CN111187785B

CN111187785B - 一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用

Info

Publication number: CN111187785B
Application number: CN202010088611.1A
Authority: CN
Inventors: 开国银; 尤大伟; 冯岳; 黄超; 范三鹏; 张通
Original assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Current assignee: Zhejiang Chinese Medicine University ZCMU
Priority date: 2020-02-12
Filing date: 2020-02-12
Publication date: 2021-07-16
Anticipated expiration: 2040-02-12
Also published as: CN111187785A

Abstract

本发明提供了一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用,并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列及其酶学性质,属于生物工程技术领域。色氨酸脱羧酶OpTDC2可用于催化色氨酸脱羧形成色胺，其米氏常数K_m值为1.02mM。相比于其他植物来源的色氨酸脱羧酶，比如长春花(Catharanthus roseus)K_m为1.31mM，萝芙木(Rauvolfia verticillate)K_m为2.89mM，印度人参(Withania Somnifera)K_m为1.49mM，我们的色氨酸脱羧酶OpTDC2具有更低的米氏常数，即对底物的亲和力更强，催化效率更高，可以为合成生物学研究提供多样性的底物来源，因此具有一定的应用价值。

Description

一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用

技术领域

本发明涉及一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、其酶学性质，属于生物工程技术领域。

背景技术

色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，EC 4.1.1.28,TDC)可以催化色氨酸脱羧形成色胺，是喜树碱合成过程中连接初生代谢和次生代谢的关键酶。

色氨酸脱羧酶最早是见于药用植物长春花中进行报道，并且在多种植物中均有发现。

色氨酸脱羧酶属于裂解酶类，具有较高的底物特异性，对类似的芳香族氨基酸如酪氨酸，苯丙氨酸等没有脱羧作用。

先前的研究表明，色氨酸脱羧酶基因在陆生植物中往往以多基因家族形式存在。例如，Melina等人于1997年在喜树中分离和鉴定了两条色氨酸脱羧酶基因；Pang等人对西红柿中全部5条色氨酸脱羧酶基因进行了功能解析；Kang等人通过生物信息的手段证明水稻中含有七条色氨酸脱羧酶基因及其类似物。

然而截止目前为止，短小蛇根草中的色氨酸脱羧酶见于报道的只有一条。这一现象与其多基因家族存在这一事实不符。

因此，本发明利用本实验室短小蛇根草的转录组数据，从实验室温室培养的短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定出一条新的色氨酸脱羧酶基因，并将其命名为OpTDC2。利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白OpTDC2以验证其活性，并对其进行Ni-柱亲和纯化以及酶学性质研究。

发明内容

本发明目的在于从药用植物短小蛇根草无菌苗中分离和鉴定了一条新的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2，利用大肠杆菌进行异源重组表达蛋白OpTDC2，并公开了其酶学性质及其应用。

本发明采用的技术方案是：

一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2，所述色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种上述的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达方法，通过将色氨酸脱羧酶基因OpTDC2构建至原核表达载体pCold TF中得到重组质粒pCold TF-OpTDC2，并将阳性重组质粒pCold TF-OpTDC2转入BL21(DE3)感受态细胞中组成重组菌株。重组菌株在诱导剂IPTG的诱导下表达出可溶性蛋白OpTDC2。所述重组质粒pCold TF-OpTDC2的序列如SEQ ID NO.4所示，其中原核表达载体pCold TF的序列如SEQ ID NO.3所示。其中，构建重组质粒pCold TF-OpTDC2时，先提取短小蛇根草无菌苗全基因组RNA，并将其反转录获得全基因组cDNA。设计色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的特异性引物，扩增得到色氨酸脱羧酶基因OpTDC2全长编码框序列，将扩增得到的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2全长编码框序列与双酶切后的pCold TF质粒片段进行同源重组连接从而构建得到重组表达质粒pCold TF-OpTDC2。

一种上述可溶性蛋白OpTDC2在色氨酸催化反应中的应用。

进一步地，所述的色氨酸催化反应的温度为15～70℃,pH为5.5～11.0,辅因子浓度为0.1～3.0mmol·L^-1。

进一步地，所述的色氨酸催化反应的最适温度为45℃，最适pH为8.0，最适辅因子浓度为0.1mmol·L^-1。

进一步地，所述的色氨酸催化反应中还包括金属离子Mn²⁺，Mn²⁺的终浓度为10mmol·L^-1。

进一步地，所述辅因子为磷酸吡哆醛。

本发明的有益效果：从药用植物短小蛇根草中鉴定出一条新的色氨酸脱羧酶OpTDC2，为进一步解析该药用植物中关键酶基因参与调控抗癌药物喜树碱的合成奠定了一定的研究基础。同时，通过研究发现其同样可以催化色氨酸脱羧形成色胺，其米氏常数K_m值为1.02mM。相比于其他来源植物的色氨酸脱羧酶，比如长春花(Catharanthus roseus)K_m为1.31mM，萝芙木(Rauvolfia verticillate)K_m为2.89mM，印度人参(Withania Somnifera)K_m为1.49mM，我们的色氨酸脱羧酶OpTDC2具有更低的米氏常数，即对底物的亲和力更强，催化效率更高，可以为合成生物学研究提供多样性的底物来源，因此具有一定的应用价值。

