos de varredura completa (50–1200 m/z). a detecção de triptaminas foi conduzida por extração das massas iônicas da triptamina correspondente na amostra de controle não alimentada. Na cultura alimentada com 5-hidroxiindol, foram detectadas 5-hidroxitriptamina, 5- hidroximetiltriptamina e 5-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina. Na cultura alimentada com 4-cloroindol, foram detectadas 4-clorotriptamina e 4-cloro-N,N- dimetiltriptamina. Na cultura alimentada com 5-bromoantranilato, foram detectadas 5-bromotriptamina, 5-bromo-N-metiltriptamina e 5-bromo-N,N- dimetiltriptamina (ver FIG. 4).
[00128] Exemplo 4. Produção de triptaminas substituídas por levedura engenheirada.
[00129] Antranilato produzido por biossíntese a partir do metabolismo de carbono central (isto é, antranilato substituído com hidrogênio) pode ser metabolizado para formar triptaminas substituídas com modificação genética. As substituições da posição amina da triptamina e do anel indol foram investigadas. Um plasmídeo de gene múltiplo com sequências de replicação CEN6/ARS4, cassete de expressão de URA3 e resistência a canamicina foi clonado para conter sequências de codificação de triptofano descarboxilase de B. atrophaeus (SEQ ID NO: 19), triptofano 4-hidroxilase de P. cyanescens (SEQ ID NO: 33), 4- hidroxitriptamina quinase de P. cubensis (psiK, SEQ ID NO: 41) e triptamina N- metiltransferase de P. cubensis (psiM, SEQ ID NO: 21) sob o controle de pares de um promotor de levedura de alta atividade e pares de terminador (por exemplo,
promotores pCCW12, pTDH3 e pPGK1 ou terminadores tADH1, tPGK1 e tENO1) e e foi denominado plasmídeo pRJP1608 (FIG. 5). A rota biossintética de conversão do ácido antranílico presente no metabolismo da levedura a triptaminas por enzimas codificadas no pRJP1608 é mostrada na FIG. 6. Um segundo plasmídeo de gene múltiplo com sequências de replicação CEN6/ARS4, cassete de expressão de URA3 e resistência a canamicina foi clonado para conter sequências de codificação de triptofano descarboxilase de B. atrophaeus (SEQ ID NO: 19), triptofano 4-hidroxilase de P. cyanescens (SEQ ID NO: 33) e aralquilamina N- acetiltransferase de B. taurus (SEQ ID NO: 46) sob o controle de pares de promotor de levedura de alta atividade e terminador (por exemplo, promotores pCCW12, pTDH3 e pPGK1 ou terminadores tADH1, tPGK1 e tENO1) e foi denominado plasmídeo pRJP1618 (FIG. 7). A rota biossintética de conversão do ácido antranílico presente no metabolismo de levedura a triptaminas por enzimas codificadas no pRJP1618 é mostrada na FIG. 8.
[00130] A cepa BY4741 de S. cerevisiae (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) foi utilizada para os experimentos neste estudo e propagada a 30°C. O plasmídeo pRJP1608 foi transformado em BY4741 pelo protocolo de acetato de lítio e selecionado em meio completo sintético sem uracil. A cepa resultante, yNAB001, foi isolada e genotipada. O plasmídeo pRJP1618 foi transformado em BY4741 pelo protocolo de acetato de lítio e selecionado em meio completo sintético sem uracil. A cepa resultante, yNAB002, foi isolada e genotipada.
[00131] Colônias de yNAB001 e yNAB002 foram utilizadas para inocular culturas de 5 mL de e foram crescidas a 30ºC em um agitador rotativo a 225 rpm. Os meios das culturas foram amostrados pela centrifugação de 1 mL da cultura a 18000 rpm e transferência dos meios clarificados para frascos de amostra. A análise foi realizada por cromatografia/espectrometria de massa (LCMS) com um sistema 1260 Infinity LC conectado a um espectrômetro de massa 6120 Quadrupole (Agilent Technologies). Uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 Guard (4,6 cm × 12,5 cm, 5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) foi conectada a uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 mm × 100 mm, 3,5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) a 20°C utilizando-se uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. As fases móveis de água e acetonitrila continham 0,1% de ácido fórmico como modificador de pH. O gradiente de eluição (proporção volumétrica água:acetonitrila) foi como se segue: 98:2 (0–2 min), declive linear de 98:2 a 5:95 (2–17 min), 5:95 (17–22 min), declive linear de 5:95 a 98:2 (22–23 min) e 98:2 (23–28 min). A absorbância foi medida pela utilização de um detector de matriz de diodo para a análise UV–Vis. A MS foi conduzida no modo de electrospray de ionização positiva à pressão atmosférica (API-ES positive) a voltagem do fragmentador de 100-V como detecção iônica ajustada para ambos os modos de varredura completa (50–1200 m/z).
