CN111826379B - 芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用,所述芍药PlTDC基因的登录号是KY765554。本发明通过将构建的PlTDC基因过量表达载体转化到烟草中进行表达,降低了植物,尤其是烟草花瓣中花色苷含量,抑制了花色苷合成相关基因表达,创制了淡粉色烟草新种质。
Description
技术领域
本发明属于基因新用途技术领域,具体涉及芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用。
背景技术
色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase,TDC;EC4.1.1.28)位于色氨酸代谢途径中,催化色氨酸(tryptophan)进行脱羧反应生成色胺(tiyptamine)。TDC生物化学特征研究最早开始于长春花,是一种可溶性的胞液蛋白,并且单体作为一种分子量为54,000的同二聚体存在。而对长春花TDC基因的研究中,发现TDC酶对色氨酸显示出很高的底物特异性,Km值为0.075mmol/L,而在短小蛇根草、水稻和萝芙木中TDC酶的Km值分别为0.72mmol/L、0.69mmol/L和2.89mmol/L。
TDC基因首次于1993年在长春花(J04521)中得到克隆,随后它在水稻(AK069031)、萝芙木(HM067439)、喜树(KU842377)等植物中也被相继分离。目前,TDC基因在植物中的应用较多,如Mehrotra等将长春花TDC基因在蛇根木中进行超表达,发现转基因植株的毛状根中具有较多的萜类吲哚生物碱(Mehrotra S,Srivastava V,Rah man LU,etal.Overexpression of a Catharanthus tryptophan decarboxylase(tdc)gene leadsto enhanced terpenoid indole alkaloid(TIA)production in transgenic hairy rootlines of Rauwolfia serpentine.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,2013,115:377-384);Gill等将喜树TDC基因在杨树和烟草中进行超表达,发现两者植株均保持正常生长,而色胺积累水平提高,并影响了多毛虫和天蛾的进食量与数目(Gill RIS,Ellis BE,Isman MB.Tryptamine-induced resistance in tryptophan decarboxylase transgenicpopla r and tobacco plants against their specific herbivores.Journal ofChemical Ecology,2003,29:779-793);Huang等发现变异山羊草TDC基因通过改变下游次生代谢产物含量来调节植株对谷物囊肿线虫的抗性(Huang Q,Li L,Zheng M,et al.Thetryptophan de carboxylase 1 gene from Aegilops variabilis No.1 regulate theresistance against cereal cyst nematode by altering the downstream secondarymetabolite contents rather than a uxin synthesis.Frontiers in Plant Science,2018,9:1297);发明专利CN104232664A公布了一种易变山羊草色氨酸脱羧酶核酸序列,它能够提高烟草抗根结线虫能力。这些应用表明TDC基因可以被用于提高次生代谢产物含量、增强植株抗逆性。
芍药为芍药科芍药属多年生宿根草本花卉,是我国的传统名花,与牡丹并称为“花王”和“花相”。芍药作为近些年国际市场上新兴的高档切花,不断受到大众的追捧,而花色是影响其市场价格的重要因素。芍药PlTDC基因的cDNA全长序列为1849bp,具有起始密码子ATG、完整开放阅读框1512bp、终止密码子TAG、5'非编码区53bp、3'非编码区270bp和poly(A)11bp,共编码504个氨基酸,在GenBank中登录号为K Y765554。Zhao等前期检测了PlTDC基因在不同花色芍药品种花瓣中的表达水平,发现其在白色花瓣中表达水平最高,其次为紫色花瓣和红色花瓣,而在粉色花瓣中表达水平最低(Zhao DQ,Wang R,Liu D,etal.Melatonin and expression of tryptophan dec arboxylase gene(TDC)inherbaceous peony(Paeonia lactiflora Pall.)flowers.Molecul es,2018,23:1164),表明PlTDC与芍药花色之间并不存在一定的相关性。此外,Zhao等通过转基因研究发现芍药PlTDC可以增强植株耐干旱和盐碱能力(Zhao DQ,Zhang XY,Wang R,et al.Herbaceouspeony tryptophan decarboxylase confers drought and salt stressestolerance.Environmental and Experimental Botany,2019,162:345-356)。而芍药PlTDC在改变植物花色方面的应用尚未有报道。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足,本发明的目的是提供芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用。