附图说明

图1：pCold TF-OpTDC2的重组载体谱；

图2：SDS-PAGE分析重组工程菌E.Coil BL21 IPTG诱导表达情况：M:Marker；1:含pCold TF的菌株胞内可溶表达；2：含pCold TF-OpTDC2菌株胞内可溶表达；

图3：SDS-PAGE分析重组工程菌E.Coil BL21胞内可溶蛋白的纯化情况：M:Marker；1:胞内可溶蛋白；2：0mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；3：40mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；4：300mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；5：500mmol咪唑缓冲液洗脱蛋白；

图4：A:色胺标准品的HPLC分析图；B:纯化后的pCold TF-OpTDC2蛋白(灭活)催化反应产物的HPLC分析图；C：纯化后pCold TF-OpTDC2蛋白(未灭活)催化反应产物的HPLC分析图；

图5：不同温度对色氨酸脱羧酶活性的影响；

图6：不同pH对色氨酸脱羧酶活性的影响，图中，空心圆对应PH 5.5-7.5,实心圆对应PH 7.5-9,空心菱形对应PH 9-11；

图7：不同辅因子浓度对色氨酸脱羧酶活性的影响；

图8：不同金属离子对色氨酸脱羧酶活性的影响；

图9：以L-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的催化动力学参数；

图10：以L-色氨酸和D-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的底物特异性。

具体实施方式

下述实施例中，采用的pCold TF载体购自于北京华越洋生物有限公司，但不限于此。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

一般性说明：实施例所涉及的RNA提取试剂盒和反转录试剂盒购自北京天根生化有限公司，快切酶购自Takara公司，无缝连接酶购自南京诺唯赞公司，质粒试剂盒购自上海生物工程有限公司，胶回收试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司，但不限于此。操作完全按照相应说明书进行。引物合成与质粒测序由浙江尚亚生物技术有限公司完成。

OpTDC2基因的获得

我们使用O.pumila TDC(BAC41515.1)作为在短小蛇根草转录组数据库中进行局部Blast搜索的探针来识别假定的O.pumila TDCs。蛋白质序列(GeneBank MN864864)与先前报道的OpTDC具有高度同源性，命名为OpTDC2，OpTDC2的基因序列如SEQ ID NO.1所示,氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例1

本实施例为本发明所述的色氨酸脱羧酶基因的克隆及大肠杆菌工程菌的构建

短小蛇根草RNA提取及反转录

1将短小蛇根草无菌苗洗净放入液氮速冻，使用已经处理过的研钵对其进行充分研磨，取50-100mg粉末进行RNA提取。利用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒得到全植株cDNA备用。

2大肠杆菌感受态的制备

从LB平板上分别挑取JM109和BL21(DE3)单菌落，接种于2mL LB培养基中，37℃振荡培养过夜至对数生长中后期。然后将菌液按照1:50(v/v)的比例接种于50mL LB培养基中，37℃震荡培养3h左右至OD₆₀₀＝0.4-0.6得到培养菌液。

分别取1mL上述培养菌液于1.5mL离心管中，冰浴5min，4℃5000r/min离心5min，弃上清(注意尽量弃除上清)。

在每个离心管中加入100ul冰上预冷的Solution A，轻轻晃动离心管使菌体充分悬浮，禁止剧烈振荡。

4℃5000r/min离心5min，弃上清(注意尽量弃除上清)。

在每个离心管中加入100ul冰上预冷的Solution B，轻轻晃动离心管使菌体充分悬浮，禁止剧烈振荡。

制作完成得到JM109和BL21感受态细胞。本感受态细胞可以直接用于DNA的转化实验，也可以于-80℃中保存，以备以后使用。在-80℃保存时,可以有效保存一年以上，但不能反复冻融，一旦融解后,不能再进行-80℃保存。

3PCR扩增色氨酸脱羧酶基因

1)引物的设计

根据本实验室短小蛇根草转录组数据库中色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的序列设计引物，引物直接带有同源臂和酶切位点(下划线标示)，具体引物设计为：

F：GGTATCGAAGGTAGGCATATGATGGGCAGCATTGATGCAA(SEQ ID NO.5)

R：CTATCTAGACTGCAGGTCGACTTAAATATCAATGCACTGATGATTTTCC(SEQ ID NO.6)

2)PCR扩增

扩增反应体系为：PCR反应组成液(50ul)

PCR反应的条件：98℃30s，58℃30s，72℃1.5min，35个循环，得到PCR产物最后保存于4℃中。

PCR产物经过胶回收试剂盒回收后送浙江尚亚生物有限公司测序，测序所得到色氨酸脱羧酶基因OpTDC2基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3)双酶切和连接