[00132] A detecção das triptaminas foi conduzida por extração da triptamina correspondente não encontrada na amostra de controle não alimentada. Adicionalmente, foi conduzida uma MS/MS em tandem. Na cultura da yNAB001, as massas iônicas para triptamina, 4-hidroxitriptamina, 4-fosforiloxitriptamina, 4- hidroxi-N,N-dimetiltriptamina e 4-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina foram detectadas (FIG. 6). Os dados de fragmentação da MS/MS em tandem foram coletados para 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina a uma massa iônica positiva de 205,1335 m/z (FIG. 9) e para 4-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina a uma massa iônica positiva de 285,0999 m/z (FIG. 10). Na cultura da yNAB002, as massas iônicas para triptamina, 4-hidroxitriptamina, N-acetil-triptamina e 4-hidroxi-N- acetil-triptamina foram detectadas (FIG. 8). Os dados de fragmentação de MS/MS em tandem foram coletados para N-acetil-triptamina a uma massa iônica positiva de 203,1179 m/z (FIG. 11) e para 4-hidroxi-N-acetil-triptamina a uma massa iônica positiva de 219,1128 (FIG. 12). No meio de uma cepa de BY4741 não transformada foram detectados apenas níveis traço de triptamina e nenhuma das triptaminas mencionadas anteriormente dos meios de yNAB001 e yNAB002.
[00133] Exemplo 5. Produção de derivados de triptamina a partir da alimentação de triptaminas pela utilização de células engenheiradas.
[00134] Os microrganismos podem ser geneticamente modificados para expressar enzimas metabólicas capazes de derivatizar triptaminas. Substituições hidroxil e fosforiloxi nas posições do indol de triptaminas foram investigadas pela expressão de enzimas heterólogas em levedura e alimentando as triptaminas com várias substituições amina. Um plasmídeo de expressão de gene único com sequências CEN6/ARS4 de replicação, cassete de expressão de URA3 e resistência a canamicina foi clonado para conter uma sequência de codificação de triptamina 4-hidroxilase de P. cyanescens (SEQ ID NO: 33) e foi denominado pRJP1639 (FIG. 13). Um plasmídeo de expressão de gene único com sequências CEN6/ARS4 de replicação, cassete de expressão de URA3 e resistência a canamicina foi clonado para conter uma sequência de codificação de triptamina 5- hidroxilase de S. mansoni (SEQ ID NO: 47) e foi denominado pRJP1640 (FIG. 14). Um plasmídeo de expressão de gene único com sequências CEN6/ARS4 de replicação, cassete de expressão de LEU2 e resistência a canamicina foi clonado para conter uma sequência de codificação de 4-hidroxitriptamina quinase de P. cubensis (SEQ ID NO: 41) e foi denominado pRJP1641 (FIG. 15).
[00135] A cepa BY4741 de S. cerevisiae (MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) foi utilizada para os experimentos neste estudo e foi propagada a 30°C. O plasmídeo pRJP1639 foi transformado em BY4741 pelo protocolo de acetato de lítio e selecionado em meio completo sintético sem uracil. A cepa resultante, yNAB003, foi isolada e genotipada. O plasmídeo pRJP1640 foi transformado em BY4741 pelo protocolo de acetato de lítio e selecionado em meio completo sintético sem uracil. A cepa resultante, yNAB004, foi isolada e genotipada. O plasmídeo pRJP1641 foi linearizado por digestão com NotI e transformado na cepa yNAB003 pelo protocolo de acetato de lítio e selecionado em meio completo sintético sem leucina. A cepa resultante, yNAB005, foi isolada e genotipada.
[00136] Culturas de yNAB003, yNAB004 e yNAB005 crescidas durante uma noite foram utilizadas para inocular culturas de 250 mL de meio completo sintético e foram crescidas a 30ºC em uma um agitador rotativo a 225 rpm. As culturas foram concentradas em 25 mL de meio completo sintético sem uracil e transferidas para tubos de cultura de 5 mL.