技术方案:为了实现上述发明目的,本发明采用的技术方案如下:
芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用,所述芍药PlTDC基因的登录号是KY765554。
优选,所述植物为烟草。
含有芍药PlTDC基因的过量表达载体在改变植物花色中的应用,所述芍药PlTDC基因的登录号是KY765554。
优选,所述植物为烟草。
含有芍药PlTDC基因的宿主细胞在改变植物花色中的应用,所述芍药PlTDC基因的登录号是KY765554。
优选,所述植物为烟草。
本发明通过构建芍药PlTDC基因的过量表达载体,采用农杆菌介导的叶盘法将pCAMBIA1301-PlTDC过量表达载体转入烟草中,待植株开花后,转PlTDC基因的烟草植株花色为淡粉色,而野生型烟草植株花色为红色,表明过量表达PlTDC基因具有改变植物花色的功能。
有益效果:本发明通过将构建的PlTDC基因过量表达载体转化到烟草中进行表达,降低了植物,尤其是烟草花瓣中花色苷含量,抑制了花色苷合成相关基因表达,创制了淡粉色烟草新种质。
附图说明
图1:野生型和转PlTDC基因的烟草植株花色表型比较:其中,野生型烟草植株花色为红色;转PlTDC基因的烟草植株花色为淡粉色。
图2:野生型和转PlTDC基因的烟草花瓣色泽参数a*值比较:其中,不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
图3:野生型和转PlTDC基因的烟草花瓣中花色苷含量比较:其中,不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
图4:野生型和转PlTDC基因的烟草花瓣中花色苷合成相关基因的表达水平:其中,CHS为查耳酮合酶基因;CHI为查耳酮异构酶基因;F3H为黄烷酮3-羟化酶基因;DFR为二氢黄酮醇-4-还原酶基因;ANS为花色素合成酶基因;不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明。
实施例1芍药PlTDC基因过量表达载体在烟草中的表达
芍药PlTDC基因过量表达载体构建:设计含有酶切位点BamH I和Kpn I用于扩增PlTDC序列的引物(上游引物PlTDC-F:5'-CGCGGATCCATGGGTAGTCTTGAAC-3',下游引物PlTDC-R:5'-GGGTACCCTAACACCCCTTGAGTAT-3')。PCR产物连接到pEASYTM-T5 Zero CloningVector载体,转化Trans-T1感受态细胞,而后在附加0.1%氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆、提取阳性质粒。取双元表达载体pCAMBIA1301质粒和含酶切位点的PlTDC质粒分别用BamH I和Kpn I进行双酶切,反应体系为:2.0μL 0.5×K Buffer、10μL pCAMBIA1301质粒或含酶切位点的PlTDC质粒、1.0μL BamH I、1.0μL Kpn I、6.0μL ddH2O;37℃反应1.5h。双酶切产物经过琼脂糖凝胶电泳分析,采用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA ExtractionKit Ver.4.0(TaKaRa)凝胶回收试剂盒回收纯化质粒pCAMBIA1301大片段和PlTDC大片段。用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物,反应体系为:1.0μL 10×T4 ligaseBuffer、1.0μL T4 DNA ligase、1.0μL pCAMBIA1301大片段、10μL PlTDC大片段、7.0μLddH2O;在22℃室温连接15min后进行65℃水浴10min,取5μL连接产物转化Trans-T1感受态细胞,而后在附加0.05%卡那霉素的LB平板上37℃过夜培养,挑取阳性单克隆扩大培养,提取质粒pCAMBIA1301-PlTDC,再进行双酶切与测序验证,直至pCAMBIA1301-PlTDC过量表达载体构建成功。
芍药PlTDC基因过量表达载体转化烟草:挑取农杆菌EHA105单菌落于YEB液体培养基中(含有Rif 50mg/L和Kan 50mg/L),28℃,200rpm培养过夜。取所摇菌液2mL加入50mL含有相同抗生素的液体YEB中,在相同条件下培养至OD600=0.3-0.4。将摇好的菌倒入50mL离心管中,室温离心5000rpm、10min,弃上清备用。先在灭菌后的小三角瓶中加入400μL乙酰丁香酮(20mg/mL),向离心管中加入5mL MS0(MS0液体基本培养基,无琼脂和蔗糖)将溶解菌体,用枪打匀,倒入加有400μL乙酰丁香酮的小三角瓶中,然后加MS0至50mL。向另一个灭菌小三角瓶中加入50mL MS0(MS0液体基本培养基,无琼脂和蔗糖)备用。取烟草的无菌苗叶片,切成小块(约1cm×1cm),放入50mL加有MS0小三角瓶中,共切100-150片叶片放入瓶中,将叶片倒入覆有纱布的烧杯,取经过滤后的叶片加入50mL MS0+AS的小三瓶中,侵染8min,侵染时不断轻轻摇动;侵染完成后,滤去菌液,取出叶片,用无菌滤纸吸干叶片表面多余的菌液,接种于共培养培养基[MS0+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.66%琼脂]中,暗培养3d;共培养结束后,转入抗性芽筛选分化培养基[MS0+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.66%琼脂+100mg/L Cb+25mg/L Hyg]中进行选择培养,两周继代一次,直到分化出芽;当分生不定芽达2cm以上时,切下不定芽,转入生根筛选培养基[1/2MS+0.3mg/LIBA+30g/L蔗糖+6.66%琼脂+50mg/L Cb+8mg/L Hyg]进行生根筛选。经过4-6个月的培养,可获得转PlTDC基因烟草。