将pCold TF质粒(序列如SEQ ID NO.3所示)进行双酶切，酶切体系为

10×Q.cut Buffer	5ul
		pCold TF质粒	30ul
限制性内切酶NdeⅠ	2.5ul
		限制性内切酶SalⅠ	2.5ul
灭菌蒸馏水	10ul

上述反应在37℃反应3h后进行核酸胶回收，然后与PCR回收产物进行连接。

连接体系为：

上述反应在37℃反应30min，然后冰浴5min，准备转化。

4)转化

1.取1管上述制得的JM109感受态置于冰上融化。

2.将连接反应液全部转入JM109感受态中，并吹打均匀。

3.冰浴30min。

4.在42℃水浴中热激90s，然后冰浴2min。

5.加入1mL LB培养基，在37℃条件下培养1h复壁。

6. 5000r/min离心5min，弃900ul上清，剩余菌体和培养液吹打均匀，涂布含有Amp抗性的平板。

7. 37℃过夜倒置培养。

8.挑选6个单克隆重组质粒进行菌落PCR阳性鉴定，并将阳性克隆送浙江尚亚生物进行测序。测序引物为pCold TF通用引物pCold F1 primer和pCold R1 primer。

9.比对测序结果，得到阳性重组质粒pCold TF-OpTDC2(如SEQ ID NO.4所示)，其图谱如图1所示。

10.将阳性重组质粒转入BL21(DE3)感受态得到重组菌株备用。

实施例2

本实施例为本发明所述的重组菌株的诱导表达

1.取10ul实施例1制得的重组菌株加入2mL LB培养基，加入2ul氨苄溶液(终浓度为100ug/ml)，以空载菌株(pCold TF质粒转入BL21(DE3))作为对照，37℃，220rpm，过夜培养得到种子菌液。

2.取上一步骤种子菌液400ul转接加入含20mL LB培养基的三角瓶，加入20ul氨苄溶液(终浓度为100ug/ml)，培养3h左右至OD₆₀₀＝0.4-0.6,冰浴15min。

3.每个三角瓶中加入50ul的IPTG溶液(终浓度为0.1mmol·L^-1)，16℃，220rpm，过夜诱导培养。

4.分别取步骤3中诱导的空质粒菌液和带目的基因的重组质粒菌液1mL，8000rpm离心5min，弃上清，再分别加入1mL磷酸缓冲液(pH＝8.0)重悬菌体，超声破碎，破2s停4s，35％功率，持续5min。

5.4℃下，8000rpm离心5min，取上清跑蛋白胶验证，如图2所示，重组蛋白可溶性表达。

6.蛋白纯化及酶活性鉴定。

通过上述方法，将剩余的pCold TF-OpTDC2发酵液进行菌体富集破碎得到粗酶液。通过AKTA pure蛋白纯化系统进行Ni-柱纯化，洗脱方法为将A1、A2、B1、B2、四根管路都放到水里，设置system flow 20ml/min进行排气。然后设置system flow 1ml/min、flow path(column position 3)、delta pressure 0.5、Gradient 0、inset A1,待水滴均匀流出后装Ni-柱，平衡10min后将A1放入结合液中，B1放入洗脱液中，再排气一次，平衡15min，然后上样粗酶液，用300mM的高浓度咪唑缓冲液B1梯度洗脱目的蛋白，如图3所示，将吸附在柱子上的蛋白洗脱下来得到色氨酸脱羧酶备用。

实施例3

取20mmol·L^-1磷酸二氢钠和磷酸氢二钠缓冲液0.25mL(pH＝8.0)补足蒸馏水至0.8mL，加入0.03mL纯酶，45℃预热5min,加入0.2mL L-色氨酸反应30min,加入1.0mL甲醇终止反应,通过HPLC检测在波长为280nm处的特征峰。HPLC结果如图4所示，本研究所得到的纯酶OpTDC2可以催化色氨酸进行脱羧反应，当OpTDC2酶高温失活后则无法进行脱羧反应。

实施例4-9是对纯化得到的蛋白进行酶学性质研究。其反应体系为100ul反应体系，其中底物母液浓度是50mol·L^-1，辅因子为磷酸吡哆醛，色氨酸脱羧酶浓度0.25mg·ml^-1，反应30min后加入100ul甲醇终止反应,并进行HPLC定量。

实施例4

本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适温度值。以L-色氨酸为底物，在pH＝8.0、辅因子浓度为0.1mmol·L^-1的条件下，分别测定不同的温度值(15,20,25,30,35,40,45,50,55，60,65,70℃)条件下的色胺的产量。如图5所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适温度值为45℃。

实施例5

本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适pH值。以L-色氨酸为底物，在45℃、辅因子浓度为0.1mmol·L^-1的条件下，分别测定不同的pH(50mmol·L^- ¹NaH₂PO₄-Na₂HPO₄,pH 5.5-7.5；50mmol·L^-1Tris-HCl,pH 7.5-9.0；50mmol·L^-1glycine-NaOH,pH 9.0-11.0)条件下的色胺的产量。如图6所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适pH值为8.0。