Foram adicionados 5 mM de várias triptaminas (incluindo 5-metoxi-N,N-dimetiltriptamina, N,N-diisopropil-triptamina, N-metil- N-isopropiltriptamina, N,N-dimetiltriptamina, N,N-tetrametilenotriptamina e N,N- dipropiltriptamina) a tubos separados (FIG. 16). Após 3 dias de incubação a 30ºC, os meios das culturas foram amostrados pela centrifugação de 1 mL de cultura a 18000 rpm e transferência dos meios clarificados para frascos de amostra.
A análise foi realizada por cromatografia/espectrometria de massa (LCMS) com um sistema 1260 Infinity LC conectado a um espectrômetro de massa 6120 Quadrupole (Agilent Technologies). Uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 Guard (4,6 cm × 12,5 cm, 5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) foi conectada a uma coluna Zorbax Eclipse Plus C18 (4,6 mm × 100 mm, 3,5 µm de empacotamento, Agilent Technologies) a 20°C utilizando-se uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min.
As fases móveis de água e acetonitrila continham 0.1% de ácido fórmico como o modificador de pH.
O gradiente de eluição (proporção volumétrica água:acetonitrila) foi como se segue foi como se segue: 98:2 (0–2 min), declive linear de 98:2 to 5:95 (2–17 min), 5:95 (17–22 min), declive linear de 5:95 a 98:2 (22–23 min) e 98:2 (23–28 min). A absorbância foi medida pela utilização de um detector de matriz de diodo para a análise UV–Vis.
A MS foi conduzida no modo de electrospray de ionização positiva à pressão atmosférica (API-ES positiva) à voltagem do fragmentador de 100-V com detecção iônica ajustada para ambos os modos de varredura completa (50–1200 m/z). A detecção das triptaminas foi conduzida por extração das massas iônicas da correspondente triptamina não encontrada na amostra de controle não alimentada ou no estoque químico da triptamina original.
Derivados 4-hidroxi das triptaminas alimentadas foram identificados para a cultura de yNAB003 culture.
Derivados 5-hidroxi das triptaminas alimentadas foram identificados para a cultura de yNAB004. As massas iônicas para 4-hidroxi-N,N-dipropiltriptamina e 4-fosforiloxi-N,N-
dipropiltriptamina foram identificadas no meio de cultura de yNAB005 alimentado com N,N-dipropiltriptamina (ver FIG. 16).
[00137] Exemplo 6. Determinação colorimétrica para alta atividade de hidroxilação
[00138] Sem a adição de um grupo protetor na posição hidroxil da 4-hidroxi- triptamina e do 4-hidroxitriptofano, os compostos irão oxidar a um composto colorido. Da mesma forma, a subsequente atividade de hidroxilase e oxidação na triptamina e triptofano pode ser utilizada como um indicador da atividade da hidroxilase. De maneira a demonstrar isto, a formação de cor da cepa yNAB003 com alta quantidade de triptamina 4-hidroxilase de P. cyanescens (SEQ ID NO: 33) foi comparada à atividade de BY4741 tipo selvagem. Quatro culturas de 3 mL separadas foram iniciadas para BY4741 tipo selvagem e yNAB003 por 3 dias a 30ºC em meio completo sintético com a adição de 4 mM de triptamina a 750 rpm de agitação de alta frequência. Após o cultivo, estas culturas foram centrifugadas para peletizar as células para observação da formação de pigmento. A formação de um produto azul foi observada nas culturas de yNAB003 como uma indicação da atividade de triptamina 4-hidroxilase e não foi observada nas culturas de BY4741 tipo selvagem (FIG. 17).
[00139] Embora as realizações preferidas da presente invenção tenham sido mostradas e descritas, será óbvio aos técnicos no assunto que tais realizações são providas apenas como exemplo. Não é pretendido que a invenção seja limitada pelos exemplos específicos providos no relatório. Embora a invenção tenha sido descrita com referência ao relatório mencionado anteriormente, as descrições e ilustrações das realizações aqui não devem ser consideradas no sentido limitante. Numerosas variações, alterações e substituições irão ocorrer aos técnicos no assunto sem se afastarem da invenção. Além disto, deve ser entendido que todos os aspectos da invenção são estão limitados às apresentações, configurações ou proporções relativas apresentadas aqui as quais dependem de uma variedade de condições e variáveis. Deve ser entendido que várias alternativas às realizações da invenção descritas aqui podem ser empregadas na prática da invenção.