转PlTDC基因烟草植株花色表型鉴定:在烟草植株花朵开放后,可以观察到野生型烟草花瓣为红色,而转PlTDC基因烟草花瓣为淡粉色,表明过量表达PlTDC基因具有改变植物花色的功能,结果见图1。
实施例2烟草植株花瓣色泽相关性指标测定
烟草植株花瓣色泽参数a*值测定:采用便携式成像分光色差仪(RM 200QC,美国爱色丽公司)测定花瓣色泽参数a*值,与野生型烟草相比,转PlTDC基因烟草花瓣具有显著较低的a*值,表明转PlTDC基因烟草花瓣色泽较浅,结果见图2。
烟草植株花瓣中花色苷含量测定:称取1.0g新鲜花瓣,用液氮将花瓣研磨成粉状,用6mL的提取液(CH3OH:ddH2O:HCl;70:29.9:0.1;V:V:V)溶解,遮光条件下在4℃恒温振荡24h进行花色苷提取,然后用离心机以12,000rpm的转速离心10min,吸取上清液,通过0.22μm微孔滤膜过滤,采用分光光度计测定520nm下的吸光度。从图3可以看出,与野生型烟草相比,转PlTDC基因烟草花瓣中花色苷含量显著较低,表明芍药PlTDC基因能够调控花色苷合成。
烟草植株花瓣中花色苷合成相关基因的表达水平检测:以烟草花瓣为材料,采用RNAiso Plus(Total RNA提取)(TaKaRa)试剂盒来提取总RNA,并采用PrimerScriptTM RTreagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒将总RNA反转录成cDNA,反应体系为:1.0μL RNA、2.0μL 5×gDNA Eraser Buffer、1.0μL gDNA Eraser和6.0μL RNase Free dH2O;反应条件为:42℃反应2min。反应完成后,再在第一步的反应液中依次加入4.0μL 5×PrimeBuffer 2(for Real Time)、1.0μL RT Primer Mix、4.0μL RNase Free dH2O和1.0μL PrimeRT Enzyme Mix I;反应条件为:37℃反应15min,85℃反应5s。将反转录所获得的cDNA采用TransTip Green qPCR SuperMix试剂盒(Trans)进行qRT-PCR检测,以烟草Actin(AB158612)为内参基因(Actin-F:5'-TCCTCATGCAATTCTTCG-3'、Actin-R:5'-ACCTGCCCATCTGGTAAC-3'),检测花色苷合成相关基因CHS1(NM_001325705.1)、CHS2(XM_016634418.1)、CHI(AB213651.1)、F3H(AF036093.1)、DFR1(EF421429.1)、DFR2(EF421430.1)、ANS1(JQ866630.1)和ANS2(JQ866631.1)的表达水平,反应体系为:2.0μLcDNA、12.5μL2×TransTip Green qPCR、上游引物与下游引物各1.0μL(10mM)、8.5μLddH2O;反应程序为:94℃预变性30sec,然后94℃变性5sec,52℃退火30sec,72℃延伸30sec,反应45个循环,溶解曲线65℃-95℃,每5sec升温0.5℃;它们的特异型引物分别为:CHS1-F:5'-CAAACTCTTCTCCCCGAT-3'、CHS1-R:5'-CCACAAGGCTTTTCTCAAT-3';CHS2-F:5'-CCAAGATTACCCATTTAGTC-3'、CHS2-R:5'-CTTAGCCAATCGGAGAAC-3';CHI-F:5'-GTGCCTCCATTCTTTTTAC-3'、CHI-R:5'-GCGATACTACACTTTGCTG-3';F3H-F:5'-TTGAAACGACACACGGAT-3'、F3H-R:5'-GAGATTAACCACAAAAGCAC-3';DFR1-F:5'-GATACTGGCAGAGAAGGC-3'、DFR1-R:5'-AGTGAAAGGGCAGTGATT-3';DFR2-F:5'-GTTTTCACTTCATCGGCT-3'、DFR2-R:5'-CCATCCTGTCATCTTCTTAG-3';ANS1-F:5'-GCAAATAGTGCTTGTGGT-3'、ANS1-R:5'-TGCTGGAATGTAGTCTGTAG-3';ANS2-F:5'-TCCAGGCTATCCCTAAAG-3'、ANS2-R:5'-CATAACACCCCACTCCAT-3'。采用公式2-△△CT法计算基因的相对表达量。从图4可以看出,与野生型烟草相比,CHI、DFR1、DFR1、ANS1、ANS1在转PlTDC基因烟草花瓣中的表达水平较高,而CHS1表达水平较低。
综上所述,本发明提供了一种芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用,通过将构建的PlTDC基因过量表达载体转化到烟草中进行表达,降低了烟草花瓣中花色苷含量,抑制了花色苷合成相关基因表达,创制了淡粉色烟草新种质。
Claims (3)
1.芍药PlTDC基因在改变植物花色中的应用,所述芍药PITDC基因在Genbank数据库的登录号是KY765554,所述植物为烟草。
2.含有芍药PlTDC基因的过量表达载体在改变植物花色中的应用,所述芍药PITDC基因在Genbank数据库的登录号是KY765554,所述植物为烟草。
3.含有芍药PlTDC基因的宿主细胞在改变植物花色中的应用,所述芍药PITDC基因在Genbank数据库的登录号是KY765554,所述植物为烟草。
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