实施例6

本实施例为本发明所述的研究色氨酸脱羧酶酶促反应的最适辅因子浓度值。以L-色氨为底物，在pH＝8.0和反应温度为45℃的条件下，分别测定不同的辅因子浓度(0.1,0.5,1.0,1.5,2.0，2.5，3.0mmol·L^-1)条件下的色胺的产量。如图7所示，可知色氨酸脱羧酶酶促反应的最适辅因子浓度为0.1mmol·L^-1。

实施例7

本实施例为本发明所述的不同的金属离子(氯化钠-Na⁺，氯化钾-K⁺，氯化亚铁-Fe² ⁺,氯化铁-Fe³⁺，硫酸锰-Mn²⁺，硫酸铜-Cu²⁺，氯化镁-Mg²⁺，氯化钙-Ca²⁺，硫酸锌-Zn²⁺,终浓度为10mmol/L)对色氨酸脱羧酶酶促反应的影响。以L-色氨酸为底物，在pH＝8.0，反应温度为45℃的条件，辅因子浓度为0.1mmol·L^-1下，分别测定不同的金属离子存在情况下的色胺的产量。如图8所示可知，Mn²⁺对该酶促反应有明显的促进作用，Cu²⁺，Zn²⁺，Fe³⁺对该酶促反应有明显的抑制作用。

实施例8

本实施例为本发明所述的以L-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的催化动力学参数。

在最适反应pH和反应温度下测定该色氨酸脱羧酶催化不同浓度的L-色氨酸时的反应速率,反应体系中含0.1mmol·L^-1辅因子磷酸吡哆醛,参照Linewear-Burk双倒数作图法,计算V_max和K_m值，进而算出K_cat/K_m值，如图9所示，K_m＝1.02mmol·L^-1，V_max＝0.20umol·min^-1，K_cat＝0.79S^-1，K_cat/K_m＝774.5S^-1·mol^-1。

实施例9

本实施例为本发明所述的以L-色氨酸和D-色氨酸为底物研究色氨酸脱羧酶的底物特异性。如图10所示，结果表明该色氨酸脱羧酶对L型色氨酸的亲和力要强于D型色氨酸。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干优化改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江中医药大学

<120> 一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达及应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> 短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)

<400> 1

atgggcagca ttgatgcaaa taatatcaat ggtgcttatc cttcatcccc agttgcccca 60

ttcaaaccac ttgatcccga agagttcagg aaacaagccc atgttatggt tgatttcata 120

gctgattatt acaaaaatat tgaaaaatat ccagttctca gccaagttga gcctggttat 180

cttcgaaccc gcctccctga aacggcccct tatttacctg aaccctttga gaacattctt 240

caagatatac aaaaagatat tatccctgga atgactaact ggctaagccc caactttttt 300

gcatattttc cagccactgt tagctctgct gcttttcttg gagaaatgtt atgcactggt 360

ttcaactctg tggggtttaa ctggctcgct tcccctgctg ccaccgaact agagatggtg 420

gttatagatt ggctggctaa catgcttaag ctcccaaatt ctttcatgtt ttcaggcact 480

ggtggcggtg ttcttcaagg aacaaccagt gaggctattc tttgtaccct tatcgcctcc 540

cgcgaccgtg cattcgagaa aattggagtt gaaaacattg gtaagcttgt ggtttatgca 600

tctgatcaaa cacactcttt tttccacaag acttgcaaat tagctgggat ttttccatgc 660

aatataaaaa taattcctac aacctcggaa gccaactttt ccatgtcccc tcatgctctg 720

cgtaaacaaa tcgaatctga cgttgcgggc ggattggtcc caattttcct atgtgcaaca 780

atagggacca cttcgaccac tgccattgac ccagtgagtg gtcttgccaa agtggcaaat 840

gatttcagtg tgtggattca cgttgatgct gcctatgcag gaagtgcatg catatgccct 900

gaatttagga agtatttgga tggagttgag ctagttgatt cacttagttt gagccctcat 960

aaatggttac tttgttattt ggattgctgt tgcttgtggg taaagaaacc ggcattgatg 1020

gtgaaggcgt tgagcactaa ccctgagtac ttgagaaaca aaagaagtga atttgattca 1080

gttgtggatt ttaaagattg gcaaataggt accggccggc gatttcgagc actccgatta 1140

tggcttatta tgcgtagtta cggcgttgca aacctccaac gacacattcg atcggacgtt 1200

gaaatggcta aaatgttcga aggattcgtg aagtctgatc cgaggtttga agttgttgtg 1260

ccgcgaacat tttcacttgt atgttttagg ctcaatccat ttggacgttc caataatgca 1320

acctacgtag aactcttgaa cgagaagctg ctggatttgg ttaattcaac tggcagagct 1380

tacatgactc acacaaaggt tggtggagta tacatgttga gatttgcagt tggagcgaca 1440

ttgacagagg aacgccatgt gaatgcagct tgggaattaa taaaagaatg cactgctgct 1500

ttactcaagg aaaatcatca gtgcattgat atttaa 1536

<210> 2

<211> 511

<212> PRT

<213> 短小蛇根草(Ophiorrhiza pumila)