É, portanto, contemplado que a invenção deve cobrir também quaisquer de tais alternativas, modificações, variações ou equivalentes.
Pretende-se que as reivindicações anexas definam o escopo da invenção e que os métodos e estruturas dentro do escopo destas reivindicações e suas equivalentes estejam cobertos por estas.

Claims (93)

REIVINDICAÇÕES
1. Célula microbiana que produz uma triptamina, caracterizada pelo fato de conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um antranilato a uma triptamina.
2. Célula microbiana que produz uma triptamina, caracterizada pelo fato de conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um indol a uma triptamina.
3. Célula microbiana que produz uma triptamina, caracterizada pelo fato de conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptofano a uma triptamina.
4. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato do dito antranilato ser um antranilato substituído.
5. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizada pelo fato do dito antranilato ser onde: cada R é independentemente um hidrogênio, um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
6. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato do dito indol ser um indol substituído.
7. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 2 ou 6, caracterizada pelo fato do dito indol ser onde: cada R é independentemente um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1- C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
8. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizada pelo fato da dita triptamina ser uma triptamina substituída.
9. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8 caracterizada pelo fato da dita triptamina ser onde: cada R é independentemente um hidrogênio, um halogênio, -OH, C1-C5 alquil, C1-C5 alcoxi, NO2, NH, COOH, CN, enxofre, SO3, SO4 ou PO4.
10. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-9, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma ou mais de: trpD, trpB, trpC e trpA.
11. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas compreenderem um operon multicistrônico que codifica pelo menos duas de trpD, trpB, trpC e trpA.
12. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato do dito operon multicistrônico apresentar uma sequência de ácidos nucleicos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-4.
13. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-12, caracterizada pelo fato da dita trpD compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-7.
14. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-13, caracterizada pelo fato da dita trpC compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 8 e 9.
15. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-14, caracterizada pelo fato da dita trpB compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 10 e 11.
16. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 10-15, caracterizada pelo fato da dita trpA compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 80% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 12 e 13.
17. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma descarboxilase.
18. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato da dita descarboxilase ser uma triptofano descarboxilase.
19. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato da dita triptofano descarboxilase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 14-20.
20. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-19, caracterizada pelo fato da dita ou mais enzimas compreenderem uma transferase.
21. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato da dita transferase ser selecionada do grupo consistindo em: triptamina N-metiltransferase, triptamina benzoil transferase, serotonina N- acetiltransferase, dopamina N-acetiltransferase, arilalquilamina N- acetiltransferase e triptamina hidroxicinamoil transferase.
22. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato da dita transferase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 21-31 ou 46.
23. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem triptamina 4-hidroxilase.
24. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato da dita triptamina 4-hidroxilase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35.
25. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-24, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma P450 redutase.
26. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 25, caracterizada pelo fato da dita P450 redutase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 36-40.
27. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma quinase.
28. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato da dita quinase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44.
29. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 ou 8-28, caracterizada pelo fato do dito antranilato ser produzido por biossíntese pela dita célula microbiana.
30. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 ou 8-28, caracterizada pelo fato do dito antranilato ser alimentado à dita célula microbiana engenheirada.
31. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 4, 5 ou 8-30, caracterizada pelo fato do dito antranilato ser 5- bromoantranilato, 6-hidroxiantranilato, 5-hidroxiantranilato, 6-cloroantranilato ou 5-cloroantranilato.
32. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 6, 7 ou 8-28, caracterizada pelo fato do dito indol ser produzido por biossíntese pela dita célula microbiana.
33. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 6, 7 ou 8-28, caracterizada pelo fato do dito indol ser alimentado à dita célula microbiana engenheirada.
34. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 6, 7, 8-28, 32 ou 33, caracterizada pelo fato do dito indol ser selecionado do grupo consistindo em: 5-hidroxiindol, 4-hidroxiindol, 7-hidroxiindol e 4- cloroindol, 5-bromoindol ou 4-fluorindol.
35. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-34, caracterizada pelo fato de secretar a dita triptamina em caldo de cultura.
36. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-35, caracterizada pelo fato da dita triptamina ser selecionada de qualquer triptamina descrita nas FIG. 4, FIG. 6 ou FIG. 8.
37. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizada pelo fato da dita triptamina ser selecionada do grupo consistindo em: triptamina, 5-hidroxitriptamina, 5-hidroximetiltriptamina, 5- hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 5-fosforiloximetiltriptamina, 5-fosforiloxi-N,N- dimetiltriptamina, 4-hidroxitriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 4- fosforiloxitriptamina, 4-fosforiloxi-N,N-triptamina, 7-hidroxitriptamina, 7- fosforiloximetiltriptamina, 7-fosforiloxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-cloro- triptamina, 4-cloro-N,N-dimetiltriptamina, 5-bromotriptamina, 5-bromo- metiltriptamina, 5-bromo-N-metiltriptamina, 5-bromo-N,N-dimetiltriptamina, N- acetil-triptamina, 4-hidroxi-N-acetil-triptamina.
38. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizada pelo fato da dita célula microbiana ser uma célula eucariótica.
39. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-38, caracterizada pelo fato da dita célula microbiana ser uma célula de levedura.
40. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelo fato da dita célula de levedura ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.
41. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 39 ou 40, caracterizada pelo fato da dita célula de levedura não expressar uma ou mais das aminotransferase I (aro8) e fenilpiruvato descarboxilase (aro10) aromáticas.
42. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-41, caracterizada pelo fato da dita célula de levedura supraexpressar uma ou mais entre fosforibosilantranilato isomerase (TRP1), antranilato sintase (TRP2), indol-3-glicerolfosfato sintase (TRP3), antranilato fosforibosil transferase (TRP4) e triptofano sintase (TRP5).
43. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-41, caracterizada pelo fato da dita célula de levedura supraexpressar um mutante de uma ou mais entre fosforibosilantranilato isomerase (TRP1), antranilato sintase (TRP2), indol-3-glicerolfosfato sintase (TRP3), antranilato fosforibosil transferase (TRP4) e triptofano sintase (TRP5).
44. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 39-43, caracterizada pelo fato da dita célula de levedura apresentar duas ou mais cópias da dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que atuam sinergicamente.
45. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-44, caracterizada pelo fato da dita célula microbiana ser um procarioto.
46. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-45, caracterizada pelo fato de ser uma célula bacteriana.
47. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato da dita célula bacteriana ser da espécie Escherichia coli ou Corynebacterium glutamicum.
48. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizada pelo fato da dita célula bacteriana não expressar um ou mais dos genes de triptofanase (tna), elemento repressor de triptofano (trpR) ou antranilato sintase (trpE).
49. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-48, caracterizada pelo fato pelo menos de uma cópia d dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas ser integrada de forma estável no genoma da célula microbiana.
50. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de duas ou mais cópias da dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas serem integradas de forma estável no genoma da célula microbiana.
51. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato das ditas duas ou mais cópias da dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas serem da mesma sequência.
52. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato das ditas duas ou mais cópias da dita uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas serem de uma sequência distinta.
53. Método para a síntese de uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4 ou 7-52 na presença de um antranilato, sintetizando assim a dita triptamina.
54. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a alimentação do dito antranilato à dita célula microbiana.
55. Método de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato do dito antranilato ser produzido por biossíntese pela dita célula microbiana.
56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 53-55, caracterizado pelo fato do dito antranilato ser um antranilato substituído.
57. Método para a síntese de uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 ou 5-52 na presença de indol, sintetizando assim a dita triptamina.
58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a alimentação do dito indol à dita célula microbiana.
59. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato do dito indol ser produzido por biossíntese pela dita célula microbiana.
60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 57-59, caracterizado pelo fato do dito indol ser um indol substituído.
61. Método para a síntese de uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 7-52 na presença de triptofano, sintetizando assim a dita triptamina.
62. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a alimentação do dito triptofano à dita célula microbiana.
63. Método de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato do dito triptofano ser produzido por biossíntese pela dita célula microbiana.
64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 53-63, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a purificação da dita triptamina a partir da dita cultura.
65. Célula microbiana caracterizada pelo fato de conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética para converter uma triptamina a um derivado de triptamina.
66. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 65, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma triptamina 4-hidroxilase.
67. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pelo fato da dita triptamina 4-hidroxilase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-35.
68. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-67, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma triptamina 5-hidroxilase.
69. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato da dita triptamina 5-hidroxilase compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 47.
70. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-69, caracterizada pelo fato da dita uma ou mais enzimas compreenderem uma 4-hidroxitriptamina quinase.
71. Célula microbiana de acordo com a reivindicação 70, caracterizada pelo fato da dita 4-hidroxitriptamina quinase apresentar uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID NOs: 41-44.
72. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-71, caracterizada pelo fato da dita triptamina ser uma triptamina substituída.
73. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-72, caracterizada pelo fato da dita triptamina ser selecionada do grupo consistindo em: 5-metoxi-N,N-dimetil-triptamina, N,N-diisopropil-triptamina, N- metil-N-isopropiltriptamina, N,N-dimetiltriptamina, N,N-tetrametilenetriptamina, N,N-dipropiltriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, triptamina, 4- hidroxitriptamina, 5-hidroxitriptamina, ibogamina, 4-hidroxiibogamina e 5- hidroxiibogamina.
74. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-73, caracterizada pelo fato do dito derivado de triptamina ser qualquer derivado de triptamina descrito na FIG. 16.
75. Célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-73, caracterizada pelo fato do dito derivado de triptamina ser selecionado do grupo consistindo em: 5-hidroxi-N,N-diisopropil-triptamina, 5-hidroxi-N-metil- N-isopropiltriptamina, 5-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 5-hidroxi-N,N- tetrametilenetriptamina, 5-hidroxi-N,N-dipropiltriptamina, 4,5-metoxi-N,N- dimetil-triptamina, 4-hidroxi-N,N-diisopropil-triptamina, 4-hidroxi-N-metil-N- isopropiltriptamina, 4-hidroxi-N,N-dimetiltriptamina, 4-hidroxi-N,N- tetrametilenetriptamina, 4-hidroxi-N,N-dipropiltriptamina, 4-fosforiloxi-N,N- dipropiltriptamina, 4-hidroxitriptamina, 5-hidroxitriptamina, 4-metoxitriptamina, 5-metoxitriptamina, 4-fosforiloxitriptamina, 5-fosforiloxitriptamina, 4-
hidroxiibogamina, 5-hidroxiibogamina, 4-fosforiloxiibogamina e 5- fosforiloxiibogamina.
76. Método para a síntese de um derivado de triptamina a partir de uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender: o cultivo de uma célula microbiana de acordo com qualquer uma das reivindicações 65-75 na presença de uma triptamina, sintetizando assim o dita derivado de triptamina.
77. Método de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a purificação do dito derivado de triptamina a partir da dita cultura.
78. Vetor caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma ou mais enzimas compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-49.
79. Célula microbiana caracterizada pelo fato de conter uma ou mais sequências de ácidos nucleicos heterólogas que codificam uma enzima a partir de uma rota de síntese de triptamina ou um fragmento desta compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência a qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-49.
80. Método para avaliar os níveis de 4-hidroxitriptamina em uma célula microbiana conforme definida na reivindicação 79, caracterizado pelo fato de compreender a detecção de uma cor ou um produto fluorescente da dita 4- hidroxitriptamina dentro da dita célula microbiana.
81. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato da dita 4-hidroxitriptamina ser oxidada dentro da dita célula microbiana, produzindo assim uma 4-hidroxitriptamina oxidada.
82. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato da dita 4-hidroxitriptamina oxidada ser diretamente proporcional a um nível de 4- hidroxitriptamina sintetizada dentro da dita célula microbiana.
83. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de uma oxidação da dita 4-hidroxitriptamina oxidada ser catalisada por sulfato de ferro.
84. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de uma oxidação da dita 4-hidroxitriptamina oxidada ser catalisada por uma enzima expressa pela dita célula microbiana.
85. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato da dita enzima compreender uma sequência de aminoácidos apresentando pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência à SEQ ID NO: 45.
86. Método para a conversão de um antranilato a uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender a incubação do dito antranilato na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um antranilato a uma triptamina.
87. Método para a conversão de um indol a uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender a incubação do dito indol na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte um indol a uma triptamina.
88. Método para a conversão de triptofano a uma triptamina, caracterizado pelo fato de compreender a incubação do dito triptofano na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte triptofano a uma triptamina.
89. Método para a conversão de uma triptamina a uma triptamina derivatizada, caracterizado pelo fato de compreender a incubação da dita triptamina na presença de uma ou mais enzimas envolvidas em uma rota biossintética que converte a uma triptamina derivatizada.
90. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 86-89, caracterizada pelo fato de ser realizado na ausência de uma célula biológica.
91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de ser realizado sob condições in vitro.
92. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de ser realizado sob condições livres de célula.
93. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de ser realizado em um lisado de célula.
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