<400> 2

Met Gly Ser Ile Asp Ala Asn Asn Ile Asn Gly Ala Tyr Pro Ser Ser

1 5 10 15

Pro Val Ala Pro Phe Lys Pro Leu Asp Pro Glu Glu Phe Arg Lys Gln

20 25 30

Ala His Val Met Val Asp Phe Ile Ala Asp Tyr Tyr Lys Asn Ile Glu

35 40 45

Lys Tyr Pro Val Leu Ser Gln Val Glu Pro Gly Tyr Leu Arg Thr Arg

50 55 60

Leu Pro Glu Thr Ala Pro Tyr Leu Pro Glu Pro Phe Glu Asn Ile Leu

65 70 75 80

Gln Asp Ile Gln Lys Asp Ile Ile Pro Gly Met Thr Asn Trp Leu Ser

85 90 95

Pro Asn Phe Phe Ala Tyr Phe Pro Ala Thr Val Ser Ser Ala Ala Phe

100 105 110

Leu Gly Glu Met Leu Cys Thr Gly Phe Asn Ser Val Gly Phe Asn Trp

115 120 125

Leu Ala Ser Pro Ala Ala Thr Glu Leu Glu Met Val Val Ile Asp Trp

130 135 140

Leu Ala Asn Met Leu Lys Leu Pro Asn Ser Phe Met Phe Ser Gly Thr

145 150 155 160

Gly Gly Gly Val Leu Gln Gly Thr Thr Ser Glu Ala Ile Leu Cys Thr

165 170 175

Leu Ile Ala Ser Arg Asp Arg Ala Phe Glu Lys Ile Gly Val Glu Asn

180 185 190

Ile Gly Lys Leu Val Val Tyr Ala Ser Asp Gln Thr His Ser Phe Phe

195 200 205

His Lys Thr Cys Lys Leu Ala Gly Ile Phe Pro Cys Asn Ile Lys Ile

210 215 220

Ile Pro Thr Thr Ser Glu Ala Asn Phe Ser Met Ser Pro His Ala Leu

225 230 235 240

Arg Lys Gln Ile Glu Ser Asp Val Ala Gly Gly Leu Val Pro Ile Phe

245 250 255

Leu Cys Ala Thr Ile Gly Thr Thr Ser Thr Thr Ala Ile Asp Pro Val

260 265 270

Ser Gly Leu Ala Lys Val Ala Asn Asp Phe Ser Val Trp Ile His Val

275 280 285

Asp Ala Ala Tyr Ala Gly Ser Ala Cys Ile Cys Pro Glu Phe Arg Lys

290 295 300

Tyr Leu Asp Gly Val Glu Leu Val Asp Ser Leu Ser Leu Ser Pro His

305 310 315 320

Lys Trp Leu Leu Cys Tyr Leu Asp Cys Cys Cys Leu Trp Val Lys Lys

325 330 335

Pro Ala Leu Met Val Lys Ala Leu Ser Thr Asn Pro Glu Tyr Leu Arg

340 345 350

Asn Lys Arg Ser Glu Phe Asp Ser Val Val Asp Phe Lys Asp Trp Gln

355 360 365

Ile Gly Thr Gly Arg Arg Phe Arg Ala Leu Arg Leu Trp Leu Ile Met

370 375 380

Arg Ser Tyr Gly Val Ala Asn Leu Gln Arg His Ile Arg Ser Asp Val

385 390 395 400

Glu Met Ala Lys Met Phe Glu Gly Phe Val Lys Ser Asp Pro Arg Phe

405 410 415

Glu Val Val Val Pro Arg Thr Phe Ser Leu Val Cys Phe Arg Leu Asn

420 425 430

Pro Phe Gly Arg Ser Asn Asn Ala Thr Tyr Val Glu Leu Leu Asn Glu

435 440 445

Lys Leu Leu Asp Leu Val Asn Ser Thr Gly Arg Ala Tyr Met Thr His

450 455 460

Thr Lys Val Gly Gly Val Tyr Met Leu Arg Phe Ala Val Gly Ala Thr

465 470 475 480

Leu Thr Glu Glu Arg His Val Asn Ala Ala Trp Glu Leu Ile Lys Glu

485 490 495

Cys Thr Ala Ala Leu Leu Lys Glu Asn His Gln Cys Ile Asp Ile

500 505 510

<210> 3

<211> 5769

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60

tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120

ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180

cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240

aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcacat gcaagtttca 300

gttgaaacca ctcaaggcct tggccgccgt gtaacgatta ctatcgctgc tgacagcatc 360

gagaccgctg ttaaaagcga gctggtcaac gttgcgaaaa aagtacgtat tgacggcttc 420

cgcaagggca aagtgccaat gaatatcgtt gctcagcgtt atggcgcgtc tgtacgccag 480

gacgttctgg gtgacctgat gagccgtaac ttcattgacg ccatcattaa agaaaaaatc 540

aatccggctg gcgcaccgac ttatgttccg ggcgaataca agctgggtga agacttcact 600

tactctgtag agtttgaagt ttatccggaa gttgaactgc aaggtctgga agcgatcgaa 660

gttgaaaaac cgatcgttga agtgaccgac gctgacgttg acggcatgct ggatactctg 720

cgtaaacagc aggcgacctg gaaagaaaaa gacggcgctg ttgaagcaga agaccgcgtg 780

accatcgact tcaccggttc tgtagacggc gaagagttcg aaggcggtaa agcgtctgat 840

ttcgtactgg cgatgggcca gggtcgtatg atcccgggct ttgaagacgg tatcaaaggc 900

cacaaagctg gcgaagagtt caccatcgac gtgaccttcc cggaagaata ccacgcagaa 960

aacctgaaag gtaaagcagc gaaattcgct atcaacctga agaaagttga agagcgtgaa 1020

ctgccggaac tgaccgcaga gttcatcaaa cgtttcggcg ttgaagatgg ttccgtagaa 1080

ggtctgcgcg ctgaagtgcg taaaaacatg gagcgcgagc tgaagagcgc catccgtaac 1140

cgcgttaagt ctcaggcgat cgaaggtctg gtaaaagcta acgacatcga cgtaccggct 1200

gcgctgatcg acagcgaaat cgacgttctg cgtcgccagg ctgcacagcg tttcggtggc 1260

aacgaaaaac aagctctgga actgccgcgc gaactgttcg aagaacaggc taaacgccgc 1320

gtagttgttg gcctgctgct gggcgaagtt atccgcacca acgagctgaa agctgacgaa 1380

gagcgcgtga aaggcctgat cgaagagatg gcttctgcgt acgaagatcc gaaagaagtt 1440

atcgagttct acagcaaaaa caaagaactg atggacaaca tgcgcaatgt tgctctggaa 1500

gaacaggctg ttgaagctgt actggcgaaa gcgaaagtga ctgaaaaaga aaccactttc 1560

aacgagctga tgaaccagca ggcgtccgcg ggtctggaag ttctgttcca ggggccctcc 1620

gcgggtctgg tgccacgcgg tagtggtggt atcgaaggta ggcatatgga gctcggtacc 1680

ctcgagggat ccgaattcaa gcttgtcgac ctgcagtcta gataggtaat ctctgcttaa 1740

aagcacagaa tctaagatcc ctgccatttg gcggggattt ttttatttgt tttcaggaaa 1800

taaataatcg atcgcgtaat aaaatctatt attatttttg tgaagaataa atttgggtgc 1860

aatgagaatg cgcaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 1920

acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 1980

agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 2040

atcagagcag attgtactga gagtgcacca taaaattgta aacgttaata ttttgttaaa 2100

attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa 2160

aatcccttat aaatcaaaag aatagcccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa 2220

caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca 2280

gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg 2340

taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc 2400

ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc 2460

aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca 2520

gggcgcgtac tatggttgct ttgacgtatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 2580

agaaaatacc gcatcaggcg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 2640

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 2700

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 2760

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 2820

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 2880

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 2940

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 3000

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 3060

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 3120

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 3180

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 3240

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 3300

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 3360

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 3420

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 3480

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 3540

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 3600

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 3660

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 3720

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 3780

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 3840

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 3900

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 3960

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 4020

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 4080

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 4140

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 4200

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 4260

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 4320

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 4380

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc 4440

tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct 4500

aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 4560

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg 4620

gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc 4680

tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg 4740

atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc 4800

gagatatccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc 4860

atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg 4920

gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt 4980

tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt 5040

aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc 5100

agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca 5160

tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca 5220

tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc 5280

gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt 5340

tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg 5400

gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg 5460

ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg 5520

tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc atactctgcg 5580

acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc 5640

tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc 5700

tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac 5760

cgccgccgc 5769

<210> 4

<211> 7269

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggaatggt gtggccgatt aatcataaat atgaaaaata attgttgcat cacccgccaa 60

tgcgtggctt aatgcacatc aaattgtgag cggataacaa tttgatgtgc tagcgcatat 120

ccagtgtagt aaggcaagtc ccttcaagag ttatcgttga tacccctcgt agtgcacatt 180

cctttaacgc ttcaaaatct gtaaagcacg ccatatcgcc gaaaggcaca cttaattatt 240

aagaggtaat acaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcacat gcaagtttca 300

gttgaaacca ctcaaggcct tggccgccgt gtaacgatta ctatcgctgc tgacagcatc 360

gagaccgctg ttaaaagcga gctggtcaac gttgcgaaaa aagtacgtat tgacggcttc 420

cgcaagggca aagtgccaat gaatatcgtt gctcagcgtt atggcgcgtc tgtacgccag 480

gacgttctgg gtgacctgat gagccgtaac ttcattgacg ccatcattaa agaaaaaatc 540

aatccggctg gcgcaccgac ttatgttccg ggcgaataca agctgggtga agacttcact 600

tactctgtag agtttgaagt ttatccggaa gttgaactgc aaggtctgga agcgatcgaa 660

gttgaaaaac cgatcgttga agtgaccgac gctgacgttg acggcatgct ggatactctg 720

cgtaaacagc aggcgacctg gaaagaaaaa gacggcgctg ttgaagcaga agaccgcgtg 780

accatcgact tcaccggttc tgtagacggc gaagagttcg aaggcggtaa agcgtctgat 840

ttcgtactgg cgatgggcca gggtcgtatg atcccgggct ttgaagacgg tatcaaaggc 900

cacaaagctg gcgaagagtt caccatcgac gtgaccttcc cggaagaata ccacgcagaa 960

aacctgaaag gtaaagcagc gaaattcgct atcaacctga agaaagttga agagcgtgaa 1020

ctgccggaac tgaccgcaga gttcatcaaa cgtttcggcg ttgaagatgg ttccgtagaa 1080

ggtctgcgcg ctgaagtgcg taaaaacatg gagcgcgagc tgaagagcgc catccgtaac 1140

cgcgttaagt ctcaggcgat cgaaggtctg gtaaaagcta acgacatcga cgtaccggct 1200

gcgctgatcg acagcgaaat cgacgttctg cgtcgccagg ctgcacagcg tttcggtggc 1260

aacgaaaaac aagctctgga actgccgcgc gaactgttcg aagaacaggc taaacgccgc 1320

gtagttgttg gcctgctgct gggcgaagtt atccgcacca acgagctgaa agctgacgaa 1380

gagcgcgtga aaggcctgat cgaagagatg gcttctgcgt acgaagatcc gaaagaagtt 1440

atcgagttct acagcaaaaa caaagaactg atggacaaca tgcgcaatgt tgctctggaa 1500

gaacaggctg ttgaagctgt actggcgaaa gcgaaagtga ctgaaaaaga aaccactttc 1560

aacgagctga tgaaccagca ggcgtccgcg ggtctggaag ttctgttcca ggggccctcc 1620

gcgggtctgg tgccacgcgg tagtggtggt atcgaaggta ggcatatgat gggcagcatt 1680

gatgcaaata atatcaatgg tgcttatcct tcatccccag ttgccccatt caaaccactt 1740

gatcccgaag agttcaggaa acaagcccat gttatggttg atttcatagc tgattattac 1800

aaaaatattg aaaaatatcc agttctcagc caagttgagc ctggttatct tcgaacccgc 1860

ctccctgaaa cggcccctta tttacctgaa ccctttgaga acattcttca agatatacaa 1920

aaagatatta tccctggaat gactaactgg ctaagcccca acttttttgc atattttcca 1980

gccactgtta gctctgctgc ttttcttgga gaaatgttat gcactggttt caactctgtg 2040

gggtttaact ggctcgcttc ccctgctgcc accgaactag agatggtggt tatagattgg 2100

ctggctaaca tgcttaagct cccaaattct ttcatgtttt caggcactgg tggcggtgtt 2160

cttcaaggaa caaccagtga ggctattctt tgtaccctta tcgcctcccg cgaccgtgca 2220

ttcgagaaaa ttggagttga aaacattggt aagcttgtgg tttatgcatc tgatcaaaca 2280

cactcttttt tccacaagac ttgcaaatta gctgggattt ttccatgcaa tataaaaata 2340

attcctacaa cctcggaagc caacttttcc atgtcccctc atgctctgcg taaacaaatc 2400

gaatctgacg ttgcgggcgg attggtccca attttcctat gtgcaacaat agggaccact 2460

tcgaccactg ccattgaccc agtgagtggt cttgccaaag tggcaaatga tttcagtgtg 2520

tggattcacg ttgatgctgc ctatgcagga agtgcatgca tatgccctga atttaggaag 2580

tatttggatg gagttgagct agttgattca cttagtttga gccctcataa atggttactt 2640

tgttatttgg attgctgttg cttgtgggta aagaaaccgg cattgatggt gaaggcgttg 2700

agcactaacc ctgagtactt gagaaacaaa agaagtgaat ttgattcagt tgtggatttt 2760

aaagattggc aaataggtac cggccggcga tttcgagcac tccgattatg gcttattatg 2820

cgtagttacg gcgttgcaaa cctccaacga cacattcgat cggacgttga aatggctaaa 2880

atgttcgaag gattcgtgaa gtctgatccg aggtttgaag ttgttgtgcc gcgaacattt 2940

tcacttgtat gttttaggct caatccattt ggacgttcca ataatgcaac ctacgtagaa 3000

ctcttgaacg agaagctgct ggatttggtt aattcaactg gcagagctta catgactcac 3060

acaaaggttg gtggagtata catgttgaga tttgcagttg gagcgacatt gacagaggaa 3120

cgccatgtga atgcagcttg ggaattaata aaagaatgca ctgctgcttt actcaaggaa 3180

aatcatcagt gcattgatat ttaagtcgac ctgcagtcta gataggtaat ctctgcttaa 3240

aagcacagaa tctaagatcc ctgccatttg gcggggattt ttttatttgt tttcaggaaa 3300

taaataatcg atcgcgtaat aaaatctatt attatttttg tgaagaataa atttgggtgc 3360

aatgagaatg cgcaggccct ttcgtctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 3420

acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 3480

agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggctggctta actatgcggc 3540

atcagagcag attgtactga gagtgcacca taaaattgta aacgttaata ttttgttaaa 3600

attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa 3660

aatcccttat aaatcaaaag aatagcccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa 3720

caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca 3780

gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc caaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg 3840

taaagcacta aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc 3900

ggcgaacgtg gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc 3960

aagtgtagcg gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca 4020

gggcgcgtac tatggttgct ttgacgtatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 4080

agaaaatacc gcatcaggcg tcaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta 4140

tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat 4200

aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc 4260

ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga 4320

aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca 4380

acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt 4440

ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg 4500

gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc 4560

atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata 4620

acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt 4680

tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag 4740

ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca 4800

aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg 4860

aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg 4920

ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag 4980

atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg 5040

aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag 5100

accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga 5160

tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt 5220

tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc 5280

tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc 5340

cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac 5400

caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac 5460

cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt 5520

cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct 5580

gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat 5640

acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt 5700

atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg 5760

cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt 5820

gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt 5880

tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc 5940

tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg gtcgagatcc cggtgcctaa tgagtgagct 6000

aacttacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 6060

agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgccagg 6120

gtggtttttc ttttcaccag tgagacgggc aacagctgat tgcccttcac cgcctggccc 6180

tgagagagtt gcagcaagcg gtccacgctg gtttgcccca gcaggcgaaa atcctgtttg 6240

atggtggtta acggcgggat ataacatgag ctgtcttcgg tatcgtcgta tcccactacc 6300

gagatatccg caccaacgcg cagcccggac tcggtaatgg cgcgcattgc gcccagcgcc 6360

atctgatcgt tggcaaccag catcgcagtg ggaacgatgc cctcattcag catttgcatg 6420

gtttgttgaa aaccggacat ggcactccag tcgccttccc gttccgctat cggctgaatt 6480

tgattgcgag tgagatattt atgccagcca gccagacgca gacgcgccga gacagaactt 6540

aatgggcccg ctaacagcgc gatttgctgg tgacccaatg cgaccagatg ctccacgccc 6600

agtcgcgtac cgtcttcatg ggagaaaata atactgttga tgggtgtctg gtcagagaca 6660

tcaagaaata acgccggaac attagtgcag gcagcttcca cagcaatggc atcctggtca 6720

tccagcggat agttaatgat cagcccactg acgcgttgcg cgagaagatt gtgcaccgcc 6780

gctttacagg cttcgacgcc gcttcgttct accatcgaca ccaccacgct ggcacccagt 6840

tgatcggcgc gagatttaat cgccgcgaca atttgcgacg gcgcgtgcag ggccagactg 6900

gaggtggcaa cgccaatcag caacgactgt ttgcccgcca gttgttgtgc cacgcggttg 6960

ggaatgtaat tcagctccgc catcgccgct tccacttttt cccgcgtttt cgcagaaacg 7020

tggctggcct ggttcaccac gcgggaaacg gtctgataag agacaccggc atactctgcg 7080

acatcgtata acgttactgg tttcacattc accaccctga attgactctc ttccgggcgc 7140

tatcatgcca taccgcgaaa ggttttgcgc cattcgatgg tgtccgggat ctcgacgctc 7200

tcccttatgc gactcctgca ttaggaagca gcccagtagt aggttgaggc cgttgagcac 7260

cgccgccgc 7269

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggtatcgaag gtaggcatat gatgggcagc attgatgcaa 40

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctatctagac tgcaggtcga cttaaatatc aatgcactga tgattttcc 49

Claims

1.一种短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2，其特征在于，所述色氨酸脱羧酶OpTDC2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种权利要求1所述的色氨酸脱羧酶基因OpTDC2的克隆表达方法，其特征在于，通过将色氨酸脱羧酶基因OpTDC2构建至原核表达载体pCold TF中得到重组质粒pCold TF-OpTDC2，并将阳性重组质粒pCold TF-OpTDC2转入BL21(DE3)感受态细胞中组成重组菌株；重组菌株在诱导剂IPTG的诱导下表达出可溶性蛋白OpTDC2；所述重组质粒pCold TF-OpTDC2的序列如SEQ ID NO.4所示，其中原核表达载体pCold TF的序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种权利要求1所述的短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因OpTDC2在催化色氨酸生成色胺中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，催化色氨酸生成色胺的温度为15～60℃,pH为5.5～11.0,辅因子浓度为0.1～3.0mmol·L^-1。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，催化色氨酸生成色胺的温度为45℃，pH为8.0，辅因子浓度为0.1mmol·L^-1。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的催化色氨酸生成色胺的反应中还包括金属离子Mn²⁺，Mn²⁺的终浓度为10mmol·L^-1。

7.根据权利要求3-6任一项所述的应用，其特征在于，所述辅因子为磷酸吡哆醛。